Procedimiento General en el Cultivo de las Microalgas Aislamiento de la cepa La cepa, tambin llamada cultivo patrn, constituye la base de la siembra.

Al tratarse de cultivos valiosos, se aslan en medios especializados enriquecidos con nutrientes, en condiciones de riguroso control de temperatura e iluminacion. Como material alga se tiene en cuenta la variedad, Chlorella vulgaris, cepa LAUN 002, adquirida del National Center for Marine Algae and Microbiota. Para lograr el aislamiento puro de la cepa de C. Vulgaris se realizan repiques mediante la tcnica de siembra en plato de Petri en diluciones seriadas (10-3 y 104 ) preparadas en medio de cultivo Basal Bold (BBM) lquido tal como lo reporta Jimnez (2012)(VER COMO SE CITA). La verificacin de la eficacia de esta prctica se realiza a travs de su monitoreo continuo, ya sea a simple vista, mediante el uso de un microscopio o su tincin con azul de lactofenol, con el fin de detectar crecimiento fngico en la periferia o parte superior de la colonia de C. vulgaris e identificar conidios y otras estructuras del hongo. 1 Cultivo Una vez aisladas las cepas se cultivan en 100ml de medio de cultivo BBM estril a una temperatura de 20 2 C, luminosidad constante de 1750 lumen y pH= 6,6. (BAC) (Escobar, Hernndez, & Corts, 2008) en matraces cnicos de fondo plano con tapn de algodn en el cuello, aptos para un volumen de 250 ml esterilizado en autoclave. Luego se guardan en una incubadora a una temperatura entre 4 a 12 C, iluminada por 4 lmparas fluorescentes de 8 vatios (W) que proporcionan una intensidad lumnica de 450 lux calculada en la superficie del cultivo. El objetivo no es acelerar el crecimiento sino mantener los cultivos en buenas condiciones. Los cultivos no se airean ni se introduce dixido de carbono. Las cepas tambin se mantienen en la incubadora en tubos de ensayo con tapa rosca de algodn de 20 cc. EN FIN PARA Q SIRVE EL PRIMER CULTIVO??? NO QUEDA MUY CLARO Preparacin del inoculo Para la preparacin del inoculo utilizado en los sistemas de cultivo se emplea un sistema de transferencias sucesivas en recipientes de crecimiento cada vez mayor. Etapa inicial

En primera instancia se realiza un cultivo inicial en matraces de 500 ml con 250 ml de medio estril. La inoculacin de las algas se realiza cuando los matraces esterilizados han alcanzado la temperatura ambiente, transfiriendo aspticamente bajo una campana de luz UV, un volumen de 20ml de cepa al medio fresco. La boca de estos recipientes se debe flamear para matar los microorganismos que pueden ingresar al interior. Luego de la inoculacin los matraces son colocados en una estantera con iluminacin con una separacin de 15 a 20 cm. Estos cultivos deben agitarse en forma peridica y suavemente, a fin de variar la posicin de las clulas. La intensidad de luz debe estar entre 1500 y 2000 lux. Los inculos se cultivan durante perodos variables de tiempo. En el caso de estas especies, que tienen intervalos de generacin cortos, este perodo dura entre 3 y 5 das. Etapa intermedia Esta etapa se desarrolla en matraces de 2000 ml, con 1200 ml de medio de cultivo y un 5% de los cultivos iniciales que se obtuvieron en la etapa previa. Esta inoculacin se realiza bajo el mismo esquema del caso anterior evitando que las algas sedimentadas pasen al nuevo medio. Los nuevos recipientes son agitados con aire y CO2 filtrado a mximo 1mTAMAO DE LA MALLA DEL FILTRO?. La temperatura se debe mantener a 18 grados centgrados, igual que para la etapa anterior, con una intensidad de luz ajustable entre 2000 y 2500 lux, y con un periodo de permanencia de aproximadamente 72 horas. Etapa final Los cultivos intermedios a un 10% son empleados como inculo para recipientes de 20 litros. Como se procede en todas las etapas el medio enriquecido con los nutrientes se filtra a 1m y se esteriliza. Luego se flamea la boca de cada recipiente y se toman las precauciones del caso para prevenir la contaminacin, evitando adems transferir las algas sedimentadas de los cultivos intermedios. La intensidad luminosa se ajusta a 5000 lux. La temperatura se mantiene entre 18 y 20 grados centgrados, y al igual que en el caso anterior se filtra aire con dixido de carbono. Etapa de cultivo masivo En el caso de cultivos masivos se trabaja con volmenes de 2000 a 3000 litros, se opera con recipientes plsticos los cuales son iluminados en la parte superior con una alta intensidad de luz que ronda los 6000 lux. Los inculos son obtenidos de la etapa anterior que presentan un crecimiento rpido y carecen de sedimento NO PEGA ESA FRASE AH METIDA Y COMO Q NO TIENE RAZON DE ESTAR, NO

SE Q QUERES ACLARAR. En los cultivos masivos la aireacin con CO2 no es filtrada. En esta etapa se debe hacer principal hincapi en los controles y precauciones a tener, debido a que el grado de contaminacin bacteriana es la mayor en esta etapa. NO ACLARAS Q MEDIO DE CULTIVO SE USA SE USA BBM U OTRO??? GUARDA CON EL CHAMUYO EH, MIRA Q TENES Q PREPARAR 3000 LITROS DE BBM

Figura Error! No text of specified style in document.1-1: Procedimiento General en el Cultivo de las Microalgas.

Preparacin del medio de cultivo Medio Basal de Bold, recomendado para algas de agua dulce, especialmente: Chlorella Vulgaris Soluciones patrones de Macronutrientes. Compuesto (Sales) Formula Cantidad

Nitrato de Sodio Cloruro de Calcio Dihidratado Fosfato de Potasio, dibsico Fosfato de Potasio, monobsico Cloruro de Sodio

NO3Na ClCa. 2H20 PO4HK2 PO4H2K ClNa

10g/400ml 8g/400ml 3g/400ml 3g/400ml 7g/400ml 1g/400ml

Sulfato de Magnesio Heptahidratado SO4Mg.7H2O

Solucin patrn de Micronutrientes Compuesto EDTA Na2 Etilendiamintetractico Hidrxido de Potasio Agua destilada Boro Acido Brico Agua destilada Hierro Sulfato de Hierro Heptahidratado Acido Sulfrico Agua destilada Trazas Sulfato de Zinc Heptahidratado Cloruro de Manganeso Dihidratado Trixido de Molibdeno Sulfato de Cobre Pentahidratado Nitrato de Cobalto Hexahidratado Agua destilada Mtodo de preparacin: 1) Disolver cada una de las sales en 400 mL de agua destilada o desmineralizada. 2) Almacenar las 6 soluciones en frascos color mbar y en refrigeracin. SO4Fe.7H2O SO4H2 4,98g 1g en 1000ml BO3H3 11,42g en 1000ml Formula EDTA Na2 KOH Cantidad 50g 31g en 1000ml

SO4Zn.7H2O Cl2Mn.4H2O MoO3 SO4Cu.5H2O (NO3)2Co.6H20

8,8g 1,44g 0,71g 1,57g 0,49g en 1000ml

3) Preparar cada una de las soluciones de micronutrientes como se especifica en la tabla. 4) A 1000 ml de agua agregar 10 ml de cada una de las soluciones de macronutrientes y 1 ml de las soluciones de micronutrientes. 5) Ajustar el pH a 6.8-7.2 6) Esterilizar durante 15 minutos a 15 libras de presin (121 C) (folleto y composicin y preparacin de medios de cultivo)

HABRIA Q VER LOS TITULOS, XQ PONES PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO CON NEGRITA Y EL RESTO COMO SI NADA NO SE CHE NO SERIA IMPORTANTE NOMBRAR LA DENSIDAD CELULAR EN CADA ETAPA???