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DETECCINES DE LA EXPRESIN DE CITOQUINAS MEDIANTE RT-PCR EN TIEMPO REAL EN GANADO OVINO CYTOKINES GENE EXPRESSION DETECTION BY REAL TIME RTPCR IN SHEEP
Ana Cristina Prez de Diego Camacho, Almudena Snchez Matamoros, Jos Manuel Snchez-Vizcano Rodrguez Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET) Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria.UCM. RESUMEN Las citoquinas son molculas proteicas secretadas por diferentes clulas, fundamentalmente del sistema inmunitario, como respuesta a una estimulacin inmunolgica. Existen diferentes tcnicas para estudiar la produccin y accin de stas en los individuos. Este estudio consiste en la puesta a punto de una tcnica de Retrotranscripcin- Reaccin en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en tiempo real para la deteccin de la expresin del ARNm que codifica seis citoquinas (TNF-, IFN, IL-4, IL2, IL-10, IL-12). Los resultados preliminares se obtuvieron tras la aplicacin de la tcnica a linfocitos estimulados in vitro con ConA (Concanavalina A) y LPS (Lipopolisacrido de E.coli) demostrando la deteccin de ARNm para IL-4, IL-2 e IFN y TNF-, IL-12 e IL-10, respectivamente; posteriormente se realiz el estudio en ovejas inmunizadas frente a Chlamydophyla abortus, permitiendo la deteccin de la expresin de ARNm de las seis citoquinas. Estos resultados demuestran que es una tcnica rpida, sensible y fiable para la deteccin de citoquinas. Palabras clave: Citoquinas, RT-PCR, ovino ABSTRACT Cytokines are protein molecules that cells from the immune system secrete in response to immune stimulation. There are different techniques to study their production and their action on individuals. This study consists of the development of a real time RT-PCR method for the detection of the expression of mRNA coding for six cytokines (TNF-, IFN, IL-4, IL2, IL10, IL-12). The preliminary results were obtained from the study of lymphocites stimulated with Con A and LPS, showing the detection of ARNm, IL-4, IL-2, IFN and TNF-, IL-12, IL-10, respectively. Its subsequent application in sheep that were vaccinated against Chlamydophila abortus, allowed the detection of mRNA expression for the six cytokines.

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These results show that it is a swift, sensitive and reliable technique to detect mRNA of cytokines. Keywords: Cytokines, real time RT-PCR, sheep. INTRODUCCIN Las citoquinas son molculas proteicas de bajo peso molecular (15-30 KDa) secretadas por diferentes clulas, fundamentalmente del sistema inmunitario, como respuesta a una estimulacin inmunolgica (Giulietti et al., (2001). Atendiendo a su funcin ms relevante, las citoquinas se pueden dividir en aquellas que estn involucradas en el desarrollo hematopoytico, o bien aquellas implicadas en la respuesta inmunitaria, tanto innata como adaptativa, habiendo sido elegidas para nuestro estudio seis citoquinas relacionadas con la respuesta inmunitaria. Existen diferentes tcnicas para estudiar la produccin y accin de las citoquinas en el individuo; este trabajo consiste en la puesta a punto de una tccnica de RetrotranscripcinReaccin en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en tiempo real para analizar la expresin de genes que codifican las citoquinas: TNF-, IFN, IL-4, IL2, IL-10 e IL-12, siguiendo parcialmente la tcnica descrita por Konnai et al. (2003). La RT-PCR como tcnica de biologa molecular permite la deteccin y cuantificacin de un fragmento de ARN determinado en una muestra; esta deteccin a tiempo real se consigue mediante una sonda SYBR GREEN que se une al ADN de doble cadena y emite fluorescencia. En este caso, hemos realizado esta tcnica de forma similar a la descrita por Kukielka et al.(2008). Una vez realizada la puesta a punto de esta tcnica mediante el anlisis de linfocitos estimulados in vitro, fue adaptada para la evaluacin de animales de la especie ovina vacunados frente a clamidiosis, con el fin de aplicarla posteriormente en el seguimiento de diferentes inmunizaciones y enfermedades. MATERIAL Y MTODOS Origen de los linfocitos: A. Puesta a punto de la tcnica: Los primeros ensayos se realizaron con linfocitos estimulados in vitro obtenidos de sangre de 12 ovejas adultas de raza Rubia del Molar procedente de vena yugular recogida en tubos con anticoagulante (EDTA).

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B. Validacin de la tcnica: Se realiz extrayendo ARNm directamente de sangre recogida con anticoagulante (EDTA) de 4 ovejas adultas de raza Churra a las que se haba vacunado frente a clamidiosis previamente para estimular su sistema inmunitario.

Obtencin de linfocitos y su estimulacin A. Puesta a punto: La obtencin de linfocitos se realiz por gradiente de densidades con HISTOPAQUE-1077 (Sigma-aldrich), tcnica que permite la separacin de clulas mononucleares de sangre perifrica, comprobando despus su viabilidad mediante la tincin con azul tripn. Una vez separados los linfocitos y tras la realizacin del recuento, se ajust la concentracin a 2 - 5 millones /ml (dependiendo de la muestra y el estado del estudio) usando el medio de cultivo RPMI1640 (Gibco) especfico para clulas sanguneas. De esta solucin siempre se cultivan 100 l /pocillo, lo que supone entre 200.000 y 500.000 linfocitos, y posteriormente fueron estimulados con mitgenos (Concanavalina A, Lipopolisacrido de Escherichia coli) para favorecer la 1.
Tabla 1. Mitgenos utilizados para estimulacin junto con las concentraciones y tiempos de cultivo, que fueron probados a lo largo del estudio. Con A: Concavalina A; LPS: Lipopolisacrido de Escherichia coli. MEZCLA MITOGENO CONCENTRACION (ug/ml) TIEMPO Con A LPS Con A 5 10 10 LPS 5 10 5

produccin de citoquinas. Los mitgenos fueron usados a distintas

concentraciones y durante diferentes periodos de tiempo de cultivo, segn se indica en la tabla

0,5

10

15

10

15

16h, 24h y 48h 24h

Extraccin de ARNm A. Puesta a punto: Linfocitos estimulados Inicialmente para la extraccin de ARNm se procedi al uso del reactivo TRIZOL. Otro mtodo utilizado fue mediante el uso del RNeasy Mini Kit (Quiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante.Tras la extraccin del ARN se proceda a la destruccin del ADN mediante el uso de RNase-Free DNase Set (Quiagen ). B. Validacin de la tcnica: Sangre

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En esta fase slo se realiz mediante el RNeasy Mini Kit (Quiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante para sangre completa. Posteriormente se realiz la destruccin del ADN, mediante el uso de RNase-Free DNase Set (Quiagen ).Como valor indicativo aproximado de la cantidad de ARN empleada para la RT-PCR se calcul la concentracin mediante espectrofotometra (Sambrook y Russell, 2001).

RT-PCR A. Puesta a punto: Las primeras pruebas de la puesta a punto de la tcnica se realizaron en un paso, utilizando el Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit (Stratagene), ste incluye todos los componentes necesarios para llevar a cabo la sntesis de copias de ADN a partir del ARNm en un nico tubo (buffer, MgCl2, Nucletidos, SureStarTaq polimersa, SYBR Green, Transcriptasa reversa), salvo los cebadores y la muestra. Los cebadores se obtuvieron de estudios anteriores(Tabla 2).
Tabla 2. Primers empleados para la deteccin de citoquinas y genes de expresin constante (GAPDH, B-actina) utilizados en el estudio, indicando la cantidad utilizada, la longitud del producto, la temperatura de anillamiento as como la referencia bibliogrfica de los estudios anteriores en los que se probaron estos primers.
Gen GAPDH - Actina TNF- IL- 10 IL12 IFN IL- 2 Il-4 Secuencia de primers (5-3) Concentracin F: ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT 100 nM R: CAT GCC AGT GAG CTT CCC GTT F: CGC ACC ACT GGC ATT GTC AT 100 nM R:TCC AAG GCG ACG TAG CAG AG F: GAA TAC CTG GAC TAT GCC GA 100 nM R: CCT CAC TTC CCT ACA TCC CT F: TGC TGG ATG ACT TTA AGG G 400 nM R:AGG GCA GAA AGC GAT GAC A F: AAC CTG CAA CTG AGA CCA TT 400 nM R: ATC CTT GTG GCA TGT GAC TT F: GCT TTA CTG CTC TGT GTG CT 100 nM R: GAC TTC TCT TCC GCT TTC TG F: TTT TAC GTG CCC AAG GTT AA 400 nM R: CGT TTA CTG TTG CAT CAT CA F: GCC ACT TCG TCC ATG GAC AC 100 nM R: TTC CAA GAG GTC TCT CAG CG Producto (pb) 153 227 238 186 186 442 217 311 T de anillamiento 60C 55C 60C 55C 55C 60C 55C 60C Referencia Gohin et al. (1997) S. Konnai et al. (2003) Smeed et al. (2007) S. Konnai et al. (2003) S. Konnai et al. (2003) Gohin et al. (1997) S. Konnai et al. (2003) Gohin et al. (1997)

La muestra inicial consisti en 0,3- 2 g. de ARNm procedente de linfocitos estimulados. A esta muestra se le aade: Master mix de la QRT-PCR, la enzima RT (Retrotranscriptasa), responsable de la transcripcin de ARNm a ADNc (ADN complementario), en las cantidades indicadas por el fabricante y los cebadores en las concentraciones que encontramos en la tabla 2. El termociclador utilizado para la RT-PCR fu el modelo Mx3000p (Stratagene).Los programas a los que fueron sometidas las muestras se exponen en la tabla 3.

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Tabla 3 Programas de ciclos a los que se sometieron las muestras de ARN para la realizacin de la RT-PCR en un paso. CICLOS 1 1 45 1 PASO Retrotranscriptasa inversa (RT) Desnaturalizacin Replicacin del ADN Elongacin DURACIN 30 minutos 10 minutos 45 segundos 40 segundos 30 segundos 7 segundos TEMPERATURA 48 95 95 55: IL2, IL10, IL12 60: TNF-, IFN, IL4 72 72

Tras la RT-PCR se realiz una curva de disociacin que comienza a 65C hasta alcanzar los 95C, para asegurar que el resultado positivo se corresponde con el fragmento deseado y no se trate de dmeros de cebadores o bien de fragmentos inespecficos. Los resultados positivos fueron secuenciados. Posteriormente se procedi a la realizacin de la puesta a punto en dos pasos. El primer paso consisti en la transcripcin inversa del ARN que da lugar a la sntesis de ADNc, mediante el uso de AffinityScript QPCR ADNc Synthesis Kit (Stratagene), realizndose la retrotranscripcin incubando durante 5 minutos a 25C para permitir el anillamiento de los oligo cebadores, 15 minutos a 42, lo que se corresponde con la fase de sntesis del ADNc y finalmente 5 minutos a 95 para terminar la reaccin de transcripcin inversa. Tras la obtencin del ADNc, se procedi a realizar el segundo paso, que se corresponde con la PCR, mediante el uso del Brillant II SYBR Green QPCR mix, que contiene todos los componentes necesarios para la amplificacin del ADNc. Los cebadores utilizados y las condiciones de uso para la PCR son las citadas para la RT-PCR en un paso. En este caso, el programa utilizado para la PCR que se muestra en la tabla 4 carece del ciclo correspondiente a la retrotranscripcin.
Tabla 4. Programas para las PCR de las muestras sometidas a una RT previa en otro paso. CICLOS 1 45 1 PASO Desnaturalizacin Replicacin del ADN Elongacin DURACIN 10 minutos 45 segundos 40 segundos 30 segundos 7 segundos TEMPERATURA 45 95 55: IL2, IL10, IL12 60: TNF-, IFN, IL4 72 72

Para la obtencin de la curva de disociacin de la muestra se procedi del mismo modo que en el proceso en un paso. B. Validacin de la tcnica:

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La validacin de la tcnica, es decir, el anlisis de las muestras de sangre de 4 ovejas churras vacunadas, se realiz con el protocolo en dos pasos. RESULTADOS La realizacin de la extraccin de ARN en linfocitos estimulados in vitro fue satisfactoria, tanto con el uso del reactivo TRIZOL como del RNeasy Mini Kit (Quiagen). Este ltimo fue el elegido para la extraccin en sangre obtenindose ratios de pureza de ARN cercanos a 1,8 mediante espectofotometra. Los genes de expresin constante, utilizados en este estudio como referencia, fueron GAPDH y -Actina, los cuales fueron detectados por PCR tanto en la puesta a punto en muestras de linfocitos estimulados y no estimulados in vitro, como en las muestras de sangre procedentes de ovejas vacunadas frente a clamidiosis. En los casos en los que los linfocitos procedentes de sangre perifrica, fueron estimulados mediante el uso de Con A como mitgeno, se pudo detectar mediante las PCRs desarrolladas en este trabajo la presencia del ARNm para IL-4, IL-2 e IFN. La estimulacin con LPS dio lugar a resultados positivos para las PCRs diseadas con el objetivo de amplificar regiones del ARNm origen de TNF-, IL-12 e IL-10. Finalmente, la estimulacin conjunta con concentraciones de 10 g/ml de Con A. y 5 g/ml de LPS permiti la deteccin mediante RT- PCR de todas las citoquinas estudiadas (Figuras 1 y 2).

500 pb

500 pb

242pb 147 pb GAPDH 153 pb IL-4 311 pb TNF 228 pb -actina 227 pb IL-2 217 pb IL-10 186 pb IL-12 186 pb

242pb 147 pb

Figura 1. Imagen de un gel realizado con los productos de RT-PCR en tiempo real para GAPDH, IL4, TNF-, Actina, IL-2, IL-10, IL-12. Linfocitos estimulados con Con A y LPS.

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B
Dimero de primers

IFN-

IFN-

Control negativo

Figura 2. RT-PCR en tiempo real, para la deteccin de ARNm de IFN-. a) Muestras estimuladas con ConA y LPS. b) Imagen de la curva de disociacin para IFN-.

La RT-PCR realizada tanto en un paso como en dos, permiti la elaboracin de dos programas de PCR, los cuales se diferenciaban nicamente en la temperatura de anillamiento; realizndose en un caso a 55C (-Actina, IL 2, IL 10 e IL 12) y en otro a 60C (GAPDH, IL 4, TNF- e IFN), obtenindose resultados positivos que posteriormente se secuenciaron y presentaron homologa con las secuencias de ARNm que codifican citoquinas en ovino publicadas en las bases de datos, del 99% - 100%. En la fase de validacin, utilizando como muestra el ARN procedente directamente de la sangre de animales vacunados, la tcnica permiti detectar la expresin de ARNm de las seis citoquinas (Figura 3).
TNF-

INF-

Figura 3. Ejemplo de RT-PCR en tiempo real, para TNF e IFN con muestras de sangre de ovejas vacunadas.

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DISCUSIN La eleccin de la extraccin de ARN en linfocitos estimulados in vitro mediante el mtodo RNeasy Mini Kit (Quiagen) para la puesta a punto y nica tcnica utilizada en sangre, se debe a que esta tcnica facilita el tratamiento posterior de destruccin de ADN, el cual se realizaba tras la extraccin del ARN. Este paso es fundamental en este protocolo, ya que evita la contaminacin genmica de la muestra, mediante la digestin del ADN presente, consiguiendo mantener nicamente el ARN. Las cantidades de ARN utilizadas, a pesar de ser medidas mediante espectrofotometra, han sido variables a lo largo del experimento, puesto que el objetivo inicial del trabajo no era la cuantificacin, si no la puesta a punto de la RT-PCR cualitativa. Por lo que en esta fase del mtodo no ha representado un problema para la interpretacin de los resultados. En la fase de puesta a punto de la tcnica, la estimulacin con 10g/ml de Con A dio como resultado la expresin de genes de IL-4, IL-2 e IFN, como se indica en los resultados. Estos resultados se corresponden parcialmente con lo esperado, puesto que estudios previos de Gohin et al. (1997) indicaban que para la produccin de estas citoquinas era necesaria la utilizacin de Con A (7,5 g/ml) junto con Phorbol Triacetate (5 ng/ml); sin embargo, en este caso la utilizacin de Con A ha sido suficiente. Para la obtencin de TNF- e IL-10, Gohin et al.(1997) usaban como mitgeno el LPS (10 g/ml), coincidiendo con los datos obtenidos en el presente trabajo. Se ha conseguido detectar, y por tanto estimular, la produccin de IL12, mediante el uso de Con A y LPS, sin la necesidad de emplear otros mitgenos utilizados en estudios previos como el pokweed mitogen (Konnai et al, 1994). En cuanto a los cebadores, cabe destacar que en este estudio se han adaptado los ya publicados para PCR convencional (Gohin et al.1997) en la tcnica de PCR en tiempo real, optimizndose las concentraciones y las temperaturas para disminuir el trabajo laboratorial en la medida de lo posible, hasta conseguir resultados satisfactorios para las seis citoquinas, utilizando solamente dos temperaturas de anillamiento diferentes, pudiendo as utilizar un mismo programa para la PCR de tres citoquinas simultneamente. Existen estudios previos para la deteccin de expresin de genes de citoquinas que se realizan mediante el uso de sondas Taqman (Budhia et al., 2006), pero no mediante SYBR Green para el estudio de las seis citoquinas cuya expresin se detecta en este trabajo, el cual presenta las ventajas de no tener que disear una sonda especfica y es una tcnica mucho ms econmica. Se realizaron RT-PCRs en uno paso y dos pasos, obtenindose resultados positivos. Se comenz mediante la tcnica en un paso porque sta minimiza la contaminacin de la muestra de ARNm, al ser manipulada una sola vez, y porque los protocolos de esta tcnica ya se
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empleaban con xito por nuestro equipo (Kukielka et al., 2008). Tras la obtencin de los primeros resultados positivos con la tcnica anterior, se procedi a la realizacin en dos pasos, ya que nos permite realizar con la misma cantidad de ARNm inicial hasta 10 veces ms PCRs que la tcnica en un paso. La RT-PCR en tiempo real mediante una sonda SYBR GREEN ha resultado apropiada, comparando los productos de PCR con las secuencias publicadas en las bases de datos. Las puestas a punto de las PCRs para GAPDH y -Actina, sern la herramienta vlida para la cuantificacin, actualmente en desarrollo en nuestro laboratorio. La tcnica puesta a punto en este trabajo fue probada, mediante el anlisis de sangre de animales con el sistema inmunitario activo tras la vacunacin para clamidiosis, lo que supone que, a su vez, ser una herramienta til, para la descripcin de la evolucin de estas citoquinas en respuesta a enfermedades o vacunas. CONCLUSIONES La RT-PCR en tiempo real parece ser una herramienta til para el estudio de la expresin de ARNm que codifica citoquinas de un modo rpido, sensible y fiable a partir de sangre de animales con un sistema inmunitario activo. La tcnica puesta a punto en este estudio, permite detectar la expresin de seis citoquinas realizando slo dos programas diferentes de PCR. El protocolo estandarizado incluyendo los dos genes de expresin constante (GAPDH, Bactina) permitir cuantificar la expresin gnica de las citoquinas objeto de este estudio. AGRADECIMIENTOS Este ensayo ha sido financiado gracias al proyecto europeo BTVAC FP6-2005-SSP-5A. AC. Prez de Diego, disfruta de una beca del programa FPU del Ministerio de Educacin y Almudena Snchez Matamoros de una beca de colaboracin en el Departamento de Sanidad Animal. Los autores muestran su agradecimiento a la Dra. Beln Rodrguez, y a las tcnicos Beln Rivera y Roco Snchez, por su dedicacin y colaboracin en este estudio, y a la Asociacin Nacional de Ganado selecto Churro (ANCHE), por el envo de muestras de sangre de animales vacunados.

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