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LESO E MORTE CELULAR As clulas e os tecidos esto organizados e capacitados a desempenhar funes necessrias manuteno da vida do indivduo. Dependendo do estmulo pode ocorrer a adaptao necessria, como nas clulas musculares do halterofilista ou na hiperqueratose das mos do lavrador. Como exemplo de adaptaes fisiolgicas temos a mobilizao de clcio da matriz ssea apelos osteoclastos sob a ao do paratormnio. O mesmo paratormnio, se em excesso, pode causar a chamada leso de clulas gigantes na mandbula ou maxila, que caracterizada pela presena de reas de reabsoro ssea (radiolcidas). Entretanto no h mobilizao de Ca++ dos dentes. Se o estmulo for excessivo ou txico para a clula, leses irreversveis levam a morte celular. O limite entre estmulo fisiolgico e lesivo no exato. Radiao UV pode causar estmulo para produo de melanina, formao de bolha, descamao da pele ou cncer. O termo degenerao (alterao sub-letal) refere-se a alteraes celulares que no matam a clula, deixando-as com as funes diminudas. Estas alteraes podem ser reversveis ou evoluir para a morte celular. Pode ocorrer ou no acmulo de substncias no citoplasma. Uma causa comum de degenerao celular a anxia. A clula tem quatro sistemas interdependentes que quando alterados podem levar a morte celular: 1- membranas - que mantm a homeostasia inica e osmtica da clula e das organelas. 2- respirao aerbica - fosforilao oxidativa com produo de ATP (mitocndrias). 3- sntese de protenas e manuteno do citoesqueleto. 4- DNA. As alteraes moleculares levam posteriormente s alteraes morfolgicas, que so observadas quando a leso j bastante acentuada. Assim, as clulas cardacas, que sofrem leso irreversvel em 20-60 min. aps a isquemia, apresentaro alteraes microscpicas de morte celular somente aps 12 horas. As principais causas das alteraes celulares e das doenas so: alteraes genticas, deficincias nutricionais, distrbios endcrinos, doenas imunolgicas, agentes fsicos e qumicos, infeces, anxia. Aes especficas difcil determinar o local exato de ao das substncias que causam leso celular, mas estas devem interferir em sistemas bsicos da clula, como na manuteno da integridade do DNA e das membranas, na sntese de protenas e no funcionamento das mitocndrias. Algumas substncias reagem diretamente com molculas das clulas, outras indiretamente pela formao de substncias txicas ou radicais livres. Como exemplo de ao direta temos: -Cianeto: inativa a citocromo-oxidase das mitocndrias. -Cloreto de mercrio: o Hg liga-se a grupos sulfidrila da membrana celular, causando aumento de permeabilidade, principalmente nas clulas do trato gastrointestinal (absorvem) e rins (excretam). -Clostridium perfringens: bactria anaerbia que produz fosfolipases, as quais atacam as membranas celulares. -CCl4 e o acetaminofeno: atuam indiretamente pela formao de radicais livres. Leso por isquemia A hipxia, causada por obstruo vascular ou outros mecanismos, causa alteraes celulares bem estudadas e que ilustram como ocorrem leses reversveis ou irreversveis. A sensibilidade de cada clula depende da capacidade em resistir a falta de oxignio, ATP, entrada de clcio e

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neutralizao de radicais livres. Os neurnios so muito sensveis, mas fibroblastos so extremamente resistentes. So exemplos de viabilidade celular frente a hipxia: -Neurnio - 3-5 min. -Miocrdio, hepatcitos - 10 min - 2horas -Fibroblastos, msculo esqueltico, epiderme - muitas horas. O esquema abaixo ilustra as alteraes celulares devido isquemia.

Isquemia (hipxia) Falta de O2 ATP

inibio da bomba Na/K na membrana aumento da entrada de Na edema do RER (inchao turva)

edema mitocondrial
inibio da bomba de Ca++ Ca++ entra no citosol ativao de fosfolipase reduo da sntese protica metabolismo anaerbio reduo do pH liberao de enzimas lisossmicas, ativadas em pH cido

leso de membrana entrada macia de H2O e Ca++

NECROSE

-A falta de O2 diminui a fosforilao oxidativa e ativa a gliclise. Na respirao aerbica formam-se 38 ATPs (304.000 cal.) e na gliclise apenas 2 ATPs por glicose. H acmulo de cido ltico, com diminuio do pH. -A concentrao de Na+ intracelular menor do que extracelular, enquanto que a de K+ maior. Esta diferena de concentrao devido a bomba de Na+, que um complexo de protenas dependentes de energia (ATP). Na falta de ATP, entra mais Na+ na clula, principalmente no R.E. e mitocndrias, dando clula o aspecto de inchao turva (ver tumefao celular abaixo). Os ribossomos se desprendem do RE. -A concentrao de Ca++ no citosol muito baixa, sendo este removido por bombas dependentes de ATP. Normalmente o Ca++ celular est ligado a protenas no RER e mitocndrias. A quantidade de Ca++ aumenta no citosol devido ao aumento de permeabilidade dos canais de ons clcio, alterao das membranas, diminuio de ATP e leso mitocondrial. A entrada de Ca++ na clula o ponto em comum de muitas causas de morte celular. -A maior concentrao de Ca++ ativa enzimas destrutivas como fosfolipases, proteases (membranas e citoesqueleto), ATPases (ATP), com desorganizao de membranas das organelas e dos componentes do citoesqueleto. -O Ca++ desnatura protenas, causando alteraes caractersticas da necrose por coagulao. -Os efeitos da maior concentrao de Ca++ parecem ser mediados por radicais livres.

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-A ruptura dos lisossomos libera enzimas hidrolticas, ativas em pH cido. As clulas lesadas liberam enzimas no plasma, como ocorre nas hepatites e no infarto do miocrdio. No infarto h liberao de TGO (transaminase glutmico oxaloactica), transaminases pirvicas, LDH (desidrogenase lctica), CK (creatinina quinase). -Cerca de 60 segundos aps o incio da isquemia, a clula cardaca para de se contrair, comea a usar glicognio (gliclise) com conseqente produo de cido lctico e diminuio do pH. Posteriormente sofre as alteraes acima descritas, sendo estas reversveis at 1 hora aps a hipxia. As alteraes morfolgicas sero observadas em microscopia de luz depois de 12h da morte celular. Tumefao celular (degenerao hidrpica ou vacuolar, edema celular, inchao turva) conseqncia da entrada de gua na clula devido a alterao da permeabilidade da membrana celular. O edema celular ocorre quando h alterao no equilbrio inico, com entrada de Na+, devido a diminuio na produo de energia (ATP). Fragmentos de fgado incubados com cianeto ou 2-4 dinitrofenol sofrem edema celular devido a insuficincia de ATP. As clulas tornam-se levemente granuladas e vacuolizadas. Em seguida, pelo menos in vitro, se for diminuda a concentrao de Na+ (sal), a clula perde gua e pode voltar ao normal. In vivo mais provvel que a entrada de Na+ seja resultante de leses celulares, e no simplesmente devido a maior concentrao de sal no meio extracelular. Ocorre principalmente nos rins, fgado e miocrdio. Nos rins os tbulos tm a luz diminuda e irregular, s vezes com o citoplasma arrebentado. A clula fica com volume aumentado, organelas espaadas e ncleo intacto, sem deslocamento. As clulas com ncleos plidos ou fragmentados j esto sofrendo necrose. Macroscopicamente o rim fica com peso aumentado, e o parnquima torna-se saliente quando a cpsula cortada. Em microscopia eletrnica observa-se dilatao do RE e mitocncrias. Protenas de Estresse Foi observado que as clulas quando submetidas a choques trmicos produzem protenas que protegem outras protenas de alteraes devidas aos estmulos injuriosos. Como foram inicialmente estudadas aps choque trmico (so sintetizadas em quantidades muito aumentadas aps breve exposio a temperaturas elevadas - 42oC por exemplo), foram chamadas de protenas de choque trmico ou Heat Shock Proteins (HSP). So tambm produzidas por outros estmulos fsicos (radiao), qumicos ou biolgicos (isquemia, vrus). Existem vrios tipos de HSP. As HSP 60 e 70 so chamadas de chaperonas, porque atuam se ligando a outras protenas, evitando que estas se alterem. As HSP foram descritas inicialmente em bactrias E.coli mutantes que no permitiam a replicao do bacterifago lambda (bacterifago um vrus capaz de infectar e se replicar em bactrias). Estas bactrias mutantes produziam verses alteradas de HSP 60 e 70, defeito este que impossibilitava a construo do vrus. Acreditava-se que as chaperonas atuassem somente prevenindo agregao de protenas ainda no terminadas ou enroladas ("unfolded"). Provavelmente elas tambm interagem com seus clientes, produzindo efeitos semelhantes a uma massagem nas protenas, ligando-se a regies incorretamente enroladas dando uma nova chance para que ocorra o enrolamento correto (estruturas secundria e terciria). A HSP 70 parece atuar cedo na vida das protenas, ligando-se a estas antes do trmino da sntese protica. Em contraste, a HSP 60 forma uma estrutura em barril (como uma cmara de isolamento) dentro da qual existe um meio adequado para ocorra a reorganizao da estrutura secundria e terciria das protenas incorretamente enroladas.

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Na fisiologia normal da clula, as HSP participam do transporte intracelular das protenas, como colgeno. As HSP parecem reduzir a necrose no corao isqumico, assim como proteger o crebro. As HSP so essenciais para a sobrevivncia das clulas. Seria a resposta celular semelhante ao que ocorre no organismo em situaes de estresse, quando h liberao de adrenalina. Na impossibilidade de reparao das protenas defeituosas, estas so marcadas com uma etiqueta de ubiquitina. A ubiquitina uma pequena protena composta por 76 amino cidos (massa molecular de 8.564,8 Da) expressa em todos os organismos eucariotos. Entretanto, a ubiquitina por si s no degrada protenas, servindo somente como um sinal que marca a protena-alvo para a destruio, a qual ocorre atravs do sistema ubiquitina-proteossomo de degradao protica (complexo enzimtico macromolecular que degrada protenas citoplasmticas e nucleares, tambm conhecido como proteossomo 26s). A marcao das protenas-alvo com ubiquitina ocorre atravs de uma reao complexa dependente de ATP. As clulas possuem ainda um sistema para retirar molculas de ubiquitina das protenas j marcadas, processo chamado de desubiquitinao, o qual protege da degradao protenas erroneamente ubiquitinadas. O sistema ubiquitina-proteossomo no degrada somente protenas defeituosas, mas tambm protenas que possuem um turnover rpido, como aquelas que controlam a progresso do ciclo celular (ex: p53, p21, p27), receptores de superfcie (EGFR, c-erb B2), enzimas metablicas, dentre outras. Corpsculos de Incluso Clulas que sofrem estresse crnico podem formar agregados de protenas no citoplasma, chamados de corpsculos de incluso. Hepatcitos expostos ao lcool formam massas de filamentos intermedirios, de colorao rsea nos cortes corados em H&E, chamado de corpsculo hialino de Mallory. Na doena de Parkinson formam-se incluses esfricas de aspecto hialino como halo claro nos neurnios, chamados de corpos de Lewy. Na doena de Alzheimer, os neurnios apresentam um novelo neurofibrilar de microtbulos e neurofilamentos. As incluses virais indicam replicao viral, mas os vrus podem j ter deixado as incluses. -Vrus herpes (HSV 1,2, V-Zoster, CMV, EBV) - incluses nucleares. -Papovavirus- Papiloma vrus e vrus JC (human polyoma vrus, causador de uma doena desmielinizante rara, chamada leucoencefalopatia progressiva multifocal) - incluses nucleares. -Poxvirus- molusco contagioso- no citoplasma. Atrofia Celular e Autofagia Quando o estmulo nocivo a clula pode atrofiar. Protenas e organelas so envolvidas por membranas derivadas do RER, que se fundem com lisossomos, causando degradao das organelas. Clulas em atrofia podem mostrar vacolos autofgicos em microscopia eletrnica, como corpos densos, lamelares (figuras de mielina), devido as membranas ricas em fosfolpidios no digeridos (corpos residuais), chamados de lipofuscina. A lipofuscina facilmente observada em clulas cardacas de idosos em microscopia de luz, como grnulos amarelos. Macroscopicamente o corao tem colorao marrom, chamado de atrofia parda. Radicais livres Radicais livres so espcies qumicas bastante reativas, consequentemente instveis, que tm um eltron no pareado na rbita mais externa. Nas clulas, a principal fonte de radicais livres a mitocndria, oriundos dos processos oxidativos da respirao. Tambm so formados no citosol, lisossomos, RE e membranas, pela ao de enzimas como citocromo P-450 e xantina

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oxidase. Os principais radicais livres no organismo so derivados do oxignio: nion Superxido O2 e on hidroxila OH. H2O2 oxidante e fonte importante de radicais livres. O radical hidroxila parece ser o mais importante na clula. O xido ntrico tambm pode agir como radical livre. Formao dos radicais livres: -reaes de xido-reduo- o oxignio respirado usado na mitocndria para formao de gua, CO2 e ATP. Os eltrons liberados no ciclo de Krebs formam nions superxidos. Na presena de Fe, pela reao de Fenton formam nion hidroxila, que extremamente reativo, reagindo imediatamente com protenas, lipdios e DNA. O radical hidroxila pode ser formado pela reao de Fenton, por radiao UV ou pela reao de Haber-Weiss Reao de Haber-Weiss- H2O2 + O2 OH + OH + O2 -Ferro livre- O Fe livre pode catalisar reaes que formam radicais livres, na chamada reao de Fenton. Fe++ + H2O2 Fe+++ + OH + OHIrradiao- RX, UV - H2O H + OH

-Xantina oxidase- a xantina um metablito do ATP, que se acumula em clulas com hipxia. Quando oxidada pela xantina oxidase gera oxignio reativo. Durante a isquemia no h formao de radicais reativos de oxignio. Quando a oxigenao restabelecida, grandes quantidades de radicais se formam nas mitocndrias atravs da xantina oxidase, podendo ocorrer a necrose por re-perfuso. Allopurinol, inibidor da xantina oxidase, tem sido usado clinicamente para limitar a necrose cardaca aps infarto do miocrdio. -Neutrfilos- a destruio de bactrias pelos neutrfilos envolve radicais livres derivados do oxignio. Tetracloreto de carbono- radicais livres so produzidos como produtos intermedirios no metabolismo de substncias txicas como o tetracloreto de carbono (CCl3 + Cl- ). O CCl4 metabolizado no REL dos hepatcitos, iniciando a peroxidao lipdica, com degradao das membranas celulares e edema do RE visvel em microscopia eletrnica aps 2 h. Efeitos dos radicais livres: -Mitocndrias - podem causar liberao de Ca++ para o citosol. -DNA- estima-se que o DNA da clula humana est exposto a 10.000 hits oxidativos por dia. A oxidao do DNA mitocondrial maior porque est prximo de onde o radical livre formado em grandes quantidades. Alm do mais, o DNA mitocondrial no tem histonas, que se ligam e protegem o DNA nuclear. O DNA mitocondrial transcreve cerca de 10 protenas, necessrias s funes da prpria mitocndria. Sugere-se que a alterao do DNA mitocondrial leva a diminuio de produo de energia, e isto seria uma das causas do envelhecimento. -Altera protenas das bombas inicas. -Peroxidao de lipdios- desorganizao de membranas (a reao autocataltica, com a molcula atacada tornando-se ativa, formando uma cadeia de reaes).

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-Admite-se que radicais livres participam da aterosclerose, cncer e envelhecimento. Inativao dos radicais livres: Antioxidantes: vitamina E e -caroteno. So lipossolveis e protegem membranas. Enzimas: -Superxido desmutase- transforma superxido em perxido de hidrognio. -Catalase, glutationa peroxidase - transformam o perxido de hidrognio em oxignio e gua. A glutationa peroxidase catalisa a liberao de H do grupo SH da glutationa reduzida (GSH), que reage com OH ou H2O2. 2 GHS + 2 OH 2 GHS + H2O2 H2O + GS-GS 2H2O + GS-GS

-Transferrina - se liga a Fe livre, inibindo a reao de Fenton. Esquema da formao dos principais radicais livres na clula.

O2
RE M

oxidao enzimas do citosol

oxidase p-450

NADPH oxidase

oxidase
SOD

O2 +O2

O2 Fe++ Fe+++ O2 + H2O2 OH catalase

H2O

H 2O2

Em resumo, o radical livre oxida molculas de DNA, protenas e lipdios, num processo comparvel ao da ferrugem. Que tal o ditado estou enferrujado? Leso sub-letal - (inchao turva) -edema mitocondrial -edema do RE -perda de ribossomos -resposta de estresse -autofagia de organelas e protenas alteradas

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Morte celular -perda de nuclolo -perda de ribossomos -edema mitocondrial e RE mais intensos -ruptura de lisossomos -fragmentao de membranas -alterao nuclear- picnose, carilise, cariorrexe Obs. edema mitocondrial a alterao inicial, sendo parmetro de fixao em microscopia eletrnica de transmisso. Leso celular por vrusQuanto a forma de causar alteraes celulares, os vrus so classificados em citopticos e oncognicos. Os citopticos se multiplicam dentro da clula, usando toda a maquinaria gentica desta para sua prpria replicao. Neste caso, a clula hospedeira destruda pelo vrus ou por mecanismos imunolgicos, como ocorre na hepatite, AIDS, herpes. Os oncognicos modificam o genoma celular, integrando-se a este e replicando-se juntamente com todo o genoma da clula hospedeira, podendo facilitar a formao de uma clula neoplsica, dependendo do lugar onde se insere.

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Objetivos - Leso Celular. l. Comente as diferentes respostas da pele pela ao da radiao UV. 2. Cite os quatro sistemas principais da clula, que quando alterados podem levar morte celular. 3. Comente porque as clulas cardacas observadas em microscopia de luz, no mostram alteraes morfolgicas, num indivduo que morreu de infarto fulminante. 4. Explique como o cloreto de mercrio lesa as clulas, e cite que clulas so alteradas in vivo. 5. Esquematize e explique os efeitos da hipxia na clula. 6. Explique a participao do Ca na leso celular. 7. Comente a liberao de enzimas no plasma em casos de hepatite e infarto do miocrdio. 8. Explique que so bombas de Na e Ca? 9. Descreva os aspectos morfolgicos da tumefao turva, em microscopia de luz e eletrnica. Pode usar o exemplo dos efeitos do dinitrofenol no rim ou fgado. 10. Conceitue protenas de choque trmico (heat shock proteins) e como atuam nas clulas que sofreram estmulo lesivo. 11. Conceitue e exemplifique corpsculos de incluso. 12. Que so incluses virais. 13. Que lipofuscina, como se forma e qual o aspecto em microscopia de luz e eletrnica? 14. Quais as conseqncias do acmulo de lipofuscina nas clulas cardacas? 15. Conceitue radical livre. 16. Quais so os radicais livres derivados do oxignio? 17. Justifique porque aps um infarto do miocrdio o uso de um inibidor da xantina oxidase por limitar a necrose celular. 18. Explique como o tetracloreto de carbono pode causar leses nos hepatcitos. 19. Por que DNA mitocondrial mais vulnervel a ao de radicais livres, do que o DNA nuclear? 20. Que so antioxidantes? 21. Por que a transferrina considerada antioxidante? 22. Faa uma analogia entre a ao dos radicais livres nas clulas e o processo de ferrugem. 23. Cite as alteraes celulares aps um estmulo sub-letal (o aspecto microscpico de inchao turva). 24. Cite as alteraes observadas na morte celular. 25. Comente como os vrus citopticos e oncognicos atuam nas clulas.