Las tcnicas de preconcentracin

Determinacin de melanina utilizando polmeros impresos moleculares magnticos y cromatografa lquida de alto rendimiento
Miao Wang , Yong - xin Ella , Xin Wei Du, Yu- Ting Huang Xiao -Mei Shi , Mao -jun Jin, Jin Fen , Shao Hua y Wang Jing Clave Laboratorio de Seguridad y Calidad Agroalimentaria del Ministerio de Agricultura, PR China, Instituto de Estndares de Calidad y Testing Technology for Agriproducts del CAAS, Beijing, China Un nuevo mtodo utilizando polmeros de impronta molecular magnticos (MMIP) especficos para el reconocimiento, separacin, y extraccin de la melamina en la leche bovina se desarroll con un aditivo estante magntico externo en el presente documento. El MMIP se sintetiz con Fe3O4 nanopartculas y la tecnologa de sntesis de polmeros de impresin molecular. Con la ayuda de una etapa de elucin con metanol / cido actico mezcla de elucin, la melamina se puede recogi y se concentr. Mediante el uso de cromatografa lquida de alto rendimiento combinado con esta tcnica de tratamiento previo, los analitos se eluyeron a partir de los polmeros magnticos pueden ser determinados. Este mtodo de extraccin fue validado por el anlisis de la matriz de la leche de vaca que se incurren. El mtodo propuesto simplifica los procedimientos del mtodo de extraccin en fase slida clsica y mejora la fiabilidad del mtodo. Las recuperaciones obtenidas de este mtodo estaban en el rango de 85,04 a 105,2 % en muestras de leche con pas. El lmite de deteccin (LOD) fue inferior a 29,2 ng g - 1. Palabras clave: cromatografa lquida de alta eficacia, polmero impreso molecular magntica; melamina ; Pre tratamiento INTRODUCCIN La melamina es una triazina heterocclico que contiene nitrgeno con un contenido de nitrgeno de 66,7 %. Se ha aadido ilegalmente a los productos lcteos y leche cruda para hacer que los productos parecen tener un alto contenido de protena (Li et al . 2010 ) . Hay muchos mtodos de deteccin de melamina , incluyendo la cromatografa lquida de alto rendimiento ( HPLC ) , HPLC - espectrometra de masas ( Ding et al 2008 . ; Recibido el 24 de mayo de 2012; aceptado el 23 de junio de 2012. Este trabajo fue apoyado por la Fundacin Nacional de Ciencias Naturales de China (N 31171890, 30771425). Correspondencia: Jing Wang, de la Academia de Ciencias Agrcolas, Instituto de Estndares de Calidad y Tecnologa de Ensayos para la agro -productos, Zhongguancun South Street No.12, Haidian District, Beijing 100081, China chino. NUEVO MTODO PARA PROBAR MELAMINA EN LA LECHE Filigenzi et al. 2008) , cromatografa de gases- espectrometra de masas ( Miao et . Al 2009), la superficie mejorada espectroscopia Raman (Lin et al. 2008) , y la electroforesis capilar ( Yan et . Al 2009). La impresin molecular es un mtodo popular desarrollado en los ltimos aos que se basa en la hiptesis de cerradura y llave (Pauling 1940). En un disolvente adecuado, con la ayuda de las fuerzas intermoleculares, la molcula plantilla y el monmero funcional puede formar un complejo hospedador-husped. La adicin de un agente de reticulacin y el iniciador puede iniciar la formacin de polmeros estables. Despus de la elucin de la molcula molde, las cavidades que actan como sitios de unin especficos para los analitos se forman en el polmero. Estos polmeros de impresin molecular (MIP) tienen selectividad estable y especfica para las molculas diana. ( Wulff , Sarhan , y Zabrocki 1973 ) En comparacin con anticuerpos biolgicos , MIP tener mejor estabilidad fsica y qumica , son menos costosos , ms fciles de preparar , y podran utilizarse en una amplia variedad de separaciones cromatogrficas , sensores biomimticos , extracciones en fase slida , y muchas otras reas ( Koohpaei et al. 2008 ) . Los Fe3O4 nanopartculas son nanomateriales funcionales que se utilizan en el anlisis , el diagnstico clnico de cido nucleico , la focalizacin de medicamentos , enzima y la inmovilizacin de clulas , y muchos otros campos

debido a sus caractersticas magnticas , superpara - magnetismo, y la capacidad de ser funcionalizado para obtener actividad bioqumica ( Gubin 2009 ) . Sntesis de MIP en la superficie de las nanopartculas de Fe3O4 sera combinar su adsorcin selectiva y propiedades magnticas. Las perlas magnticas con AMIP cscara se podran utilizar en muchas aplicaciones para la deteccin de residuos ( Ansell y Mosbach 1998 ) . En el presente estudio, las partculas magnticas se recubrieron con MIP capaces de reconocer especficamente la melamina . Estos MIP magntica ( MMIPs ) se utilizaron para detectar la melamina en la leche bovina . EXPERIMENTAL Productos Qumicos El FeC13 - 6H2O, FeC12 - 4H2O, azobisisobutironitrilo y NaOH fueron adquiridos de Beijing Chemical Co. (Beijing, China). El PEG6000, PVA, y el cido oleico se obtuvieron de Sinopharm Reactivo Co. melamina fue adquirido de cido Alfa Aesar Co. Meth acrlico ( MAA) y dimetacrilato de etilenglicol ( EGDMA ) se obtuvieron en Acros Organics , y acetonitrilo y metanol fueron de Thermo Fisher Scientific . Sntesis de nanopartculas magnticas Una solucin de FeCl3 - 6H2O ( 5,4 g) y FeCl2 - 4H2O ( 1,99 g ) ( relacin molar 2:1) se prepar en 80 ml de H2O destilada dos veces , y luego se transfiri a un matraz de tres bocas y se agit a 600 rpm . La mezcla se calent a 70 C, y se burbuje N2 a travs de la solucin durante 30 minutos para eliminar O2. Una cantidad de 20 ml de una solucin acuosa de NaOH (16 g = ml) solucin que se haba burbujeado con N2 y luego se aadi rpidamente a la mezcla. Despus, la mezcla se agit bajo atmsfera de N2 durante 2 h para asegurar la reaccin lleg a la finalizacin. Cuando la reaccin lleg a la finalizacin, se observaron negro Fe3O4 nanopartculas en el matraz de tres bocas. Luego 1 g ofPEG6000 y 2 ml de cido oleico se aadieron al matraz para modificar la superficie de las nanopartculas . Las nanopartculas se lavaron despus con cada uno de los siguientes disolventes en secuencia: doble - H2O destilada, metanol, y acetonitrilo . Las partculas magnticas se recogieron con una rejilla de separacin magntica, y se secaron en un horno de vaco a 60 C durante 30 minutos (Harris et al. 2003) . Sntesis de MMIPs de melamina Melamina ( 0,25 mmol , 31.5mg ) , MAA ( 1 mmol , 0.085mL ) , DMSO ( 2 ml ) , y el glicol ( 5 ml ) se aadieron a un 0 matraz de fondo redondo de 100 ml . La mezcla fue vrtice se mezcla y se calent a 60 C hasta que la melamina completamente disuelto. Se aadi acetonitrilo (40 ml) , y la mezcla se agit a temperatura ambiente , y despus se 0 almacen en el refrigerador ( 4 C ) durante la noche . Se aadieron las partculas de Fe3O4 magnticos ( 100 mg ) , EGDMA ( 5 mmol , 0.95mL ) , y azobisisobutironitrilo ( 10 mg ) , y la solucin se burbuje con N2 durante 10 min 0 para eliminar O2 . El matraz se cerr hermticamente y se calent a 60 C durante 12 h , y despus se enfri en hielo a temperatura ambiente . Polmeros eran visibles en el matraz despus de la refrigeracin, y estos se aislaron despus de tratamiento con ultrasonidos durante 10 min y centrifugacin a 5000 r = min durante 5 min. ThemagneticMIPs se secaron en un horno de vaco a 60 C durante 30min (M. Ding et al. 2011) . Despus de la polimerizacin, las molculas de plantilla necesarios para ser trasladados de las cavidades de los polmeros. En este caso, los polmeros magnticas se lavaron con metanol al 95% = 5 % de cido actico glacial en un extractor de Medias dej durante 12 h para eliminar la plantilla de melamina a partir de la MIP. Los MMIPs se lavaron hasta que la melamina ya no se detect en el sobrenadante. Despus de la separacin de los MMIPs con la rejilla magntica, que se secaron en un horno de vaco a 60 C durante 2 h. (Li Et al . 2010 ) Microesferas de polmero Caracterizacin Las estructuras de la superficie y tamaos de partcula de las microesferas de polmero se analizaron por microscopa electrnica. El MIP tambin se analizaron por rayos infrarrojos de Fourier (FT-IR) espectrometra como pastillas de KBr . Los experimentos de adsorcin con el microesferas de polmero Para investigar el efecto del tiempo de reaccin sobre la absorcin de melamina , MMIPs (2 mg ) se colocaron en un tubo de centrfuga de 1,5 ml, y se aadi una solucin en acetonitrilo de melamina ( 60 mmol = L ) . La mezcla se 0 coloc en un agitador oscilante a 28 C, y se agit durante diversos perodos de tiempo. El MIP se aislaron a

continuacin, utilizando la separacin magntica y el sobrenadante se analiz por HPLC. Para cada tiempo de agitacin, se calcul la capacidad de unin por unidad de masa de polmero adsorbido. La MIP (2 mg) se colocaron en tubos de centrfuga de 1,5 ml, y se aadi una solucin en acetonitrilo de la melamina (1 ml, 0,1 - 64mg = L ) . La 0 mezcla se coloc en un agitador oscilante, y se agita durante 12 horas a 28 C. Se calcul la capacidad de unin por unidad de masa de polmero, y las isotermas de adsorcin de la melamina polmero impreso microesferas se obtuvieron. La selectividad de los MMIPs Atrazina, una estructura analgica de melamina , y el cloranfenicol , que es otro producto qumico prohibido en la leche , se utilizaron para investigar la selectividad de los MMIPs . Las estructuras de estos productos qumicos se muestran en la figura. 1. Soluciones estndar (1 mmol = L) de cada compuesto se prepararon en etanol: agua (9:1, v = v). Una alcuota (1 ml) de cada solucin estndar se aadi a MMIPs (2,0 mg) en un tubo Eppendorf. Los tubos se mezclaron vigorosamente durante 15 min a temperatura ambiente, y luego se eliminaron los MMIPs a partir del sobrenadante con un imn externo. La cantidad residual de cada compuesto en el sobrenadante se determin por HPLC. Anlisis HPLC Una solucin madre de patrn de melamina (1,000 g = L ) se prepar disolviendo una cantidad exactamente pesada de estndar de melamina en un disolvente de metanol y agua ( 04:01 ) . La solucin madre de patrn se diluy para preparar una serie de soluciones patrn de trabajo de melamina (0,1 - L = 256 mg) , que se utilizaron para construir una curva de calibracin . La HPLC se realiz en una columna Waters 2475 = 2998 ( Waters Corporation , Milford , MA ) con una columna polar HILIC - 100 SEPAX ( SEPAX , Newark, DE ) . La fase mvil fue acetonitrilo y agua ultra - pura con 3 mmol = L de acetato de amonio (09:01), y el caudal de la fase mvil fue de 1,0 ml = min. La melamina se detect a 240 nm usando un detector de matriz de diodos. Deteccin de melamina por HPLC en leche bovina Muestras de leche de vaca ( 2 ml ) se enriquecieron con melamina ( 2,5 mg = ml ) , y despus se transfirieron en tubos de centrfuga de 50 ml . Un reactivo de extraccin (18 ml ) se aadi a cada tubo . Se evaluaron los siguientes regentes de extraccin para la extraccin de melamina a partir de la leche : ( a) 18 ml de acetonitrilo puro ; ( b ) 18 ml de acetonitrilo con 0,8 gMgSO4 y 0,2 g de Na2SO4 como agentes de secado , y (c ) 13,5 ml de cido trifluoroactico al 1 % ( TFA ) y 4,5 ml de acetonitrilo . Cada tubo fue mezclado por ultrasonidos durante 10 min y se dej reposar durante 1 minuto, y despus 30 mg de MMIPs se aadi. Los tubos fueron mezclados vrtice durante 5 min, se centrifugaron durante 10 min a 8000 r = min, y se dejaron reposar durante 1 min, que se separ la mezcla en un lquido claro sobrenadante y sedimento blanco. TheMMIPs se transfirieron entonces a un tubo de 10 ml limpio, y prelavados y acondicionados con metanol. El sobrenadante de la ltima etapa fue entonces pipeta en el tubo, y el tubo se agit por lo melamina entr en contacto directo con los PIM y se transfiere a ellos desde la matriz de la muestra. Un imn externo se utiliza para retener los MMIPs en el tubo mientras que se lavaron dos veces para eliminar las impurezas. La melamina en los MMIPs se eluy despus con 1,5 ml de metanol: cido actico (95:5, v = v) tres veces. Los eluatos se combinaron y se evaporaron a sequedad bajo una corriente de N2. El residuo se resuspendi en acetonitrilo puro de grado HPLC, se filtr a travs de un filtro de membrana de 0,22 mm y se inyect en la HPLC ( Chen 2009 ) . RESULTADOS Y DISCUSIN Caracterizacin de las partculas magnticas y MMIPs Las partculas de Fe3O4 se sintetizaron y se revistieron con cido oleico y PEG 6000 para formar una cscara hidrfobo y aadir algunos grupos qumicos necesarios. El Fe3O4 recubierto entonces unido fcilmente a MAA y EGDMA, que se utiliza como un monmero funcional y cruzar enlazador para sintetizar los MMIPs . El dimetro medio de las nanopartculas fue de aproximadamente 10 nm .

La Figura 1 muestra el espectro de FT - IR de las nanopartculas modificadas Fe3O4. El pico a 560 cm - 1 es un pico caracterstico de Fe3O4, y se puede atribuir a Fe -O estiramiento y flexin vibraciones. Tambin se observaron picos a 580 y 400 cm - 1 debido al desplazamiento causado por el efecto de tamao de las nano partculas. La banda de absorcin ancha cerca de 3400 cm - 1 corresponde a enlaces de hidrgeno, y los picos a 2920 y 3024 cm - 1 se puede atribuir a las vibraciones de CH - 2. Los picos a 1500 cm - 1 y 1150 cm - 1 son de OH - flexin y el estiramiento de la CO hidroxilo alcohlico, respectivamente, en PEG6000. Los dos picos a 1700 cm - 1 (tramo CO) y 3444 cm - 1 (O- H estiramiento) indican grupos carboxlicos estn presentes en el polmero. En el espectro de FT - IR de la MMIPs (Fig. 2 ) , se observaron picos a 1700 cm - 1 ( tramo CO) y 3444 cm - 1 ( tramo OH ) de los grupos carboxlicos en la superficie del polmero . Los picos en 1601, 1492, y 1452 cm - 1 se pueden atribuir a benceno, y picos a 700 y 750 cm - 1 corresponden a los picos de mono - sustituidos de benceno. Los picos a 2923 y 3025 cm - 1 son de metileno y CH. El pico a 554 cm - 1 es de Fe -O. Estos resultados muestran los MMIPs tienen los picos de absorcin caractersticos de Fe3O4, lo que confirma que contienen las nanopartculas magnticas. Caractersticas de adsorcin, estudios de fijacin y anlisis Scatchard La absorcin de melamina por MMIP aument a medida que aument el tiempo de agitacin, pero la mayor parte de la absorcin se produjo en la primera 30min ( fig. 3 ) . La absorcin de melamina por MMIPs y MNIPs aument a medida que la concentracin de melamina aument. La cantidad de melamina adsorbida por los PIM fue mayor que la de los PIN , debido a la capacidad de unin especfica de los PIM para la melamina ( fig. 4 ) . El anlisis de Scatchard es un mtodo para estudiar caracteres de sitios de unin de polmeros de impresin molecular. En esta ecuacin, Q significa la capacidad de absorbancia ; C se refiere a la concentracin del sustrato de melamina ( mg = L ) ; Qmx significa la capacidad mxima de unin aparente ; mientras Kd es la constante de disociacin en el sitio de unin . Por trazado Q = C vs Q y la bsqueda de los nmeros de las curvas de regresin, un nmero de tipos de sitios de unin podra ser asegurado. Anlisis Scatchard (Fig. 5 ) indic que haba dos tipos de sitios de unin en las MMIPs . Sitio de unin 1 trabaj en una gama apropiada de concentraciones de sustrato, con Qmax1 1,3857 y Kd1 6,8611 segn Scatchard ecuacin q = C melamina Qmax QKd : El otro sitio de unin, con Qmax2 61.7047 y Kd2 0,0149, trabaj principalmente en concentraciones muy bajas o altas de sustrato. Esto podra explicarse por el nmero relativamente bajo de sitio de unin 1 y su afinidad relativamente alta en comparacin con el sitio de unin 2. Sitio de unin 2 sera funcional cuando haba muy bajas concentraciones de melamina o en soluciones con concentraciones muy altas de melamina , lo que conducira a la saturacin del sitio de unin 1 . La selectividad de los MMIPs Incluso en la presencia de la atrazina y el cloranfenicol , la melamina se adsorbi selectivamente por el MMIPs ( fig. 6). El anlisis de muestras autnticas leche bovina El mtodo fue validado mediante el anlisis de muestras de leche bovina autnticos para la melamina . Los procedimientos de extraccin y limpieza se han simplificado en un solo paso. Efecto Matrix Los ingredientes complejos en matrices de muestras pueden aumentar en gran medida el ruido de fondo y afectar a la sensibilidad analtica. Algunos estudios han informado de que las tcnicas de extraccin selectiva se pueden utilizar para reducir o incluso eliminar los efectos de la matriz (M. Ding et al. 2011). Los cromatogramas (Fig. 7) se obtuvieron de la melamina en muestras de leche con pas que se extrajeron con los MMIPs. Se observ una ligera mejora de iones para la melamina usando las MMIPs. Estos resultados muestran los MMIPs eliminan el efecto de la matriz.

Rendimiento analtico Los cromatogramas de melamina extrados de muestras de leche bovina con pas se muestran en la figura. 7. La Columna HILIC Polar- 100 dio buenos modelos de picos y alta sensibilidad para la melamina. Para las muestras adicionadas (256 mg = 0,1 - L), el anlisis por HPLC de la melamina en la leche enriquecida bovina mostr una buena linealidad con coeficientes de correlacin (r) entre 0.995 y 0.999. El lmite de deteccin , determinado como la cantidad mnima de cada analito en la matriz de la muestra que proporciona una relacin seal - a - ruido de tres, fue 29,2 ng = ml . Las recuperaciones de melamina variados con los tres reactivos de extraccin diferentes. Para acetonitrilo puro y acetonitrilo con los agentes de secado las recuperaciones de melamina fueron 99,2 % y 105,2 %, respectivamente. Con TFA acetonitrilo se recuper ninguna melamina , a pesar de que esta mezcla de disolventes es ampliamente utilizado en otros mtodos de extraccin de melamina . La razn de esto puede ser que los MMIPs no pudieron capturar eficazmente melamina en el cido fuerte ( 1 % de TFA ) , ya que puede daar los sitios de unin de la MIP . Las recuperaciones en acetonitrilo fueron> 90 %, lo que es satisfactorio para el anlisis de trazas. Los resultados del mtodo de extraccin propuesto se compararon con los de otros mtodos de anlisis, incluyendo MIP - microextraccin en fase slida ( Hu et al . 2008 ) y la extraccin en fase slida - MIP ( Caro et al . 2005 ) . El mtodo propuesto es ms sencillo que estos otros mtodos, ya que no requiere centrifugacin o filtracin adicional. En su lugar, los analitos se extraen fcilmente, limpiada, y se separan de la matriz de la muestra con un imn externo. Esto podra reducir el tiempo de anlisis. Para evitar el problema de la molcula plantilla de fugas, el uso de una molcula de plantilla artificial con una estructura qumica similar a la melamina podra ser investigada en el futuro. Una molcula de plantilla artificial sera asegurar la plantilla y de los picos de sustrato fueron bien separados en el cromatgrafo , y esto sera eliminar la interferencia de las molculas de plantilla filtrados . El anlisis de muestras autnticas Muestras de leche fresca se compraron de un supermercado local, y se analizaron usando el mtodo descrito anteriormente (Selectividad de la seccin MMIPs ) . La melamina no se detect en estas muestras. CONCLUSIONES En este estudio, se sintetizaron los granos MMIPs con ncleo de nanopartcula magntica y melamina especfica MIP cscara. Los MMIPs se utilizaron con xito para separar melamina a partir de muestras de leche. En lugar de utilizar centrifugacin y filtracin como en la extraccin en fase slida convencional, la melamina se adsorbi selectivamente y se recogi rpidamente por los MMIPs con la ayuda de un imn externo. En comparacin con los procedimientos de preparacin de muestras convencionales, tales como extraccin con disolventes, centrifugacin, la limpieza, y la concentracin por extraccin en fase slida, esta tcnica es eficiente, simple y rpida. Los polmeros magnticos pueden ser reciclados y reutilizados muchas veces. Este mtodo es prometedor para la determinacin de residuos de plaguicidas, contaminantes, medicamentos veterinarios y aditivos prohibidos en muestras de alimentos. En comparacin con los mtodos convencionales, este mtodo tiene requisitos ms bajos de disolvente y es menos costoso.