HUESO BOVINO COMO FUENTE DE MATRIZ SEA DESMINERALIZADA BOVINE BONE LIKE SOURCE OF DEMINERALIZED BONE MATRIX BUSTAMANTE

CANO JJ*, RIVERA POSADA J**, CANO QUINTERO W***, ROBLES ROBLES R, GONZLEZ MONTAA JR, PRIETO MONTAA F. Universidad de Len.24007. Len. E-mail: dmvjgm@unileon.es * Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Pamplona.Colombia. ** Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad de Antioquia. Colombia. *** Interkim SA. Girardota, Antioquia, Colombia. RESUMEN La matriz de hueso desmineralizado ha mostrado la capacidad de inducir la formacin de hueso en lugares ectpicos y como material de injerto seo osteoinductivo. Igualmente ha sido mezclado con diferentes transportadores de forma que permita su manipulacin durante el implante en aplicaciones que requieran recuperacin sea. La desmineralizacin del hueso, disminuye la respuesta inmune y expone los diversos factores de crecimiento de la matriz, los cuales tienen participacin directa en las funciones de osteognesis, osteoconduccin, remodelacin, realizacin y homeostasis en el microambiente celular seo. Este estudio explora un mtodo prctico que permita obtener una matriz orgnica despus de remover la fase mineral del hueso, de tal manera que aquella promueva una efectiva osteoinduccin en modelos vivos. La operacin inicial de desmineralizacin comenz con la recoleccin en matadero de huesos frescos de bovino. Posteriormente el hueso es pulverizado hasta el tamao deseado de partcula, seguido por desengrasado/desinfeccin y tratamientos de desmineralizacin con cido. Finalmente la muestra es liofilizada. La caracterizacin se realiz mediante un anlisis de espectroscopia de infrarrojos. PALABRAS CLAVE: Matriz sea, bovino, osteoinduccin. SUMMARY Demineralized bone matrix has shown the capacity to induce bone formation in ectopic places and as material of osteoinductive bone graft. It has been mixed with a carriers variety like allow different forms of manipulation for a variety of carriers that need osseous recovery. Bone demineralization diminishes the immune response and exposes the diverse factors of growth of the bone matrix, which have direct participation in the functions of osteogenesis, osteoconduction, remodelling and homeostasis in the cellular osseous microatmosphere. This study explores a method that allows to obtain an organic matrix after removing the mineral phase of the bone like it promotes an effective osteoinduction in animal models. The initial bone demineralization operation began with fresh bovine bones taked from slaughterhouse. First, bone is pulverized to the desired average particle size, followed by deffating/disinfecting and acid demineralization treatments. After the sample is liophilized and then is realized its characterization with an infrared analysis. Key words: bone matrix, bovine, osteoinduction.

INTRODUCCIN En los ltimos aos se ha prolongado la vida humana y han mejorado las perspectivas de vida animal. La sntesis de materiales biocompatibles, ha permitido reemplazar alguna parte del cuerpo cuando sta est deteriorada. La regeneracin sea es la tcnica de eleccin para reparar defectos de pequeo y mediano tamao en maxilares y huesos largos, emplendose como tratamiento complementario para la colocacin de implantes oseointegrados. An no existe un sustituto de hueso ideal, y por ello continuamente se estn realizando investigaciones. En la mayora de los casos son productos caros, lo que no permite que estn al alcance de todas las personas y menos an en la prctica veterinaria. La matriz de hueso desmineralizada es un material de injerto que promueve la formacin sea y que ha sido ampliamente usado en aplicaciones ortopdicas y odontolgicas en todo el mundo. Se ha obtenido de hueso humano, rumiante, roedor y de otras especies. Para la obtencin del hueso desmineralizado pueden seguirse varios procedimientos (Reddie et al, 1972; Concannon et al, 1997; Rabie et al, 2000; Han et al, 2005). Aunque el descrito por Concannon, resulta ser el ms prctico. El presente estudio explora un mtodo de sntesis de dicha matriz orgnica, la cual despus de verificar sus caractersticas ser utilizada para producir una pasta sea maleable (en combinacin con proteinas morfogenticas seas, colgeno e hidroxiapatita), con el fin de comprobar sus propiedades osteoinductivas en un modelo in vivo y as contribuir en la satisfaccin de las necesidades del cirujano en el campo de la ciruga plstica y ortopdica. MATERIAL Y MTODOS Como hemos indicado el mtodo propuesto por Concannon,es el ms usado para la obtencin de hueso desmineralizado. El hueso molido se desmineraliza en cido clorhdrico 0,6 N (25 meq de HCl/g de hueso) durante un periodo de tres horas realizando el cambio de la solucin cuando sta se satura. El hueso desmineralizado es entonces deshidratado en etanol al 70% durante un periodo de 10 minutos, luego se decanta, se liofiliza y se guarda a temperatura ambiente. Proponemos un mtodo similar con ligeras modificaciones que permite una mejor extraccin de los lpidos, una desalcoholizacin ms eficiente de la solucin y que adems puede ser realizado en sencillos laboratorios. A partir de huesos bovinos recogidos directamente en el matadero, se hierve el hueso para eliminar lpidos y fluidos sanguneos y posteriormente se pone a secar hasta que presente un porcentaje bajo de

humedad. Tras tener el hueso bien seco, se realiza una pretrituracin con un martillo para poder dejar el tamao adecuado para el siguiente paso. Se introduce la muestra en un molino Thomas-Willey, con intencin de lograr un tamao de partcula adecuado (no superiores a 150 m) para el siguiente paso teniendo al final un total de 80 gramos de muestra. Este tamao de partcula se define tamizando en mallas finas (micras)- (ROTAP DE MALLAS 270-240-200-150-120-80-70-40-20-10 PLATO DE RESIDUO FINAL), ya que a menor tamao de la partcula se obtiene mayor superficie de contacto con los reactivos. Luego de tener la muestra en polvo se adiciona en una solucin de cido clorhdrico 0,6 N, y se toman 3,3 litros que corresponden a la cantidad de muestra de hueso molido (80 gramos). Se dejan en homogenizacin por espacio de tres horas, iniciando con 1 litro y cada hora cambiando la solucin ya que esta se satura. En total se obtuvieron tres muestras de 1 litro respectivamente. Posteriormente se procede a deshidratar con etanol cada una de las muestras obtenidas, para ms tarde proceder a la liofilizacin a temperatura ambiente. La muestra lquida se filtra con papel filtro (Schleicher & Schuell, 125 mm 5893) y se obtiene la muestra para liofilizacin. La prueba de Soxhlet o de verificacin de grasa permite mediante extraccin con ter de petrleo y calentamiento moderado la cuantificacin de los lpidos presentes en la muestra. La cantidad de calcio presente se valor mediante absorcin atmica. El anlisis de la muestra por medio de un espectrofotmetro permite determinar las absorbancia de dicha muestra, y es realizada a 512 nm que es el adecuado para muestras slidas segn la normas. La medicin del tamao de la partcula se realiz, como hemos indicado mediante las mallas ROTAP. RESULTADOS Y DISCUSIN Los lpidos presentes en la muestra son 0,556%, cantidad muy baja, por lo que no afect al procedimiento qumico de obtencin del hueso desmineralizado. La absorbancia a 512 nm fue de 1.518 mg/g (mg de Ca(PO3)2/g de HCl 0,6 N). El calcio present valores de 2,58%. Segn Reddi (1972) la descalcificacin preferiblemente debe dar resultados menores del 10%, siendo el ideal 0,5%. No se logr descalcificacin completa, lo que a su vez puede provocar una posible interferencia en extraccin de protenas, pero est dentro del rango aceptado para su utilizacin como material osteoinductor. El tamao de las partculas se situ en 150 m. Bolander y Balian (1986) trabajaron con 100-300 m, mientras que Reddi et al (1972) con tamaos entre 74-420 m. Es preferible menor tamao de partcula (100-150 ), puesto que ello aumenta la superficie de contacto (Le Geros, 1991). Por todo lo expuesto podemos afirmar que el producto obtenido es adecuado para la produccin de pasta sea, que tras combinarse con protenas morfogenticas seas, colgeno e hidroxiapatita, pueda ser usado en osteoinduccin. La pasta as formada debe, posteriormente, ser utilizada en implantes seos in vivo.

BIBLIOGRAFA Bolander ME, Balian G. The use of demineralized bone matrix in the repair of segmental defects. Augmentation with extracted matrix proteins and a comparison with autologus grafts. The Journal of Bone and Joint Surgery, 1986; 68 (8): 1264-1274. Bowman SM, Zeind J, Gibson LJ, Hayes WC, McMahon TA. The Tensile Behavior of Demineralized Bovine cortical Bone. J. Biomechanics 1996; 29 (11): 1497-1501. Broz JJ, Simske SJ, Greenberg AR. Material and compositional properties of selectively demineralized cortical bone. Journal of Biomechanics. 1995; 28 (11): 1357-1368. Concannon MJ, Boschert MT, Puckett CL. Bone induction using demineralized bone in the rabbit femur: A long term study. Plastic and Reconstructive Surgery. 1997; 99 (7): 1983 1988. Han B, Tang B, Nimni, ME. Quantitative and sensitive in vitro assay for osteoinductive activity of demineralized bone matrix. Journal of Orthopaedic Research. 2003; 21: 648 654. Han B, Yang Z, Nimni M. Effects of moisture and temperature on the osteoinductivity of demineralized bone matrix. Journal of Orthopaedic Research. 2005; 23: 855-861. Le Geros R: Calcium phosphate biomaterials in preventive and restorative dentistry, in calcium phosphates, in RZ Legeros (ed): Oral Biology and Medicine. Basel, Switzerland, Karger, 1991: 154-192. Rabie AB, Wong R, Hgg U. Composite autogenous bone and demineralized bone matrices used to repair defects in the parietal bone of rabbits. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 2000; 38: 565570. Reddi AH, Huggins C. Biochemical sequences in the transformation of normal fibroblasts in adolescents rats. Proc. Nat. Acad. Sci. 1972; 69 (6): 1601-1605. Walsh WR, Christiansen DL Demineralized bone matrix as a template for mineral-organic composites. Biomaterials 1995; 16: 1363-1371.