Aislamiento de Levaduras

AISLAMIENTO DE LEVADURAS CAPACES DE PRODUCIR ALCOHOL A PARTIR DE
MACROFITAS ACUATICAS EXTRAIDAS MECANICAMENTE DE LA LAGUNA DE

FQUENE
MELISSA VANEGAS
MONICA ZAPATA PINEDA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTA DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogot D.C
FQUENE
MELISSA VANEGAS
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al titulo de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
FACULTA DE CIENCIAS
Bogot D.C
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
catlica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien
se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.
FQUENE
MELISSA VANEGAS
APROBADO
Patricia Martnez Nieto Jorge Robles Camargo
Directora Codirector
Fundacin Humedales Pontificia Universidad Javeriana

Henry Crdoba Erika Patricia Martnez
Pontificia Universidad Javeriana CORPOICA
FACULTA DE CIENCIAS
Bogot D.C
FQUENE
MELISSA VANEGAS
APROBADO
Ingrid Schuler Ph.D Janeth Arias Palacios MSc
Decana Acadmica Directora de Carrera
FACULTA DE CIENCIAS
Bogot D.C
AGRADECIMIENTOS
A nuestros padres por su apoyo
A la Fundacin Humedales por permitirnos realizar el proyecto
A la Pontificia Universidad Javeriana en especial a la facultad de qumica por permitirnos el uso
de los laboratorios y los reactivos necesarios para el desarrollo del proyecto.
A nuestra directora Patricia Martnez y codirector Jorge Robles por la colaboracin durante la
realizacin de esta investigacin.
A Elizabeth Gil por la colaboracin prestada en algunos ensayos realizados.
Al Dr. Jaime Bernal por su asesora.
Al Hospital San Ignacio por permitirnos realizar la prueba de identificacin de levaduras.
Y a todas las personas que de una u otra forma hicieron parte de este proyecto y lograron su
realizacin.
TABLA DE CONTENIDO

Pg.
1. Introduccin 1
2. Justificacin y planteamiento del problema 2
3. Marco terico 3
3.1. Laguna de Fquene 3
3.2. Problema ambiental 3
3.3. Macrfitas contaminantes de la Laguna de Fquene 3
3.3.1 Elodea (Egeria Densa) 3
3.3.2 Buchn de Agua (Eichhornia Crassipes) 4
3.3.3 Alternativas de disposicin de las macrfitas 4
3.4 .Bioetanol 5
2.4.1. Produccin de bioetanol 5
3.5. Hidrlisis 5
3.5.1. Hidrlisis qumica 6
3.5.1.1. Hidrlisis con cidos concentrados 6
3.5.1.2. Hidrolisis con cidos diluidos 6
3.6.1.3. Hidrlisis enzimtica 6
3.6. Fermentacin de los azcares 7
3.7. Cuantificacin de etanol 7
4. Objetivos 8
4.1. Objetivo general 8
4.2. Objetivos especficos 8
5. Metodologa 9
5.1. Muestreo 9
5.2 Aislamiento de levaduras 9
5.3 Hidrlisis 9
5.3.1 Hidrlisis acida con cido sulfrico o peractico 9
5.3.2 Hidrlisis mixta 9
5.3.3 Hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio 10
5.3.4. Hidrlisis biolgica con Pleurotus ostreatus 10
5.3.5. Azucares reductores 10
5.3.6. Anlisis de datos 10
5.4. Determinacin de la produccin de etanol 10
5.4.1. Prueba de yodoformo 10
5.4.2. Determinacin semi-cuantitativa de etanol por la 11
tcnica del dicromato de potasio
5.4.3. Cromatografa de gases acoplada a masas 11
5.5. Caracterizacin taxonmica preliminar de las levaduras 11
6. Resultados y discusin 12
6.1. Muestreo y aislamiento 12
6.2. Hidrlisis 12
6.2.1. Hidrlisis acida con cido sulfrico o peractico 12
6.2.2. Hidrlisis mixta 14
6.2.3. Hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio 14
6.2.4. Hidrlisis biolgica con Pleurotus ostreatus 16
6.3. Determinacin de la produccin de etanol 19
6.3.1. Prueba de yodoformo 19
6.3.2. Determinacin semi-cuantitativa de la produccin
de etanol por la tcnica del dicromato de potasio 19
6.3.3. Cromatografa de gases acoplada a masas 22
6.4. Caracterizacin taxonmica preliminar de las levaduras 24
7. Conclusiones 26
8. Recomendaciones 27
9. Bibliografa 28
10. Anexos 37
LISTA DE FIGURAS
Pg.

Figura 1. Concentacin de azucares obtenidos en la hidrlisis
con diferentes mezclas de cido sulfurico y tratamietnos
de buchon (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos 12
Figura 2. Concentacin de azcares reductores en la hidrlisis
con diferentes mezclas de cido sulfurico y tratamientos
de elodea (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos 13
Figura 3.Concentracin de azcares reductores obtenidos en la
hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio al 5% en buchn con
diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos 15
Figura 4. Concentracin de azcares reductores obtenidos en la
Hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio al 5% en elodea
con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos 15
Figura 5. Concentracin de azcares reductores obtenidos en
la hidrlisis biologica con Pleurotus ostreatus en buchn utilizando
diferentes Concentraciones del hongo durante 13 das de incubacin 16
Figura 6. Concentracin de azcares reductores obtenidos en
la hidrlisis biologica con Pleurotus ostreatus en elodea utilizando
diferentes Concentraciones del hongo durante 13 das de incubacin 17
Figura 7. Concentracin de etanol producida por las levaduras escogidas
en el diseo in vitro con buchn durante 48 horas de incubacin de forma
semi-cualitativa por el ensayo del dicromato 20

Figura 8. Concentracin de etanol producida por las levaduras escogidas
en el diseo in vitro con elodea durante 48 horas de incubacin de forma
semi-cualitativa por el ensayo del dicromato 21
Figura 9. Cromatograma de la produccin de etanol con la
levadura 30 en el medio hidrolizado con Pleurotus ostreatus,
con un tiempo de retencin 1.48 minutos 23
Figura 10. Cromatograma de la produccin de etanol con la
levadura 23a en el medio sin hidrlisis, con un tiempo de
retencin 1.48 minutos 24
LISTA DE TABLAS

Pg.

Tabla 1. Comparacin estadstica de los mejores tratamientos de
hidrlisis acida, alcalina con NaOH 5% con las otras hidrlisis
qumicas y con la biolgica en buchn 18
Tabla 2. Comparacin estadstica de los mejores tratamientos
de hidrlisis acida, alcalina con NaOH 5% con las otras hidrlisis
qumicas y con la biolgica en elodea 18

Tabla 3. Identificacin preliminar de las levaduras escogidas como
mejores productoras de etanol por el mtodo del yodoformo 25
LISTA DE ANEXOS
Pg.
Anexo 1. Composicin de los medios de cultivo utilizados
durante la fase experimental 37
Anexo 2. Curva patrn para al determinacin de azucares
reductores por el mtodo del cido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) 39
Anexo 3. Curva patrn para la determinacin de etanol por
el mtodo del dicromato de potasio 41
Anexo 4. Aislamiento de levaduras en cada medio de cultivo
utilizado en la investigacin 44
Anexo 5. Crecimiento de las levaduras escogidas en los
medios hidrolizados y sin hidrlisis biolgica 45
Anexo 6. Anlisis estadstico de los tratamientos de
hidrlisis acida (H
2
SO
4
) 47
Anexo 7.Anlisis estadstico de los tratamientos de
hidrlisis alcalina (NaOH 5%) 51
Anexo 8. Anlisis estadstico de los tratamientos de hidrlisis
biolgica con Pleurotus ostreatus 53
Anexo 9. Resultados de los controles de la prueba cualitativa
para la determinacin de etanol (yodoformo) 55
Anexo 10. Produccin de etanol por la prueba cualitativa de
yodoformo y comparacin de los resultados con el crecimiento en
buchn o elodea como nica fuente de carbono. 57
Anexo 11.Anlisis estadstico de la determinacin de etanol
por la prueba del dicromato de potasio 59

Anexo 12.Identificacin presuntiva de las 13 cepas de levaduras
escogidas como mejores productoras de etanol 61

RESUMEN
En el presente estudio se investig la capacidad de las levaduras aisladas de la laguna de
Fquene para la produccin de etanol, utilizando como sustrato el buchn de agua (Eichhornia
crassipes) y la elodea (Egeria densa), mediante una tcnica cualitativa (prueba de yodoformo),
semicuantitativa (dicromato de potasio) y cromatografa de gases acoplada a masas.
Cuarenta y nueve levaduras fueron aisladas y se identificaron las 13 cepas que presentaron un
sobrenadante amarillo laminado caracterstico de etanol en la prueba de yodoformo. Estas
cepas se acercaron bioqumicamente a los gneros Candida sp, Brettanomyces sp y
Hansenula sp. Adicionalmente, se realizaron 3 pre-tratamientos hidrolticos (cido, alcalino y
biolgico) a los sustratos vegetales estudiados (determinando la cantidad de azucares
reductores por el mtodo de DNS), encontrando una mayor cantidad de azucares liberados en
g/L con el tratamiento biolgico (Pleurotus ostreatus) a un nivel de significancia de 0.01. Lo
anterior permiti escoger este mtodo hidrolticos para adecuar los sustratos para la produccin
de etanol
A partir de esto se realiz un diseo al azar inoculando las mejores levaduras productoras de
etanol (escogidas mediante una prueba cualitativa de yodoformo) en los medios especficos de
buchn y elodea con el pretratamiento biolgico y sin pretratamiento. La concentracin de
etanol fue determinada a las 24 y 48 horas de cultivo por la prueba del dicromato de potasio; al
igual que las concentraciones de azucares y la cantidad de clulas/ml. Al final de la
fermentacin se determin que las levaduras que mayores concentraciones de etanol
produjeron con este mtodo fueron C. albicans en medio hidrolizado de buchn (54.97 g/L) y C.
lusitaniae en medio hidrolizado de elodea (37.80 g/L. A partir de esto se realiz una
cromatografa de gases acoplada a espectrmetro de masas de estas levaduras, donde se
comprob la produccin de etanol en los medios hidrolizados y no hidrolizados con un tiempo
de retencin del catin molecular de 1.48 minutos.
1. INTRODUCCION
La laguna de Fquene es una importante fuente hdrica para los departamentos de Boyac y
Cundinamarca; lamentablemente est desapareciendo, debido a la eutroficacin producida por
la contaminacin proveniente de desechos agrcolas, ganaderos y de aguas residuales. Estos
desechos contienen alta concentracin de nitrgeno (N), fsforo (P) y materia orgnica,
promoviendo el crecimiento de plantas acuticas como buchn de agua y elodea brasilera, que
estn deteriorando conjuntamente con otros factores el ecosistema y reduciendo el espejo de
agua.
A partir de este problema, los pescadores de la Asociacin Los Fundadores con el apoyo de
La Fundacin Humedales, el Instituto de Desarrollo Rural -ICONDER- y la Corporacin Andina
de Fomento CAF-,empezaron a utilizar como materia prima los desechos de las malezas
acuticas en la produccin de abono orgnico. Pero, a pesar de ser efectivo, controla solo
parcialmente la problemtica de la disposicin final de estos desechos, ya que la cantidad de
buchn de agua destinada para la produccin de bioabono es solo una pequea proporcin
comparado con la cantidad extrada mensualmente de material vegetal.
Estudios recientes han empleado el buchn de agua, principalmente, en la produccin de papel
y biocombustible (bioetanol). El Jacinto de agua o buchn es un excelente candidato como
materia prima para los anteriores procesos debido a su contenido de celulosa. La celulosa se
hidroliza por accin qumica o enzimtica produciendo azucares que se fermentan
posteriormente a etanol. El empleo de esta planta acutica como sustrato puede disminuir la
problemtica que se presenta en la laguna Fquene y otras lagunas colombianas con el mismo
problema de infestacin, y reducir los costos de produccin de este biocombustible, ya que el
buchn de agua presenta un rpido crecimiento, es de fcil cultivo y propagacin.
Por lo anterior esta investigacin pretende aislar levaduras procedentes de la laguna de
Fquene capaces de producir alcohol a partir de las plantas acuticas invasoras, buchn de
agua y elodea, como punto de partida en la bsqueda de alternativas para solucionar la
disposicin final de estas plantas acuticas una vez extradas de la laguna de Fquene y
mejorar la calidad de vida de los pescadores de la zona.
2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIETO DEL PROBLEMA

La laguna de Fquene constituye una fuente de sustento y seguridad alimentaria para ms de
200 familias, muchas de ellas dedicadas a la pesca artesanal; que junto con la agricultura se
constituyen en dos campos de donde proceden los ingresos de las mismas.
Desafortunadamente en la laguna por causa de la contaminacin se acumulan grandes
cantidades de nutrientes que permiten el crecimiento de maleza acutica como buchn de
agua y elodea. Estas plantas generan eutroficacin en la laguna y crea no solo un gran impacto
medioambiental, sino tambin un problema socio econmico ya que muchas familias de
pescadores dependen de ella (Fundacin Humedales, 2001; Cruz, 2004; Estrada et al., 2004)
Estudios recientes han demostrado que el buchn de agua puede ser una opcin viable como
sustrato para la produccin de biocombustible y aunque hasta el momento no se han
encontrado estudios reportados para la macrfita elodea, dado el rpido crecimiento y fcil
obtencin de la laguna, podra ser una alternativa econmicamente sustentable y amigable con
el medio. Lo anterior debido a que no solo se disminuye la biomasa extrada de la laguna, sino
tambin se contribuye a control de las emisiones de gases txicos a la atmosfera por parte de
los combustibles provenientes del petrleo (Garca, et al., 2006; Isarankura-Na-Ayudhya, et al
2007).
3. MARCO TEORICO
3.1. Laguna de Fquene
La laguna de Fquene, se ubica en el sistema hdrico de los ros Ubat y Surez en el
departamento de Cundinamarca, con una altitud de 2539 m. Esta laguna tiene una superficie
total de 3150 ha, un volumen de 50 millones de m3 y una profundidad media de 2 m (Japan
International Cooperation Agency-JICA-, 2000; Ministerio del Medio Ambiente, 2002;
Corporacin Autnoma Regional de Cundinamarca -CAR-, 2009). La laguna posee una alta
biodiversidad, con una fauna de 91 especies de vertebrados (mamferos, aves, peces), y hace
parte de los humedales del altiplano de Cundinamarca y Boyac, que son centro de diversidad
biolgica y endemismo de la biota de agua dulce Andina, ms importante del Norte de
Suramrica (Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial -MAVDT-, et al 2006;
Valderrama, 2007).
Esta importante red hdrica soporta una poblacin de ms de 200 mil habitantes que viven de la
ganadera, la agricultura, la minera, el desarrollo agroindustrial y la pesca; siendo esta ultima
una fuente de seguridad alimentaria (Instituto Colombiano para el Desarrollo Rural-INCODER-,
2009). Otro importante servicio ambiental radica en que el complejo de humedales es fuente de
agua para el consumo de ms de 70,000 personas y como proveedor para el sistema de riego,
sobre el cual se basa una de las industrias lecheras ms prsperas del pas (Maya y Castillo,
2005; Fundacin Humedales, 2008).
3.2. Problema ambiental
Hoy da, el avance de la frontera agrcola contina siendo una de las principales causas de la
disminucin del 70% de la extensin de la laguna. Actualmente hay ms de 21.000 hectreas
sembradas con cereales, maz, arveja y frjol y la situacin se agrava con la ganadera
extensiva en ladera e intensiva en la zona plana. Adems se usan fertilizantes qumicos para
adaptar la zona a la actividad agropecuaria y varios concentrados, sales y otros suplementos,
cuyos residuos van a parar a la laguna al igual que las excretas (Tognetti, 2006).
Ademas lo anterior, la explotacin minera de carbn que saca ms de 763.000 toneladas del
mineral al ao y el desarrollo urbano, le descarga a la laguna las aguas residuales domsticas
e industriales de los habitantes de 14 municipios (CAR, 2000 y 2009).

El alto deterioro de este cuerpo de agua esta representado en los excesivos niveles de fosfatos
y nitratos agregados por el sector ganadero y agricultor, as como la proliferacin de plantas
acuticas como buchn de agua y la elodea, que han acelerado procesos de eutroficacin y
por consiguiente de desecacin de la laguna. El espejo de agua se ha reducido
considerablemente haciendo imposible la navegacin (Fundacin Humedales, 2008).
3.3. Macrfitas contaminantes de la laguna de Fquene
3.3.1. Elodea (Egeria densa)
Esta planta se conoce comnmente como Elodea, y cientficamente como Egeria densa, de la
Familia Hidrocharitaceae. Es una de las plantas acuticas ms comunes, originaria de
Sudamrica y Amrica central que se caracteriza por su rpido crecimiento (Morgan, 2009).
Es una planta que puede estar tanto enraizada en el sustrato como flotante, adems es una
gran consumidora de nutrientes y tiene la ventaja debido a su rpido crecimiento que
desprende una sustancia antibitica que ayuda a evitar el crecimiento de las algas verde-
azuladas. Al mismo tiempo consume tantos nutrientes que evita la aparicin de otros tipos de
algas (Feijo et al., 1993; Calixto y Del Basto, 2005). La planta vive enteramente bajo el agua,
salvo sus pequeas flores que flotan unidas a la planta por delicados tallos (Feijo et al., 2002).
En el verano, se desprenden hijuelos de la planta madre, que luego enraza, y comienza una
nueva planta, formando grupos densos que cubre a los invertebrados acuticos, peces y
anfibios.
Esta planta afecta el movimiento del agua, su calidad y el uso para la pesca, navegacin y
recreacin. (Direccin General de Aguas-DGA- et al., 2005). Al igual que otros hidrfitos de
crecimiento laminar-tapizante, la explosin demogrfica de esta especie produce desajustes
ecosistemticos, como condiciones de anoxia, eutroficacin, alteracin del ciclo de los
nutrientes, reduccin de la penetracin lumnica y desplazamiento de especies nativas (Dillon
et al., 1988). Adems, su crecimiento puede dar lugar a obstrucciones de conductos y

canalizaciones con la consiguiente prdida econmica para los sectores perjudicados (Ozbay,
2001; The Nature Conservancy of Vermont, 2003)
En nuestro pas se encuentran varios cuerpos de agua con invasin de macrfitas acuticas
en Cundinamarca y Boyac como la laguna de Fquene, Tota. Sochagota y Palagua (Ramsar,
2008).
3.3.2. Buchn de agua (Eichhornia crassipes)
Esta planta se conoce con el nombre de Buchn, Jacinto o Lirio de agua y cientficamente
como Eichhornia crassipes, de la Familia Ponteridaceae (Petrell y Bagnall, 1991). Puede vivir
en aguas duras o blandas con temperaturas de 15 a 30C, rangos de pH amplios, de 5.5 a 9.0,
e iluminacin alta o muy alta. Puede alcanzar un dimetro de 30 cm y una altura de 20 cm.
Posee hojas en rosetn, peciolos cortos hinchados casi bulbosos, flores vistosas grandes en
forma de espiga y de color violeta o azul claro (Schouben, 2005; Masterson, 2007).
El Buchn de agua es una planta de crecimiento rpido que flota sobre la superficie del agua
ofreciendo un excelente refugio para los peces y protegindolos del sol excesivo y las heladas;
sus extensas races cuelgan por debajo, donde pueden alcanzar la altura de un metro o ms;
en estas condiciones su crecimiento se caracteriza por formar masas compactas que son
arrastradas por el viento (Aweke, 1993). Estas grandes masas pueden ocasionar problemas en
los cuerpos de agua como: Reduccin de la biodiversidad, obstruccin de los ros y
alcantarillado interfiriendo fsicamente con la navegacin, el flujo del agua y las actividades de
pesca. Estos bloques compactos toman la luz del sol, impidiendo el desarrollo del fitoplancton,
que son bsicos en las cadenas alimenticias acuticas, disminuyen el oxigeno disuelto
producido normalmente por las plantas acuticas sumergidas. As como alteracin en la
qumica del agua (Ozimek et al.1993; Schouben, 2005).
Son consideradas entre las 100 especies ms invasoras del mundo por la Unin Internacional
para la Conservacin de la Naturaleza (UICN) ya que pueden obstruir en poco tiempo una va
fluvial o lacustre (Senz, 2003). Tiene la capacidad de absorber nutrientes (N, P, Ca, K, entre
otros) de los cuerpos de agua, los cuales normalmente se pierden. Como consecuencia de su
proliferacin en ros y lagos importantes, estn causando problemas en canales de riego
agrcolas y afecciones a los ecosistemas ribereos; ya que cubre como una manta toda la
superficie del ro, por su fcil reproduccin vegetativa y sexual (Gunnarsson y Petersen, 2007).
Adems es una especie sin predadores, ni competidores en muchos sitios (Schouben, 2005;
Valderrama, 2007)
3.3.3. Alternativas para la disposicin de las macrfitas
El buchn de agua se ha convertido en un sustrato para el proceso de compostaje como una
alternativa de gestin al problema generado por la disposicin final en Colombia y otros pases
del mundo (Eslava y Garca, 2001; Fundacin Humedales y Netherlands Antilles Healthy
Islands Foundation, 2004; Cruz, 2004; Calixto y Del Basto, 2005; Martnez-Nieto, 2004, 2006 y
2007; Palacios, 2007; Fundacin Humedales, 2008). Otros usos que se le han dado a esta
planta es su utilizacin para la fabricacin de pulpa de papel, a nivel veterinario la alimentacin
de aves de corral, en la fabricacin de muebles y bolsos, como fuente de medicamentos, entre
otros. Esta macrfita puede ser econmicamente procesada para generar humus de lombriz,
biogs y es comnmente usada en el reciclaje de aguas, ya que contribuye en la reduccin del
DQO, slidos solubles, nitritos, fosfatos y potasio principalmente (Abraham y Kurup, 1996;
Sharma et al., 1999; Gajalakshmi et al., 2001; Nigam, 2002; Singhal y Rai, 2003; Martnez-
Nieto, 2006; Gunnarsson y Petersen, 2007; Palacios, 2007).
Se ha buscado otras disposiciones finales para el buchn de agua dentro de los cuales esta la
utilizacin de estos residuos como materia prima para la industria papelera, por el manejo
ecolgico de los procesos bajo el esquema de produccin ms limpia compatible con los
ecosistemas. Adems est la utilizacin de este como filtro biolgico para la remocin de
contaminantes orgnicos e inorgnicos y otras sustancias txicas, y la produccin de
biocombustible como el etanol (Gajalakshmi et al., 2001; Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Lara et
al., 2007).

3.4. Bioetanol
El alcohol etlico o etanol es un producto qumico obtenido a partir de la fermentacin de los
azcares que se encuentran en los productos vegetales, tales como cereales, remolacha, caa
de azcar, sorgo o biomasa. Cuando se produce por la fermentacin de los azcares
contenidos en la materia orgnica de las plantas, se denomina bioetanol o etanol de biomasa
(Hernndez, 2001; National Renewable Energy Laboratory-NREL-, 2007 y Corporacin
Colombiana Agropecuaria -CORPOICA, 2009). Para la fabricacin de este, se puede utilizar
una gran cantidad de materias primas como almidn de maz, cereales, remolacha o residuos
forestales (Gray et al., 2006). El buchn de agua se ha considerado como posible substrato
para la produccin de etanol ya que tienen una ventaja por su rpido crecimiento y obtencin a
bajo costo (Garca et al., 2006; Masami et al., 2008; Mishima et al., 2008).
El combustible bioetanol se emplea como alternativa para disminuir la dependencia de las
importaciones de crudo y minimizar el impacto que las fluctuaciones del mercado ocasionan en
los precios (Inga, 2009). Adicionalmente a esto, la preocupacin actual por el cambio climtico
debido a las emisiones de los gases del efecto invernadero, ha generado la bsqueda de
prcticas que sean ms compatibles con el medio ambiente (Kafarov et al., 2006). Por ejemplo
se puede mezclar la gasolina con bioetanol, ya que las emisiones de gases txicos a la
atmosfera por la utilizacin de etanol es mucho ms baja que las emisiones generadas por el
petrleo y sus derivados fundamentalmente disminuyen la emisin de xidos de azufre y
nitrgeno (Nigam, 2002; Isarankura-Na-Ayudhya et al., 2007; Masami et al., 2008).
Concretamente, emiten un 88% menos de emisiones de dixido de carbono (CO2) a la
atmsfera; sin embargo, su proceso de fabricacin supone un gran esfuerzo para producir
molculas de azcar simple que se consigue por el calentamiento de la biomasa o el
tratamiento con cidos (Campo, 2006; Linde, 2006; Kumar, 2009).
En la actualidad se trabaja fundamentalmente en la bsqueda de materias primas baratas, que
sustituyan a las tradicionales materias azucaradas, como melazas para alcanzar mayor
eficiencia en los procesos de fermentacin, recuperacin y purificacin de alcohol producido
(Hernndez, 2001 y Miliarium Aureum, 2004). A raz de esto se empez a utilizar como materia
prima la biomasa vegetal, desechos agrcolas o madereros, para producir alcohol, denominado
de segunda generacin (Gonzlez, 2008).
3.4.1 Produccin de Bioetanol
En la naturaleza, este proceso es llevado a cabo por diferentes organismos que usan enzimas
para liberar el azcar contenido en la celulosa como algunos gneros bacterianos como
Clostridium sp y Zymommonas sp que fermentan los azcares y los transforman en alcohol
(Inga, 2009).
Los residuos vegetales contienen una mezcla compleja de carbohidratos como celulosa,
hemicelulosa y lignina que son llevados hasta etanol por accin enzimtica (Nigam, 2002; Bon
et al, 2007; Masami et al., 2008). Las celulosas no pueden ser fermentadas directamente, es
necesario degradarlas a azucares ms sencillos (Garca et al., 2006; Isarankura-Na-Ayudhya et
al; 2007). Para esto se utilizan pre tratamientos de hidrlisis con cidos concentrados, diluidos
y la hidrlisis enzimtica (Miliarium Aureum, 2004; Kovacs, 2009).
Los materiales para producir etanol que se encuentran disponibles en gran cantidad y bajo
costo son los lignocelulsicos, su empleo podra reducir costes de produccin (Angenent,
2007; National Renewable Energy Laboratory-NREL-, 2007). Una fuente lignoceluloltica es el
buchn de agua, considerada maleza acutica, que puede ser empleada en la produccin de
biocombustible, ya que puede proporcionar los azucares necesarios para la bioconversin a
etanol (Abraham y Kurup, 1996; Nigam, 2007; Misami et al., 2008).
3.5. Hidrlisis
La biomasa lignocelulsica presenta una estructura compleja compuesta de tres fracciones
(celulosa, hemicelulosa y lignina) que deben ser procesadas. La fraccin mayoritaria de esta
biomasa es la celulosa cristalina, que debido a su estructura qumica se dificulta su hidrlisis y
conversin a azcares fermentables (Reese, 1955; Angenent, 2007; Kovacs, 2009). Por el
contrario la hemicelulosa es fcilmente hidrolizable, pero su carbohidrato principal, la xilosa, es
difcil de fermentar a alcohol. Por ltimo la lignina, no puede convertirse en etanol, porque no es
un carbohidrato, sino un polmero rgido aromtico.
Mediante un proceso qumico (hidrlisis) que divide la celulosa y la hemicelulosa por accin de
la molcula de agua en medio cido, en molculas ms pequeas, se logra una solucin
azucarada. La hidrlisis permite tambin eliminar productos de la descomposicin que puede
tener efectos desfavorables durante la fermentacin como el furfural e hidroximetilfurfural (Bon
y Ferrara 1996; Miliarium Aureum, 2004; Campo, 2006; Garca, et al., 2006).
3.5.1. Hidrolisis qumica
3.5.1.2 Hidrlisis con cidos concentrados
En este proceso se aade cido sulfrico a la biomasa seca a una temperatura controlada de
50C. Despus se aade agua para diluir el cido de la mezcla, aumentando la temperatura
hasta 100C. El producto de este proceso se prensa para posteriormente separar la mezcla de
cido y azucares (Badger, 2002; Garca, et al., 2006).La principal ventaja del proceso de
concentracin es la alta eficiencia de recuperacin del azcar, que puede ser en el orden de
ms del 90% de los azcares de la hemicelulosa y celulosa. Desafortunadamente, es un
proceso relativamente lento y costoso en cuanto a la recuperacin del cido. Si este no es
recuperado, se deben utilizar grandes cantidades de cal para neutralizar el cido en la solucin
de azcar, lo cual crea gastos adicionales, por lo que industrialmente no se realiza (Badger,
2002).
3.5.1.3 Hidrlisis con cidos diluidos
Esta es la hidrlisis ms empleada y se realiza mezclando la biomasa con una proporcin de
cido sulfrico de 0.7% o 1% para hidrolizar la hemicelulosa a 190C. Para hidrolizar la
celulosa que es ms resistente se usa cido sulfrico al 0.4% y 215C. Finalmente el producto
hidrolizado se neutraliza y recupera mediante percolacin (Garca et al., 2006; Isarankura-Na-
Ayudhya et al., 2007).
La mayora de los procesos de diluir el cido se limitan a una eficiencia de recuperacin de
azcar de alrededor del 50% (Badger, 2002); ya que en la primera reaccin convierte los
materiales celulsicos en azcar y la segunda convierte los azcares a otros productos
qumicos (Biocombustibles, 2007). La mayora de los otros productos son el furfural (un
producto qumico utilizado en la industria del plstico) que puede ser txico para los
microorganismos empleados en la fermentacin (Campo et al., 2006).
La mayor ventaja de los procesos que utilizan el cido diluido es su rpida tasa de reaccin,
que facilita la continua transformacin. Su mayor desventaja es su bajo rendimiento en azcar.
Para procesos rpidos y continuos, a fin de permitir la penetracin del cido, las materias
primas debern reducirse en tamao, de manera que la dimensin mxima de las partculas
est en el rango de unos pocos milmetros (Badger, 2002).
3.5.2. Hidrlisis enzimtica
Consiste en transformar la celulosa en azucares de menor peso molecular por la accin de
enzimas llamadas celulasas, para que los microorganismos como levaduras o bacterias
puedan producir etanol (Reese, 1955). En sntesis, el proceso consiste en descomponer la
celulosa y la hemicelulosa del residuo, en azcares sencillos y transformarlos en etanol por
fermentacin. En primer lugar se lleva a cabo un pretratamiento del residuo cuyo objetivo es
alcanzar los mejores resultados en las etapas siguientes (hidrlisis y fermentacin) (Gray et al.,
2006). Como resultado del pretratamiento se obtiene una disolucin de azcares provenientes
de la ruptura de la hemicelulosa y un residuo slido (constituido principalmente por la celulosa
del residuo original) (Kovacs et al., 2009).
Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aerbicos o anaerbicos,
mesfilos o termfilos. Sin embargo, slo algunos de ellos producen enzima celulasa
extracelular capaz de hidrolizar la celulosa (Chacn y Waliszewski, 2005).
A partir de los hongos aerbicos se han obtenido los complejos celulolticos utilizados en la
mayora de los estudios (Eriksson y Wood 1985), debido a que son capaces de degradar la
celulosa, la hemicelulosa y la lignina por un complejo de enzimas hidrolticas y oxidativas (Gosh
y Gosh, 1992). Entre los otros microorganismos productores del complejo enzimtico, los
termoflicos son de inters por su capacidad para producir enzimas celulolticas termoestables,
las cuales son en general estables bajo condiciones severas, incluso en niveles de pH
altamente cidos o alcalinos as como temperaturas de hasta 90 C (Lamed y Bayer 1988;
Nigam, 2002).
La hidrlisis enzimtica es un proceso que presenta ventajas frente a la hidrlisis qumica,
como bajos costos, mayor rendimiento y la no utilizacin de agentes qumicos (Garca et al.,
2006; Mishima et al., 2006; Bon et al., 2007;). Adems la produccin de subproductos puede
ser controlada y las necesidades de energa son relativamente bajas (Badger, 2002; Bell y
Attfield, 2007).
3.6. Fermentacin de los azcares
Este proceso es llevado a cabo por microorganismos como las levaduras, bacterias y hongos
aerbicos o anaerbicos, mesfilos o termfilos que fermentan los azucares liberados del
pretratamiento. Gracias a la enzima invertasa presente en las levaduras los azucares se
convierten en glucosa y fructosa (Hernndez, 2001; Inga, 2009). Estas a su vez reaccionan con
otra enzima llamada zimasa, que tambin est presente en la levadura para producir el etanol y
dixido de carbono (Miliarium Aureum, 2004; Garcia et al.,2006; Masami et al.,2008).
3.7. Cuantificacin de etanol
Existen varios mtodos para medir la concentracin de etanol. Estn los mtodos qumicos de
oxidacin simple como la prueba del dicromato de potasio, permanganato, cobre y la prueba
del yodoformo. Tambin hay mtodos enzimticos (alcohol oxidasa), de inmunoensayo
(atenuacin de la energa radiante) y los cromatogrficos en fase gaseosa que utilizan
columnas de acero inoxidable o vidrio y HPLC (Rovida, et al. 1984; Taylor, et al.1984; Sharma
y Quantrill, 1994; Fletcher y Van Staden, 2003; Machinski et al, 2003; Machinski y Nishiyama,
2003; Universidad Nacional de la Plata, 2009). Al igual se encuentran los mtodos de
picnmetria y refractometria (Masson, 1997; Morrison y Boyd, 1998; Matiz, 2002).
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Aislar de la laguna de Fquene cepas nativas de levaduras capaces de producir alcohol a partir
de Jacinto o Buchn de agua (Eichhornia crassipes) y/o Elodea brasilera (Egeria densa) como
primer paso en la bsqueda de alternativas sostenibles para solucionar la disposicin final de
esta macrfitas extradas mecnicamente de la laguna de Fquene.
4.2. Objetivos especficos
Obtener de la laguna de Fquene cepas nativas de levaduras que utilicen el buchn y/o
elodea (con o sin pretratamiento de hidrlisis de carbohidratos) como fuente de
carbono.
Escoger las levaduras nativas que produzcan alcohol a partir de la utilizacin de las
macrfitas acuticas extradas de la laguna de Fquene.
Caracterizar a un nivel taxonmico preliminar las levaduras que produjeron alcohol a
partir de buchn de agua y elodea, especies contaminantes de la laguna de Fquene.
5. METODOLOGIA
5.1. Muestreo
Se escogieron 5 puntos dentro de la extensin de la laguna de Fquene y se tomaron 3
muestras de agua en cada uno, para un total de 15 muestras. En cada punto se midieron las
caractersticas fisicoqumicas con sonda multiparmetro, en cuanto a temperatura, pH,
conductividad y slidos disueltos; al igual se midieron parmetros como la profundidad, olor y
color. Los puntos fueron georeferenciados con un sistema de Global Position System (GPS),
marca GARMIN NUVI 200w suministrado por la Fundacin Humedales y a la Asociacin de
pescadores de Fquene Los Fundadores.
En dos de los sitios muestreados, adems se recolectaron muestras por triplicado de las
plantas acuticas buchn y elodea y adicionalmente se tomaron muestras de suelo y compost
a un Km en inmediaciones a la laguna de Fuquene del embarcadero en la vereda Guatancuy
del municipio de Fquene.
5.2. Aislamiento de levaduras
Un volumen de 5 mL de las 15 muestras de agua obtenidas de la laguna de Fquene se
sembraron en los medios lquidos melaza, YGC, soya-malta, arroz, buchn (Anexo 1). Este
mismo procedimiento se llevo a cabo con 5 g. de las muestras slidas (buchn, elodea, suelo y
compost) que fueron agregados a los seis medios descritos anteriormente. Los medios fueron
incubados a temperatura ambiente y a las 48 horas se realiz coloracin de Gram para
comprobar el crecimiento.
Al observar crecimiento en las muestras se realizaron pases a medios slidos para su
aislamiento y se les asign una denominacin consecutiva. A las colonias sospechosas
compatibles con morfologa de levaduras, se les realiz coloracin de Gram y se sembraron en
medios de cultivo YGC y Sabouraud hasta su purificacin.
5.3. Hidrlisis
Este procedimiento se realizo como pretratamiento de las macrfitas Jacinto de agua y Elodea
brasilera para liberar los azucares contenidos en la pared celular de buchn de agua y elodea
mediante los tipos de hidrolisis acida, alcalina y biolgica.
5.3.1. Hidrlisis acida con cido sulfrico o peractico
Suspensiones en agua destilada de las macrfitas, buchn y la elodea, en una proporcin 1:9
m/v, sometidas o no a filtracin previa, fueron hidrolizadas con cido sulfrico (Masami et al.,
2007) o peractico (Abraham y Kurup, 1996), segn el mtodo utilizado. En el primer
procedimiento se utilizaron soluciones de cido sulfrico en tres Concentraciones (2%, 1% y
0,5% m/v), las cuales se mezclaron con las suspensiones de buchn y elodea (con y sin
filtracin previa) en proporciones 1:1, 1:4, 1:9, 1:19, 1:49 y 1:99 v/v. Cada mezcla se someti a
esterilizacin por autoclave a 121C, evaluando dos tiempos diferentes 30 y 60 min. Este
procedimiento se realiz por triplicado y las unidades experimentales fueron neutralizadas por
adicin gota a gota de hidrxido de sodio al 10% m/v. La distribucin de este diseo fue
completamente al azar con arreglo factorial teniendo como factores el tratamiento del sustrato,
la concentracin del cido sulfrico, mezcla sustrato y tiempo de esterilizacin; con tres
repeticiones por tratamiento y un total de 216 unidades experimentales.
El otro mtodo de hidrlisis acida se llev a cabo hirviendo 10 g del buchn o la elodea lavados
y cortados con 100mL de cido peractico a 100C durante 30 minutos. Posteriormente se
realizaron lavados con agua destilada hasta que el agua estuviera neutra y el buchn se llevo a
80 C durante toda la noche (Abraham y Kurup, 1996., Masami et al, 2007).

5.3.2. Hidrlisis mixta
Para la hidrlisis mixta el buchn y la elodea fueron secados previamente en horno a 105C
durante 24 horas. Posteriormente, una cantidad del buchn o la elodea secos fueron
mezclados por triplicado a una relacin 1:8 en cido sulfrico al 1% m/v, la mezcla se agit por
7 horas en agitador magntico a 250 rpm y temperatura ambiente. Esta mezcla se filtr y se
lav con agua caliente a 60C y luego se calent la mezcla de filtrado ms agua de lavado a
100C durante 15 minutos y se llev a un pH de 10 con hidrxido de calcio slido en

combinacin con sulfito de sodio 0,1%. La mezcla se neutraliz con cido sulfrico 1N hasta
pH 6.0 (Nigam, 2002).
5.3.3. Hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio
Se realizaron dos tratamientos de hidrlisis alcalina utilizando hidrxido de sodio al 5 y 10 %
m/v. En uno de ellos, se tomaron suspensiones de buchn y de elodea para mezclarlas por
triplicado con Hidrxido de sodio 5% m/v para llegar a proporciones 1:1, 1:4, 1:9, 1:19, 1:49 y
1:99 v/v; las cuales, se esterilizaron a dos diferentes tiempos, 30 y 60 minutos. Las muestras se
neutralizaron mediante lavados con agua. Este procedimiento se baso en la metodologa
propuesta por Isarankura (2007). El otro mtodo de hidrlisis qumica alcalina se realizo
utilizando una relacin macrfita: solucin de hidrxido de sodio 10 % de 1:10 (gramos de
buchn o elodea en una solucin de Hidrxido de sodio 10% m/v). La mezcla se esterilizo en
autoclave a 121 C por 30 minutos, luego se filtro y lavo con agua destilada hasta su
neutralidad. El filtrado de buchn o elodea fue secado durante toda la noche a 80C (Abraham
y Kurup, 1996). La distribucin de este diseo fue completamente al azar teniendo como
tratamientos la mezcla de sustratos e hidrxido de sodio y el tiempo de esterilizacin; con tres
repeticiones para un total de 36 unidades experimentales.
5.3.4. Hidrlisis biolgica con Pleurotus ostreatus (suministrado por al empresa
Champinfung LTDA)
El hongo Pleurotus ostreatus se sembr en aserrn, sustrato utilizado comnmente para la
produccin industrial de orellanas (Martnez-Nieto, 2009 com. pers.). Una vez invadido el medio
por el micelio blanco caracterstico de este gnero, el hongo estuvo listo para ser empleado en
los ensayos de hidrlisis.
Se prepar un medio liquido con extracto de malta, aserrn, buchn o elodea, y se distribuyo
un volumen de 45mL en frascos de vidrio, los cuales fueron inoculados con 0.9g, 2.7g y 4.5g
del hongo Pleurotus ostreatus. Este procedimiento se realiz por triplicado para cada
tratamiento con distribucin completamente al azar y la incubacin se hizo a temperatura
ambiente.
5.3.5. Azcares reductores
A Todos los tratamientos de las diferentes hidrlisis y sus repeticiones, se les determin la
concentracin de azucares reductores expresada en gramo/litro (g/L) por el mtodo del cido
dinitrosalicilico (Anexo 2) descrito por Miller (1959) a temperatura ambiente. En la hidrlisis
biolgica se tomaron lecturas de azucares reductores a los 5, 7, 10, 11, 12 y 13 das de
incubacin del hongo a diferentes Concentraciones; mientras que, en los otros procedimientos
se realizo el anlisis al finalizar el tratamiento.
5.3.6. Anlisis de datos
Los resultados de la hidrlisis con cido sulfrico se analizaron estadsticamente mediante un
anlisis de varianza con arreglo factorial a un nivel de significancia de 0.01. Los datos
obtenidos de azcares reductores en la hidrlisis alcalina con NaOH 5%m/v y biolgica fueron
analizados mediante anlisis de varianza de dos factores con 0.05 de significancia. Las
diferencias entre tratamientos se determinaron mediante el test de rango mltiple de Duncan
con un nivel de significancia de 0.01 y 0.05 para as poder escoger el mejor tratamiento.
La comparacin final de los tratamientos de hidrlisis se realiz mediante un anlisis de
varianza de una sola va ( 0.01) y Test de rango mltiple de Duncan para las diferencias entre
tratamientos.
5.4. Determinacin de la produccin de etanol
5.4.1. Prueba del yodoformo
Se determin cualitativamente la produccin de etanol por las levaduras aisladas mediante el
mtodo de yodoformo (Griffin, 1981; Morrison, 1998; Hill et al, 2000) en medios, YGC, Buchn
y Elodea sin hidrolisis (Anexo 1). Este consiste en agregar a 5ml del medio de cultivo con
crecimiento de levaduras durante 48 horas, 2ml de hidrxido de sodio 10%m/v y 3 ml de lugol
(I
2
-Kl) lentamente, esta mezcla se dejar reposar por 5min y si hay presencia de etanol se
observa un precipitado amarillo correspondiente a la formacin de yodoformo. Para poder
establecer diferencias en la formacin del precipitado se prepararon controles de etanol as

como de otras sustancias que pudieran reaccionar con el reactivo o producirse durante la
fermentacin alcohlica, como metanol, butanol, isobutanol, acetato de etilo, glicerol, alcohol
amlico, acetona, acetaldehdo, alcohol isoproplico y fenol. Las proporciones utilizadas de los
controles fueron 1:1, 1:9, 1:99 (volumen de etanol u otras sustancias en volumen de medio de
cultivo estril). La interpretacin se hizo por cruces, otorgando cuatro cruces al precipitado
presentado en la mayor proporcin 1:1 de etanol en el medio de cultivo respectivo y una cruz
para la proporcin menor de 1:99.

5.4.2. Determinacin semi-cuantitativa de etanol por la tcnica del dicromato de potasio
Despus de escoger el mejor mtodo de hidrlisis a un nivel de significancia de 0.01, y las
posible levaduras productoras de etanol a partir de buchn o elodea con el mtodo del
yodoformo; se procedi a determinar semi-cuantitativamente la produccin del alcohol por el
mtodo de dicromato de potasio (Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Oviedo, 2009) mediante dos
diseos completamente al azar (uno para buchn y otro para elodea). Estos diseos tenan
como tratamientos dos medios inoculados con las mejores levaduras escogidas de buchn o
elodea y su respectivos controles sin inocular; con tres repeticiones, para un total de 48
unidades experimentales para buchn y 42 unidades experimentales para elodea. Se utilizaron
como medios de cultivo, preparaciones de buchn o de elodea con pretratamiento hidroltico (el
mejor mtodo de hidrlisis) y las suspensiones de las macrfitas sin ninguna clase de pre
tratamiento hidroltico.
La tcnica de dicromato consiste en tomar 2 mL de medio crecido de levaduras (centrifugado a
3200rpm durante 30 minutos) y mezclarlo con 2 mL de una solucin oxidante de dicromato de
potasio (anexo 3) La mezcla se homogeniz en vrtex a 1500 rpm y se calent en bao
termostatado de 80-85 C, por 30 min. Se enfro a t emperatura ambiente y se ley la
absorbancia a 440 nm y se interpol en la curva de calibracin (Anexo 3), reportando el valor
de etanol en g/L en dos tiempos 24 y 48 horas (Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Zumaqu,
2009). Otras variables que se determinaron fueron azcares reductores (g/L) por el mtodo
DNS (Miller, 1959) y recuento celular en cmara de Neubauer para determinar el consumo de
azucares y el aumento de biomasa.
Mediante la prueba semi-cuantitativa de dicromato se escogieron las dos mejores levaduras
posibles productoras de etanol, una en el diseo con buchn y otra con elodea, para realizar
cromatografa de gases acoplada a espectrmetro de masas y determinar presencia de etanol.
5.4.3. Cromatografa de gases acoplada a espectrmetro de masas
Al caldo de cultivo con las dos levaduras escogidas por la metodologa anterior, se les realizo
una determinacin por cromatografa de gases acoplada espectrmetro de masas en un equipo
Agilent Technologer 6850 series lll, con columna HP5MS apolar de 30 metros, utilizando como
gas de arrastre helio y una temperatura del inyector de 250C. El fin de esta prueba fue
comprobar la presencia de etanol en el ensayo.
5.5. Caracterizacin taxonmica preliminar de las levaduras
Las trece levaduras escogidas para el ensayo semicuantitativo utilizando la tcnica del
dicromato de potasio, se identificaron preliminarmente teniendo en cuenta las caractersticas
macroscpicas en medios Sabouraud, agar tabaco y Malta-Glucosa; y la formacin de
estructuras microscpicas caractersticas en medios harina de maz y Caldo leche. Adems se
determin el crecimiento en caldo YGC a diferentes temperaturas 0, 37 y 42C y
Concentraciones de cloruro de sodio de 10% y 16%; como en agar malta glucosa al 50 % y
agar malta sal glucosa (Anexo1). Posteriormente se evalu el crecimiento y asimilacin de
Nitratos y de Urea.
Adicionalmente se realiz prueba cromognica empleando el panel para la identificacin rpida
de levaduras MicroScan de Dade Behring Inc., para la identificacin definitiva de las levaduras.
Esta prueba fue realizada por el laboratorio clnico del Hospital Universitario San Ignacio.
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1. Muestreo y aislamiento
A las colonias aisladas se le asign una numeracin consecutiva, determinando como
sospechosas de levaduras un total de cuarenta y nueve colonias diferentes; las cuales
crecieron en todos medios empleados incluyendo los medios pre-hidrolizados de buchn y
elodea (Anexo 4). Posteriormente estas cepas se sembraron en buchn y elodea sin
tratamiento hidroltico previo, observando crecimiento de todas las cepas en las dos macrfitas
(Anexo 5). Esto posiblemente a que estos sustratos fueron previamente secados al aire libre en
el municipio de Fuquene donde pueden actuar microorganismos que poseen actividad
celuloltica, proteoltica y amiloltica (Calixto y Basto, 2005). Existen estudios que indican que
algunas levaduras pueden utilizar parcialmente la hemicelulosa proveniente del buchn de
agua hidrolizada con cido sulfrico en medio liquido (Nigam, 2002, Isarankura et al, 2007,
Masami et al, 2008, Mishima el al, 2008).
En los ambientes acuticos se encuentran una gran variedad de microorganismos, la densidad
y el tipo de microorganismo se relaciona con el estado trfico y las caractersticas
fisicoqumicas del agua (Urano et al, 2000., Russo, 2006); sin embargo, en este estudio estos
factores no tuvieron incidencia en el nmero de aislamientos de levaduras, ya que se present
un patrn similar de recuperacin de cepas en los diferentes puntos de muestreo (Anexo 4).
6.2 Hidrlisis
6.2.1. Hidrlisis acida con cido sulfrico o peractico
Los resultados obtenidos en la hidrlisis con cido sulfrico mostraron diferencias en la
cantidad de azucares reductores liberados de las dos macrfitas (Figura 1 y 2). El anlisis de
varianza con arreglo factorial encontr diferencias altamente significativas entre los
tratamientos utilizando como sustrato buchn (Anexo 6). La suspensin de buchn con una
concentracin de cido sulfrico del 0.5%, en proporcin 1:1 y sesenta minutos de
esterilizacin (0.669g/L), mostro diferencias con los otros tratamientos evaluados, siendo el
mejor resultado para la prueba de rango mltiple de Duncan (Anexo 6); mientras que, para
elodea se encontr que el mejor tratamiento fue en la suspensin, con una concentracin de
cido del 1%, en proporcin 1:1 y sesenta minutos de esterilizacin (1,081g/L), mostrando
diferencias altamente significativas con los otros tratamientos (Anexo 6).
Figura 1. Concentacin de azucares obtenidos en la hidrlisis con diferentes mezclas de cido

sulfurico y tratamietnos de buchon (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos.
Figura 2. Concentacin de azcares reductores en la hidrlisis con diferentes mezclas de cido

sulfurico y tratamientos de elodea (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos.
En los resultado para buchn, los picos ms altos de azcares se obtuvieron en las
proporciones de 1:1 y 1:19 en la concentracin de 0.5% de cido con sesenta minutos de
esterilizacin; como tambin, en la proporcin 1:1 con una concentracin de 1% en sesenta
minutos y al 2% con una proporcin de sustrato de 1:1 con 30 minutos de esterilizacin. El

resto de tratamientos presentaron resultados mucho menores a estos (Figura 1).
La concentracin del cido influy en la cantidad de azcares reductores liberados, pero la
biomasa vegetal tambin fue un factor determinante en los resultados, como se puede observar
en la proporcin sustrato-cido 1:1 de los tratamientos que presentaron la mayor liberacin de
azcares reductores, tanto en buchn como elodea (Figura 1 y 2). Esto se explica porque en
esta proporcin se encuentra la mayor cantidad de material vegetal hidrolizable con respecto a
las dems, favoreciendo la hidrlisis de los polisacridos y traducindose por tanto en un
mayor rendimiento de la hidrlisis (Sarrouh et al., 2005). Las otras proporciones tienen una
menor cantidad de fibra en donde el cido pueda ejercer su accin y por consiguiente la
cantidad de azcares liberados va a ser menor (Cunningham y Lpez, 1994). Por esta misma
razn se encuentra mayor cantidad de azcares en los tratamientos de suspensin que en los
filtrados. Esto se evidencia ms claramente en las diferencias observadas con los valores
obtenidos en la misma concentracin de cido sulfrico pero diferentes proporciones del
sustrato (Anexo 6). Por ejemplo en la mejor concentracin para buchn de 0.5%, la proporcin
de sustrato de 1:1 presenta 0.669g/L de azcar en sesenta minutos de esterilizacin, siendo
una cantidad mayor que las proporciones 1:4, 1:9, 1:19, 1:49 y 1:99 para estas mismas
condiciones, con Concentraciones cada una respectivamente de 0,2919 g/L, 0,5629 g/L, 0,134
g/L, 0,0906 g/L y 0,0877 g/L azcares reductores (Anexo 6).
En publicaciones se ha encontrado que la temperatura tambin tiene un efecto positivo en la
cantidad de azcares que se hidrolizan jugando un papel importante al separar el complejo
celulosahemicelulosa al facilitar la accin de las enzimas sobre cada molcula (Meja et al.,
2007). En los estudios realizados por Campo et al. (2006) y Redding et al. (2008) demuestran
que temperaturas entre 110 -130C ayudan a mejorar la hidrlisis de los materiales celulsicos;
posiblemente al trabajar en el presente estudio con una temperatura de 121
o
C se favoreci la
hidrlisis de los componentes estructurales de la pared celular vegetal (Anexo 6 y 7).

Los tratamientos con cido sulfrico en Concentraciones generalmente por debajo del 4% en
peso, han sido de mayor inters en los estudios al ser econmicos y eficaces (Breijo y Yufera,
1989). Sin embargo se ha demostrado que los materiales que han sido sometidos a la hidrlisis
cida pueden ser ms difciles de fermentar, por la presencia de sustancias txicas que puede
inhibir a las clulas y afectar a la tasa de crecimiento especfico de clulas y rendimiento de
masa por ATP (Palmqvist, 2000; Mussatto et al., 2004; Galbe y Zacchi, 2007).
La hidrlisis con el cido peractico mostr una concentracin de azcares reductores de
0,083g/L para buchn y 0,08g/L para elodea; comparados con las mejores Concentraciones
encontradas en el cido sulfrico se demuestra una menor capacidad hidroltica de esta
sustancia, debido posiblemente a que es un oxidante fuerte utilizado en la decoloracin,
desinfeccin y blanqueo de materiales celulolticos mas que un compuesto hidroltico (Teixeira
et al., 2000; Zhaoa et al., 2007, Bernal-Castillo, 2009 com. pers.). En investigaciones se ha
encontrado que hidroliza parcialmente los materiales lignocelulsicos, deslignificando y
aumentando la superficie y la exposicin de las fibras de celulosa (Neidleman, 1993; Xue-Bing
et al., 2008). Adems, como se comento anteriormente, la temperatura influye en la liberacin
de azcares y este tratamiento utilizo una temperatura de 105
o
C menor a la utilizada en la
hidrlisis con cido sulfrico y por debajo del rango propuesto por Redding et al (2008) para
mejorar la hidrlisis de celulosa.
Para muchos autores la hidrlisis acida presenta bajos rendimientos y una elevado formacin
de subproductos txicos (furfural y hidroximetilfurfural) con un alto consumo de energa; por
eso investigadores como Mussatto et al., (2006) recomiendan la mezcla de hidrlisis cida y
alcalina para mejora los resultados que pueden obtenerse solamente usando cidos. Tambin
otros investigadores como Lazaro y Arauzo (1994) recomiendan la hidrlisis enzimtica que
usa menos energa y da productos puros con rendimientos cuantitativos.
6.2.2. Hidrlisis mixta
Los resultados obtenidos en cuanto a concentracin de azcares reductores fue de 0,09g/L
para elodea y buchn. Esta cantidad es un poco superior a la obtenida con el cido peractico,
y comparada con la hidrlisis con cido sulfrico es inferior en las dos macrfitas (Anexo 6).
Las Concentraciones de azcares reductores deberan haber sido mayores que en los
tratamientos con cido sulfrico; ya que la adicin de sustancias alcalinas se usan como una
forma eficaz de acondicionamiento para reducir la toxicidad de los hidrolizados generados a
partir de pre-tratamiento de la biomasa lignicelulolitica para la produccin de etanol (Ranatunga
et al., 2000; Horvth et al., 2005). Sin embargo, en este estudio la liberacin de azcares
reductores fue menor a otras hidrlisis; pero hay que tener en cuenta que el ajuste de pH con
hidrxido de calcio si no se hace en un tiempo corto hay perdida del 10 % de la glucosa (Kumar
et al.,2009).
6.2.3. Hidrlisis alcalina con hidrxido de sodio
Los resultados encontrados la hidrlisis con NaOH al 5% evidenci la menor cantidad de
azcares reductores tanto en buchn como elodea (Figura 3 y 4), comparado con las hidrlisis
con cido sulfrico, peractico y la mixta. El anlisis de varianza encontr diferencias
significativas en los tratamientos con NaOH al 5% a un nivel de 0.05 (Anexo 8). El mejor
tratamiento en buchn (0.16 g/L de azcares reductores) (Figura 3) fue con una proporcin de
sustrato 1:1 y una esterilizacin durante 30 minutos al igual que en elodea (0.09 g/L azcares
reductores) (Figura 4).
Figura 3.Concentracin de azcares reductores obtenidos en la hidrlisis alcalina con hidrxido de

sodio al 5% en buchn con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos.
Figura 4. Concentracin de azcares reductores obtenidos en la hidrlisis alcalina con hidrxido

de sodio al 5% en elodea con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos.
La menor cantidad de azcares reductores en buchn se dio en la proporcin de sustrato 1:49
y 1:99 (Figura 3) en los dos tiempos de esterilizacin; y para elodea se present en las
proporciones de 1:4, 1:9, 1:49 y 1:99 (Figura 4) .
Comparando los azcares obtenidos en este tratamiento con respecto a la mejor concentracin
obtenida en la hidrlisis con cido sulfrico, son mucho menores; debido posiblemente, a que
la hidrlisis alcalina provoca un hinchamiento de la celulosa que no necesariamente conlleva a
una hidrlisis, ni modifica su composicin qumica (Fuentes et al., 2008). La concentracin en
los procesos industriales en los que se utiliza el hidrxido de sodio est entre el 1 y el 5% como
la utilizada en este estudio, e implica un aumento en volumen de 30 a 60% respectivamente de
la celulosa, sin llegar a hidrolizarla (Fuentes et al., 2008; Nez, 2008), razn por la cual estos
resultados no mostraron un incremento significativo en la concentracin de azcares
reductores.
En los resultados obtenidos con NaOH al 5% con los del 10% se observa en buchn una
concentracin de 0.12g/L de azcares reductores que es menor que la encontrada al 5%, y en
elodea se obtuvo la misma cantidad de azcares 0.09 g/L en las dos Concentraciones;
demostrndose as, que Concentraciones un poco mayores de hidrxido de sodio no ejerce
resultados significativos en los rendimientos de azcares reductores.
6.2.4. Hidrlisis biolgica con Pleurotus ostreatus
Los resultados encontrados durante los 13 das de incubacin del hongo muestran que en
buchn la concentracin de azcares reductores comienza a aumentar al inicio del tratamiento
hasta el da 10 donde empiezan a disminuir ligeramente (Figura 5 y 6).
Figura 5. Concentracin de azcares reductores obtenidos en la hidrlisis biologica con Pleurotus

ostreatus en buchn utilizando diferentes Concentraciones del hongo durante 13 das de
incubacin.
En la macrfita elodea tambin se observ al da 10 un aumento de los azcares donde
despus comienzan a disminuir (Figura 6). En la figura 6 no se observa claramente la
disminucin al haber una variacin pequea entre los valores, pero al observar los datos como
por ejemplo en la concentracin del 2% en el da 10 se obtuvieron 2,44 g/L de azcares
reductores y al da 11 fue de 2,38 g/L, donde se aprecia la disminucin (Anexo 8).
Figura 6. Concentracin de azcares reductores obtenidos en la hidrlisis biologica con Pleurotus
ostreatus en elodea utilizando diferentes Concentraciones del hongo durante 13 das de
incubacin.
Segn el anlisis de varianza se present diferencias significativas entre los tratamientos

(Anexo 8) y se evidencio mediante la prueba de Duncan que los mejores resultados en buchn
se obtuvieron con la concentracin del hongo del 10% a los 10 (4,256g/L) y 7 das (4,375g/L)
de incubacin (Anexo 8). Para la elodea el anlisis estadstico mostr que los tratamientos del
hongo a los 7 (3,37 g/l), 10 (3,48 g/l) y 11 das (3,48 g/l) con concentracin de P. ostreatus del
10 %, al igual que en la concentracin del hongo al 3% a los 10 (3,27 g/l) y 11 das (3,21 g/l),
no presentaron diferencias significativas entre ellos (Anexo 8).
Despus de los diez das de incubacin se observ la disminucin de los azcares reductores
en las dos macrfitas desde el da once hasta el trece, da en el cual se realiz la ltima lectura
de azcares reductores debido a su tendencia a disminuir (Anexo 8). La reduccin de la
actividad enzimtica podra atribuirse a la acumulacin de subproductos que la inhiben; los
cuales son producidos durante el metabolismo del hongo, como resultado de la hidrlisis de los
diferentes componentes de los cidos orgnicos esterificados de la hemicelulosa, y de los
derivados fenlicos solubilizados de la lignina (Palmqvist, 2000; Rodrguez et al., 2003;
Snchez y Carlos, 2005).
Al comparar los azcares obtenidos con las dems hidrlisis realizadas se observo como la
actividad enzimtica es mucho ms eficiente que cualquier sustancia qumica utilizada. Al
comparar estadsticamente los mejores tratamientos de cada tipo de hidrlisis, el anlisis de
varianza muestra diferencias significativas a un nivel de 0.01 entre tratamientos y de acuerdo
con la prueba de Duncan, los tratamientos con el hongo P. ostreatus a una concentracin del
10 % a los 10 y 7 das de incubacin fueron los de mayor liberacin de azcares (Tabla 2). En
elodea la mayor cantidad de azcares se present con una concentracin del hongo de 10% a
los 10 y 11 das de incubacin (Tabla 2).
Tabla 1. Comparacin estadstica de los mejores tratamientos de hidrlisis acida, alcalina con
NaOH 5% con las otras hidrlisis qumicas y con la biolgica en buchn.
Tratamiento Azcares
reductores (g/L)
Suspensin buchn -0.5 % cido Sulfrico 1:1- Esterilizacin 60min 0,67 b
cido Peractico -Neutralizacin lavados 0,083 c
NaOH 5 % 1:1- Esterilizacin 30 minutos 0,16 c
NaOH 10 % - Neutralizacin lavados 0,12 c
H2SO4+ Hidrxido de calcio +sulfito sodio -Neutralizacin cido 0,090 c
Hongo concentracin 10 % a los 10 das de incubacin 4,375 a
Tabla 2. Comparacin estadstica de los mejores tratamientos de hidrlisis acida, alcalina con
NaOH 5% con las otras hidrlisis qumicas y con la biolgica en elodea.
Tratamiento Azcares
reductores (g/L)
Suspensin elodea -1 % cido Sulfrico 1:1- Esterilizacin 60min 1,08 d
cido Peractico -Neutralizacin lavados 0,08 e
NaOH 5 % 1:1- Esterilizacin 30 minutos 0,09 e
NaOH 10 %-Neutralizacin lavados 0,09 e
H2SO4-Hidroxido de calcio +sulfito sodio - Neutralizacin cido 0,09 e
Hongo concentracin 10 % a los 11dias de incubacin 3,48 ab
Hongo concentracin 10 % a los 7dias de incubacin 3,37 bc
Hongo concentracin 3 % a los 10dias de incubacin 3,27 c
Hongo concentracin 3 % a los 11dias de incubacin 3,21 c
Una de las ventajas del uso de la hidrlisis biolgica como tratamiento del material
lignocelulolitico, es que las enzimas pueden actuar sobre los compuestos txicos presentes en
los hidrolizados y cambiar su composicin. Se ha encontrado que el uso de la lacasa y de las
enzimas de la peroxidasa de los hongos de podredumbre blanca, ha promovido el aumento en
el consumo de glucosa y la productividad de etanol, debido a la accin de estas en cidos y
compuestos fenlicos (Mussatto y Roberto, 2004). La selectividad de las enzimas no permite la
conversin a otro tipo de compuestos diferentes a azcares evitando as la formacin de
compuestos txicos para los microorganismos (Meja et al., 2007). Lo que se ve reflejado en los
resultados, con un rendimiento mayor de azcares reductores en la hidrlisis biolgica en
comparacin con los otros tratamientos probados (Tabla 1 y 2). Otros autores han encontrado
altos rendimientos con este tipo de hidrlisis como Bon, y Ferrara (1996), Nigam (2002),
Campo et al., (2006), Galbey y Zacchi (2007), Isarankura-Na-Ayudhya et al., (2007) y Kumar et
al., (2009).
Algunos autores como Hatakka (1984), Lazaro y Arauzo (1994), utilizaron este tipo de hongo
para hidrolizar materiales lignocelulosicos, ya que se alcanzan rendimientos superiores a los de
cualquier hidrlisis; encontrando en este estudio resultados similares, donde la cantidad de
azcar hidrolizada a partir de la biomasa vegetal de las plantas acuticas, buchn y elodea, fue
mayor al de los tratamientos qumicos.
Con base a estos resultados, la hidrlisis biolgica al 10 % de concentracin de P. ostreatus
con 10 das de incubacin, se escogi por su mayor contenido de azcares liberados en las
dos macrfitas, para la determinacin de alcohol etlico por el mtodo del dicromato de potasio.
Este hongo es muy utilizado porque tiene un alto potencial biotecnolgico en diferentes
sectores industriales, siendo capaz de degradar compuestos tan complejos como la lignina
(Manzano et al., 2004). Adems esta hidrlisis trae beneficios ya que no produce sustancias
txicas para los microorganismos y su utilizacin a nivel industrial puede ser ms econmica
comparada con el gasto de emplear cidos diluidos o concentrados (Badger, 2002).
6.23 Determinacin de la produccin de etanol
6.3.1. Prueba del yodoformo
De las cuarenta y nueve levaduras aisladas se determin por medio de la prueba del
yodoformo, que nueve levaduras eran las posibles mejores productoras de etanol a partir de
buchn y 6 a partir de elodea en los medios con buchn y elodea hidrolizados (Anexo 10). Esta
prueba tambin dio positiva en YGC, el cual contiene un azcar simple que puede ser
transformado fcilmente por las levaduras a etanol (Petrovska et al, 2000; Buitrago y Estrada,
2007).
La prueba del yodoformo (CHI3) se basa en la formacin de este compuesto que se observa
como un precipitado de color amarillo a partir de una reaccin de halogenacin en medio
bsico (Griffin, 1981.; Primo, 1996; Morrison et al, 1998). Al realizar la prueba a los tubos con
diferentes proporciones de etanol en medio estril, se present un precipitado color amarillo
laminado (Anexo 9).
Algunos de los otros compuestos utilizados como controles presentaban color y apariencia
similar a los tubos con las diferentes proporciones de etanol, como el alcohol isoproplico y el
acetaldehdo (Anexo 9). En literatura se ha reportado que el acetaldehdo es el nico aldehdo
sencillo que da positivo para la prueba de yodoformo y alcohol isoproplico es un alcohol
secundario que puede oxidarse formando una cetona, la cual reacciona positivamente
formando el haloformo amarillo llamado yodoformo (Grifiin, 1981., Primo, 1996, Morrison et al,
1998) Sin embargo se visualiza (Anexo 9) que los colores de los tubos de estos compuestos
suelen ser ms oscuros que el etanol, al finalizar la reaccin.
Por otro lado, la cetona presenta dos fases en el tubo de proporcin 1:1, se alcanza a observar
un amarillo en el fondo del tubo (Anexo 9); el cual posiblemente sea producto de la formacin
de yodoformo, ya que se ha reportado como un compuesto yodoformo positivo (Grifiin, 1981,
Morrison et al, 1998). En el anexo 9 se observan las diferencias entre los precipitados formados
por los compuestos empleados como controles en esta prueba.
6.3.2. Determinacin semi-cuantitativa de etanol por la tcnica del dicromato de potasio

Los resultado encontrados en los dos diseos experimentales mostraron una mayor produccin
de etanol con la levadura 30 en el medio buchn hidrolizado con Pleurotus ostreatus a las 48 h
de incubacin (Figura 7) y en elodea con la levadura 17 en las mismas condiciones (36,425g/L)
(Figura 8). Comparando los medios sin hidrlisis de los dos ensayos se observ que la
levadura 23a en elodea present la mayor produccin de etanol a las 48 horas (Figura 7 y 8).
Figura 7. Concentracin de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseo in vitro con
buchn durante 48 horas de incubacin de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato
Figura 8. Concentracin de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseo in vitro con
elodea durante 48 horas de incubacin de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato
Las Figuras 7 y 8 con relacin a la produccin de etanol y consumo de azcares reductores en

buchn y elodea respectivamente, muestran como la cantidad de etanol aumenta de las 24 a
las 48 horas, y los azcares reductores disminuyen (Anexo 5; esto se debe a que los
microorganismos consumen los azcares para su crecimiento y produccin de etanol. Cuando
la cantidad de sustrato no es suficiente detienen el crecimiento y la produccin de etanol como
lo afirman Palmqvist y Hahn-Hagerdal (2000), Fujita et al. (2002), Cervantes y Pedroza (2007)
Aguilar y Saucedo (2008) y Xiros y Christakopoulos (2009).
En el ensayo con buchn, la Figura 7 muestra que la ms baja produccin de etanol en el
medio sin hidrlisis se obtuvo con la levadura 1 y la ms alta en la 16. En el medio hidrolizado
en este mismo diseo la menor concentracin producida fue en la cepa 16 y R y la mayor con
la levadura 30. En elodea la menor concentracin de etanol en el medio no hidrolizado se
observ en la levadura 1 y T a las 48 horas y la mayor en la 23a. En los medios hidrolizados la
menor concentracin se dio en la 30 y la mayor en la 23a (Figura 8).
La levadura 30 en el diseo con buchn hidrolizado a las 24 horas present una concentracin
de etanol de 38,40g/l y a las 48 de 55,303g/l, mostrndose un aumento significativo en la
produccin, al igual que la levadura 23a en elodea con una produccin de etanol de 18,511g/l a
las 24 horas y a las 48 horas de 30,867g/l (Figura 7 y 8). El anlisis de varianza mostr
diferencias significativas en los dos diseos ( 0.05) y en el caso de buchn, la levadura 30 en
el medio hidrolizado con P. ostreatus, no present diferencias significativas con la levadura T y
1 en el mismo medio a las 48 h, siendo los mejores tratamientos.
En la prueba de rango mltiple de Duncan al evaluar el diseo in vitro con elodea muestra que
la levadura 23a en medio hidrolizado biolgicamente fue el mejor tratamiento y no evidenci
diferencias significativas con las levaduras 17, T y 23 en el mismo medio a las 48 horas, como
tampoco con las levaduras T y 23 a las 24 horas (Anexo 11).
En los medios sin hidrlisis se observ una produccin de etanol en bajas Concentraciones de
las 24 a las 48 horas al compararlos con los medios hidrolizados (Figura 7 y 8); esto se puede
deber a que las levaduras no tienen los mecanismos necesarios para degradar los compuestos
de las macrfitas como la celulosa y la lignina; mientras que con relacin a la hemicelulosa se
han aislado algunas levaduras degradadoras de este compuesto como Candida sp y
Trichosporon sp (Fernndez y Novo, 1988; Palmqvist y Hahn-Hagerdal, 2000; Srinorakutara et
al., 2006; Battan et al., 2007: Cervantes y Pedroza, 2007). No obstante lo que pudo haber
permitido a los microorganismos acceder a estos sustratos fue el proceso de esterilizacin al
que fueron sometidos los medios antes de ser inoculados, adems del pre-secado de las
muestras en la planta de produccin de bioabono ubicada en el Municipio de Fquene, antes
de su uso en el laboratorio.
En los medios hidrolizados si se present una liberacin de azcares reductores posiblemente
a partir de lignina, celulosa y hemicelulosa debido a la maquinaria enzimtica que posee P.
ostreatus (Manzano et al., 2004; Mussatto y Roberto, 2004). Por consiguiente se puede ver en
este estudio al igual que lo observado por autores como Fuentes et al. (2008), que la hidrlisis
logra el aprovechamiento de los azcares reductores liberados de la degradacin de los
componentes de las macrfitas, generada por el hongo Pleurotus ostreatus.
Adems es importante resaltar que el procedimiento trmico, generalmente, es utilizado como
pretratamiento para aplicar posteriormente hidrlisis, debido a que separa el complejo
celulosahemicelulosa facilitando la accin de las enzimas sobre cada molcula. El uso de la
temperatura en este estudio posiblemente favorece la hidrlisis de la hemicellosa mientras que
la celulosa no pudo ser afectada. Por consiguiente este tratamiento tiene efectos ms notables
sobre la hemicelulosa y en menor medida sobre la celulosa (Mejia et al., 2007).
Las levaduras que produjeron la mayor concentracin de etanol por el mtodo dicromato de
potasio se escogieron para la realizacin de la cromatografa de gases. (Las levadura 30 en el
medio hidrolizado de buchn y la 23a en el medio sin hidrlisis de elodea).
6.3.3. Cromatografa de gases acoplada a espectrmetro de masas

En los cromatogramas se comprueba la produccin etanol (Tiempo de retencin de 1.48
minutos), por las levadura 30 y 23a en medios que contenan buchn y elodea
respectivamente, a las 48 horas de incubacin. Con relacin a la levadura 30 en medio
hidrolizado biolgicamente a las 48 horas, se observa adems del etanol otros productos de
fermentacin como el dixido de carbono, 1-propanol, 2-metil y 1-butanol, 2-metil (Figura 9); al
igual para elodea se presentaron productos de la fermentacin como el dixido de carbono,
acetato de etilo y 1-butanol, 3-metil (Figura 13). Estos alcoholes se pueden presentar en la
fermentacin como consecuencia del metabolismo de los azcares (Madigan et al.,2003;
Ramrez, 2006).
Figura 9. Cromatograma de la produccin de etanol con la levadura 30 en el medio hidrolizado con
Pleurotus ostreatus, con un tiempo de retencin 1.48 minutos
Figura 10. Cromatograma de la produccin de etanol con la levadura 23a en el medio sin hidrlisis,
con un tiempo de retencin 1.48 minutos
Por medio de este mtodo se pudo comprobar la produccin de etanol de las levaduras
escogidas en el medio hidrolizado como sin hidrlisis. Es un mtodo de eleccin para la
determinacin de etanol que ofrece alta selectividad y resultados precisos, utilizado en varios
estudios (Corrales y Rangel, 1999; Monsalve et al., 2006; Sarmiento y Silva, 2007; Oviedo et
al., 2009 y Pea y Arango, 2009).
6.4. Caracterizacin taxonmica preliminar de las levaduras
Se determin mediante las pruebas bioqumicas y el MicroScan que la mayora de las
levaduras escogidas como posibles productoras de etanol son cercanas al gnero Candida sp
(Tabla 5, Anexo 12). Los otros gneros encontrados fueron cercanos a , y
Hansenula sp (Tabla 5, Anexo 12).
Tabla 3. Identificacin preliminar de las levaduras escogidas como mejores productoras

de etanol por el mtodo del yodoformo
Cdigo
Identificacin
1 Brettanomyces sp.
16 Hansenula sp
17 Hansenula sp
23 Candida parasilopsis
23 a C. lusitaniae
30 C. albicans
45 H. polymorpha
R C. parasilopsis
T C. lusitaniae
Los resultados encontrados tienen relacin con lo reportados por varios estudios de aislamiento
de levaduras acuticas, los cuales mencionan que algunas especies del gnero Cndida
pueden encontrase en dichos ambientes (Ochoa y Vzquez, 2004). Adicionalmente especies
del gnero Candida sp. se han reportado como productoras de etanol y algunas a partir de
compuestos vegetales prehidrolizados como el buchn de agua (Isarankura et al, 2007.,
Mishima el al, 2008., Masami et al, 2008., Nigam, 2002;). El gnero Hansenula sp. tambin ha
sido reportado por algunos autores como productor de etanol (Olena et al, 2008., Voronovsky
et al, 2009., Dejelal et al, 2006). Dichas investigaciones dan soporte a los resultados
encontrados en este estudio, ya que se determin que las levaduras identificadas como
mejores productoras de etanol, en su mayora fueron aisladas de las muestras de agua de la
Laguna, (1, 16, 23, 23a, 30, R, T) y se determin que producan etanol a partir de las
macrfitas acuticas hidrolizados y sin hidrlisis.
El hallazgo de levaduras productoras de etanol en dos macrfitas invasoras de la laguna de
Fuquene (Masami et al, 2008 y Nigam, 2002), es de importancia como punto de partida para
posteriores estudios, como una alternativa amigable con el medio y sustentable
econmicamente para disponer de los residuos de dichas plantas al ser extradas
mecnicamente de la laguna. Y adems si se pueden usar para la produccin del
biocombustible se va a contribuir al control de la emisin de gases txicos a la atmosfera por
parte de los combustibles provenientes del petrleo y a mejorar la calidad de vida de los
habitantes de la zona de influencia de la Laguna de Fquene.
7. CONCLUSIONES
En total de la laguna de Fquene y de las macrfitas buchn y elodea, se aislaron 49 cepas y
trece de ellas que presentaron la mayor produccin de etanol fueron identificadas como
cercanas a los gneros Candida sp, Brettanomyces sp y Hansenula sp., esto demuestra la
diversidad de la Laguna de Fquene y la importancia de la implementacin de medidas para su
conservacin.
El mejor pretratamiento para buchn y elodea fue el biolgico con Pleurotus ostreatus a los
diez das de incubacin que present la mayor liberacin de azcares fermentables con un
promedio de 55,303g/l y 30,867g/l para buchn y elodea respectivamente.
Las levaduras C. albicans C. lusitaneae produjeron la mayor cantidad de etanol en medios
con buchn y elodea hidrolizados y no hidrolizados, los cuales fueron comprobados por
cromatografa de gases. El potencial de esas cepas para futuras investigaciones en el campo
de los biocombustibles de segunda generacin es de gran importancia ya que permite el
aprovechamiento de materiales lignocelulsicos.
Con los resultados obtenidos durante este trabajo se cumpli con el objetivo general de la
investigacin, ya que se aislaron levaduras capaces de producir etanol a partir de las
macrfitas acuticas buchn y elodea, siendo un punto de partida para una posible solucin a
la disposicin final de estos residuos vegetales una vez extrados mecnicamente de la laguna
de Fquene.
8. RECOMENDACIONES
Las levaduras C. albicans y C. lusitanie se recomiendan para futuras investigaciones en la
produccin de biocombustibles en medios con las plantas acuticas, buchn o elodea, tratadas
por mtodos biolgicos con P. ostreatus.
Es necesario continuar con los estudios de estas macrfitas acuticas para dar una alternativa
industrial a escalas mayores en la produccin de etanol.
Continuar con la identificacin molecular de las cepas aisladas de la laguna de Fuquene para
as conocer las mejores condiciones de fermentacin inherentes a la cepa, para el
aprovechamiento de buchn y elodea en la produccin de etanol.
Se debera investigar los microorganismos que actan en el pre-secado que realizan la
Asociacin de pescadores Los Fundadores para la produccin de bioabono, y utilizada en
este estudio, como cepas promisorias en la liberacin de azcares fermentables, al ayudar en
la degradacin del material constitutivo de la pared celular de las plantas acuticas, buchn y
elodea.
Es recomendable cuantificar la produccin de alcohol por mtodos cromatograficos y optimizar
la produccin de biocombustibles de las levaduras aisladas.
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10. ANEXOS
Anexo 1. C
MEDIO COMPONENTES CANTIDAD (g, mL o UI)L
Melaza Melaza 100g
Sulfato de magnesio (MgSO
4
) 0.5g
Sulfato de amonio (NH
4
)
2
SO
4
) 5g
Fosfato de potasio (KPO
4
) 1g
Cloranfenicol 0,5g
Penicilina 20000 UI
Agar-agar 15g
Soya-Malta Malta 30g
Harina de soya 3g
Cloranfenicol 0,5g
Penicilina 20000 UI
Agar-agar 15g
Arroz Arroz 500g
Cloranfenicol 0,5g
Penicilina 20000 UI
Agar-agar 15g
Dextrosa Sabouraud Glucosa 40g
Peptona 10g
Agar-agar 15g
YGC Glucosa 20g
Extracto de levadura 5g
Cloranfenicol 0.1g
Agar-agar 15g
Medio de crecimiento de
Pleurotus ostreatus
Aserrn 1600g
Salvado de trigo 360g
Melaza 40g
Cal 1g
Malta Glucosa 50 % Glucosa 500g
Extracto de malta 10g
Extracto de levadura 2.5g
Agar-agar 15g
Malta Glucosa Extracto de malta 20 g
Glucosa 20 g
Peptona 1g
Agar-agar 15g
Tabaco Tabaco de cigarrillos 50g
Agar-Agar 15g
Malta Sal Glucosa Glucosa 128g
Extracto de malta 20g
Cloruro de sodio (NaCl) 100g
Agar-agar 15g
YGC con 10 % de Cloruro
de Sodio (NaCl)
Glucosa 20g
Cloranfenicol 0.1g
Agar-agar 15g
YGC con 16 % de Cloruro
de Sodio (NaCl)
Glucosa 20g
Cloranfenicol 0.1g
Agar-agar 15g
Harina de Maz Harina de maz amarillo 20g

Glucosa 20g
Peptona 20g
Tween 80 0.19mL
Agar-agar 15g
Leche Leche entera 170mL
Cloranfenicol 0.25g
Caldo nitrato Glucosa 20g
Nitrato de sodio (NaNO
3
) 2g
Sulfato de magnesio
heptahidratado (MgS0
4
* 7H
2
0)
0.5g
Fosfato mono potsico (KH
2
PO
4
) 0.5g
Sulfato ferroso (SO
4
Fe) 1g
Urea Urea 20g
Fosfato de potasio monobsico
(KH
2
PO
4
)
9.1g
Fosfato de potasio dibsico
(K
2
HPO
4
)
9.5g
Extracto de levadura 0.1g
Rojo de fenol 0.01g
Agar-agar 15g
Ascosporas Glucosa 1g
Peptona 10g
Agar-agar 15g
Todos los medios deben ser llevados a esterilizar en autoclave a 121 C (15lb de presin)
durante 15. El medio malta sal glucosa y malta glucosa 50% son esterilizados en un bao de
agua hirviendo por 30 minutos.
Anexo 2.
Curva patrn para al determinacin de azucares reductores por el mtodo del cido 3,5-
dinitrosalicilico (DNS)
Preparacin del reactivo
En un vaso de precipitado de 250mL, se adiciono 50mL de agua destilada y 1.6g de hidrxido
de sodio, disolviendo continuamente en una plancha magntica a temperatura ambiente.
Luego se agrego lentamente 43.8 g de tartrato de sodio y potasio hasta su disolucin completa.
Se cubri el vaso de precipitado con papel aluminio. Posteriormente se agrego 1g de cido 3,5-
di-nitro saliclico (DNS) lentamente continuando con la agitacin. Se completo hasta un
volumen de 100ml con agua destilada en el vaso de precipitado El reactivo se dejo toda la
noche en agitacin constante y al otro da se paso a un baln volumtrico aforado de 100mL
previamente forrado con aluminio.
Preparacin de la solucin stock de glucosa 2g/L
Se peso 0.2g de glucosa anhidra y se disolvi en 50mL de agua destilada utilizando un baln
volumtrico aforado de 100mL. Despus de homogenizarse de completo, se llevo a un volumen
de 100mL con agua destilada.
Preparacin de las soluciones de glucosa de la curva patrn
Se utilizo la formula de V1*C1= V2*C2 y para preparar las seis diferentes Concentraciones de
glucosa g/L con un volumen final de 2mL. El procedimiento para preparar cada una se ve a
continuacin.

Reactivo Blanco Concentraciones g/L
0.50 0.70 1.00 1.50 1.70 2.00
Glucosa (mL) - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Agua (mL) 0.25 - - - - - -
Se protegen los tubos de ensayo tapa rosca de 13*100mm con papel aluminio.
Reactivo de
DNS
0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Se calientan los tubos de ensayo en un bao termostatado con agua hirviendo sin papel
aluminio por cinco minutos y posteriormente detenga la reaccin por inmersin de los tubos en
hielo durante 5 minutos.
Agua
destilada (mL)
2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Se pone nuevamente el papel aluminio a cada tubo y se determina la absorbancia de cada
solucin a una longitud de onda de 540nm, ajustando la absorbancia con el blanco de prueba.
Determinacin de la concentracin de azucares reductores de cada muestra

Se toman 0.25mL de la muestra en un tubo de ensayo, forrando cada uno con aluminio para
protegerlo de la luz, y se agregan 0.25mL de reactivo DNS. Se calientan los tubos de ensayo
en un bao termostatado con agua hirviendo sin papel aluminio por cinco minutos y
posteriormente detenga la reaccin por inmersin de los tubos en hielo durante 5 minutos.
Al cabo de este tiempo se pone nuevamente el papel aluminio a cada tubo y se determina la
absorbancia de cada solucin a una longitud de onda de 540nm, ajustando la absorbancia con
el blanco de prueba.
Luego de tener la absorbancia se reemplaza en la ecuacin que se determino por medio de
una regresin lineal con la curva patrn que se muestra a continuacin.
Curvas patrn para la cuantificacion de azucares reductores del reactivo de DNS.
Anexo 3.
Curva patrn para la determinacin de etanol por el mtodo del dicromato de potasio
Preparacin de los reactivos
Solucin oxidante
Se mezclan 4.165 g de dicromato de potasio (97%) y 250 mL de cido sulfrico (96%) en un
vaso de precipitado de 600mL. Luego esta solucin se para a un baln volumtrico aforado de
1000 mL y se completa hasta el aforo con agua destilada.
Solucin de carbonato de potasio
Se mezclan de 20 g de carbonato de potasio (98%) en un vaso de precipitado de 250mL hasta
que se disuelva. Luego esta solucin se transfiere a un baln volumtrico de 100mL y se
completa con agua destilada hasta el aforo.
Despus de tener las 2 soluciones anteriores preparadas se realiza la solucin final:
Solucin final.
Se toman 4 mL de la solucin oxidante en un tubo de ensayo y luego se adiciona, gota a gota,
2 mL de solucin de carbonato de potasio hasta finalizar el burbujeo.
Procedimiento para la realizacin de la curva patrn
Se prepararon diferentes concentraciones de etanol en agua destilada (2,5, 5,0, 10, 15, 20, 30)
como se muestra en la tabla siguiente. Se mezclan 2 mL de la solucin final con 2 mL de los
diferentes patrones en un tubo de ensayo homogeneizndose en vrtex a 1500 rpm durante
10 s. Seguidamente se realiza un calentamiento en bao termostatado de 80-85 C, por 30
min. Se enfra a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a una longitud de onda de 440
nm, ajustando la absorbancia con el blanco de prueba

El blanco se prepara con cido sulfrico con una concentracin de 6N.
Determinacin de etanol en cada muestra
Se tomaron 10mLde la muestra de medio de cultivo en un tubo de ensayo y se centrifuga a
3500 rpm durante 20 min. Se trabaja con el sobrenadante de donde se toman 2mL en un tubo
de ensayo y se mezclan con 2mL de la solucin final en un vrtex por 10 segundos.
Estos tubos son puestos en un bao termostatado de 80 a 85C por 30 minutos. Al cabo de
esto se dejan enfriar a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a una longitud de onda de
440 nm ajustando la absorbancia con el blanco de prueba. Los datos obtenidos se multiplican
por el factor que corresponda a cada medio que se presentan a continuacin debajo de cada
grafica, para hallar la concentracin en g/L.
Concentracin
g/l
Etanol
(mL)
Agua
destilada(mL)
Blanco* - -
2.5 0.05 19.95
5 0.1 19.9
10 0.2 19.8
15 0.3 19.7
20 0.4 19.6
30 0.5 19.5
Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio elodea hidrolizada con P.

ostreatus, ajustada de acuerdo con la metodologa planteada por Torrenegra
(1993). Factor= 35.71

Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio elodea sin pretratamiento
hidroltico, ajustada de acuerdo con la metodologa planteada por Torrenegra
(1993). Factor= 105.03
Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio buchn hidrolizado con P.

ostreatus, ajustada de acuerdo con la metodologa planteada por Torrenegra
(1993). Factor= 68.90
Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio buchn sin pretratamiento
hidroltico, ajustada de acuerdo con la metodologa planteada por Torrenegra
(1993). Factor=133.92
Anexo 4.
Aislamiento de levaduras en cada medio de cultivo utilizado en la investigacin.

Muestra Ubicacin GC MLLA2A LLCDLA 8UCnCN AkkC2

SCA
MAL1A
Agua
Laguna de
Fquene sector
Ubate

Agua
Laguna de
Fquene sector
Tagua

Agua
Laguna de
Fquene Monroy

Agua
Laguna Fquene
sector la Isla

Buchn
Laguna Fquene
sector la Isla

Agua
Laguna de
Fquene sector
Suarez

Elodea
Laguna de
Fquene sector
Suarez

Suelo
Vereda
Guatancuy,
municipio de
Fquene. Predio
Fundacin
Humedales

Compost
Vereda
Guatancuy,
municipio de
Fquene. Predio
Fundacin
Humedales

Anexo 5.
Crecimiento de las levaduras escogidas en los medios hidrolizados y sin hidrlisis
biolgica
Crecimiento de levaduras en buchn hidrolizado con Pleurotus ostreatus en el ensayo de
produccin de etanol por el mtodo del dicromato de potasio.
Crecimiento de levaduras en elodea hidrolizado con Pleurotus ostreatus en el ensayo de

produccin de etanol por el mtodo del dicromato de potasio.
Anexo 6.
Anlisis estadstico de los tratamientos de hidrlisis acida (H
2
SO
4
)
A nSC
I V G
L
S
C
C
M
I V C
I
S

11C SUS1kA1C A E^ E^
CCNCLN1kACICN CIDC
SULIUkICC 8
E^ E^
SUS1kA1CCIDC E^ E^
LS1LkILI2ACICND E^ E^
SCAx8 E^ E^
SCAxC E^ E^
SCAxD E^ E^
SC8xC E^ E^
SC8xD E^ E^
SCCxD E^ E^
SCAx8xC ^ ^
SCAx8xD E^ ^
SCAxCxD E^ ^
SC8xCxD E^ E^
SCAx8xCxD ^ ^
SCLkkCk
1C1AL
D
1 n A k L
1 S
C

n
SC

L
A
N C
n

NCn
N
8
S

S

8
I

S

A nSC
I
V
G
L
S
C
C
M
I V C
I
S

11C SUS1kA1C A E^ E^
CCNCLN1kACICN
CIDC SULIUkICC
8
E^ E^
SUS1kA1CCIDC

E^ E^
LS1LkILI2ACICND E^ E^
SCAx8 E^ E^
SCAxC E^ E^
SCAxD E^ E^
SC8xC E^ E^
SC8xD E^ E^
SCCxD E^ E^
SCAx8xC ^ ^
SCAx8xD E^ E^
SCAxCxD E^ E^
SC8xCxD E^ E^
SCAx8xCxD ^ ^
SCLkkCk
1C1AL
D
1 n A k L
1 S
C

n
SC

L
A
N C
n

NCn
N
L
S

S

L
I

S

Anexo 7.
Anlisis estadstico de los tratamientos de hidrlisis alcalina (NaOH 5%)
A NCn

Modelo Suma de
cuadrados
tipo III
Grados de
libertad
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
Modelo
Corregido
.022
a
11 0,002 852,829 0
Intercepto 0,286 1 0,286 123657,324 0
Concentracin
del sustrato
0,009 5 0,002 746,095 0
Tiempo de
esterilizacin
(min)
0,01 1 0,01 4214,046 0
Concentracin
del sustrato *
Tiempo de
esterilizacin
(min)
0,003 5 0,001 287,318 0
Error 0 24 0

Total 0,308 36

Correccin
Total
0,022 35

D NCn
NaOH 5 %
Proporcin
Tiempo de
esterilizacin(min)
30 60
1:1 0,159 a 0,085 bcd
1:4 0,108 b 0,075 cd
1:9 0,098 bc 0,074 cd
1:19 0,092 bcd 0,068 cd
1:49 0,088 bcd 0,068 cd
1:99 0,088 bcd 0,0670 d
A NCn
Modelo Suma de
cuadrados
tipo III
Grados
de
libertad
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
Modelo
Corregido
.024
a
11 .002 15.368 .000
Intercepto .003 1 .003 23.839 .000
Concentracin
del sustrato
.017 5 .003 23.839 .000
Tiempo de
esterilizacin
(min)
.001 1 .001 8.310 .008
Concentracin
del sustrato *
Tiempo de
esterilizacin
(min)
.006 5 .001 8.310 .000
Error .003 24 .000

Total .031 36

Correccin
Total
.028 35

D NCn
NaOH 5 %
Proporcin
Tiempo de esterilizacin(min)
30 60
1:1 0,093 a 0,071 ab
1:4 0,078 ab 0,068 b
1:9 0,075 ab 0,067 b
1:19 0,074 ab 0,068 b
1:49 0,070 ab 0,067 b
1:99 0,073 ab 0,068 b
Anexo 8.
Anlisis estadstico de los tratamientos de hidrlisis biolgica con Pleurotus ostreatus
Anlisis de varianza de la hidrlisis biolgica con Pleurotus ostreatus en buchn con un nivel de
significancia de 0.05.
Modelo Suma de
cuadrados
tipo III
Grados de
libertad
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
Modelo
Corregido
36.545
a
17 2,15 101,99 0
Intercepto 503,25 1 503,25 23876,212 0
Tiempo (das) 9,33 5 1,866 88,531 0
Concentracin
del hongo
23,612 2 11,806 560,128 0
Tiempo (das) *
Concentracin
del hongo
3,603 10 0,36 17,092 0
Error 0,759 36 0,021
Total 540,554 54
Correccin
Total
37,304 53
Prueba de rango mltiple de Duncan para la hidrlisis biolgica con Pleurotus ostreatus en
buchn.
Tiempo (das)
Concentracin del
hongo Pleurotus
ostreatus Azucares reductores (g/L)
5 7 10 11 12 13
2%
2,05 h 2,17 gh 2,24 gh 2,22 gh 2,15 gh 2,10 h
3%
2,13 h 3,69 cd 3,73 bcd 3,50 de 3,33 ef 3,19 f
10%
2,40 g 4,25 a 4,37 a 3,96 b 3,78 bcd 3,63 d
Anlisis de varianza de la hidrlisis biolgica con Pleurotus ostreatus en buchn con un nivel de
significancia de 0.05.
Modelo Suma de
cuadrados
tipo III
Grados de
libertad
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
Modelo
Corregido
12.743
a
17 ,750 38,718 ,000
Intercepto 410,804 1 410,804 21219,728 ,000
Tiempo (das) 4,907 5 ,981 50,698 ,000
Concentracin
del hongo
7,191 2 3,595 185,722 ,000
Tiempo (das) *
Concentracin
del hongo
,644 10 ,064 3,327 ,004
Error ,697 36 ,019
Total 424,244 54
Correccin
Total
13,439 53
Prueba de rango mltiple de Duncan para la hidrlisis biolgica con Pleurotus ostreatus en elodea.
Concentracin del
hongo Pleurotus
ostreatus
Tiempo (das)
Azucares reductores (g/L)
5 7 10 11 12 13
2% 1,93 d 2,38 c 2,44 c 2,38 c 2,22 c 2,17 d
3% 2,16 d 2,99 b 3,27 ab 3,21 ab 2,96 b 2,87 b
10% 2,41 c 3,367 ab 3,48 a 3,48 a 3,01 b 2,88 b
Anexo 9.
Resultados de los controles de la prueba cualitativa para la determinacin de etanol
(yodoformo)
Prueba de yodoformo controles de etanol y algunos posibles interferentes. En la primera columna

de la izquierda se observan los resultados de la prueba de yodoformo para los controles con
proporciones de izquierda a derecha 1:1, 1:9 y 1:99 en medio buchn; en la columna de la derecha
para el medio elodea con las mismas proporciones. En las filas se encuentran los diferentes
compuestos. A. Etanol, B. Acetato de etilo, C. Acetona, D. Alcohol Isoproplico, E. Metanol.
Anexo 10.
Produccin de etanol por la prueba cualitativa de yodoformo y comparacin
de los resultados con el crecimiento en buchn o elodea como nica fuente de
carbono.
CEPA
Prueba de Yodoformo
Crecimiento nica
Fuente de carbono
Caldo YGC Buchn Elodea Buchn Elodea
1 +++ +++ +++ ++ +++
2 - - - + ++
3 ++ + - ++ ++
4 ++ + + ++ ++
5 +++ + - + ++
6 ++ + + + ++
7 +++ - - +++ +++
8 - - - ++ ++
Y - - - ++ ++
9 - - - ++ ++
S + - - ++ +++
10 + - - +++ ++
11 - - - ++ ++
T ++ +++ ++ ++ ++
14 + - - +++ ++
16 +++ +++ + ++ +
16a - - - ++ ++
17 +++ + ++ + +
17a ++ + - + ++
17m ++ + + ++ +
18 + - - ++ +++
19 + - - ++ +++
21 - - - ++ +
22a ++ + + + +
23 +++ +++ ++ ++ ++
23a +++ ++ ++ +++ +++
25a +++ + - ++ ++
26 + - - ++++ ++++
R +++ +++ + ++++ ++++
29 - - - + +
30 ++ +++ +++ +++ ++++
35 + + - ++ ++
40 - - - ++ +
41 +++ - - ++ +++
42 - - - + +
45 +++ +++ + +++ ++
50 - - - ++ ++++
52 - - - + +
59 - - - ++ +
U - - - +++ +++
54 + + - ++ ++
60 - - - +++ +++
63 + - - ++ +++
70 - - - + +++
74 - - - +++ ++++
76 - - - + +++
77 - - - +++ +++
79 - - - + +
81 + ++ - ++ +
Anexo 11.
Anlisis estadstico de la determinacin de etanol por la prueba del dicromato de potasio
A N
Modelo Suma de
cuadrados
tipo III
Grados
de
libertad
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
Modelo
Corregido
4863.458
a
9 540.384 12.059 .000
Intercepto 16.476.797 1 16.476.797 367.678 .000
Tiempo(horas) 159.235 1 159.235 3.553 .073
Hidrolisis 3.546.820 1 3.546.820 79.147 .000
Levadura 1.157.402 7 165.343 3.690 .009
Error 985.888 22 44.813
Total 22.326.143 32
Correccin
Total
5.849.345 31
D
Determinacin de etanol
Levadura Medio Etanol g/L
24 48
1 Hidrolizado
37,180 bcd 41,570 ab
Sin hidrolisis
6,935 f 9,462 f
T Hidrolizado
37,605 bcd 41,34 ab
Sin hidrolisis
10,151 f 13,413 f
16 Hidrolizado
23,655 cdef 34,679 bcd
Sin hidrolisis
10,656 f 22,277 def
23 Hidrolizado
31,245 bcde 37,665 bcd
Sin hidrolisis
8,084 f 12,310 f
R Hidrolizado
23,175 cdef 36,333 bcd
Sin hidrolisis
9,278 f 11,988 f
30 Hidrolizado
38,400 bc 54,9704 a
Sin hidrolisis
7,533 f 12,999 f
45 Hidrolizado
17,706 ef 35,598 bcd
Sin hidrolisis
12,034 f 14,004 f
Control Hidrolizado
16,490 ef 16,655 ef
Sin hidrolisis
6,476 f 6,495 f
A N
Modelo Suma de
cuadrados
tipo III
Grados
de
libertad
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
Modelo
Corregido
2376.381
a
8 297.048 18.408 .000
Intercepto 12.905.660 1 12.905.660 799.741 .000
Tiempo(horas) 275.171 1 275.171 17.052 .001
Hidrolisis 1.610.432 1 1.610.432 99.796 .000
Levadura 490.777 6 81.796 5.069 .003
Error 306.609 19 16.137
Total 15.588.649 28
Correccin Total 2.682.989 27
D
Determinacin de etanol
Levadura Medio Etanol g/L
24 48
1 Hidrolizado
17,546 fghi 32,474 abc
Sin hidrolisis
8,865 i 14,698 fghi
T Hidrolizado
33,393 ab 35,230 a
Sin hidrolisis
12,034 ghi 14,652 fghi
17 Hidrolizado
29,627 abcde 36,425 a
Sin hidrolisis
10,289 hi 17,684 fghi
23 Hidrolizado
30,775 abcd 33,577 ab
Sin hidrolisis
10,65 ghi 16,030 fghi
23 A Hidrolizado
21,664 defg 37,803 a
Sin hidrolisis
18,511 fgh 30,867 abcd
30 Hidrolizado
23,288 cdef 31,785 abc
Sin hidrolisis
11,132 ghi 16,030 fghi
Control Hidrolizado
20,336 efgh 24,724 bcdef
Sin hidrolisis
6,384 i 6,568 i
Anexo 12.
Identificacin presuntiva de las 13 cepas de levaduras escogidas como mejores
productoras de etanol
Compuesto LEVADURAS
L23 LR L30 L23A LT L1 L16 L17 L45
Hidroxiprolina-b- Naftilamida + + + + + - - - -
L-isoleucina-b-naftilamida - - - D + - D + +
L-prolina-b-Naftilamida + + + + + - - - -
L-tirosina-b-Naftilamida + + + + + + + + +
Glicina-b-Naftilamida - - - - - - D + +
Glicilglicina-b-Naftilamida + - + + + - - - -
Glicil-L-arginina 4-metoxi-b-Naftilamida + - + - - - - - -
Glicil-L-prolina-4-metoxi-b-Naftilamida - - - - - - - - -
L-arginil-L-arginina-b-Naftilamida + + - - - - - - -
L-lisil-L-alanina 4-metoxi-b-Naftilamida - + - - - - - - -
L-alanina-4-metoxi-b-Naftilamida - - - - - - - - -
L-seril-L-tirosina-b-Naftilamida - - - - - - - - -
Urea - - - - - - - - -
3-Indoxil-fosfato + + + + + - + + +
L-histidina -b-Naftilamida D + D D D D D + +
Sacarosa - + - - - + - - -
Sacarosa + + + + + + + + +
Trehalosa + + + + + + + + +
p-nitrofenil--D-glucopiranosido - - - - - - - - -
o-nitrofenil--D-glucopiranosido - - - + + - - - -
o-nitrofenil--D-Galactopiranosido - - - - - - - - -
p-nitrofenil--D-glucopiranosido - - + + + + + + +
p-nitrofenil--Fucopiranosido - - - + + + + + +
p-nitrofenil--D-Galactopiranosido - - - - + + + + +
p-nitrofenil-N-acetil-B-D-Glucosamina - - - - - - - - -
p-nitrofenil--D-celobiosa - - - - - - - - -
p-nitrofenil-N-acetil-B-D-Galactosaminida - - + - - - - - -
Identificacin presuntiva
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Aislamiento de Levaduras

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