UNIVERSIDAD PEDAGGICA Y TECNOLGICA DE COLOMBIA-UPTC FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE POSGRADOS MAESTRA EN QUMICA

CUANTIFICACIN DE ACRILAMIDA, DETERMINACIN DE LA CINTICA DE FORMACIN Y SU INHIBICIN, EN EL PROCESO DE PRODUCCIN DE PANELA

JOHN JAIRO VARGAS LASSO

Tunja, 2013

UNIVERSIDAD PEDAGGICA Y TECNOLGICA DE COLOMBIA-UPTC FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE POSGRADOS MAESTRA EN QUMICA

TTULO TRABAJO DE GRADO Trabajo de Investigacin como requisito parcial para optar al grado de Magister en Qumica

Nombre del Autor JOHN JAIRO VARGAS LASSO Nombre del tutor OSCAR JULIO MEDINA VARGAS

Tunja, 2013 1. RESUMEN DEL PROYECTO:

La panela es uno de los productos principales en la canasta familiar y es un producto que se exporta a diferentes partes del mundo, . estudios recientes CULES??han determinado la presencia de acrilamida en la panela por lo cual nos pone en alerta para buscar soluciones y poder tener un producto libre de sustancias que son catalogadas por la FAO como posibles cancerolgicos. En abril de 2002 la Administracin Nacional de Alimentos de Suecia e investigadores de la Universidad de Estocolmo anunciaron que la acrilamida, una sustancia qumica txica en las clulas somticas y germinales, posee el potencial de inducir daos hereditarios en los genes y cromosomas, por lo cual es considerada potencialmente cancergena formndose en muchos tipos de alimentos preparados/cocidos a temperaturas elevadas (superiores a 120C) tales como: fritos y horneados con niveles bastante altos (concentraciones que van hasta 10 mg / kg) que se encuentran en papas fritas y papas; por la reaccin entre la asparagina y los azcares reductores. Los ltimos datos advierten que la presencia de esta sustancia en alimentos, en elevadas cantidades puede constituir un peligro para la salud pblica. El estudio realizado en la Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia, ha demostrado su presencia en panela proveniente del municipio de Moniquir (Boyac), por lo cual la acrilamida ha llegado a ser el centro de inters y permite cuestionar cul es la concentracin de acrilamida presente en panela negra, blanca y pulverizada?. Resaltando el hecho de que en Colombia, no se han publicado hallazgos relacionados con la formacin de acrilamida en el proceso de produccin de la panela. Segn cifras de la FAO, Colombia es el segundo productor mundial de panela y ocupa el primer lugar en consumo por habitante, y hace parte de la economa y canasta familiar. COLOMBIA?? ABSTRACT (1 pgina) 2 INTRODUCCIN

2.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2.1.1 DESCRIPCIN DEL PROBLEMA Segn cifras de la FAO, 26 pases en el mundo producen panela y Colombia es el segundo productor despus de la India, con un volumen que representa el 12,1% de la produccin mundial en 2001. Sin embargo, en trminos de consumo por habitante, Colombia ocupa el primer lugar con un consumo de 34,2 Kg. este producto hace parte de la economa y canasta familiar de muchas de las familias colombianas. (Corpoica, 2001) En la produccin de panela se pueden encontrar varios inconvenientes de los cuales salen varias incgnitas, algunas de ellas son: como debe de ser la presentacin del producto, que

tipos de clarificante se deben usar, si debe o no tener solidos suspendidos y aditivos se deben agregar para tener un producto final. Teniendo en cuenta la posible formacin de la acrilamida en la panela ya sea por la reaccin de Maillard o por la adicin de poliacrilamidas, nos crea muchas incgnitas sobre la calidad del alimento que estamos consumiendo y cual ser una posible solucin. Teniendo en cuenta que la acrilamida es considerado con un producto cancerolgico. 2.1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En la Hoya del Ro Surez, departamento de Boyac, se produce panela que abastece el mercado nacional y en ocasiones se exporta, pero an no se han monitoreado los peligros qumicos que ocasionan algunos compuestos como la Acrilamida. Frente a esta realidad, el problema es: se puede determinar la Acrilamida, establecer la cintica de formacin y su inhibicin, en la panela que se produce en Boyac, mediante HPLC? 2.21 OBGETIVOS

Objetivo General Cuantificar la acrilamida, determinar la cintica de formacin y su inhibicin, en el proceso de produccin de panela. 2.2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS Optimizar el mtodo para la determinacin de acrilamida mediante la tcnica analtica HPLC/UV. Cuantificar por HPLC los niveles de acrilamida presentes en la materia prima, proceso y producto final (panela), en muestras tomadas aleatoriamente en el mercado local de Tunja Boyac. Determinar los puntos crticos en la elaboracin de panela y establecer la cintica de reaccin de formacin de la acrilamida por HPLC. Determinar el procedimiento ms adecuado para la inhibicin de acrilamida en el proceso de produccin de panela. 2.3 INTRODUCCION La acrilamida (2-propenamida) es un compuesto hidroflico de bajo peso molecular conocida principalmente por su uso como monmero en la produccin de poliacrilamida se emplea en plsticos y como medio de electroforesis.

En el ao 2002 la Administracin Nacional de Alimentos de Suecia detect altas concentraciones de acrilamida que se formaba durante el calentamiento a altas temperaturas de alimentos ricos en almidn, como las papas fritas, pan, galletas, alimentos extrudos, etc. Este descubrimiento es de inters pblico, porque la acrilamida es genotxico y ha sido clasificada como probable carcinognico para humanos (Grupo 2A) por la Agencia Internacional de Investigacin sobre Cncer (IARC) (IARC, 1994, De Wilde et al. 2005) El descubrimiento se origina a partir de resultados de la formacin de un aducto especfico en humanos entre la hemoglobina y la acrilamida, ms adelante tambin encontrada por los cientficos de la Universidad de Estocolmo en ratas alimentadas con papas frita. Las conclusiones a la fecha muestran que la acrilamida se forma durante la preparacin culinaria e industrial de alimentos, ricos en carbohidratos que se fren, hornean o extruyen a temperaturas que exceden los 120 C, como producto de la reaccin de la asparagina y glucosa que corresponde a la conocida reaccin de Maillard. Con motivo de este hallazgo, surgi el requerimiento urgente de desarrollar un mtodo analtico sensible, robusto y de un costo razonable, que pueda cuantificar acrilamida en diferentes matrices de alimentos con bajos niveles de deteccin (Mg/Kg). Diferentes mtodos se haban desarrollado en el pasado para determinar monmero de acrilamida, especialmente en agua, fluidos biolgicos y alimentos. Se basaban en tcnicas de cromatografa lquida o de gas. Sin embargo, estos mtodos como tales no eran apropiados, en alimentos cocinados, para analizar acrilamida en bajos niveles. En particular, carecen de selectividad y el grado adicional de certeza analtica requerida para confirmar la presencia de esta pequea molcula como es la acrilamida en la compleja matriz de un alimento. 1 Es as como a raz de este hallazgo diversos grupos de investigacin en el mundo inician trabajos para desarrollar metodologas analticas que cumplan con estos requisitos de determinacin de alta sensibilidad.2 El hallazgo de altos niveles de acrilamida en alimentos de consumo habitual despert preocupacin e inters mundial para la determinacin y cuantificacon de acrilamida en productos alimenticios.1 2.3.2 MARCO TERICO La panela es el producto obtenido de la extraccin y evaporacin de los jugos de la caa de azcar, elaborado en los establecimientos denominados trapiches paneleros o en las centrales de acopio de mieles vrgenes, en cualquiera de sus formas y presentaciones (1). Es un alimento tradicional en muchos pases de Amrica Latina y el Caribe y se considera ms valiosa que el azcar desde el punto de vista nutricional, por su alta concentracin de azcares y por su aporte de minerales, grasas, compuestos proteicos y trazas de vitaminas3 2.3.3Proceso de elaboracin

El proceso de elaboracin de panela consiste en moler la caa, clarificar y evaporar el jugo hasta obtener una miel concentrada (ms de 90Brix), la cual se bate, moldea y enfra para lograr la solidificacin (6). En la figura 1 se presenta el diagrama de flujo del proceso de elaboracin de panela, donde se destaca un intervalo de pH entre 5,2 a 6,2 en las diferentes etapas del proceso. Valores superiores o inferiores a este intervalo presentan problemas de calidad en el producto final. En las etapas de clarificacin, encalado y punteo se emplea el calentamiento del jugo de caa con el fin de eliminar impurezas y concentrar el jugo de caa. La clarificacin consiste en la eliminacin de las cachazas o slidos en suspensin tales como bagacillos (material lignocelulsico), hojas, arenas, tierra, sustancias coloidales y slidos solubles presentes en el jugo de la caa. La limpieza de los jugos ocurre gracias a la accin combinada del calentamiento suministrado por la hornilla y la accin de ciertos aglutinantes . Estos se sumergen directamente en el jugo cuando se alcanzan temperaturas entre 50 y 85C, donde a los 75C se retiran las impurezas denominadas cachaza negra y a los 95C se retira la cachaza blanca. El encalado es una parte de la limpieza donde se adiciona cal (xido de calcio), con el objeto de regular la acidez de los jugos a un valor de pH de 5,8, para prevenir laformacin de azcares reductores y ayudar a la clarificacin de los jugos; la aplicacin se realiza en dos etapas a 40C y 80C. El punteo corresponde a la etapa de evaporacin y concentracin del jugo de caa donde se alcanzan temperaturas entre los 98 y 120C.

Figura 1. Proceso de produccin de panela. Adaptado de Hernndez et al. (2002) (2), Castellanos F. et al. (2010) (8) y CORANTIOQUIA (2012)

COOREGIR ESTE GRAFICO: QUIEN ES APONTE? 2.3.4Que es la acrilamida La acrilamida (2-propenamida) es un producto qumico de amplio uso en la industria (se utiliza en la sntesis de poliacrilamidas), del cual se conocen varias caractersticas fsicoqumicas.2

Estructura de la Acrilamida

Se presenta como un polvo blanco cristalino soluble en agua, etanol, metanol, dimetilter y acetona; no es soluble en heptano ni benceno. Se polimeriza rpidamente al alcanzar el punto de fusin o al ser expuesto a la luz ultravioleta. La acrilamida slida es estable a temperatura ambiente, pero puede polimerizarse violentamente cuando se mezcla o expone a agentes oxidantes.3 La acrilamida se emplea fundamentalmente en el tratamiento del agua potable, en el procesado de la pulpa de papel y tambin para retirar slidos en suspensin de las aguas residuales de la industria antes de ser eliminados o para su eventual reutilizacin. Sin embargo, existe un gran nmero de otras posibles aplicaciones, como aditivo en cosmticos, acondicionador de suelos, procesado de minerales y en la formulacin de agentes selladores para diques, tneles, represas y alcantarillados La acrilamida (2-Propenamida) se encontr en ciertos alimentos que contenan almidn y fueron procesados y cocinados a altas temperaturas (ms de 120 C fritos, asados) los niveles de acrilamida se incrementaron al aumentar el tiempo de calentamiento.3 La acrilamida y sus anlogos han sido ampliamente utilizados desde el siglo pasado por diversos compuestos qumicos y ambientales. Algunos de los usos comunes de la acrilamida es el papel, tintes, cosmticos, artculos de tocador y industria. Se obtiene comercialmente como un producto intermedio en la produccin y la sntesis de poliacrilamidas. Acrilamidas tambin se han utilizado como floculantes para aclarar agua potable y para el tratamiento de aguas residuales, ellas son componente del humo de tabaco. Se han realizados numerosos estudios en acrilamida y su posible mutagenicidad y carcinogenicidad en animales y humanos.4 2.3.5 Mecanismos de formacin de la acrilamida en los alimentos Los alimentos analizados hasta la fecha, con niveles de acrilamida ms elevados estn en las papas, y los productos a base de cereales sometidos a procesamiento con calor como frer, cocinar a la parrilla o al horno. Tambin se encontraron niveles ms bajos en algunos otros alimentos procesados con calor. Sin embargo, slo se evalu una variedad limitada de tipos de alimentos hasta la fecha y stos pertenecen a la dieta occidental.5 La acrilamida es una molcula pequea y simple. Se podra formar en los alimentos calentados a travs de varios mecanismos diferentes que pueden incluir reacciones de carbohidratos, protenas y aminocidos, lpidos y posiblemente otros componentes menores de los alimentos.6 Algunas de las posibilidades que se proponen ms comnmente son: Formacin a travs de acrolena o cido acrlico que puede provenir de la degradacin de lpidos, carbohidratos o aminocidos libres Formacin mediante la deshidratacin/descarboxilacin de ciertos cidos orgnicos comunes incluyendo cido mlico, cido lctico y cido ctrico.

Formacin directa a partir de aminocidos por reaccin de maillard con la asparagina.

En los dos primeros casos, el origen del nitrgeno en la molcula de acrilamida posiblemente sea el amonaco liberado en los procesos de desaminacin6. Como an no se han informado estudios sistemticos, no hay evidencias para identificar alguna ruta especfica de formacin, ni para excluir ninguna posibilidad. La acrilamida tambin podra provenir de fuentes no alimentarias. Es muy probable que haya una cantidad de mecanismos de reaccin involucrados, dependiendo de la composicin del alimento y de las condiciones de procesamiento. Como an no se han informado estudios sistemticos, no hay evidencias para identificar alguna ruta especfica de formacin, ni para excluir ninguna posibilidad. La acrilamida tambin podra provenir de fuentes no alimentarias. Es muy probable que haya una cantidad de mecanismos de reaccin involucrados, dependiendo de la composicin del alimento y de las condiciones de procesamiento. Esto hace difcil por el momento sacar conclusiones sobre la influencia de diversos procesos alimentarios o brindar recomendaciones sobre cmo minimizar los niveles de acrilamida.7 La formacin de acrilamida parece ser un fenmeno de superficie y el contenido de agua tambin puede ser un factor importante. En estos dos casos, hay tambin similitudes con las reacciones al dorarse los alimentos cuando se los calienta (reaccin Maillard), y debe investigarse esta posible conexin.7

2.4 TOXICIDAD 2.4.1 Exposicin y riesgo (humano) La neurotoxicidad es el factor no-cancergeno no-genotxico ms importante que presenta la ingesta de acrilamida en humanos y en animales. Exposiciones a altas dosis de esta sustancia en humanos y animales inducen cambios en el Sistema Nervioso Central (SNC), mientras que la exposicin prolongada a bajas dosis da como resultado neuropata perifrica en presencia o ausencia de complicaciones sobre el SNC. Se han reconocido tambin efectos sobre la fertilidad en animales. 2.4.2 Exposicin alimentaria Desde la primera comunicacin sobre el contenido de acrilamida en los alimentos, se ha descrito una gama de concentraciones en distintos alimentos y productos alimenticios. En el Cuadro 1 se ofrece un resumen de los resultados especficos obtenidos hasta el momento de los anlisis de acrilamida en los alimentos. En algunos de estos grupos de productos el nmero de anlisis realizados ha sido escaso. Se han observado diferencias significativas en las concentraciones de acrilamida dentro de las categoras especficas de alimentos y de lotes de productos elaborados en las mismas condiciones.11

Tabla 1: Concentraciones notificadas de acrilamida en los alimentos Grupo de alimentos/productos Mnimo Patatas fritas (redondas y crujientes) Patatas (crudas) Patatas (cocidas) Patatas fritas (alargadas) Maz frito (crujiente) Productos de panadera Pan Pan (tostada) Galletas (dulces y saladas) Cereales de desayuno Pan tostado (crujiente) Caf (tostado) T Granos de cebada tostados Productos a base de chocolate Nueces, avellanas Preparados para lactantes y alimentos para bebs Fuente: ftp://ftp.fao.org/codex/alinorm03/al03_39s.pdf La acrilamida se forma probablemente en muchos alimentos, pero no todos han sido estudiados. La cantidad a la que el consumidor est expuesto est relacionada con los niveles presentes en el alimento y la cantidad de alimento consumida. Los alimentos que no son fritos no contienen cantidades apreciables de acrilamida (crudos o cocidos en agua)12. 2.4.3 REACCIN DE MAILLARD La Acrilamida es producida en alimentos durante los procesos de coccin a altas temperaturas por medio de las Reacciones de Maillard tambin conocida como Pardeamiento no enzimtico, con caramelizacin son las reacciones qumicas principales que se producen en los productos de panadera la cual es la responsable de muchos de los 170 <10 <4 59 120 24 <10 25 18 22 <30 45 142 210 <2 28 <10 Mximo 2510 <50 <50 12800 220 364 130 1430 650 1400 1900 374 567 578 909 339 130

colores y sabores existentes en algunos alimentos 13. Las Reacciones de Maillard estn relacionadas con una serie de reacciones, resultado de productos reductores, primariamente azcares, que reaccionan con protenas o con grupos amino libres, en la cual se envuelven compuestos amino y la reduccin de azcares con acrilamida, como uno de sus principales productos. Esta reaccin cambia tanto las propiedades qumicas como fisiolgicas de las protenas. En general la acumulacin de pigmentos de color marrn indica que la reaccin se ha producido en alimentos que contienen hidratos de carbono y protenas. En el pardeamiento no enzimtico, suceden 4 rutas principales, si bien, la qumica de estas reacciones est relacionada con la reaccin de Maillard: Reaccin de Maillard, Oxidacin del cido ascrbico, Peroxidacin de lpidos y Caramelizacin a alta temperatura, siendo esta ultima la reaccin de pardeamiento de los azcares que son calentados por encima de su punto de fusin en ausencia de protenas o aminocidos. Esta se ve favorecida por condiciones alcalinas o cidas y se usa para la coloracin comercial de caramelos y para obtener flavores. La caramelizacin puede ser conveniente o perjudicial para la calidad de un producto alimentario, y se puede prevenir evitando el proceso a alta temperatura y almacenando a bajas temperaturas.13
O N O C O Asn
O

O N O Dicarbonilo
O O O O O

N N C

+
O OH2 O

O O

Statler et al. Nature 2002, 419: 449

Glucosa

Mottram et al. Nature 2002, 419: 448

N N C O O O O O Aldehido de Strecker N C O O O O NH2 Acrilamida CH2 C O N O O O O O N C N

+
O N

EXPERIMENTAL
O N

+
O

Aminocetona

RESULTADOS Y DISCUSIN CONCLUSIONES

Figura: 2 reaccin de maillard 2.4.4 ESTRATEGIAS PARA LA MITIGACIN DE LA ACRILAMIDA FORMADA POR LA REACCIN DE MAILLARD EN ALIMENTOS

Teniendo en cuenta que los agentes promotores ms importantes de la formacin de AA son: asparagina, azcares reductores, bicarbonato de amonio (NH4HCO3) como agente de horneado, temperatura de reaccin y pH, a continuacin se presentan algunas estrategias para la reduccin de AA: La adicin de la enzima asparaginasa permite la reduccin de la concentracin de asparagina por hidrlisis de sta, siendo una metodologa eficiente, simple y que mantiene las caractersticas sensoriales del producto. Pese a que la reduccin total de asparagina no se logra, con el uso de una concentracin de 45.000 UI/kg de asparaginasa en el alimento, se disminuye en un 90% la concentracin de AA (28). La disminucin del pH reduce la formacin de AA posiblemente por la protonacin del grupo -amino de la asparagina, impidiendo la reaccin con el grupo carbonilo. Se ha encontrado que la reduccin de 1,60 unidades de pH a partir de 3,93 disminuye en un 41% la concentracin de AA, no obstante la relacin entre pH y AA puede variar debido a la matriz del alimento, el procesamiento y el punto inicial de pH. Para la reduccin del efecto asociado con la presencia de bicarbonato de amonio, se considera su reemplazo por el bicarbonato de sodio como agente de horneado, sto permite una reduccin en la concentracin de AA del 70%. La adicin de cidos orgnicos como los cidos tartrico o ctrico junto al bicarbonato de sodio produce una reduccin en la formacin de AA. Los tratamientos trmicos moderados como bajas temperaturas por tiempos prolongados (LTLT, por su sigla en ingls) disminuyen la formacin de AA que es catalizada por la temperatura sin superar los 80C . 2.5 TECNICAS DE ANALISIS DE ACRILAMIDA La Organizacin Mundial de la Salud ha reportado dos tcnicas para el anlisis de acrilamida como son: 2.5.1Cromatografa de gases/espectrometra de masa (GC-MS) A pesar de que la acrilamida puede analizarse como tal, sin derivacin, cuando se usa GCMS, la molcula normalmente se bromura y forma un derivado que mejora las propiedades de la GC. El derivado de la acrilamida se identifica por su tiempo de retencin y por la

relacin de los iones caractersticos de la MS. Una vez que se establece la identidad de acrilamida en un tipo de alimento determinado, puede ser posible utilizar la cromatografa de gases con deteccin de captura de electrones (ECD, siglas en ingls) u otras tcnicas de deteccin selectivas para monitorear los niveles de rutina, a pesar de que con esta tcnica analtica la identificacin slo se basa en el tiempo de retencin. El nivel mnimo que puede medirse cuando se usa GC-MS oscila entre 5 y 10 g/kg.14 2.5.2 Cromatografa de lquidos/espectrometra de masa/Masa (LC-MS/MS) Debido a la preocupacin sobre la posible formacin de artefactos durante el procedimiento de bromuracin, se desarrollaron los mtodos de LC-MS/MS para el anlisis directo de acrilamida sin necesidad de derivar. La sustancia se identifica por su tiempo de retencin y por las intensidades relativas de iones. El lmite de medicin usando LC MS/MS es de alrededor de 20 a 50 g/kg. 2.5.3 Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (HPLC) La cromatografa liquida de alta eficiencia es una de las tcnicas mas utilizadas para el anlisis de sustancias y mezclas complejas. La separacin cromatogrfica tiene lugar por la diferente interaccin de molculas entre dos fases, un lecho o fase estacionaria y una fase mvil lquida15 Los principales mecanismos de separacin son: Cromatografa de adsorcin: La fase estacionaria es un adsorbente (slice, almina) y la separacin se basa en una serie de procesos repetitivos de adsorcin-desorcin fundamentalmente. En este tipo de cromatografa los solutos polares son mas fuertemente retenidos por la fase slida estacionaria y presentan mayores tiempos de retencin. Cromatografa de particin: se basa en la competencia por el analito entre la fase lquida mvil, la fase estacionaria lquida y la separacin ocurre por una serie de procesos de reparto. Cromatografa de exclusin: No presenta interaccin entre la fase estacionaria y el soluto y se fundamenta en la mayor o menor posibilidad de que las molculas del soluto penetren en los poros de las partculas de relleno. Las molculas muy grandes no pueden entrar siendo excluidas mientras que otras se introducirn en mayor o menor grado en los poros segn su tamao; cuanto menor sea su tamao mas profundo entrara en las partculas y mas tarde escaparan de la columna. La fase estacionaria es un relleno de partculas slidas porosas de tamao de poro conocido16. 2.6 ESTADO DEL ARTE En un estudio para determinar acrilamida se estableci una fase mvil de 4% acetonitrilo y 96% agua as como una deteccin UV a 210-225nm, un flujo de 0.1ml/min, el coeficiente de correlacin igual a 0.999, el limite de deteccin y cuantificacin fueron de 6 y 23 g/Kg respectivamente, as como la reproducibilidad de 27 y 52 g/Kg a concentraciones de 30 y

51 g/Kg y el %RSD entre 2.1 y 10.9%, teniendo en cuenta estas condiciones se obtuvo una concentracin en muestras analizadas de alimentos entre 27-198 g/Kg tomando 1g de muestra para su anlisis. Los estudios publicados hasta la fecha no aclaran el umbral txico de la acrilamida en humanos. De acuerdo con la informacin del IARC de Lyon, el instituto de referencia mundial donde se centralizan los datos acerca de los productos qumicos que pueden provocar distintas formas de cncer, fechada en 1994 y actualizada en 1997, distintos estudios han demostrado que la ingesta de acrilamida en ratas y ratones de laboratorio puede llevar a la formacin de diversas formas de cncer, en especial papilomas y cncer de piel. Tambin se ha comprobado que pueden aparecer alteraciones genticas en cultivos celulares, aunque de momento nada ha podido probarse con los escasos estudios realizados en humanos. Segn diversos estudios, la poblacin general est expuesta a una ingesta de entre 0,3 y 1,1 mg/kg de peso al da, dependiendo del tipo de alimentacin. La cantidad diaria admisible para evaluar los riesgos toxicolgicos por inhalacin o contacto con la piel se ha fijado en 5 mg/kg de peso corporal y da. La poblacin est expuesta, a travs de la dieta, a una dosis de acrilamida media diaria de 0,85 mg/kg A partir de los diversos trabajos realizados, se estima que la poblacin general est expuesta, a travs de la dieta, a una dosis de acrilamida media diaria de 0,85 microgramos por kilo de peso. Con todo, los expertos aseguran que la acrilamida se biodegrada con rapidez, no se bioacumula en la cadena trfica y es no lipoflica (no se acumula en tejidos adiposos). Todo ello permite descartar a este compuesto como un problema acumulativo. 3 METODOLOGIA 3.1 EQUIPOS Y REACTIVOS. Los equipos y reactivos que utilizamos en esta investigacin son los relacionados en la tabla 2 a continuacin. Equipos y reactivos HPLC/UV COLUMNA BOMBA INYECTOR DETECTOR BALANZA ANALITICA CENTRIFUGA BOMBA DE VACIO ACETONITRILO Caractersticas Agilent Technologies 1200 C18 (Zorbax Eclipse XDB 4.6x150mm, 5L) Cuaternaria Manual Uv/vis MARCA OHAUS MODELO AR2140 MARCA HETTICH MODELO D-78532 HPLC (Aldrich (Mallinckrodt, H454

AGUA Buertas, Probetas, Balones aforaros.etc ACRILAMIDA

V33467, UN 1648, CAS 75-05-8). HPLC MATERIAL DE VIDRIO CALIBRADO TIPO A (>99%) de grado electroforesis obtenida por Aldrich

3.1.2 FASE I: CONDICIONES CROMATOGRAFICAS Y ESTANDARIZACION DEL METODO El anlisis se realiz en un equipo HPLC UV-VIS Agilent technologies 1200 series, una bomba cuaternaria, un detector UV/VIS y un horno para la columna. Se inyectan 20 L de cada una de las muestras, a una longitud de onda de 210 nm, el horno de la columna a una temperatura de 23C, El gradiente de elucin debe de tener un flujo de 0.5mL/min, en la cual la fase mvil es isocratica: Acetonitrilo-Agua, 1:24 (v/v). Las corridas para cada muestra de solucin de panela fueron cada 30 minutos y para las muestras de solucin estndar de acrilamida de 6 minutos Seleccin de la longitud de onda: Se estableci la longitud de onda reportada en diferentes investigaciones 210 nm. Seleccin del flujo: Se utiliz como fase mvil agua-acetonitrilo a una relacin de 96/4% utilizada en otras investigaciones y los diferentes caudales evaluados fueron: 0.1, 0.3, 0.5 y 1mL/min. Se inyectaron 20 L de un estndar de acrilamida de 5ppm utilizando una longitud de onda 210 nm a temperatura ambiente (41). Seleccin de la Temperatura: Se acondiciono el equipo utilizando la temperatura reportada en estudios preliminares 3.1.3 FASE II: CURVA DE CALIBRACION DE ACRILAMIDA. CON ESTANDARES DE ACRILAMIDA Se realizaron soluciones de acrilamida partiendo de un patrn de 100 ppm disolviendo 0.1 g en 100 ml de agua desionizada, filtrada y desgasificada, utilizando material volumtrico. Luego se procedi a preparar soluciones de 10 ppm, 5 ppm, 2ppm, 1 ppm y 0.4ppm con las cuales se obtuvo la curva de calibracin para la cuantificacin de acrilamida en las muestras. 3.1.4 METODO DE EXTRACCION EN MUESTRAS DE JUGO DE CAA Y PANELA (BLANCA, NEGRA Y GRANULADA) Las muestras de jugo de caa se tomaron de un trapiche delimitado del municipio de chitaraque (Boyac, Colombia) y la panela (blanca, negra y granulada) panela comercial de (Boyac, Colombia). Las muestras tuvieron el siguiente tratamiento para su extraccin basados en otras investigaciones, pero con algunas modificaciones para mejorar las condiciones del mtodo de extraccin. Para el jugo de caa se tom 1 mL y se disolvio en 100 ml de agua desionizada, filtrada y

desgasificada. Para muestras de panela se tomaron 1 gr de (blanca, negra y granulada) luego se pulverizo en un tritura cuchillas extrafinas (Hitachi, Tokyo, Japon). Despues de esto se tomaron 0.5 g y se disolvieron en 100 ml de Agua desionizada, filtrada y desgasificada y se centrifuga a 4000rpm, durante 30 minutos para precipitar la mayor parte de slidos presentes Para comprobar la presencia de acrilamida en las muestras se procedi a la adicin de una concentracin conocida de acrilamida a la muestra en estudio y se inyect al equipo en donde se observ el cambio en la seal de inters. Para esta identificacin tambin se tuvieron en cuenta parmetros como son el tiempo de retencin y el rea en el cromatograma. 3.1.5 FASE III: IDENTIFICACION CUANTIFICACIN DE Y ACRILAMIDA CUANTIFICACION DE ACRILAMID POR LA TECNICA ANALITICA HPLC-UV-VIS Con el fin de cuantificar el contenido de acrilamida se tomaron diferentes presentaciones, que catalogamos como panela (blanca, negra y granulada) se realiz la extraccin con las condiciones anteriormente establecidas; cada muestra se inyect al equipo y se cuantific teniendo en cuenta el rea reportada en el cromatgrama y la respectiva curva de calibracin. Adems de establecer las diferencias de concentracin de cada uno de las muestras. 3.1.6 FASE IV: DETERMINAR LOS PUNTOS CRTICOS EN LA ELABORACIN DE PANELA En la de terminacin de los puntos crticos se tuvo en cuenta el proceso de elaboracin de la panela donde se tom muestra en cada una de las etapas de elaboracin como lo son: apronte, extraccin, encalado, evaporacin y concentracin, batido, enfriamiento y panela. Tomando 1g de muestra y se disuelve en 100 ml de agua desionizada y filtrada para posteriormente ser inyectada en el equipo y poder determinar la formacin de acrilamidaen las etapas. 4. RESULTADOS Y DISCUSIN 4.1.1 FASE I Las condiciones cromatografas se establecieron segn lo reportado en la literatura donde se ajustaron algunas de ellas para obtener mejor resolucin en los cromatogramas donde establecieron las siguientes condiciones Las muestras se inyectaron a 20L, con deteccin UV a una longitud de onda de 210nm, el horno de la columna a una temperatura de 23C. El flujo de elucin programado fu de un flujo de 0.5 mL/min, en la cual la fase mvil fue Acetonitrilo Agua, 1:24 (v/v). La elucin programada . Las corridas para cada muestra de

solucin de panela fueron de 30 minutos y para las muestras de solucin estndar de acrilamida de 6 minutos. Se realizaron corridas con tiempos de 10 y 6 minutos para determinar cul de nos mostraba una mejor resolucin en los cromatogramas, asi obteniendo que tiempo de elucin que presento una mejor resolucin fue el de 6 minutos como se observara en los cromatogramas.

4.1.2 FASE II: CURVAS PATRON CUANTITATIVA DE ACRILAMIDA

DETERMINACION

Linealidad del sistema: En la tabla Linealidad del sistema: En la tabla 3 Y 4 se reportan las absorbancias medidas por el espectrofotmetro a diferentes concentraciones y el rea medida en el HPLC a stas mismas concentraciones.

ppm blanco 1 2 4 6

210 mn 0 0,123 0,229 0,451 0,651

Tabla 3. Absorbancias y reas para la linealidad del sistema a diferentes concentraciones con espectrofotmetro Concentracin (ppm) 0,4 1 2 5 10 rea (mAU) HPLC n=1 n=2 118072 148050 552631 552631 103736 3 1081064 258014 6 2503978 506266 2 5244807

Tabla 4. Absorbancias y reas para la linealidad del sistema a diferentes concentraciones con espectrofotmetro n=1 y n=2 son los ensayos en diferentes das respectivamente.

Figura 1: Curva de calibracin de acrilamida entre 1 y 6 ppm con el espectrofotmetro.

Figura 2: Curva de calibracin mediante HPLC de acrilamida entre 0.4 y 10ppm

De la curvas de calibracin en la grfica 2 y 3 se encontr que existe proporcionalidad entre la concentracin y la respuesta del equipo (rea), y se observa que hay un coeficiente de correlacin (R2) de 0.9995, 0.9993 y 0.999 en respuesta al espectrofotmetro y HPLC a las diferentes concentraciones de acrilamida similar a lo reportado en la literatura. 4.1.3 OPTIMIZAR EL METODO DE EXTRACCION DE ACRILAMIDA EN MUESTRAS DE PLATANO FRITO En esta fase de optimizacin se encontr que al realizar el tratamiento de la muestra descrito en la parte metodolgica se logra extraer el compuesto de inters En el anexo 1 se muestran los cromatogramas para la muestra de pltano analizada, y la muestra con la adicin de un estndar conocido de acrilamida 5ppm en donde al tener como parmetro el tiempo de retencin y la seal observada se pudo comprobar la presencia de acrilamida en la muestra analizada. 4.1.4. FASE IV: CUANTIFICACION DEL CONTENIDO ACRILAMIDA EN HOJUELAS DE PLATANO MADURO. DE

Concentracin rea (mAU) 118072 0,4 552631 1 1037363 2 2580146 5 5062662 10

Tabla 5. Estndar acrilamida entre 0.01-10ppm concentracin VS reas de (mAU)

Figura 3. Curva de calibracin de estndar entre 0.01 y 10ppm. Teniendo en cuenta la anterior curva de calibracin se logr determinar la concentracin de acrilamida en las muestras analizadas.

Tabla 6: concentracin de acrilamida para las muestras analizadas.

Los valores de acrilamida en Muestras de panela segn lo reportado en la tabla 1, sealan que la ingesta diaria podra rebasar los valores recomendados por la OMS y el CODEX ALIMENTARIUS (0,5 microgramos/Litro de agua). 4.1.5 FASE IV: DETERMINAR LOS PUNTOS CRTICOS EN LA ELABORACIN DE PANELA Despus de la inyeccin de las muestras tomadas como puntos crticos se pudo establecer la presencia de acrilamida desde el inicio del proceso de elaboracin de la panela como se ilustra en la tabla 7 donde se observa la concentracin de este compuesto y su aumento a medida que se obtienen el producto final. MUESTRA JUGO DE CAA EXTRACCIN JUGO DE CAA / CLARIFICACIN ENCALADO EVAPORACIN Y CONCENTRACIN BATIDO Y ENFRIAMIENTO PANELA GRANULADA Tabla: 7 concentracin de acrilamida en los puntos crticos CONCENTRACIN ACRILAMIDA (mg/L) 0.4 0.5 0.5 0.6 0.7 0.9

5. CONCLUCIONES Se desarroll un mtodo que es confiable y permite determinar el compuesto acrilamida mediante la tcnica de Cromatografa Liquida de Alta Resolucin con detector UV. Se encontraron concentraciones de acrilamida entre 0.4 y 1mg/Kg/muestra en los diferentes lotes analizados siendo esto fuente significativa de acrilamida desde la materia prima hasta el producto final Las concentraciones encontradas superan los valores de ingesta diaria admisibles y estn dentro del rango en donde pueden causar problemas a la salud. Para evitar las barreras tcnicas al Comercio de la panela, se requiere inhibir la acrilamida presente, mediante los procesos aceptados por la comunidad cientfica. Es necesario ratificar mediante nuevas mediciones, los datos reportados en esta presentacin. Los niveles encontrados de Acrilamida en la panela, plantean una preocupacin, por cuanto estara rebasando lo permitido por la autoridad nacional.

6. REFERENCIAS

ACTA UNIVERSIDAD PEDAGGICA Y TECNOLGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE POSGRADOS MAESTRA EN QUMICA COMIT DE CURRCULO

El da ___ de ___________ de _______, el(la) seor(a) ___________________________ realiz la sustentacin pblica de su trabajo de grado titulado __________________________________. Los jurados designados segn el Artculo 36 del Acuerdo 052 de 2012, acordaron asignar una nota final del trabajo de grado igual a ______, correspondiente a la escala cualitativa de ___________ (Artculo 40 del Acuerdo 052 de 2012). Para constancia de lo anterior, firman:

______________________________ Director de Posgrados Facultad de Ciencias

_____________________________ Coordinador Programa de Maestra en Qumica

_______________________________ Jurado 1

______________________________ Jurado 2

______________________________ Director del Trabajo de Grado