TEMARIO:

Parte I: PRINCIPALES BIOMOLCULAS

I/ Los Aminocidos y los Pptidos
A/ LOS AMINOCIDOS
1 2 3 4 5 6 Generalidades Aminocidos proteicos Propiedades especiales de aa proteicos Reactividad Propiedades cido/base de los aminocidos Solucin tampn

A/ LOS PPTIDOS
1 2 3 4 5 6 Generalidades El enlace peptdico Propiedades de los pptidos tiles para valoracin Propiedades cido/base de los pptidos Oligopptidos con actividad biolgica Los Neuropptidos

II/ Introduccin a las Protenas:

A/ Estructura de las protenas
1Generalidades de las protenas 2 Niveles estructurales 3 Principales estructuras secundarias; Hlice 4 Principales estructuras secundarias; Laminar 5 Principales estructuras secundarias; Codos

B/ Protenas Fibrosas
1 Las Queratinas 2 El Colgeno

B/ Las Protenas Globulares

1Generalidades 2 Plegamiento de las protenas globulares 3 Desnaturalizacin de las protenas globulares

III/ Tcnicas de purificacin y anlisis de protenas

A/ Preparacin de muestras
1 Homogeneizacin 2 Tcnicas de Purificacin de protenas

B/ La Centrifugacin
1 2 3 4

Generalidades La Centrifugacin Diferencial Centrifugacin en Gradiente de Densidad Ultracentrifugacin analtica

C/ Precipitacin, Liofilizacin y Dialisis

1 Precipitacin isoelctrica fraccionada 2 Precipitacin fraccionada por eliminacin del agua de solvatacin 3 Dialisis 4 Liofilizacin

D/ Cromatografa
1 2 3 4 5 Generalidades Cromatografa Cromatografa Cromatografa Cromatografa de de de de Reparto Adsorcin, de Intercambio Inico Permeabilidad Afinidad

D/ Electroforesis

1 Generalidades 2 Electroforesis de zona 3 Electroforesis en geles de Poliacrilamida - SDS (PAGE-SDS)

D/ Otros mtodos

1 Clculo del pI de las protenas 2 Clculo de resultados de purificacin

IV/ Las Protenas

A/ Clasificacin de las protenas
1Por su composicin 2 Por su estructura 3 Por su funcin

B/ Relaciones estructura funcin

1 Generalidades 2 Tcnica experimental de clculo de KD 3

3 Fraccin de ligando unido (%) 4 Fraccin de ligando unido teniendo en cuenta la interaccin

C/ Las Apoprotenas
1 Generalidades, el grupo Hemo 2 La Mioglobina 3 La Hemoglobina

D/ La Hemoglobina
1 2 3 4 5 6 7

Cambios conformacionales Influencia del pH en la conformacin de la Hemoglobina Otros Efectores Alostricos; CO: El 2,3-Bifosfoglicerol Inhibidores No Alostricos Importancia de la presencia de Inhibidores Patologas de la Hemoglobina

IV/ Las Enzimas

A/ Generalidades en Enzimologa
1Introduccin 2 Nomenclatura y clasificacin de las Enzimas 3 Los Cimgenos 4 Las proteasas

B/ Complementaridad Enzima Sustrato

1 Modelos de complementaridad Enzima Sustrato 2 Interacciones de complementaridad entre Enzima y Sustrato 3 Factores que afectan a las interacciones Enzima Sustrato 4 Los Cofactores 5 Parmetros externos que afectan a las interacciones Enzima Sustrato

C/ Cintica de las Reacciones Enzimticos

1Generalidades de Cintica Enzimtica 2 Medida de la velocidad de una reaccin enzimtica (V) 3 Ecuacin de velocidad de Michaelis Mentel 4 Ecuacin de velocidad de Lineweaver Burk 5 Deduccin de la ecuacin por el mecanismo de la reaccin 6 Hiptesis de Brigs Haldane o Estado Estacionario 7 Hiptesis del Equilibrio Rpido 8 Conceptos importantes en cintica enzimtica

D/ La Inhibicin Encimtica

1Generalidades 2 Inhibicin Irreversible 3 Inhibicin Reversible Competitiva 4

4 Inhibicin Reversible No Competitiva 5 Inhibicin Reversible Acompetitiva

E/ Regulacin de la Actividad Enzimtica

1Actividad Enzimtica del Metabolismo 2 Regulacin Alostrica 3 Regulacin de Equilibrios polimerizacin/despolimerizacin 4 Regulacin por modificacin reversible 5 Regulacin por activacin proteoltica

F/ Isoenzimas y Agrupaciones de Enzimas

1 Las Isoenzimas 2 Agrupaciones Multienzimticas

V/ Nuclesidos y Nucletidos
A/ Introduccin
1 Funciones de los Nucletidos 2 Estructura general de nuclesidos y nucletidos 3 Nomenclatura 4 Principales tipos de Nucletidos

B/ Nucletidos no nucleicos:

1 Nucletidos Difosfato (NDP) y Trifosfato (NTP) 2 El Coenzima Nicotinamida Adenina Difosfato (NAD+/NADH) 3 El Coenzima Fosfato de Riboflavina (FMN, Flavin Mono Nucleotido) 4 El Coenzima A (CoA) 5 Nucletidos cclicos

C/ Los cidos Desoxirribonucleicos (DNA)

1Generalidades 2 Estructura 3D del DNA 3 Tipos estructurales del DNA 4 Desnaturalizacin y Renaturalizacin del DNA

D/ Los cidos Ribonucleicos (RNA)

1 Generalidades 2 Principales tipos de RNA 3 Las Nucleasas

VI/ Procesos Moleculares de la Expresin de la Informacin Gentica

A/ La Replicacin del DNA
1 Generalidades 2 Experimento de Meselson & Stahl 5

3 4 5 6

Generalidades de Replicacin del DNA en procariontes Etapas de Replicacin del DNA en procariontes La Replicacin del DNA en eucariontes Mecanismos de Reparacin de la Replicacin del DNA

B/ La Transcripcin; del DNA al mRNA

1 2 3 4

Generalidades La Transcripcin en procariontes Desarrollo de la Transcripcin en procariontes La Transcripcin en Eucariontes

C/ La Traduccin; del mRNA a las Protenas

1 Generalidades 2 Estructura del tRNA 3 La Activacin de Aminocidos 4 La Unin Anticodn mRNA 5 La maquinaria esencial para la sntesis de protenas; Los Ribosomas 6 Funcionalidad de los Ribososmas 7 La Sntesis de Protenas en Procariontes 7.1La Iniciacin 7.2 La Elongacin 7.3 La Terminacin 7.4 Balance Energtico 8 La Sntesis de Protenas en Eucariontes 9 Las Rutas de Transporte de protenas en Eucariontes 10 El Plegamiento de las Protenas en Eucariontes 11 Maduracin de las Protenas 11.1 Modificacin de aminocidos 11.2 Procesamiento Proteoltico

Parte II: EL METABOLISMO

I/ Conceptos bsicos
A/ INTRODUCCIN
1 Generalidades 2 Control del metabolismo

B/ TERMODINMICA

1 Bases de la Termodinmica 2 Clasificacin Termodinmica de las Reacciones

C/ COMPUESTOS DE ELEVADA ENERGA DE HIDRLISIS

1Generalidades 2 El ATP y el GTP

D/ COMPUESTOS REDUCTOR

DE

ELEVADA

ENERGA

DE

PODER

1 Reacciones de Oxido-Reduccin (Red-Ox) 2 La Energa en las Reacciones Red-Ox 3 Poder Reductor en el Metabolismo

I/ Metabolismo de Degradacin de la Glucosa

A/ DEGRADACIN DE LA GLUCOSA A CO2
1 2 3 4 5 6 7 8 Primera fase de la Gliclisis Segunda fase de la Gliclisis Regulacin de la Glicolisis Degradacin anaerbica del Piruvato Descarboxilacin aerobia del Piruvato en Acetil-CoA Regulacin del Complejo Piruvato dh Descarboxilacin de Acetil-CoA en el Ciclo TCA Regulacin del ciclo TCA

B/ PARTICULARIDADES TRICARBOXLICOS
1 2 3 4

DEL

CICLO

DE

LOS

CIDOS

Estereoisometra de la Aconitasa Carcter anfiblico del ciclo TCA Reacciones Anaplerticas; Carboxilacin del Piruvato Reacciones Anaplerticas; Ciclo del Glioxilato

C/LA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRNICO DE LA RESPIRACIN Y LA FOSFORILACIN OXIDATIVA

1 2 3 4 5 Generalidades Mecanismo de la cadena respiratoria Los Citocromos El transporte de electrones en la Cadena Respiratoria La Fosforilacin Oxidativa

D/ VAS DE REOXIDACIN DEL NADH CITOPLASMTICO

1 Generalidades 2 Lanzadera de Glicerol fosfato 3 Lanzadera de Malato

E/ BALANCE DE LA DEGRADACIN DE LA GLUCOSA

II/ Metabolismo de Biosntesis de Glucosa

A/ LA GLUCONEOGNESIS
1 Generalidades 2 Gluconeognesis a partir del Lactato 3 Patologas de inhibicin de la Gluconeognesis

B/ EL GLUCGENO Y SU METABOLISMO

1 Introduccin al Glucgeno 2 Biosntesis del Glucgeno 3 La degradacin del Glucgeno 4 Generalidades sobre la regulacin del metabolismo del Glucgeno 5 Regulacin de Glucgeno fosforilasa 6 Control hormonal sobre la regulacin de Glucgeno fosforilasa 7 Regulacin de Glucgeno sintasa y su control hormonal 8 Ruta de las Pentosas, o del Fosfogluconato 9 Glutatin y Patologa de la Ruta de las Pentosas en Eritrocitos

III/ Metabolismo de Lpidos

A/ LOS PRINCIPALES LPIDOS
1 2 3 4 5 Estructura y Nomenclatura Los cidos Grasos de las clulas Los Triglicridos Los Fosfolpidos Los Esteroides

B/ METABOLISMO DE DEGRADACIN DE LPIDOS

1 La Digestin de los Triglicridos en la Luz Intestinal 2 Degradacin de los Triglicridos en la mucosa intestinal 3 Lipoprotenas de la sangre 4 Recorrido de los Quilomicrones en la sangre 5 Destino de los Triglicridos en clulas Adiposas Musculares 6 Funcin de las Apoprotenas de alta densidad, HDL 7 Enfermedades cardacas relacionadas 8 Movilizacin de los cidos Grasos del tejido Adiposo 9 La -Oxidacin de los cidos Grasos ( -Ox) 10 Degradacin de los Fosfolpidos

C/ METABOLISMO DE BIOSNTESIS DE LPIDOS

1 2 3 4 5 6 7 Biosntesis de Cuerpos Cetnicos Biosntesis de cidos Grasos Va del Citrato La Biosntesis de Triglicridos Biosntesis de Fosfolpidos a partir de Diglicridos Biosntesis de Colesterol a partir de HMG-CoA Regulacin de HMG reductasa

IV/ Metabolismo Nitrogenados

de

los

Compuestos

A/ METABOLISMO DE DEGRADACIN DE AMINOCIDOS

1 Generalidades sobre el metabolismo general de los Aminocidos 2 Digestin de Protenas de la dieta 3 Desaminacin de los aminocidos 4 Eliminacin del Amoniaco en exceso consumido por los organismos 5 El Ciclo de la Urea 6 Descarboxilacin de aminocidos 7 Metabolismo del Propionil-CoA

B/ METABOLISMO DEL FRAGMENTO MONOCARBONADO

1 Generalidades sobre el metabolismo del Fragmento Monocarbonado 2 Origen del Fragmento Monocarbonado 3 La Metionina como Donador Universal de grupos Metilo 4 Biosntesis de Aminocidos 5 Biosntesis de Nuclesidos Pricos 6 Biosntesis de Nuclesidos Pirimidnicos 7 Biosntesis de Desoxirribonucletidos 8 Catabolismo de Nuclesido

Parte I: PRINCIPALES BIOMOLCULAS

I/ Los Aminocidos y los Pptidos:
A/ LOS AMINOCIDOS:
1 Generalidades: Los aminocidos, aislados por primera vez en el siglo XIX, forman las protenas al asociarse linealmente. Poseen un carbono central, con H, NH2 (amino), COOH (carboxilo) y una cadena lateral R variable. La regin cte de los aa es siempre polar: presenta un grupo cido con carga negativa, y uno bsico con carga positiva: NH 3+ CH COOLos aminocidos se diferencian por su cadena R. Slo 20 aminocidos conforman las protenas recin sintetizadas y son codificados por el ADN. Despus de maduracin, las protenas pueden presentar ms de 100 aa distintos, todos derivados de los 20 iniciales (EJ; Prolina > Hydroxiprolina). Los 20 aa iniciales se clasifican, entre otros, como aminocidos: Ambos grupos, amino y carboxilo, se encuentran en posicin . Reciben el nombre de aa proteicos. Muchos aa no proteicos son tambin vitales. Por ejemplo la Alanina es un importante neuroransmisor. 2 Aminocidos proteicos: Por las propiedades de su radical R podemos clasificarlos en 4 grupos: Los aa NO POLARES son aquellos cuyo R no es polar, ni tiene carga: Alanina (Ala; A) Valina (Val; V) Leucina (Leu; L) Isoleucina (Ile; I) Prolina (Pro; P) Fenilalanina (Phe; F)

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Triptfano (Trp; W) Metionina (Met; M)

Los Aa POLARES pueden ser de tres tipos en funcin de su carga. SIN CARGA, pueden ser bsicos con grupos alcohol (OH) o tiol (SH): Glicina, Glicocola (Gly; G) Serina (Ser; S) Treonina (Thr; T) Cistena (Cys; C) Tirosina (Tyr; Y) Asparagina (Asm; N) Glutamina (Gln; Q) CON CARGA NEGATIVA, son cidos: Aspartato (Asp; D) Glutamato (Glu; E) CON CARGA POSITIVA, son bsicos: Lisina (Lys; K) Arginina (Arg; R) Histidina (Hys; H) 3 Propiedades especiales de aa proteicos: Gly es el aa ms pequeo; Su R es un tomo de H. Se duda de su naturaleza; polar, o no polar? Pro es el nico aa que no tiene su grupo amino libre: se encuentra unido a R por una estructura de ciclo pentagonal. Otros aa tienen ciclos aromticos en R. Solamente dos aa contienen un tomo de azufre: Met (tioeter) y Cys (tiol). Todos los aminocidos, salvo Gly, presentan en el C central del grupo constante un centro quiral, produciendo efectos pticos de polarizacin de la luz. A diferencia de los glcidos naturales todos de la serie D, los aa proteicos son siempre de la serie L (L-aa), polarizando la luz en un ngulo positivo. Todos los aa tienen propiedades espectroscpicas: absorben luz UV. Se puede obtener con un colormetro su absorbancia. MAX=220nm; para aa con cilos aromticos MAX=260nm. 4 Reactividad: Carboxilo + Alcohol > Ester + Amina > Amida + Reductor > Alcohol + descarboxilacin > Amina Amina + Aldehdo + Ninhidrina > Imina R C = N R > Fuerte oxidacin 11

Esta ltima reaccin es utilizada para confirmar la presencia de aa en laboratorio, gracias a la aparicin de un compuesto coloreado. No aparece en el caso de Pro, puede aparecer una mancha amarillenta. Todos los aa presentan propiedades cido base. En funcin del pH fisiolgico, los grupos amino, carboxilo y otros grupos polares pueden encontrarse o no ionizados. Por ello los aa se comportan como cidos o bases, respondiendo a las leyes de Bronsted y Lowry. 5 Propiedades cido/base de los aminocidos: Cada cido tiene su base conjugada y viceversa. Por ello se determina Ka, cte de disociacin del cido en el punto en el que se alcanza el equilibrio entre acido y base. Ka = [Base] [H+] / [cido] pKa = -log Ka pH = -log [H+] ECUACIN DE HENDERSON HASSELBACH: pH = pKa + log ([Base] / [cido]) Los grupos se disocian por orden decreciente de acidez. Un aminocido presenta siempre por lo menos dos grupos con actividad ac/base (amino y carboxilo), con Ka propia para cada grupo. A pH muy bajo, todos los grupos estn protonados al mximo: COOH, NH3+. A medida que lo hacemos aumentar los grupos se disocian: El 50% de un grupo se ha disociado ya cuando pH = pK a. Los estados de ionizacin se prosiguen ordenadamente. A pH elevado todos los grupos de han disociado: COO-, NH2. EJEMPLO: Alanina. COOH CH NH3+ CH3 [Ala +] COO- CH NH3+ CH3 [Ala 0] pH = pKa1 50% [Ala +] 50% [Ala 0] COO- CH NH2 CH3 [Ala -] pH = pKa2 50% [Ala 0] 50% [Ala -]

Podemos visualizarlo en un grfico de las concentraciones en funcin del pH: En los puntos donde la curva es vertical, slo se encuentra una especie (Ala +, Ala 0 o Ala -)

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En los valles, pH = pKa, y las concentraciones entre las dos especies son iguales (pKa1, pKa2). Conociendo el pH, podemos calcular en cada punto el estado de equilibrio de las especies gracias a la ecuacin de Henderson Hasselbach. El punto isoelctrico pI es la media de los pK de equilibrio de [aa 0]. Si pH = pI, se encuentra la especie con carga neta nula. Si pH < pI, carga neta +. Si pH > pI, carga neta -. EJEMPLO: Alanina; pI= (pKa1 + pKa2) / 2 = 6,61 Los aminocidos cidos y los bsicos presentan una curva con cuatro regiones verticales y tres mesetas, pues tienen cuatro formas y tres pKa. Los aa cidos tienen dos mesetas (pK) con pH < 7. Las especies presentes son: [aa +], [aa 0], [aa -], [aa 2-]. Los aa basicos tienen dos mesetas (pK) con pH > 7. Las especies presentes son: [aa 2+], [aa +], [aa 0], [aa -]. Hys presenta una meseta central casi neutra (pH = 6). 6 Solucin tampn: Se trata de soluciones capaces de captar H + y OH- neutralizando cambios de pH. Se forma por una alta concentracin de cido dbil en sus dos formas (acido + base conjugada), al 50%. Para obtener un tampn con aa debe seleccionarse el aa cuyo pKa sea ms prximo al pH dado para la solucin. (Caso ideal: pK a = pH).

A/ LOS PPTIDOS:
1 Generalidades: Cortas cadenas de aminocidos unidos linealmente. Algunos, no codificados por el ADN, suelen derivar de la hidrlisis de protenas y de otros pptidos, por la accin de enzimas Proteasas. Los dipptidos se forman por dos aa. Por ejemplo, la insulina es un dipptido no derivado de protena. Los oligopptidos se forman de menos de 20 aa. Los polipptidos son los pptidos ms grandes. Incluyen a las protenas. Las uniones entre los aa son uniones covalentes que se producen entre el grupo carboxilo del primer aa y el grupo amino del siguiente. El pptido presenta por lo tanto polaridad: El primer aa presenta solo un grupo amino libre: el amino terminal a-t. El ltimo aa tiene sin embargo un nico grupo carboxilo libre: el carboxilo terminal ct.

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2 El enlace peptdico: Se trata de un enlace covalente y rgido. Al producirse por ataque nuclefilo, se desprende una molcula de agua. NH2 CH COOH R + NHH CH COOH R NH2 CH CO NH CH COOH R R + H2O El CO que queda del grupo COOH presenta un doble enlace. Al unirse con el grupo amino del siguiente, el carbono reparte el doble enlace con la siguiente proporcin: 60 % C=O; 40 % C=N. Este enlace doble entre C y N hace del enlace una unin rgida sin propiedad de giro, a diferencia de los otros enlaces N C y C C. Este enlace no es termodinmicamente favorable, y no suele darse espontneamente. 3 Propiedades de los pptidos tiles para valoracin: Los pptidos presentan propiedades pticas, desplazando como los aa proteicos el angulo de la luz polarizada. Tambin presentan propiedades qumicas que permiten poner en evidencia su presencia: la reaccin de Binnet, exclusiva para protenas y peptidos. En presencia de los amino terminal, las sales de cobre producen color. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de pptidos. Al igual que los aa que los conforman, los pptidos se comportan como cidos y bases. 4 Propiedades cido/base de los pptidos: Solo mantienen sus propiedades ac/base los grupo a-t, c-t, y aquellos grupos de R ionizables. Ala no tiene grupos ionizables en R, por lo tanto AlaAlaAla tiene los mismos grupos ionizables que Ala, y su curva tendr el mismo numero de mesetas y pKs. Ala: AlaAlaAla: NH2 CH COOH R NH2 CH CO NH CH CO NH CH - COOH R R R

Sin embargo, los valores de esos pK cambian: Cuantos ms aa hay de por medio, ms separados se encuentran los grupos ionizables. En el caso de Ala, pKa1 = 2,35; para AlaAla, pKa1 = 3,12; y

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en el caso de AlaAlaAla, pKa1 = 3,39. La fuerza del grupo cido carboxlico disminuye visiblemente. Segn aparecen en R ms grupos ionizables, se aaden ms mesetas a las dos bsicas (a-t y c-t). AlaAlaLysAla: NH2 CH CO NH CH CO NH CH CO NH CH COOH R R R R NH2 En el caso de varios aa iguales con grupos ionizables en R, todos ellos se desprotonaran de golpe con el mismo pH. Ejemplo: LysLysLysLys tendra, al igual que Lys, tres mesetas. Sin embargo, en la meseta correspondiente a NH2 de R, se desprotonaran los grupos de 4 en 4, no de 1 en 1. Para calcular el pI de un pptido tenemos que tener en cuenta esto ltimo como coeficiente.

Glu NH2 COOH pH BAJO P 3+: pKa1 P 2+: COOpKa2 P +: pKa3 P 0: NH2 NH3+ COONH3+ NH3+

Ala R

Lys NH2

Lys COOH NH2

COOH COOH R NH3

+

NH3

COOH

NH3+

NH3+

COOR NH3+ NH3+

COO15

COOpKa4 P 2-: pH ALTO NH2 COO-

NH3+

NH3+

COOR NH2 NH2

En este caso encontramos cuatro pKs y cuatro mesetas en la curva (y no cinco), pues los dos NH 2 de R de Lys se desprotonan de un mismo paso. Para el calculo de pI, es decir, el valor de pH para el cual hay 100% de [P 0], debemos utilizar pKa3 y pKa4, sin olvidar que [P +] ha de ser el doble de [P 2-]: (P +) = 2(P 2-) pI = (pKa3 + pKa4 (log 2)) / 2 5 Oligopptidos con actividad biolgica: No suelen ser de origen proteico. Ala libre es de por s un neurotransmisor: Ala: NH3+ CH2 CH2 COOH (Grupo carboxilo en ).

Carnosina: Ala_Hys. Anserina: Ala_N-3-metil-His. Se encuentra como tampn ac/base en el msculo. Glutatin: Glu_Cys_Gly. Muy abundante en todos los seres vivos. Unin Glu-Cys especial, mediada por el carboxilo del R de Glu, no por el -carboxilo. NH3+ CH CH2 CH2 CO NH CH CO NH CH2 COOCOOR SH El grupo tiol puede reaccionar reduciendo otra protena. En ese caso queda oxidado y pierde su protn. Dos molculas de glutatin oxidadas pueden quedar unidas por un puente disulfuro. Esta forma est presente en eritrocitos: mantiene el hierro en forma ferrosa evitando que se oxide. Evita tambin la oxidacin en otros tipos celulares, por ejemplo, evitando enfermedades neurodegenerativas. R1 S S R2

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Muchos Antibiticos son oligopptidos o derivados de aa con uniones particulares, como la Penicilina, Gramicidina S o Bacitracina A. Gramicidina S: Leu D-Phe Pro Val Orn Orn Val Pro D-Phe Leu

Penicilina: S R CO NH CH CH CO N Cys C CH3 C COOH Val CH3

Muchos importantes pptidos son Hormonas, como, por ejemplo, la insulina y el glucagn, de efectos contrarios, secretados en el pncreas, que controlan el metabolismo de hidratos de carbono y lpidos. Tambin lo son Serotonina, Dopamina, Estamina o Adrenalina. 6 Los Neuropptidos: Son la mayor familia de pptidos con actividad biolgica. Se forma de ms de 100 tipos de peptidos. Los neuropptidos (NP) se encuentran en el sistema nervioso. Pueden ser neurotransmisores o tener diversas funciones moduladoras como transmisin peptidrgica. Los NP controlan y modulan el apetito, la agresividad, el dolor o la memoria. Endorfinas y Encefalinas se oponen a la transmisin del dolor. Son los pptidos opiodes u opiaceos. Presentan receptores en las mbrs de neuronas, comunes a los de la morfina, produciendo el mismo efecto. (Morfina no es un NP). Se relacionan con la acupuntura y tambin con el sistema inmune. Las encefalinas son oligopptidos: Tyr Gly Phe Leu; Tyr Gly Phe Met. Las endorfinas presentan mayores pesos moleculares. Muchos importantes neuropptidos son hormonas secretadas en el eje Hipotlamo-Hipfisis. Reciben el nombre de Factores de Liberacin y controlan toda la produccin endocrina de nuestro cuerpo, como GnRH, hormona liberadora de gonadotropinas, que controla los ciclos sexuales.

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II/ Introduccin a las Protenas:

A/ Estructura de las protenas:
1Generalidades de las protenas: Son polipptidos, algunos de muy gran tamao, cuya existencia se debe a su sntesis por un ribosoma, bajo control de la informacin gentica. Su estudio y analisis son muy complejos. Han comenzado con las tcnicas de anlisis con Rayos X. La configuracin de una protena es la conformacin debida a sus enlaces. Si la configuracin cambia la molcula es distinta, como en el caso de la estereoisomera (L D). La conformacin de una protena cambia cuando giran sus enlaces, en funcin de las interacciones entre sus aminocidos, sin que cambie la molcula. Una protena puede cambiar constantemente de conformacin. EJEMPLO: Priones: PrPC Cambio Conformacional PrPSc

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Forma normal agresiva

Forma

Si por una mutacin cambia o desaparece un aa, la prot puede perder sus propiedades naturales. Algunas posiciones de aa se presentan invariables a lo largo de la evolucin. 2 Niveles estructurales: Las protenas presentan distintos niveles estructurales. El tipo de estructura depende en gran medida de su tamao. Estructura primaria: Secuencia linear de aa, de n-t a c-t. Sirve para predecir estructuras superiores. Estructura secundaria: ngulo y disposicin de los aa respecto a los aa colindantes. Algunas estructuras, como hlice o laminar, se repiten frecuentemente en distintas protenas. Estructura terciaria: Plegamiento total en el espacio del conjunto de aa, generalmente de aspecto globular. No todas las protenas presentan este tipo de estructura, descubierta con Rayos X. Estructura cuaternaria: Asociacin de varios polipptidos proteicos en un polmero. Solo en algunos casos. Por ejemplo, homodmeros o heterodmeros. Cada nivel estructural es determinante sobre el siguiente. Se habla de Protenas Oligomricas cuando estas forman un polmero por enlaces de fuerza dbil, como los puentes disulfuro. Las protenas de estructura secundaria tambin son llamadas Protenas Fibrosas. Son estructurales de los tejidos y poco solubles en agua. Presentan diagramas sencillos de Rayos X. Las protenas de estructuras terciaria o cuaternaria tambin son llamadas Protenas Globulares. Son hidrosolubles pues al plegarse sobre s mismas pueden presentar en superficie sus regiones ms hidroflicas. Las Estructuras Supersecundarias son secuencias de estructuras secundarias que se repiten frecuentemente en protenas globulares formando dominios estructurales localizados. Por ejemplo, laminar; hlice; laminar, o bien, laminar; codo; laminar; codo 3 Principales estructuras secundarias; Hlice: Hlice es una de las estructuras ms repetidas y muy estable. Puede conformar protenas fibrosas como las queratinas, o encontrarse en cierto porcentaje en protenas globulares. En vista transversal se observa como un cilindro hueco que expone hacia el exterior las cadenas R hidrofbicas. Longitudinalmente se presenta como una estructura helicoidal dextrgira (que gira naturalmente a la derecha), pues siendo los aa de la serie L es termodinmicamente ms favorable. Se forman, cada cuatro aminocidos, enlaces de hidrgeno intracatenarios entre O y N: R1 O H N R2

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Estos enlaces estabilizan notablemente la estructura secundaria limitando la libertad de giro en los enlaces covalente simples de los aa. Pro nunca se encuentra en hlice, pues su amino se encuentra unido a R y no puede formar el enlace intracatenario: Rompera la cadena cambiando su direccin, en una estructura llamada codo. El poder rotatorio de la hlice depende de la rotacin de cada aa + el valor de rotacin de la propia hlice. Por su forma la hlice tiene actividad ptica propia +D. Varios aa con grandes R no se encuentran cercanos en la hlice, pues no cabran. Varios aa con igual pH fisiolgico tampoco se encuentran cercanos en estas estructuras, pues debido a su carga habra repulsin entre ellos y la hlice perdera su valor rotatorio. Por ejemplo, Lys Lys Lys o Glu Glu Glu. Cuando baja el pH, aparecen en poli-Lys cargas que se repelen rompiendo la hlice. Ocurre lo mismo con poli-Glu al aumentar el pH. Hlice no siempre se puede deducir de la estructura primaria. En ciertas condiciones de temperatura y humedad se pueden estirar las hlices cambiando su estructura, como en el caso de la seda. 4 Principales estructuras secundarias; Laminar: Tambin llamada estructura en hoja plegada. Se observa como cadenas de aa apiladas en un plano. La estructura se estabiliza por medio de enlaces de hidrgeno intracatenarios entre c-t y a-t de las cadenas. Las cadenas pueden asociarse de forma paralela o antiparalela, siendo la antiparalela la ms estable pues presenta los tomos de N y C que han de unirse ms cerca uno del otro.

Paralelo:

R H O R N CH C N CH C N CH C H O R H O O R H O R H C N CH C N CH C N CH C N H O R H O

Antiparalelo:

R H O R N CH C N CH C N CH C H O R H O

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O H R O H C CH N C CH N C CH N R O H R Estas estructuras pueden formar protenas fibrosas y tambin se encuentran en cierta proporcin en algunos dominios de protenas globulares, como la inmunoglobulina. 5 Principales estructuras secundarias; Codos: Los Codos son estructuras secundarias formadas principalmente por Pro y Gly. Estas estructuras cambian la direccin inicial de la cadena debido al enlace especial de Pro, cuyo a-t est unido a R. Se estabiliza por la formacin de un enlace de hidrgeno intracatenario. El giro se produce a la derecha por ser termodinmicamente ms estable. En el caso exclusivo del colgeno, se puede formar de Hidroxiprolina. CH2 Pro CH2 CH2 O CH C N CH2 H N C=O C=O CH R1 HN CH R2 Gly

B/ Protenas Fibrosas:
1 Las Queratinas: Protena fibrosa insoluble de secuencias muy repetidas de hlice, unidas en estructuras superiores. Tres hlices unidas longitudinalmente forman una protofibrilla. Varias de estas ltimas se unen en microfibrillas, varias de las cuales forman las macrofibrillas. Las macrofibrillas de distintos tipos de Queratinas se encuentran sobre todo en las uas y en el pelo. Los enlaces laterales entre las hlices es mediado por puentes disulfuro resultantes de la oxidacin del tiol de Cys. Es el motivo por el que el pelo quemado huele a sulfuro. Cada tipo de Queratina tiene distinta proporcin de Cys. 21

Cuanto ms Cys presente, ms puentes se forman y ms rgida y quebradiza ser la fibra (%Cys (UAS, PEZUAS) >22). Cuanto menos Cys presente, ms flexible ser la fibra (%Cys (PIEL, LANA, PELO) = 10). 2 El Colgeno: Protena fibrosa insoluble de secuencias muy repetidas de Hlices de Colgeno, unidas en estructuras superiores. Es una estructura tambin muy frecuente en tegumentos, ligamentos y tendones en todos los animales. Se forma principalmente de: 33% Gly 13% Pro 4-OH-Pro (Hidroxiprolina, Hyp) Lys 5-OH-Lys (Hyl) Hyp y Hyl derivan de Pro y Lys respectivamente durante la maduracin de la protena. Requiere la accin de Peroxidasas, y de la presencia de cido ascrbico y vitamina C. Su plegamiento secundario forma una Hlice de Colgeno, levgira (hacia la izquierda) debido al giro de Pro facilitado por Gly, y abierta dejando los R hacia el exterior. Existen 12 tipos de Hlice de Colgeno conocidas. En algunos tambin se encuentra Cys. El Tropocolgeno es la unidad fundamental de las Fibras de Colgeno. Se trata de la unin longitudinal de tres Hlices de Colgeno, generalmente del mismo tipo, que se retuercen una sobre las otras formando un cable firme y resistente. La estabilidad del Tropocolgeno depende de las fuerzas de WW y de los puentes de hidrgeno que se forman entra Hyp y Pro prximas. Algunas Hexosas e Hidratos de Carbono se unen a Hyl de Tropocolgeno, por medio de puentes de H, estabilizando la estructura. Los Tropocolgenos se asocian entre s formando estructuras superiores. Se asocian unos con otros de manera ordenada, en estructura cabeza cola. Esta estructura se estabiliza por la formacin de enlaces covalentes entre Lys. Estos enlaces muy firmes mantienen y dan resistencia a nuestros cuerpos. Con el tiempo van aumentando las uniones covalentes, haciendo el colgeno ms rgido y quebradizo, y menos elstico. Desaminacin oxidativa: Reaccin mediada por la enzima Lisina Oxidasa del grupo amino de R de Lys: AMINA R CH2 NH2 Desaminacin oxidativa ALDEHDO R CH2 CHO

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Por medio de esta reaccin se forman dobles enlaces covalentes que estabilizan la estructura general del colgeno. En concreto se une una Lys con amino a otra oxidada y desaminada: Lys R1 NH CH CO R2 (CH2)3 N CH (CH2)3 R1 NH CH CO R2

Hyl

La sntesis de las hlices es realizada por los Ribosomas. Despus de maduracin, estn listas para ensamblarse de tres en tres. Otros polipptidos abundantes en Cys, los Pteropptidos, colaboran en el correcto ensamblaje, unindose en los extremos y luego rompindose y separndose. Finalmente aparecen las estructuras superiores, que se forman directamente en su lugar definitivo. Protena poco nutritiva por su alta concentracin en Gly e incompleta su poca variedad de aa. Patologa gentica: Ausencia de Pteropptidos. Animal no se puede tener en pie. Otras patologas: Artritis, Cirrosis heptica.

B/ Las Protenas Globulares:

1Generalidades: Solo algunas protenas presentan estructura terciaria y/o cuaternaria. Se denominan Protenas Globulares. Estas protenas son solubles en disolventes polares. Se pueden encontrar en el interior Car y en la MEC. Muchas son de muy gran tamao. Fueron fciles de descubrir por ello. Los R hidrofbicos suelen encontrarse escondidos en el interior de la estructura globular de la protena, exponindose las regiones hidroflicas hacia el exterior. La estructura supersecundaria es determinante en la estructura globular. Algunas de estas protenas presentan hasta 80% de dominios hlice y laminar, al igual que Codos. La Albumina, por ejemplo, se forma bsicamente de esas tres estructuras secundarias. Los Dominios Globulares son unidades muy sealadas de plegamiento, como subconjuntos morfolgicos dentro de la protena globular. Algunos de estos dominios estn relacionados con Dominios Funcionales, cuando presentan actividad cataltica.

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Los Centros Activos son dominios estructurales y funcionales que son activados o desactivados por medio de cambios conformacionales. Las protenas que cumplen varias funciones suelen tener varios dominios estructurales y varios centros activos. En este caso varias conformaciones pueden se funcionales. 2 Plegamiento de las protenas globulares: Pueden formarse distintos tipos de enlaces entre los aa a la hora de estabilizar las protenas en su estructura terciaria y cuaternaria. El propio H2O estabiliza y fuerza el plegamiento espontneo de la protena por el efecto hidrofbico, escondiendo los R. Debido al efecto hidrofbico, los aa polares se encuentran generalmente en la superficie, y los apolares en el interior de la protena. Prot + H2O = Aumento de la entropa Pueden formarse puentes de hidrgeno intracatenarios, entre tomos electronegativos: O H O u O H N . Son enlaces dbiles que estabilizan el plegamiento. Tambin pueden formarse, entre dos Cys, puentes disulfuro. Una protena puede plegarse de mltiples formas distintas. Influye tanto la estructura primaria como los posibles cambios conformacionales. En concreto una protena de slo 100 aa tendra 3 100 posibilidades de plegamiento. Tarda 10 -13 segundos en probar una posibilidad. Por lo tanto: tiempo de plegamiento = 10-13 . 3100 = 1,6.1027 aos Estos datos aclaran que una protena no puede probar todas las conformaciones posibles, y que debe plegarse rpida y definitivamente. Este plegamiento controlado y directo recibe el nombre de estructura nativa. Las Chaperoninas son protenas que intervienen en el plegamiento, ejerciendo como molde y acelerando el proceso. Un pequeo cambio en el plegamiento de la protena globular es tan importante como un cambio en su estructura primaria. El paso de PrPC a PrPSc, por ejemplo, depende de un pequeo cambio conformacional en un dominio localizado. Se puede hacer una prediccin grosera del plegamiento de una protena a partir de su estructura primaria, por medio de la estructura supersecundaria. EJEMPLO: Arg Arg Arg Arg Ala Val Lys Ala Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Gly Ala Ala Gly

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h o l

Codo

h o l

Algunas mutaciones puntuales pueden no afectar al plegamiento de la protena. Por ejemplo, un cambio Asp > Glu no afecta pues ambos aa son polares con carga negativa. 3 Desnaturalizacin de las protenas globulares: Hace referencia a un cambio en la estructura nativa de la protena que repercute en su actividad biolgica. En una protena cuaternaria, la ruptura del polmero es causa de desnaturalizacin, aunque se conserve la estructura terciaria. En una protena globular monomrica, un cambio conformacional que impida la actividad biolgica normal es causa de desnaturalizacin. Algunos pequeos cambios no son causa de desnaturalizacin, por ejemplo, la mutacin puntual Asp > Glu. En ocasiones es conveniente desnaturalizar las protenas con el fin de estudiar su estructura. Se puede lograr por diversas tcnicas: Aumento de temperatura. Cambios de pH. Aumento de fuerza inica (FI). Utilizando agentes desnaturalizantes, como leja o detergentes. Algunas protenas resisten los cambios de temperatura, pH y FI Mediante cambios de pH o utilizacin de algunos agentes desnaturalizantes, la desnaturalizacin de las protenas es reversible. En el caso de detergentes, como SDS, la regin polar se introduce en la protena globular, quedando las cabezas hacia el exterior. Esto modifica las fuerzas de WW. La desnaturalizacin se puso de manifiesto gracias a la Ribonucleasa. El plegamiento de esta protena es estabilizado por puentes disulfuro entre Met. Por accin de alcohol y urea los enlaces se rompen. Posteriormente, en presencia de O 2, se forman nuevos enlaces distintos a los de la estructura nativa, quedando la protena inactiva. Ambos cambios son reversibles.

III/ Tcnicas de purificacin y anlisis de protenas:

A/ Preparacin de muestras:

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1 Homogeneizacin: Previo al estudio de una protena se debe localizar en el organismo que la sintetiza. Lograremos purificarla conociendo sus propiedades biolgicas, qumicas y fsicas. Una vez localizadas las clulas se procede a la homogeneizacin. Una vez extradas se procede a su ruptura. Se pueden utilizar diversas tcnicas como la batidora, ultrasonidos o el choque osmtico. Para evitar la desnaturalizacin de las protenas, se utiliza una solucin tampn, con baja temperatura y fuerza inica. El tejido queda triturado, y sus componentes homogeneizados. 2 Tcnicas de Purificacin de protenas: Las tcnicas de purificacin no son especficas para una protena exclusiva. Sirve para separar protenas de una muestra en funcin de un criterio. Las protenas con valores iguales para el criterio empleado no se separan. La conveniente combinacin de tcnicas de purificacin permite purificar una protena deseada.

B/ La centrifugacin:
1 Generalidades: La tcnica se utiliza para separar los componentes de una muestra en funcin de su Coeficiente de Sedimentacin S (Unidad Svedberg), el cual depende del peso y la forma de cada partcula. Para ello, la Centrifugadora es una mquina que somete las muestras a una fuerza centrfuga, que depende de la gravedad y sobre todo de las revoluciones por minuto. Las Ultracentrfugas son las centrifugadoras ms fuertes. Los tubos con las muestras se colocan en el Rotor de la centrifugadora. Existen varios tipos de Rotor en funcin de su inclinacin, y de si esta es o no variable. El ngulo facilita y hace ms efectiva la centrifugacin. Si es muy inclinado el tubo puede derramarse. El tiempo al que se somete la muestra a fuerzas centrfugas tambin es responsable de la situacin final de los componentes. 2 La Centrifugacin Diferencial: Permite separar los componentes de la muestra, realizando una centrifugacin fraccionada y aplicando una fuerza cada vez superior. En funcin de la protena que deseamos analizar elegimos uno u otro precipitado. Si deseamos estudiar la fraccin soluble de la muestra podemos centrifugar directamente a 100 000 g. MUESTRA HOMOGENEIZADA

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Centrifugacin a 100 g Precipitado Clulas no trituradas Precipitado Ncleos, Cloroplastos Precipitado Mitocndrias Precipitado Lisosomas Precipitado Microsomas Sinaptosomas Ribosomas SOBRENADANTE Centrifugado a 4 000 g SOBRENADANTE Centrifugado a 15 000 g SOBRENADANTE Centrifugado a 30 000 g SOBRENADANTE Centrifugado a 100 000 g SOBRENADANTE Fraccin Soluble

3 Centrifugacin en Gradiente de Densidad: Se crea un gradiente de densidad en el tubo en el que se centrifuga la muestra. Suele utilizarse una disolucin de sacarosa en agua, ms concentrada cuanto ms cerca del fondo del tubo. La muestra se coloca en la superficie. Despus de centrifugado, cada componente cesa su sedimentacin cuando alcanza el estrato cuya densidad coincida con la suya propia. Se suele utilizar para separar orgnulos. Los orgnulos seleccionados pueden ser marcados con enzimas marcadoras para asegurar en que estrato se encuentra. 4 Ultracentrifugacin analtica: Se utiliza para el anlisis de muestras, no su purificacin. Es una tcnica muy cara de realizar, pues se precisa de una centrifugadora especial. Sirve para obtener datos como, por ejemplo, el peso molecular (PM) de una protena, o la pureza de una muestra determinada. Se debe trabajar con muestras de protenas ya purificadas. Se emplea un haz de luz para medir la Absorbancia de rayos UV (AUV) y/o el ndice de refraccin del medio (n), para deducir el PM de la protena.

C/ Precipitacin, Liofilizacin y Dialisis:

1 Precipitacin isoelctrica fraccionada:

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Es el tipo de precipitacin fraccionada ms comn. Depende de la solubilidad de las protenas en funcin de su pI. Cuando pH = pI la solubilidad de las protenas es mnima pues son menos polares. Tienden entonces a formar agregados y precipitar. Cuando pH < pI hay repulsin entre cargas +. Cuando pH > pI hay repulsin entre cargas -. Haciendo variar el pH favorecemos los distintos pI de cada tipo de proteina por separado. Podemos hacer precipitar as las distintas protenas a distintos pH, en funcin de su pI. 2 Precipitacin fraccionada por eliminacin del agua de solvatacin: Cada protena necesita determinada cantidad de agua de solvatacin. Al eliminarse en agua de solvatacin se facilita la unin entre las propias protenas, que precipitan. Aadiendo determinadas sales como Sulfato amnico (SO4(NH4)2), hacemos disminuir el agua se solvatacin. Otras sales, como NaCl o KCl, ayudan a hacer las protenas ms solubles en el agua. Podemos hacerlo fraccionadamente, si aumentamos la [Sal] progresivamente. Segn los tipos de protenas pierdan su agua de solvatacin propia, irn fraccionando y podremos separarlas, generalmente para desecharlas y aadir ms sales hasta que obtenemos el precipitado que deseamos. [Protena]OSM disminuye a lo largo de las precipitaciones fraccionadas. 3 Dialisis: Esta tcnica suele emplearse para separar las protenas purificadas de las sales que se encuentran en solucin contaminando la muestra. Se emplea una Bolsa de Dialisis con microporos. En funcin de su tamao dejarn pasar a unas molculas, y a otras no. Se introduce la muestra en una bolsa, y la bolsa en un recipiente con mucho agua distilada. La sal sale de la bolsa y el agua entra, hasta que las concentraciones osmolares se igualan. Se puede cambiar la bolsa a un nuevo recipiente con agua pura. Repitiendo la tcnica se elimina una cantidad considerable de sales. Se puede utilizar, con el mismo fin, la ultrafiltracin, sistema de filtracin con poros y embudo. 4 Liofilizacin: En una muestra poco concentrada, elimina el agua sin daar las proteinas. Hay varios mtodos. Realizar una congelacin rpida de la muestra seguida de Sublimacin al vaco, o Evaporacin al vaco. Obtenemos polvo proteico.

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Se puede realizar en concentracin con geles, utilizando una bolsa de Dilisis en un recipiente con gel que absorben la humedad.

D/ Cromatografa:
1 Generalidades: Tcnica de purificacin y analtica. Puede separa los componentes en funcin de distintos criterios: De Reparto: de su solubilidad. De Adsorcin: de su polaridad. >DE INTERCAMBIO IONICO: de su carga. De Permeabilidad: de su tamao. De Afinidad: de su especificidad biolgica. 2 Cromatografa de Reparto: Esta tcnica suele utilizarse con aa. Se utilizan tcnicas de tincin para poder visualizar su situacin durante el experimento. Se puede realizar en placa fina o en columna. Se utilizan dos disolventes no miscibles: La fase estacionaria est inmvil en la placa o columna. La fase mvil se desplaza sobre la estacionaria. En funcin de su afinidad por cada una de las fases, los componentes de la muestra quedarn anclados en la fase estacionaria, o de desplazarn con la fase mvil. La separacin de los componentes depende de su afinidad por una u otra fase, y no de su tamao. 3 Cromatografa de Adsorcin, de Intercambio Inico: Esta tcnica suele utilizarse para estudiar pptidos y pequeas protenas. Se utilizan columnas con mallas de resinas cargadas elctricamente, llamadas Intercambiadores Inicos. Las cargas son proporcionadas por determinados productos que se unen fijamente a la malla de resina. Se diferencian dos tipos: Intercambiador aninico, con cargas +. pH inicial bajo. Intercambiador catinico, con carga -. pH inicial alto. Haciendo variar el pH, logramos que las protenas caigan progresivamente, en funcin de su pI. Con un pH inicial extremo, todas las protenas cargadas quedan retenidas. Segn hacemos variar el pH, las protenas son liberadas ordenadamente, cuando su pI = pH del medio. En lugar de variar el pH, se puede hacer variar la [Sal] aumentando la fuerza inica de la columna. EJERCICIO: Cul es el orden de obtencin de los componentes de la siguiente muestra, por la tcnica de Cromatografa de Intercambio Aninico?

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MUESTRA: Quimiotripsingeno Hemoglobina Lisozima Ovoalbumina

pI 9,4 7,0 4,1 4,9

EJERCICIO: Realizamos un anlisis de una muestra con tres protenas idnticas, que slo se diferencian por un aminocido: A (Glu), B (Val) y C (Lys). Por la tcnica de Cromatografa de Intercambio Aninico, obtenemos tres fracciones a: pH = 4,5; pH = 7; y pH = 7,5. Cul es el pI de cada una de las protenas? 4 Cromatografa de Permeabilidad: Separa los componentes de una muestra en funcin de su tamao o su masa. Permite obtener el PM de las protenas. Se utilizan columnas con polmeros de resinas; algunos con textura de gel, como los polmeros de glucosa. Se trata de partculas independientes formadas por fibras polimricas. Estas partculas se hinchan en contacto con agua o con la fase mvil, y pueden absorber compuestos de la muestra en funcin de su tamao. Las protenas que pueden atravesar la resina salen de la columna por orden de peso molecular, de mayor a menor: No es una filtracin sino una cromatografa. Se pueden recuperar por separado con un colector de fracciones. En funcin del tamao del poro de la resina, aquellas protenas que son demasiado grandes quedan retenidas en la superficie de la columna. En este sentido, se asemeja a una filtracin. Debemos realizar un calibrado de la columna. Se realiza una recta de calibrado de la siguiente relacin: log PM / Ve Tenemos: V0: Volumen de exclusin, o de los intersticios entre partculas de gel. Vi: Volumen interno de las partculas de gel. Vt: Volumen total del lecho cromatogrfico. Vt = V0 + Vi KD: Coeficiente de reparto; proporcin de V i que le resulta accesible a una molcula del soluto (Para soluto de gran tamao = 0). KD = VACCESIBLE / Vi

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Ve: Volumen de elucin de un soluto. Viene dado por la expresin: Ve = V0 + KD.Vi

EJERCICIO: Cul es el orden de obtencin de los componentes de la siguiente muestra, por la tcnica de Cromatografa de Permeabilidad? MUESTRA: PM Quimiotripsingeno 25 000 Hemoglobina 64 000 Lisozima 14 000 Ovoalbumina 44 000 EJERCICIO: Se realiza una Cromatografa de Permeabilidad de una protena, y despus de la misma protena en presencia de SDS. Previamente se realiza el calibrado de la columna, y se obtiene:
PM Ve 12 400 206 25 000 184 44 000 165 68 000 153 240 000 115 330 000 106 670 000 90

Experimentando esta tcnica con la protena muestra, obtenemos los siguientes resultados: Ve (mL) - SDS 131 + SDS 152 Realizar grfico de calibrado. Cul es el PM de la protena en cada caso? Qu podemos deducir de la protena por los resultados? SOLUCIN:
PM(- SDS) = 140 000 g.mol-1 PM(+ SDS) = 74 000 g.mol-1 La protena es de estructura cuaternaria: Se trata de un homodmero. SDS desnaturaliza y rompe el polmero.

EJERCICIO: Se realiza una Cromatografa de Permeabilidad de una protena, despus de la misma protena en presencia de SDS, y finalmente en presencia de SDS y Metanol. Calculamos los PM de los resultados obtenidos: Un pico en el primer caso, un pico en el segundo y dos picos en el tercero. PM (g.mol-1)

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- SDS - Metanol + SDS - Metanol +SDS +Metanol

200 000 50 000 35 000 15 000

Qu podemos deducir de la protena por los resultados? SOLUCIN:

La protena es un homotetrmero de PM = 200.000. SDS lo rompe en cuatro subunidades de PM = 50.000. Cada subunidad es un heterodmero. metanol rompe las dos subunidades bsicas de PM = 35.000 y PM = 15.000.

5 Cromatografa de Afinidad: Es una tcnica muy compleja y selectiva. Permite aislar totalmente una protena enzima en un nico paso: rendimiento muy alto. Separa las protenas por su especificidad biolgica, gracias a la formacin del complejo Enzima Sustrato, responsable de la formacin de un Producto: S+E ES E+P

Se realiza en una columna con una resina especfica, que debe ser fabricada para el estudio de la protena en cuestin. La resina incluye un sustrato por el que la protena enzima estudiada presenta afinidad. Durante la cromatografa se forma el complejo ES. Los restos eluyen y la protena queda fijada en la columna.

D/ Electroforesis:
1 Generalidades: Tcnica de purificacin y analtica. El criterio empleado es la carga de las partculas de la muestra. La movilidad de las partculas es proporcional a su carga y a la resistencia que opone la fase estacionaria. Se crea sobre un gel hidratado un campo electromagntico, gracias a dos polos: - Ctodo; + nodo. Las protenas, en funcin de su carga, son arrastradas hacia uno u otro polo. 2 Electroforesis de zona: Se utiliza para purificar protenas. Suele realizarse sobre un gel de Agar o Poliacrilamida (antes se usaba papel) colocado sobre un vidrio refrigerado. La muestra se coloca en una pequea zona central.

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En cada extremo del gel se coloca una cubeta con una solucin tampn: una con el nodo y otra con el ctodo. El gel y la solucin tampn se conectan con papeles. En funcin de su carga + o -, la partcula presenta movilidad negativa (hacia el ctodo) o positiva (hacia el nodo) respectivamente. El peso y tamao de las partculas modifica la velocidad a la que se desplazan sobre la fase estacionaria. En funcin del valor absoluto de su carga, la protena alcanzar movilidad nula en el punto en el que encuentra su pI. Los cambios de pH del gel modifican la movilidad. 3 Electroforesis en geles de Poliacrilamida - SDS (PAGE-SDS): Esta es una tcnica analtica, que al igual que la ultracentrifugacin analtica y la cromatografa de permeabilidad, nos permite obtener el PM de los monmeros de cada protena. Se realiza en presencia de agente desnaturalizante SDS, de manera que los polmeros se separan. Adems la carga de las protenas queda solapada por las cargas negativas de SDS. Las protenas-SDS se depositan sobre el gel en la regin del ctodo. Todas tienden a desplazarse hacia el nodo debido a la carga de SDS. Una vez realizada la tcnica, las protenas deben ser teidas o sino pasarn desapercibidas en el gel. La muestra purificada no puede recuperarse. Para teir las protenas, estas son transferidas del gel a una membrana de Nitrocelulosa, gracias a una cubeta de transferencia. En la membrana las protenas son mucho ms fciles de tratar. A menudo se utilizan tcnicas de tincin por Inmunotransferencia, basadas en la especificidad del complejo Ac-Ag. EJERCICIO: Trabajamos con Protena X, PM = 140.000 g.mol -1: Realizamos primero la tcnica de Electroforesis PAGE-SDS, y posteriormente PAGE- SDS con metanol. Obtenemos los resultados siguientes. Qu podemos deducir? 67.000 43.000 30.000 20.000 g.mol-1
metanol + metanol Protena patrn

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SOLUCIN:
Con SDS obtenemos una nica banda alrededor de PM = 67.000 g.mol -1. La protena es un homodmero: 70.000 x 2 = 140.000 g.mol-1. Con SDS y metanol obtenemos sin embargo dos bandas distintas, a 30.000 y 40.000 g.mol-1 aproximadamente. Cada monmero de la estructura cuaternaria est formado a su vez por dos heterodmeros.

EJERCICIO: Realizamos una electroforesis PAGE, luego PAGE-SDS: - SDS: 300.000 g.mol-1 + SDS: 100.000 g.mol-1 y 50.000 g.mol-1 Qu podemos deducir? SOLUCIN:
Se trata sin duda de una protena de estructura cuaternaria; un heteropolmero. Sin embargo hay varias opciones: Dos subunidades de 100.000 g.mol-1 y dos de 50.000 g.mol-1, ; Una subunidad de 100.000 g.mol-1 y cuatro de 50.000 g.mol-1.

D/ Otros mtodos:
1 Clculo del pI de las protenas: El clculo del pI de un pptido se calcula teniendo en cuenta los grupos polares presentes, no aa por aa. EJEMPLO; Ribonucleasa: GRUPOS CARGADOS COOH NH2 Asp + Glu Tyr Hys Lys Arg Nmero 1 1 10 6 4 10 4 pKa 4,7 7,8 4,7 9,9 6,5 10,2 12,0

Cuando la protena R est protonada al mximo, tienen carga los grupos NH2 (1), Hys (4), Lys (10) y Arg (4): 19 +. R19+ pH: 4,7 R8+ 6,5 R4+ 7,8 R3+ 9,9 R310,2 R1312,0 R17-

Podemos deducir el pI de la protena, pues corresponde al pH en el que esta presenta carga neta nula: R3+ > R0 > R3-. Por lo tanto: Para pKa = pH = 9,9 ; 50 % [R3+], 50 % [R3-] = R0 pI = 9,9 2 Clculo de resultados de purificacin:
mg de Protena Actividad encimtica Actividad especfica Pasos de purificacin Rendimient o%

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Homogeneizad o Precipitado DEHE Cromatografa

91.400 3.260 64,3 6,2

40.000 21.100 14.800 11.500

0.4 6.5 230 1860

14,8 523 4.205

100 53 37 29

Actividad Encimtica de la muestra = UE Actividad especfica (AE); solo de nuestra enzima, en nuestra muestra AE = UE/Mb de protena. Obtenemos una protena purificada 4.205 veces, con un rendimiento de 29 %.

IV/ Las Protenas:

A/ Clasificacin de las protenas:
1Por su composicin: Protenas simples: Slo se forman de aminocidos. Protenas conjugadas: Se forman de aa y grupos prostticos unidos fuertemente a la estructura primaria de la protena. Las apoprotenas son protenas conjugadas. Por ejemplo, la Mioglobina y la Hemoglobina. 2 Por su estructura: Protenas Fibrosas: Con estructura limitada primaria o secundaria. Por ejemplo, Queratinas y Colagenos. Protenas globulares: Plegadas en estructuras terciarias o cuaternarias. 3 Por su funcin: Las funciones de las protenas son muy diversas. Reserva: Almacenan sustancias. Por ejemplo, la mioglobina almacena O2. Transporte: Transportan sustancias, generalmente sustancias no miscibles con agua a travs del torrente sanguneo. Por ejemplo, la hemoglobina transporta O2. Cataltica: Las protenas que catalizan reacciones de sustancias, algunas espontneas acelerndolas, y otras permitiendo que se produzcan, reciben el nombre de Enzimas. Son siempre globulares. Contrctil: Por ejemplo Actina, Miosina, Tubulina. Defensora o Inmune: Anticuerpos. Txica: Toxinas, como Votox o Glicina. Seales: Hormonas. Receptores: Protenas transmembrana, transductoras de seales. Estructurales: Colgeno, Actina, Tubulina, Querantina, Agrecanes Transportadora: Canales, Transportadores y Bombas inicas transmembrana. 35

Anticongelantes, de Unin Celular,

B/ Relaciones estructura funcin:

1 Generalidades: Todas las protenas presentan una estrecha relacin entre su estructura y su funcin. Esta relacin es patente por la afinidad que todas las protenas presentan por ciertos sustratos en un dominio de unin (secuencia concreta de aa): Se trata de los Ligandos: Protena + Ligando PL

KD: Constante de disociacin.KD = [P].[L] / [PL]

2 Tcnica experimental de clculo de KD: Se realiza una Dilisis. Utilizamos una bolsa cuyo poro permite solo la salida de L libre. Se introduce en la bolsa una solucin de [P] y [L] conocidas. La bolsa se coloca en un recipiente con agua destilada. Sabemos que [L]EXTINICIAL = 0. Medimos [L]EXTFINAL y calculamos la constante de disociacin. 3 Fraccin de ligando unido (%): Se trata de la parte de ligando que se encuentra unida a la protena, es decir la Saturacin de la protena. : Fraccin de ligando unido. = [PL] / ( [P] + [PL] ) KD: KA se define como constante de afinidad. Se trata del inverso de KA = [PL] / [P].[L] Por lo tanto, = KA .[P].[L] / ( [P] + KA .[P].[L] ), es decir: = KA .[L] / ( 1 + KA .[L] ) En el caso de una protena dmero, con dos lugares de unin para ligandos: P+L pK1 o pK2 PL + L pK3 PL2

Si se trata de un homodmero, los dos dominios de unin son idnticos y pK1 = pK2.

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A menudo la unin del primer ligando provoca un cambio conformacional en la protena, dificultando o facilitando la unin del segundo. Si el primer ligando no cambia la conformacin de la protena (pK3 = pK1 o pK2 en funcin de dnde se ha unido el primer L), entonces: = ([PL] + 2[PL2] ) / ( [P] + [PL] + [PL2] ) KA / [L]

n = 2 (dmero) n: n de corte, correspondiente al n de L que puede unir la protena. n

= n.KA.[L] / ( 1 + KA .[L] ) / [L] = 2.KA - .KA Generalmente la unin del primer ligando modifica conformacin de la protena: Se dice que hay Interaccin. la

3 Fraccin de ligando unido teniendo en cuenta la interaccin: = n.KA.[L]C / ( 1 + KA .[L]C ) C es el coeficiente de Hill: C = 1; No hay interaccin. C > 1; Hay interaccin positiva. C < 1; Hay interaccin negativa.

En caso de interaccin positiva, se favorece la unin del nuevo ligando. Es el caso ms frecuente de interaccin: [L] / [L]

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[L]

nu

En caso de interaccin negativa, se desfavorece la unin del nuevo ligando: [L] / [L]

En estos casos podemos identificar n gracias a la curva, pero no KA, pues en caso de interaccin es solo un promedio. Si el ligando es un gas, se utiliza la presin parcial del gas en lugar de para realizar la curva.

C/ Las Apoprotenas:
1 Generalidades, el grupo Hemo: Hemoglobina y Mioglobina son dos protenas conjugadas; Apoprotenas. Su grupo prosttico recibe el nombre Hemo, al encontrarse unidas a este reciben el nombre de Holoprotenas. El grupo Hemo posee un tomo de hierro Fe central. ste tiene seis posiciones de combinacin: Cuatro de ellas unen el Fe a cuatro tomos de N del grupo. Cuando Hemo se encuentra unido a una de estas protenas, una posicin de combinacin del Fe se une fuertemente a una Hys de la protena: Hys proximal (F8), que tira de Fe hacia ella. Hys distal bloquea la ltima posicin de combinacin del Fe, reservndola para el O2 y evitando la unin con otras sustancias.

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Durante la oxigenacin, la protena cambia de conformacin; El tomo de Fe se desplaza hacia el plano Hemo, arrastrando Hys proximal la cual queda menos inclinada. O2 Desoximioglobina Mb Oximioglobina MbO2

El Hierro no se oxida formando xido de Hierro gracias a la proteccin proteica. Se forma Hierro Oxigenado: El grupo Hemo sujeta el tomo de O2, pero puede soltarlo cuando la concentracin en el tejido es baja. 2 La Mioglobina: La Mioglobina es una protena globular monomrica, formada por una cadena con 8 tramos hlice. No hay interaccin. Su funcin es retener y reservar el O2 del cuerpo. Tiene un lugar de unin en su nico grupo Hemo. = [MbO2] / ( [Mb] + [MbO2] ) = KA.[O2] / ( 1 + KA .[O2] ) La protena se satura rpidamente en un medio con alta p(O 2). Siempre tiende a absorver y acumular el gas. Se define p50 como la presin p(O2) a la que la protena se satura al 50 %, es decir, a la que [Mb] = [MbO 2]. Para la Mioglobina, p50 = 1 Torr (Grfico fotocopia). Cuanto menor es p50, mayor es la afinidad de la protena por su ligando. Al ser inverso a KA, utilizamos KD para realizar el clculo; = (1/KD ).pO2 / ( 1 + pO2/KD ), es decir: = pO2 / ( KD + pO2 ) Para pO2 = p50; = 0,5 = p50 / ( KD + p50 ), es decir: p50 = 0,5 KD + 0,5 p50 KD = p50 = pO2 / ( p50 + pO2 ) 3 La Hemoglobina: Se trata de una protena globular de estructura cuaternaria. En concreto se trata de un homotetrmero (n = 4). Cada monmero que lo forma es similar a una protena de Mioglobina, y posee un grupo Hemo. Por lo tanto en total hay 4 grupos Hemo, y cuatro lugares de unin al O2, uno por subunidad. 39

Las subunidades presentan interaccin positiva, es decir, C > 1 (C = 2,8). Para el caso de la Hb, p50 = 26 Torr. Es mucho mayor que en el caso de la Mioglobina, por lo que presenta una afinidad mucho menor. Gracias a estas propiedades, la Hb se caracteriza por liberar O2 cuando hay poca presencia en el medio, y absorberlo en tejidos donde hay una alta concentracin, generalmente los pulmones. Existen varios tipos de Hb, en funcin de los tipos de Subunidades. Estas subunidades presentan ligeras diferencias, pero guardando siempre similitud a la Mb. Hb se encuentra en los Eritrocitos. Hb A: 2 + 2 (Normal) Hb F: 2 + 2 (Sangre materna Fetal) Hb A2: 2 + 2 (Patolgica en altas concentraciones) La diferencia entre los tipos de subunidades depende de cambios de aa en posiciones no crticas. No implican grandes cambios. Hay 9 posiciones invariables entre todos los seres vivos con Mb y Hb. Al separar las subunidades, su afinidad por el sustrato aumenta, igualando la de la Mb. Pierde sin embargo la capacidad transportadora. La Hb es sintetizada en los reticulocitos del tejido hematopoytico, y es liberada a la sangre en los Eritrocitos. Es una protena imprescindible en organismos de gran tamao, pues es capaz de absorber el O2 de los pulmones, pero tambin de liberarlo en los tejidos alejados que necesitan respirar, como msculos o SN. Tenemos, en este caso: = KA.pO2C / ( 1 + KA.pO2C ) + . KA.pO2C = KA.pO2C ; = KA.pO2C.(1-)

log ( / (1-)) = log KA + C.log pO2 Log ( / (1-)) C = 2,8 C=1

[L]

nu

C=1

log pO2

40

La pendiente cambia. Tanto el primer como el ltimo oxgeno tienen una nica posibilidad de unin, por ello la pendiente es C = 1. La pendiente cambia para los oxgenos segundo y tercero, cuya unin es favorecida y acelerada por la interaccin positiva. Debido a los cambios conformacionales, segn se unen ms O 2, KA se hace cada vez mayor, de tal manera: KA1 = 0,133. KA4 = 40. Cuanto menor es p50, mayor es la afinidad de la protena por su ligando. Al ser inverso a KA, utilizamos KD para realizar el clculo; = pO2C / ( KD + pO2C ) Para pO2 = p50; = 0,5 = p50C / ( KD + p50C ), es decir: KD = p50C = pO2C / ( p50C + pO2C ) EJERCICIO: Calcular de Mioglobina en los pulmones y en los tejidos. Calcular de Hemoglobina en los pulmones y en los tejidos sin tener en cuenta C. Calcular de Hemoglobina en los pulmones y en los tejidos teniendo en cuenta la cooperatividad. Qu podemos deducir?
pO2(PULMN) = 100; pO2(TEJIDOS) = 20 ; p50(Mb) = 1; p50(Hb) = 26 ; C(Hb) = 2,8

SOLUCIN:

Para Mb: PULMON = 99 % TEJIDOS = 95 % PULMON Para Hb sin C: = 79 % TEJIDOS = 40 % PULMON TEJIDOS Para Hb con C: = 98 % = 36 % Mb tiene mayor afinidad pues reserva oxgeno mientras Hb lo transporta hasta lugares donde escasea. C de Hb aumenta su capacidad de absorber en pulmn y liberar en tejidos.

D/ La Hemoglobina:
1 Cambios conformacionales: Como vimos, la Mb sufra un cambio conformacional entre sus estados MbO2 y Mb. Ocurre algo similar en el caso de Hb. Lgicamente, los cambios conformacionales que se producen en Hb al recibir los primeros tomos de oxgeno modifican la protena facilitando la entrada de los siguientes. En concreto, el desplazamiento de la Hys proximal del Hemo que ha recibido el oxgeno se desplaza y tira de la cadena de aa, modificando la estructura cuaternaria por la rotura de enlaces secundarios. La rotura de 8 enlaces inicos es responsable del paso de la forma tensa T a la relajada R, los dos nicos estados posibles. FORMA T: 41

1
+ + + +

ENLACES que intervienen en el cambio conformacional

+ +

O2 FORMA R:
at ct + + ct at

O2

1
+ ct + -

2
+ ct

+ + +

+ +

+ -

En conformacin R, el agua podra llegar hasta el Fe II y transformarlo en Fe III y dejando el grupo Hemo inutilizable. Otras molculas, como CO, pueden daar el grupo. Por ello la posicin de Hys distal protectora es fundamental. Se considera la Hb Protena Alostrica, pues posee dominios de unin para otras partculas. En el caso de la Hb Fetal, las pequeas diferencias entre las subunidades y la hacen menos estable en su forma R, ante todo debido al cabio Hys 143 () > Ser. Se dificulta adems la unin de 2,3-BPG. Una mutacin en Leu 143 () es responsable de la disociacin de subunidades. 2 Influencia del pH en la conformacin de la Hemoglobina: El pH modifica la afinidad de la Hb por el oxgeno. En concreto, al aumentar el pH del medio, la afinidad aumenta. Los protones se unen a la protena disminuyendo su afinidad, pero sin anularla. Se deben unir por lo tanto a un dominio distinto que el oxgeno. H+ son considerados Inhibidores Alostricos de la protena. Se acumulan primero los enlaces Hys Asp internos de la subunidades (en dibujo, enlaces en forma de asa), cuando se sobrepasa el pI de

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Hys y queda protonada. Reforzando estos enlaces refuerzan la forma T. Si sigue disminuyendo el pH, H+ se acumula en los enlaces at ct, protonando los grupos amino y reforzando los enlaces. Esto estabiliza an ms la forma T, dificultando la entrada de oxgeno. 3 Otros Efectores Alostricos: H+ no es el nico efector alostrico de la Hb. Entre ellos se ecuentran tambin el CO2, o el 2,3-BPG. El CO2 es un inhibidor, con un sitio de unin en Hb distinto al del oxgeno, pero es menos frecuente (10-20 %) que H+. El dixido de carbono se unen en los extremos at de , estabilizando la forma T: R NH COO4 El 2,3-Bifosfoglicerol: 2,3-BPG es sintetizado a partir de precursores en el interior de eritrocitos. Es un inhibidor alostrico de Hb, que acta como intermediario durante la Gliclisis, o degradacin de la glucosa. GLUCOSA 1,3-BPG GLICOLISIS MUTASA (Retrocontrol) 2,3-BPG El paso de 1,3-BPG a 2,3-BPG es controlado por la enzima Mutasa. Al producirse una disminucin de la presin en el medio, disminuye tambin pO2, produciendose el denominado mal de alturas. Tras un periodo de adaptacin, este mal es superado sin problemas, al regularse correctamente la sntesis de Mutasa, haciendio disminuir la concentracin de 2,3-BPG. La sangre almacenada no libera el O 2 tan fcilmente, y parece presentar mayor afinidad. Esto se debe a la degradacin del 2,3-BPG. 5 Inhibidores No Alostrico: El Monxido de Carbono es un inhibidor no alostrico de la Hb, pues se une al mismo dominio de unin que el oxgeno, bloquendolo. Se une al Fe con 200 veces ms afinidad que O2. Cuando CO se une a Fe lo hace definitivamente, pero aumenta tambin la afinidad de los otros grupos Hemo, como lo hara el propio O 2. Cuando se el primer CO, estabiliza la forma R de la protena. Cuando hay 4 grupos CO unidos, la protena queda inutilizable.

43

En condiciones normales, una persona no fumadora presenta 0,3 % de Hb con CO. El xido Ntrico NO es otro inhibidor no alostrico de Hb se une a Fe, como el oxgeno, pero en la forma T. Cuando se une NO, unido a su vez a Glutatin, acta como vasodilatador, facilitando la entrada del oxgeno a los tejidos, y la salida del dixido de carbono. 6 Importancia de la presencia de Inhibidores: La presencia de unos u otros efectores de la Hb en los tejidos o en los pulmones facilitan su funcin en cada rgano. En los tejidos, se encuentran grandes cantidades de 2,3-BPG, H+ y CO2, que se unen a Hb facilitando la liberacin del oxgeno. Tambin se une NO-Glutatin, activando la vasodilatacin. H+ y CO2 son transportados hasta los pulmones y liberados all, donde Hb se carga de nuevo de oxgeno. 7 Patologas de la Hemoglobina: Suelen derivar de la sntesis anmala de los monmeros. Anemia Falciforme: Se produce en la subunidad una mutacin puntual Glu > Val de una posicin externa en forma T. Este cambio facilita la unin de Hb en fibras. Los eritrocitos se deforman debido a estas fibras tornando falciformes y perdiendo elasticidad, y se atascan en los capilares. Evitan la proliferacin del parsito de la Malaria. Talasemia: talasemia o talasemia, malformaciones en cadena o respectivamente, impiden la correcta accin de Hb. EJERCICIO: 1/ Enumerar las principales diferencias entre Hemoglobina y Mioglobina. 2/ Cual es el efecto de los siguientes acontecimientos en la afinidad Hemoglobina O2? 1. Disociacin de Hemoglobina en subunidades. 2. Aumento de [CO]. 3. Aumento de [CO2]. 4. Disminucin del pH. 5. Cambio de Hys 143 () por Ser. 6. Mutacin en Leu 143 (). 3/ Qu Hys son fundamentales en la funcionalidad de la Hemoglobina, y por qu? SOLUCIN:
1/ Funcin: Hb transporta, menos afinidad, Mb acumula. Subunidades: Hb 4, Mb 1. Hb con cooperacin. Hb protena alostrica 2/ 1. Aumenta. 2. Aumenta. 3. Disminuye. 4. Disminuye.

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5. Disminuye. 6. Aumenta. 3/ Hys proximal sujeta Hemo. Hys distal impide otras uniones en Fe como H2O. Otras Hys median uniones e interacciones entre subunidades y con los inhibidores.

IV/ Las Enzimas:

A/ Generalidades en Encimologa:
1Introduccin: Todos los pasos de todos los procesos metablicos estn catalizados por enzimas, y la capacidad cataltica se considera, junto con la capacidad de autorreplicacin, una de las caractersticas fundamentales de la vida.

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Existen dos mtodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reaccin qumica. Uno de ellos es la elevacin de la temperatura; el otro consiste en utilizar un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activndolos, produciendo un estado de transicin de menor energa que en la reaccin no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos. Cada clula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen muchas combinaciones posibles entre las reacciones qumicas que estos compuestos pueden experimentar. Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera especfica, aquellas reacciones que son esenciales e indispensables para que la clula viva. Todas las enzimas (salvo Ribosomas) son Protenas Globulares. Presentan un dominio de unin 3D de aminocidos llamado Centro Activo, de conformacin especial para unin y catlisis de un sustrato. El centro activo es responsable de la alta especificidad biolgica de las enzimas. 2 Nomenclatura y clasificacin de las Enzimas: Muchas enzimas han sido designadas aadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, la molcula sobre la cul ejerce su actividad cataltica. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrlisis de la arginina a urea y ornitina. Otras enzimas han recibido su nombre en funcin del tipo de reaccin que catalizan; as la Gliceraldehdo-3P- deshidrogenasa cataliza la oxidacin del la Gliceraldehdo-3P. Incluso, algunas se conocen de hace mucho tiempo y mantienen su nombre, sin dar informacin alguna del sustrato o la reaccin que catalizan, como por ejemplo, tripsina. Estos son los seis principales grupos de enzimas conocidos en la actualidad: 1. Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reduccin). 2. Transferasas (transfieren grupos funcionales). 3. Hidrolasas (reacciones de hidrlisis). 4. Liasas (reacciones de adicin a los dobles enlaces). 5. Isomerasas (reacciones de isomerizacin). 6. Ligasas (formacin de enlaces con consumo de ATP). 3 Los Cimgenos: Un Cimgeno es un tipo de enzima que se activa al separarse una parte de la molcula, bien por accin de otra enzima o por un cambio en el medio en que se encuentra, por ejemplo, un aumento de la acidez. 46

Muchos cimgenos son enzimas proteolticas o Proteasas, que se sintetizan, almacenan y liberan en una forma molecular inerte (sin actividad). As se evita la digestin de la propia enzima y de protenas circundantes. En el pncreas, adems de la secrecin de insulina por los islotes de Langerhans, se producen varias secreciones digestivas, que suelen ser cimgenos. Las enzimas pancreticas incluyen: -amilasa, Tripsina, Quimotripsina, Elastasa, Carboxipeptidasas, Aminopeptidasas, Lipasas y Nucleasas. Las enzimas pancreticas son cimgenos que requieren pH alcalino al ser sintetizadas. Por ello el pncreas secreta lquido acuoso bicarbonatado de elevado pH. La presencia de cidos grasos y pptidos en el quimo intestinal estimula la secrecin pancretica de enzimas. Al llegar al duodeno, el alto pH del medio activa estos cimgenos que comienzan a romper pptidos, cidos nucleicos y lpidos, de forma que puedan ser absorbidos por el tejido. Tripsina es un cimgeno que se activa al llegar al duodeno, debido a su bajo pH, cambiando su conformacin. La presencia de Tripsina permite la transformacin de los otros cimgenos del duodeno. Tripsingeno Proelastasa Quimotripsingeno Procarboxipeptidasa Tripsina Elastasa Quimotripsina Carboxipeptidasa

4 Las proteasas: Las proteasas catalizan la ruptura de protenas en pptidos. Se dividen en cuatro grupos: Serinproteasas, Cistenproteasas, Aspartilproteasas y metaloproteasas. Sus centros activos incluyen, respectivamente, Ser, Cys, Asp y tomo metlico. Las Serinproteasas son una gran familia de enzimas, generalmente cimgenos. Incluyen, entre otras, Tripsina, Quimotripsina y Elastasa, del duodeno, Pepsina del estmago, y otras proteasas del torrente sanguneo, responsables de la coagulacin sangunea, como la Trombina.

B/ Complementaridad Enzima Sustrato:

1 Modelos de complementaridad Enzima Sustrato:

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El Modelo de Llave Cerradura de Fisher es el modelo elemental. Segn este modelo, el centro activo presenta una estructura rgida que encaja perfectamente con el sustrato. Tiene estereoespecificidad, pues la enzima solo reconoce un estereoismero. Este modelo, sin embargo, no contempla los efectos del Alosterismo. El Modelo de Acoplamiento, o Ajuste Inducido, de Koshland, saca punta al modelo de Fisher y se adapta mejor a la realidad. Segn este modelo el centro activo es una estructura flexible que slo que definida rgidamente cuando se produce la unin E S. Al aproximarse S a E, E sufre cambios conformacionales determinantes para la orientacin de los grupos del centro activo. Slo al producirse estos cambios, E y S son perfectamente complementarios. 2 Interacciones de complementaridad entre Enzima y Sustrato: Intervienen varias fuerzas en la unin entre la E y su S. La mayora de los enlaces que se forman se deben a las fuerzas inicas. Los puentes de H son las uniones ms comunes. Son uniones direccionales: En funcin del ngulo formado entre las uniones DadorH y AceptorH, la unin ser ms o menos fuerte. DADOR H

ngulo

ACEPTOR En concreto, cuanto mayor es el ngulo , ms dbil ser la fuerza de unin. Las f WW son muy dbiles. Adquieren importancia cuando E y S son estrictamente complementarias como propone el modelo Llave Cerradura, y se aproximan un gran nmero de tomos. Algunas E sufren fuertes modificaciones al unir el sustrato. Por ejemplo Carboxipeptidasa, cuyo ct se rompe durante la unin. EJEMPLO: RIBONUCLEASA PANCRETICA Ser OH Thr OH SUSTRATO

En casos raros, se forman algunos enlaces covalentes E S.

3 Factores que afectan a las interacciones Enzima Sustrato:

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El disolvente H2O es una molcula polar, que establece puentes de hidrgeno intracatenarios. De este modo debilita las interacciones E S, y acenta las interacciones entre grupos apolares. Cuando tiene lugar la unin E S, se excluye el agua de la regin del centro activo. Efecto de Proximidad: Al aproximarse a la E, el S se orienta adecuadamente de manera a unirse correctamente al centro activo, debido a fuerzas electromagnticas. Los aa del centro activo de la enzima participan en la unin y catlisis de S a travs de mecanismos cido/base, por ataques nuclefilos - electrfilos El efecto de proximidad y la participacin directa de los aa del centro activo son los principales responsables de la eficacia cataltica de una enzima. En algunos casos el ataque nuclefilo al S conlleva formacin de enlaces covalentes E S. 4 Los Cofactores: Se trata de factores que afectan a las interacciones ApoE S. Son, en concreto, grupos cuya unin a la protena es necesaria para su activacin cataltica, provocando cambios conformacionales. Pueden ser iones metlicos, o molculas orgnicas no proteicas. Las Apoenzimas son la parte proteica de algunas enzimas que necesitan estar unidas a un cofactor para configurar correctamente su centro activo. Apoenzima + Cofactor Holoenzima

La Holoenzima presenta actividad cataltica. Las Metaloenzimas precisan la unin coordinada covalente de iones metlicos a su cadena de aa para ser activas catalticamente. Por ejemplo, en el caso del grupo Hemo, el in Fe se encuentra unido a un grupo prosttico (cofactor que se une covalentemente). Los Coenzimas son aquellos cofactores que son molculas orgnicas. Aportan grupos esenciales para la catlisis, no presentes en la Apoenzima. A menudo tienen una parte vitamnica. Las coenzimas suelen ser modificadas durante la reaccin, pero recuperan su estado inicial al terminar esta. 3 Parmetros externos que afectan a las interacciones Enzima Sustrato: La temperatura afecta a la actividad cataltica en forma de cmpana de Gauss: TOPTIMA Suele hallase alrededor de 40 C. TELEVADA: Las protenas se desnaturalizan. TBAJA: El movimiento de las partculas se reduce. El pH puede afectar tambin a la actividad de las protenas, en funcin de su pI. Cada E tiene un pH ptimo distinto (Ejemplo: Pepsina del estmago pHOPTIMO = 2 ; Arginasa pHOPTIMO = 10).

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C/ Cintica de las Reacciones Encimticas:

1Generalidades de Cintica Encimtica: La cintica encimtica es el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. El estudio de la cintica encimtica se utiliza para el estudio de la especificidad de las encimas, su mecanismo de accin y el estudio de las rutas metablicas. En anlisis clnicos, se utilizan para la deteccin de patologas relacionadas con alteraciones de velocidad enzimtica, como en el caso de las Transaminasas. Reaccin Reversible: Mientras progresa la reaccin, lo hace tambin la reaccin inversa, haciendo decaer la velocidad. S + E ES E + P

Al agotarse el S, la velocidad de la reaccin decae. Si la E es inestable, o se encuentra en medios inapropiados, se vuelve inactiva y la velocidad decae. En algunos casos el P inhibe la reaccin, y segn aumenta su concentracin la velocidad decae. 2 Medida de la velocidad de una reaccin encimtica (V): Puede medirse tanto como la desaparicin progresiva del Sustrato, o la aparicin progresiva del Producto. Para medir sus concentraciones, utilizamos las diversas propiedades qumicas y fsicas del S, o el P, como por ejemplo, la absorbancia. Se selecciona la longitud de onda ms absorbida por la sustancia estudiada, y se calibra el colormetro. Finalmente se mide la absorbancia en el tiempo durante el transcurso de la reaccin. Dado que V decae por diversos motivos, en cintica encimtica se trabaja con V0. V (Abs S)

V0

t V0 vara cuando lo hace la concentracin de S inicial: Si [S] inicial es bajo, V0 es bajo.

50

Cuanto mayor sea [S] mayor ser tambin V0. En funcin de la cantidad de E, se alcanza el estado de saturacin cuando [S] es muy elevado: Se alcanza entonces V 0 MAX. V0 MAX V0 SATURACIN

[S]INICIAL 3 Ecuacin de velocidad de Michaelis Mentel: Se define KM (mol-1; M), constante de Michaelis Mentel, como la [S] para la cual V0 = VMAX/2. KM depende del pH y la temperatura del medio, pero no de [E]. VMAX depende de los tres factores. KM nos da una idea inversa de la afinidad de la E por su S, es decir, a mayor KM menor afinidad. VMAX V0 =a

VMAX 2

KM = b

[S]

La evolucin de V0 en funcin de [S]INICIAL forma, como hemos visto, una hiprbole. Por lo tanto: y = a.x / (x + b) De aqu, substituyendo (a) por VMAX, (b) por KM, y (x) por [S], obtenemos la ecuacin de Michaelis Mentel: V0 = VMAX.[S] / ([S] + KM) KM y VMAX se determinan experimentalmente. Se puede hacer con la hiprbole V0/[S] de Michaelis Mentel, pero suele utilizarse la expresin de Lineweaver Burk.

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4 Ecuacin de velocidad de Lineweaver Burk: Esta ecuacin es la inversa de la ecuacin Michaelis Mentel. Se utiliza para obtener KM y VMAX con ms facilidad. Con la hiprbole se necesitan altas [S], y resulta ms difcil de trabajar. 1/V0 = ([S] + KM) / VMAX.[S] b: El modelo se ajusta al de una funcin lineal, tal que: y = a.x + 1/V0 = (KM/VMAX).(1/[S]) + (1/VMAX) 1 / V0 KM / VMAX

1 / VMAX 1 / [S]

5 Deduccin de la ecuacin por el mecanismo de la reaccin: El mecanismo simple del modo de accin de una enzima presenta tres reacciones parciales, cada una con su constante cintica: K1 S + E K-1 KM = K-1 + K2 / K1 Suponemos que el equilibrio K1 se establece rpidamente, siendo entonces K2 el paso limitante de la velocidad de la reaccin. Entonces tenemos: V0 = K2.[ES] Por lo tanto, en condiciones de saturacin: V 0 = VMAX y [ES] = [E]INICIAL. De ah: VMAX = K2.[E]INICIAL La ecuacin de velocidad se deduce por medio de dos hiptesis: La hiptesis de Brigs Haldane o Estado Estacionario, o la hiptesis del Equilibrio Rpido. 6 Hiptesis de Brigs Haldane o Estado Estacionario: 52 ES K2 E + P

[ES] alcanza un equilibrio constante, es decir, es constante y por lo tanto la velocidad de formacin es igual a la velocidad de desaparicin. VFORMACIN = K1.[ES].[S] VDESAPARICIN = K-1.[ES] + K2.[ES] KEQ = [E].[S] / [ES] Teniendo en cuenta que [E] = [E]INICIAL [ES]: KEQ = ([E]INICIAL [ES]).[S] / [ES] KEQ = ( [E]INICIAL.[S] / [ES] ) [S] KEQ + [S] = [E]INICIAL.[S] / [ES] Teniendo en cuenta que [ES] = V0 / K2: KEQ + [S] = K2.[E]INICIAL.[S] / V0 KEQ + [S] = K2.[E]INICIAL.[S] / V0 Recordando que, en condiciones de saturacin, V MAX = K2. [E]INICIAL: KEQ + [S] = VMAX.[S] / V0 Obtenemos la ecuacin de Michaelis Mentel: V0 = VMAX.[S] / ([S] + KEQ) 6 Hiptesis del Equilibrio Rpido: La transformacin de ES en P es mucho ms lenta que la disociacin de ES en S, es decir, K 2 es mucho menor que K-1. Se trata en realidad de un caso particular de la primera hiptesis, donde se considera K2 despreciable. Se define en este caso KS como constante de disociacin. KS = K-1 / K1 KS = [E].[S] / [ES] Por el mismo proceso de Brigs Haldane, obtenemos tambin la ecuacin de Michaelis Mentel: V0 = VMAX.[S] / ([S] + KS) 7 Conceptos importantes en cintica encimtica:

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La Unidad de Actividad Encimtica es la [E] que cataliza la transformacin de un mol de sustrato, en un minuto, a 25 C y en condiciones ptimas de actividad. La Actividad Especfica de una enzima coincide con las unidades de actividad encimtica por mg de protena. El Nmero de Recambio es el nmero de mol de sustrato transformado en P por unidad de tiempo y de mg de enzima, cuando esta se encuentra saturada por el sustrato, es decir, V MAX / [E]INICIAL. Coincide aproximadamente con K2, y se llama tambin Constante Cataltica. La Eficacia Cataltica es K2 / KM. No nos da una idea de la eficacia de la enzima. La Fraccin de Molculas de Enzima Unidas a Sustrato se obtiene dividiendo V0 y VMAX, y es por lo tanto igual a [S] / (KM + [S]).

D/ La Inhibicin Encimtica:
1Generalidades: La actividad enzimtica suele verse inhibida por diversas sustancias, por procesos especficos. Estos procesos pueden ayudarnos a obtener informacin sobre el mecanismo de las reacciones catalizadas, los grupos funcionales del centro activo de la enzima, o los mecanismos de accin de las drogas. Ante un inhibidor, se produce la reduccin de la actividad enzimtica. Las inhibiciones pueden ser de varios tipos, los principales son: Inhibicin Irreversible: Inhibicin Reversible: E+I E+I EI EI

Si sometemos EI a Dilisis, desaparece el fenmeno de la inhibicin solo en caso de ser reversible. En este caso se produce un equilibrio rpido entre E y EI. El grado de inhibicin est relacionado con [I] y KEQ. A su vez, dentro de las inhibiciones reversibles se encuentran tres tipos de inhibidores: Inhibidores Competitivos, Inhibidores No Competitivos e Inhibidores Acompetitivos. 2 Inhibicin Irreversible: E e I se unen covalentemente, o de modo muy fuerte, de tal manera que no existe disociacin. Estos inhibidores se utilizan como arma qumica, o en insecticidas para los cultivos. Por ejemplo, Acetilcolinesterasa hidroliza Acetilcolina en uniones neuro-musculares despus de la sinapsis. Sin su inhibicin, la excitacin muscular permanecera constante.

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3 Inhibicin Reversible Competitiva: En este caso S e I, estructuralmente similares, compiten por el centro activo de la enzima, por lo que la inhibicin desaparece ante exceso de sustrato. E + S + I EI Ki = [E].[I] / [EI] Al aumentar Ki, disminuye la afinidad de E por I. Basndonos en la recta de Lineweaver Burk, al aumentar [I], aumenta la pendiente de la recta KM / VMAX, pero VMAX se mantiene constante: ES E + P

Ki: Constante de inhibicin (de disociacin de EI)

SIN I CON I 1 / VMAX

- 1 / KM - 1 / K M Se define KM como KM aparente en presencia de un inhibidor competitivo. Se puede deducir experimentalmente con la recta de Lineweaver Burk, sirviendo para el calculo de Ki. KM = KM.(1+ [I]/Ki) Ajustndolo a la ecuacin de Lineweaver Burk: 1/V0 = (1/VMAX) + (KM/VMAX).(1 + [I]/Ki).(1/[S]) 4 Inhibicin Reversible No Competitiva: No hay similitud entre S e I, y sus dominios de unin en E son distintos. E + S ES E + P 55

+ I Ki EI + S

+ I Ki ESI

En este caso KM se mantiene constante, pero VMAX cambia, cambiando tambin la pendiente de la curva KM / VMAX.

SIN I CON I 1 / VMAX 1 / VMAX

- 1 / KM Se define VMAX como VMAX aparente en presencia de un inhibidor no competitivo. Se puede deducir experimentalmente con la recta de Lineweaver Burk, sirviendo para el clculo de Ki. VMAX = VMAX / (1+ [I]/Ki) Ajustndolo a la ecuacin de Lineweaver Burk: 1/V0 = (1/VMAX).(1 + [I]/Ki) + (KM/VMAX).(1 + [I]/Ki).(1/[S]) Este tipo de inhibicin no desaparece ante exceso de S, ni se revierte. 4 Inhibicin Reversible No Competitiva: Es un caso muy raro, en el que I slo se une al complejo ES ya formado. E + S ES + I Ki ESI En este caso cambian tanto K M como VMAX, pero la pendiente de la recta se mantiene constante, es decir: KM / VMAX = KM / VMAX. SIN I 56 E + P

CON I

VMAX = VMAX / (1+ [I]/Ki) -

KM = KM.(1+ [I]/Ki)

Ajustndolo a la ecuacin de Lineweaver Burk: 1/V0 = (1/VMAX).(1 + [I]/Ki) + (KM/VMAX).(1/[S])

Al aparecer un exceso de sustrato la reaccin no se revierte ni desparece.

E/ Regulacin de la Actividad Enzimtica:

1Actividad Enzimtica del Metabolismo: En la clula viva, se encuentra una compleja red de reacciones metablicas catalizadas encimticamente, que reciben el nombre de Metabolismo. Se distinguen dos tipos de rutas metablicas: Rutas Metablicas de Biosntesis (anabolismo). Rutas Metablicas Degradativas (catabolismo). La vida de una clula depende de su metabolismo. La coordinacin y regulacin precisa y perfecta de esta red de reacciones es vital para ella. Existen rigurosos sistemas de control del conjunto de reacciones, que comprueban que se lleven a cabo las necesidades de las clulas vivas. Las enzimas, responsables del correcto funcionamiento metablico, deben por lo tanto tener: Localizacin subcelular especfica: Permite la separacin fsica de las distintas rutas metablicas. Por ejemplo, para los cidos grasos, las rutas de biosntesis suelen tener lugar en el citosol, mientras que las degradativas suceden en la matriz mitocondrial. Las Rutas Indirectas sirven para salvar la barrera fsica impuesta a los metabolitos por los sistemas membranosos. Los sistemas lanzadera transforman el metabolito de forma que pueda atravesar la membrana, y luego recuperar su conformacin nativa. Regulacin de su concentracin: Se controla rigurosamente tanto la sntesis como la degradacin de las encimas. Tiene lugar en el caso de enzimas inducibles: En el caso de E constitutivas [E] es constante.

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Las enzimas inducibles slo aparecen cuando son necesarias para la clula. Despus se degradan. En procariontes los operones (conjuntos de protenas) ven inducida su sntesis de forma conjunta. Regulacin de su actividad encimtica: Es el modo ms rpido de control sobre las rutas metablicas. Se puede producir por medio de distintos mecanismos: 1. Alosterismo. 2. Equilibrios polimerizacin/despolimerizacin. 3. Modificacin covalente reversible. 4. Activacin proteoltica, o modificacin covalente irreversible (caracteristica de proteasas; E digestivas y de coagulacin sangunea). 2 Regulacin Alostrica: Se produce por medio de la unin de un efector alostrico a una enzima que afecta al metabolismo, provocando un cambio conformacional. El efector puede ser un activador, en cuyo caso aumenta la afinidad de E por su S. Tambin puede ser un inhibidor, haciendo disminuir la afinidad de E por su S. Mientras la cintica ecimtica normal tiene forma hiperblica de Michaelis Mentel, en el caso de una encima con cintica alostrica tiene forma sinusoidal: V0

[L]

nu

[S] Las enzimas alostricas son protenas globulares con varias subunidades, y mltiples dominios de unin y centros activos. Los pequeos cambios en [S] suponen grandes cambios en la velocidad de la reaccin. Son muy sensibles a S. Los pequeos cambios en [A] (C del efector alostrico) suponen grandes cambios en la velocidad de reaccin. Si se trata de un activador, desplaza la curva sinusoidal hacia la izquierda. Si es un inhibidor, la desplaza a la derecha. De modo que, para una [S] constante, en presencia de activadores V MAX, y en presencia de inhibidores, VMIN. Se obtienen actividades encimticas muy distintas.

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La Retroinhibicin, o Inhibicin Feed-Back, es muy frecuente en rutas metablicas complejas. El ltimo producto de la ruta inhibe alostricamente a las enzimas que catalizan las primeras etapas. Por ejemplo, Aspartato Transcarbamilasa tiene subunidades catalticas con centros activos, y subunidades reguladoras con dominios de unin para efectores alostricos, separadas. ATP es un activador, que favorece la forma relajada del centro activo. CTP es, sin embargo, un inhibidor que favorece el estado tenso. 3 Regulacin de Equilibrios polimerizacin/despolimerizacin: Tiene lugar en el caso de protenas oligomricas que slo presentan su actividad ntegra en su forma polimrica. Por ejemplo, Acetil Coenzima Carboxilasa, responsable de la sntesis de cidos grasos. En algunos casos hay estados intermedios de actividad parcial: ACTIVO PARCIALMENTE ACTIVO 2 INACTIVO 2 +2

4 Regulacin por modificacin reversible: Se basa en el cambio conformacional provocado por la insercin covalente de un pequeo grupo en la cadena R de un aa de la enzima. Esto puede provocar la activacin o la desactivacin de la enzima. Generalmente se trata de la insercin de un grupo P (fosfato) o fosforilacin en un aa Ser, Thr o Tyr. Suele proceder de una molcula de ATP. Las protenas Kinasa suelen catalizar la insercin de P. Suelen activar la enzima. Se distinguen dos grupos de kinasas: Serina-treonina kinasas. Tirosina kinasas. Las protenas Fosfatasas catalizan la liberacin del grupo P, por hidrlisis. Suelen desactivar la enzima. La Adenilacin es otro grupo frecuentemente insertado para activar enzimas. Se inserta un AMP 5 Regulacin por activacin proteoltica: Las enzimas, pasad un tiempo de actividad, comienzan a destruirse por autodigestin. Se producen rupturas proteolticas irreversibles que adems conllevan cambios conformacionales. Se trata principalmente de las Serinproteasas de coagulacin y digestin. Los cimgenos del duodeno son activados encimticamente por un activador comn: la Tripsina.

F/ Isoenzimas y Agrupaciones de Enzimas:

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1 Las Isoenzimas: Se trata de las distintas formas que puede presentar una misma forma encimtica. Presentan distinta cintica y afinidad, distintos genes que las codifican, distinta expresin gentica en cada tejido, y disitnta presencia en los orgnulos subcelulares. Por ejemplo, Lactato Deshidrogenasa cataliza las transformaciones entre Piruvato y Lactato, acoplndose la reaccin a la hidrlisis de NADHs. Presenta 5 isoenzimas, de tipos M y H: LDH M4 (msculos, hgado): En el msculo cataliza el paso P > L. El Lactato es el producto final de la degradacin de la glucosa en el msculo. En el hgado cataliza L > P. Se debe a su sensibilidad a la relacin NADH/NAD +, baja en el hgado y alta en el msculo. LDH M3H (otros) LDH M2H2 (cerebro, rin) LDH MH3 (otros) LDH H4 (corazn): Calatiza el paso L > P, evitando que el Lactato se acumule. Una misma isoenzima puede catalizar su propia reaccin en un sentido u otro, influida por las condiciones del medio, como por ejemplo, la relacin NADH/NAD+. Se puede encontrar en un mismo tejido distintas isoenzimas separadas en distintos compartimentos. Por ejemplo, las enzimas que catalizan los cambios de conformacin de protenas y metabolitos para que puedan hacer rutas indirectas atravesando membranas fsicas. 2 Agrupaciones Multienzimticas: Sistemas formados por varias enzimas asociadas, de manera a obtener el mayor rendimiento energtico posible. Hay tres tipos de complejos: Los Agregados Multienzimticos, son varias enzimas asociadas en un nico complejo. Varios intermediarios de secuencias de reacciones cercanas en rutas metablicas pueden as permanecer unidas covalentemente. Las Enzimas Asociadas a la Membrana celular, si estn implicadas en la misma ruta metablica suelen encontrarse ordenadas en funcin de su participacin en la ruta en la membrana. Las Enzimas Multifuncionales son enzimas con distintas actividades enzimticas en una misma protena. Las agrupaciones multienzimticas confieren una serie de ventajas: La unin de un efector puede modificar la actividad cataltica de todo el complejo. La agrupacin disminuye la difusin de los metabolitos, y el tiempo de transicin, haciendo disminuir el gasto energtico de una ruta. 60

V/ Nuclesidos y Nucletidos:
A/ Introduccin:
1 Funciones de los Nucletidos: Presentan vario tipos de funciones en biologa: Gentica: Componentes fundamentales de cidos Nucleicos. Energtica: Molculas portadoras de Energa; la acumulan y transportan. Metablica: Algunos son Coenzimas o Intermediarios Activados para rutas de biosntesis, como por ejemplo UPD-Glucosa > Glucgeno, o CDP-Diacilglicerol > Fosfoglicridos. Transmisin de seales celulares: Mensajeros intracelulares, o segundos mensajeros. 2 Estructura general de nuclesidos y nucletido: Los nuclesidos y nucletido resultan de la unin de determinados componentes fundamentales: Un Azcar Pentosa: -D-Ribosa, en el caso de los ribonucletidos. -2-desoxi-D-Ribosa, en el caso de los desoxirribonucletidos. Una Base Nitrogenada (BN): Purina: Dos ciclos. (A, G...). Pirimidina: Un ciclo (C, T, U) Recibe el nombre de Nuclesido la unin Pentosa + BN. La unin de estos dos compuestos se produce mediante un enlace N-glucosnico entre el C1 del azcar y N1 (Pirimidina) o N9 (Purina). Recibe el nombre de Nucletido la unin Nuclesido + grupo fosfato. Esta ltima unin se suele producir entre el C 5 (tambin C2 y C3) y un OH del grupo P. Se desprende una molcula de agua. 3 Nomenclatura: Nuclesidos: Utilizamos el prefijo Desoxi- si el azcar es -2-desoxi-D-Ribosa. Seguido, el nombre de la BN: -Guan-, -Aden-, -Cit-, -Tim-. Finalmente, utilizamos el sufijo osina en purinas, e idina en pirimidinas.

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EJEMPLOS: Guanosina, Desoxiadenosina, Citidina, Desoxitimidina. Nucletidos: Partimos del nombre del nuclesido. A continuacin se pone el nmero del Carbono del azcar que media la unin (5, 3). Finalmente se indica el nmero de grupos fosfato unidos: monofosfato, Difosfato, Trifosfato. Suele emplearse un tipo de nomenclatura por iniciales. EJEMPLOS: Adenosina-5-Monofosfato (AMP) Adenosina-5-Trifosfato (ATP) Desoxiguanosina-5-Monofosfato (dGMP) 4 Principales tipos de Nucletidos: Los nucletidos nucleicos son aquellos que se encuentran en los cidos nucleicos como componentes bsicos. Encontramos dos tipos: Desoxirribonucletidos-5-monofosfato, componentes bsicos del DNA (dAMP, dGMP, dCMP, dTMP). Ribonucletidos-5-monofosfato, componentes bsicos del RNA (AMP, GMP, CMP, UMP). Se pueden encontrar en cidos nucleicos, o libres con su grupo P ionizado a pH fisiolgico. Los ciclos de la BN y la pentosa forman un ngulo casi recto. Sus espectros UV caractersticos son ( = 250-280nm). Pueden separarse y analizarse fcilmente por cromatografa de intercambio inico, pues OH de P se hidroliza a O-. El grupo P terminal en posicin o se puede separar por accin encimtica o por calefaccin en clorhdrico. El grupo P en no se puede separar. Muchos otros nucletidos no nucleicos tienen una importancia en las clulas vivas: Energa biolgica (ATP, GTP). Intermediarios activados metablicos (ADP, GDP). Coenzimas (NADH/NAD+). Segundos mensajeros (AMPc, GMPc).

B/ Nucletidos no nucleicos:
1 Nucletidos Difosfato (NDP) y Trifosfato (NTP): A menudo, los NDP actuan como intermediarios activados en rutas de biosntesis, como la sntesis del gucgeno o de fosfatidil colina. Los NTP son los transportadores universales de energa gracias al enlace del tercer grupo P. Durante su hidrlisis se libera una gran cantidad de energa. ATP + H2O ADP + Pi

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ATP + H2O

AMP + PPi (pirofosfato)

Para ambas reacciones: G0 = -7,3 kCal/mol. Por ello, otras reacciones metablicas no espontneas pueden acoplarse a esta hidrlisis, y utilizarla como fuente de energa de activacin. 2 El Coenzima Nicotinamida Adenina Difosfato (NAD+/NADH): Se trata de un dinucletido, con dos ribosas y dos grupos P que median la unin. Una ribosa est unida a Adenina mientras la otra se une al grupo Nicotinamida. Nicotinamida es la parte vitamnica del coenzima. Es un coenzima comn a Oxidoreductasas, como por ejemplo, Lactato Deshydrogenasa (LDH) o Malato Deshydrogenasa (MDH). El grupo Nicotinamida puede captar 2e - y 1H+ del Sustrato en su 4 C , diferencindose las formas oxidada y reducida. Es un coenzima fundamental en rutas de metabolismo Redox: NAD+ + 2H+ + 2e- + S
OX Reduccin

NADH + H+ + P
RED

En su forma reducida, NADH presenta dos picos de absorbancia en lugar de uno: A = 260 nm y = 340 nm. Esta particularidad es empleada para el estudio de cintica encimtica. Patologa: Peladra; deficiencia de nicotinamida. Es necesario un aporte exgeno de triptfano en los alimentos para su sntesis: Hidrlisis de aa Trp Nicotinamida El NADP+/NADPH slo se diferencia del NAD +/NADH por poseer un grupo P unido en C2 de la Ribosa de Adenina. Durante la respiracin, NADH se oxida cediendo sus electrones. NADPH al oxidarse ejerce de Poder Reductor en numerosas reacciones de biosntesis, como la de cidos grasos y esteroides. 3 El Coenzima Fosfato de Riboflavina (FMN, Flavin Mono Nucleotido): No se trata de un autntico nuclesido, pues carece de Ribosa. En su lugar se encuentra Ribitol. Isoaloxacina (tres ciclos) se unen por medio de N al ribitol, formando la Riboflavina (vit B 2), parte vitamnica. El grupo P se une en el extremo libre del ribitol. El grupo Riboflavina puede captar 2e- y 2H+ del Sustrato en sus dos N, diferencindose las formas oxidada y reducida. Es un coenzima fundamental en rutas de metabolismo Redox: FMN + 2H+ + 2eOX Reduccin

FMNH2
RED

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Es un coenzima propia de Deshidrogenasas Dependientes de Flavina, de las cadenas respiratorias. 4 El Coenzima A (CoA): Es un coenzima que acta como transportador de grupos Acilo, gracias al tomo de azufre del extremo Tiol. Su estructura es similar al nucletido ADP, pero formado por Ribosa-3-fosfato (en total, 3 grupos P). Unido al P en se encuentra un cido pantotnico, y finalmente el grupo -mercaptoetilamina con SH extremo. El cido pantotnico es su parte vitamnica. Este coenzima adquiere un papel fundamental en el metabolismo. R COO- + HS CoA
ACILO TIOL

R CO S CoA
TIOESTER

La Acetil CoA es un punto comn de la degradacin de molculas por el Ciclo de Krebs, en plantas y microorganismos: CH3 CO S CoA 5 Nucletidos cclicos: Al elevarse su concentracin en el citosol celular, AMP cclico (cAMP) y GMP cclico (cGMP) ejercen el papel de segundos mensajeros en la transduccin de seales celulares, implicando cambios metablicos. cAMP y cGMP provienen de ATP y GTP por la accin de las enzimas Adenilato Ciclasa y Guanilato Ciclasa respectivamente. Se desprende pirofosfato. La reaccin se produce ante la llegada de una seal externa. ATP GTP
ADENILATO CICLASA

cAMP + PPi cGMP + PPi

GUANILATO CICLASA

cAMP est relacionado con la transduccin de seales por receptores transmembrana asociados a protenas G. Una hormona activa el receptor, el cual activa la protena G separando la subunidad . La subunidad activa la Adenilato Ciclasa anclada a la membrana, y [cAMP] aumenta. La unin de dos cAMP en la subunidad reguladora de protenas kinasas puede activarlas o desactivarlas, regulando as la transcripcin de ciertos genes, y con ello el metabolismo.

C/ Los cidos Desoxirribonucleicos (DNA):

1Generalidades: 64

En 1869 Miesher aisla por primera vez en la historia cidos Nucleicos: cromosomas (DNA) de leucocitos. Logra aislarlos rompiendo las clulas con Clorhdrico, rompiendo los ncleos con tratamiento alcalino, y extrayendo el precipitado: lo llam Nuclena. El Cromosoma es una larga macromolcula filamentosa formada por un alto nmero de cidos desoxirribonucleicos, unidos por enlaces fosfodiester entre Desoxirribosas (en C5 y C3) y Fosfatos:
5-Desoxirribosa-3 5 libre BN

5-Desoxirribosa-3 BN

5-Desoxirribosa-3 BN 3 libre

Presenta una parte constante o esqueleto, formada por desoxirribosas y fosfatos, y una parte variable, formada por las cuatro BN, pricas o pirimidnicas. La secuencia de BN contiene la informacin gentica. Los DNA estn polarizados por su esqueleto de Ribosa-Fosfato. Por convenio, la primera desoxirribosa tiene su grupo 5 libre, mientras la ltima tiene el 3 libre. 2 Estructura 3D del DNA: Watson y Crick ganaron el Premio Nobel en 1962 al descubrir la estructura 3D del B-DNA, gracias a estudios mediante Rayos X. En su estructura 3D, el DNA est formado por dos cadenas acopladas antiparalelamente. Las uniones entre las dos cadenas estn mediadas por las BN. Sus secuencias de BN son complementarias, de forma que siempre se une una purina con una pirimidina, ms concretamente AT y C-G. 5 3 3 5

Las cadenas se enrollan espontneamente dextrgira y helicoidalmente. Las BN se encuentran apiladas en el interior de la hlice. Los puentes de H entre las BN mantienen la estructura helicoidal del DNA. La unin purina-pirimidina se descubri al calcular la distancia de separacin entre las cadenas (10,85 A), donde no caben dos purinas, pero sobra espacio para dos pirimidinas. Hay elevada especificidad en los enlaces A-T (2 puentes de H) y C-G (tres puentes de H, unin ms fuerte). La Tautomerizacin es el desplazamiento del H + que refuerza los puentes de H. Estos puentes se establecen entre un grupo dador de H y un grupo aceptor. GRUPOS ACEPTORES: CETO: R C R O R C N H 65 IMINO:

GRUPOS DADORES:

GRUPOS DADORES: ENOL: R C R OH R C N H AMINO: H

Los restos hidrofbicos de las BN crean en el medio celular Efectos Hidrofbicos, por lo que tienden a colocarse espontneamente en el interior de la estructura, afectando a la estabilidad del DNA. Entre la BN se establecen fuerzas de WW. Al haber un grandsimo nmero de BN, estas fuerzas tambin afectan a la estabilidad del DNA. Algunos casos son motivos de inestabilidad, como la repulsin entre grupos Fosfodiester a pH = 7 (Cargas -). Se encuentran neutralizadas por iones Mg2+ unidas al esqueleto del DNA. 3 Tipos estructurales del DNA: B-DNA es el la estructura del DNA en condiciones fisiolgicas normales, descrita por Watson y Crick. En este tipo estructural, los enlaces N-glicoslicos entre las BN no son diametralmente opuestos, por lo que se distinguen dos surco de distintos tamaos: El surco mayor (12 A) y el surco menor (6 A). Es una estructura flexible, plegable, y resistente a ataques mecnicos. Origina los DNA circulares de bacterias, virus y plastos. Puede Superenrrollarse: proporciona mayor empaquetamiento. El desenroscado facilita la Transcripcin. En eucariontes se enrolla describiendo una Superhlice levgira alrededor de complejos proteicos formados por Histonas: Los Nucleosomas. Varios Nucleosomas forman un Collar de Perlas, que se compacta en Cromatina. La accin de un Armazn Cromosmico proteico estructura finalmente los Cromosomas. A-DNA fue descubierto por anlisis con Rayos X. Es ms grueso y ms corto. Son fibras deshidratadas. Presentan un surco mayor ms profundo y estrecho, y uno menor superficial y ancho. 1 vuelta de hlice = 11 BN. Caso de RNA de doble hlice, o hbridos DNA-RNA. Z-DNA presenta grupos P en Zig-Zag. Hlice levgira termodinmicamente no favorable. Surco mayor convexo, surco menor profundo. 1vuelta de hlice = 12 BN. Se descubri gracias a un Hexanucletido formado por C y G: CGCGCG 66

GCGCGC En Z-DNA, G se dispone SIN (BN y pentosa del mismo lado del enlace), y C se dispone ANTI (Viceversa). 4 Desnaturalizacin y Renaturalizacin del DNA: La doble hlice de DNA se disocia localmente con frecuencia, permitiendo as la transcripcin. La Desnaturalizacin del DNA es la disociacin completa de ambas hebras, o transicin hlice cadena. Se rompen los puentes de H. Desnaturalizacin trmica o fusin del DNA: se logra por aumento de la temperatura. TFUSION o TM es la T a la que se disocia la mitad de la hlice. Se utiliza la colorimetra, pues al desnaturalizarse, la absorbancia del DNA aumenta considerablemente, a una longitud de onda concreta. La ptima para estas medidas en el ADN es = 260 nm. Este fenmeno se llama Efecto Hipercrmico. En concreto, las BN desapareadas absorben 37% ms que apareadas. Se realiza una Curva de Fusin (Abs260 en funcin de T) para obtener la TM. Se ha observado que TM depende de la [CG] de las hebras. Cuanto mayor es [CG], ms estable es la hlice, lo cual es lgico al establecerse tres puentes de H entre C y G, y solo dos entre A y T. Se puede lograr la renaturalizacin del ADN haciendo descender lentamente la temperatura, hasta descender a una T fisiolgica normal. Las hebras se reasocian correctamente. Este proceso se llama Templado.

D/ Los cidos Ribonucleicos (RNA):

1 Generalidades: Los RNA fueron descubiertos y aislados pr primera vez posteriormente al descubrimiento de los DNA, por Hoppe Seyler. Fueron extrados de levaduras. Posteriormente de plantas y bacterias. En 1914 Feulger utiliza colorantes especficos para RNA y DNA, comprobando la coexistencia de ambos tipos de molculas en la mayora de las clulas. Se trata de una larga molcula de Ribonucletidos unidos por enlaces Fosfodiester en 3 y 5. Presenta un esqueleto constante de Ribosas Fosfato, y una regin variable con BN. La estructura de una hebra es similar a la del DNA. Las principales diferencias RNA/DNA son: Ribosas (Impiden la formacin de B-RNA) / Desoxirribosas. Monocatenarias (bicatenarios, Hbridos DNA-RNA) / Doble Hlice. A-RNA (en caso de bicatenarias e hbridos) / B-DNA, A-DNA, ZDNA. Urcilo (U) / Timina (T).

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Reactivo / Estable. El grupo OH en 2 de la Ribosa impide la formacin de B-RNA: El tipo estructural B es el ms estable. Estos OH promueven la reactividad qumica del RNA y permiten interacciones entre zonas alejadas de la molcula. Por ello RNA es ms inestable, y no adquiere las proporciones del DNA, ni sus funciones de estabilidad y conservadurismo gentico. En las cadenas monocatenarias de RNA suelen producirse emparejamiento de bases dando lugar e estructuras llamadas Orquilla y Bucle. 2 Principales tipos de RNA: RNA mensajero (mRNA) transporta la informacin gentica transcrita del DNA del ncleo, al citosol. Sirve como plantilla para la traduccin por el ribosoma. Participa por lo tanto en la expresin de la informacin gentica. RNA ribosmico (rRNA) es la parte constitutiva del Ribosoma: Constituye el 75% del cuerpo del Ribosoma. RNA transferente (tRNA) transporta los aa y los incorpora a las protenas durante su sntesis, interaccionando con el molde de mRNA. RNA heterogneo nuclear (hnRNA) es en eucariontes el precursor de mRNA maduro. Es llamado tambin RNA transcrito primario. RNA pequeo nuclear (snRNA) es en eucariontes un pequeo cido ribonucleico que se incorpora a una protena que desempea un importante papel el la maduracin del hnRNA al mRNA maduro. 3 Las Nucleasas: Se trata de un grupo de enzimas, dentro de las Serinproteasas, capaces de hidrolizar los enlaces fosfodiester del RNA, y de las hebras de DNA. Estn presentes en los lisosomas de la mayora de las clulas en todos los organismos vivos. Son liberadas por el pncreas al tubo digestivo, donde catalizan la digestin de los cidos nucleicos. Se distinguen Ribonucleasas y Desoxirribonucleasas en funcin del tipo de cidos nucleicos que hidroliza. Se distinguen, en funcin de la regin del cido nucleico en la que llevan a cabo su accin: Endonucleasas: En posiciones externas. Exonucleasas 5: En los extremos 5. Exonucleasas 3: En los extremos 3. Se distinguen tambin por el tipo de nucletido que originan: Tipo a: Rompen antes del P originando un 5-Monofosfato Nuclesido. Tipo b: Rompen despus del P originando un 3-Monofosfato Nuclesido.

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Las Endonucleasas de Restriccin tienen alta especificidad, pues reconocen una corta secuencia de BN antes de realizar el corte. Slo hidrolizan dichas secuencias. Fueron descubiertas en bacterias, durante la dcada de 1970. Se nombran, por este orden, en funcin del gnero, especie y cepa de la bacteria que los sintetiza. Se asignan nmeros romanos para diferenciarlas. EJEMPLO: Eco R I (E. coli, cepa R)

VI/ Procesos Moleculares de la Expresin de la Informacin Gentica:

A/ La Replicacin del DNA:
1 Generalidades: La replicacin de la informacin gentica es fundamental, previamente a la Mitosis y la Meiosis. Permite el paso de cromosomas de una a dos cromtidas. La replicacin exacta del DNA permite su transferencia fiel a siguientes generaciones de clulas, e incluso organismos. El proceso se basa en la especificidad en el emparejamiento de BN (A-T; C-G): Conociendo la secuencia de una de las cadenas, se puede deducir la cadena complementaria. Watson y Crick descubrieron que, durante la replicacin, cada una de las cadenas acta como molde para la sntesis de su cadena complementaria. Las DNA Polimerasas son el grupo de enzimas que catalizan la sntesis de DNA, dirigidas por una cadena molde. Necesitan detectar la presencia de un Fragmento Cebador con OH en 3 de la cadena molde para iniciar la sntesis. La sntesis tiene lugar de 5 hacia 3. Se utilizan como precursores desoxirribonucletidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP). 2 Experimento de Meselson & Stahl:

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La propuesta de Watson y Crick supona que se trata de un Proceso Semiconservativo: Se conserva una cadena parental, que se utiliza para la sntesis de la complementaria. El experimento de Meselson y Stahl demuestra la naturaleza Semiconservativa del proceso. Trabajaron con E. coli. Cultivaron la generacin parental en un medio cuya fuente de N era 15NH4+. Las bacterias incorporaron entonces tomos de N radiactivos en sus cidos nucleicos. Los cidos nucleicos radiactivos podan detectarse por su elevada . Durante los siguientes ciclos celulares, cultivaron las generaciones hijas en medios cuya fuente de N era 14NH4+, no radiactivo. Observaron despus del primer ciclo celular, se observaba un nico pico de media. Despus del segundo ciclo observaron dos picos de , uno intermedio y otro de molculas no radiactivas. Este experimento, que pudo realizarse gracia a las distintas densidades de 14N y 15N, confirm que el proceso de replicacin es semiconservativo. 3 Generalidades de Replicacin del DNA en procariontes: DNA Polimerasa I se encarga de la replicacin y procesos de reparacin. Su cintica es de 16-20 Nucletidos/segundo. DNA Polimerasa II se encarga exclusivamente de reparaciones durante la replicacin del DNA. SU cintica es 2-5 N/s. DNA Polimerasa III se encarga de la replicacin durante la elongacin de la nueva cadena. Su cintica es 250 1000 N/s. Se trata de un polmero asimtrico, con un ncleo central con tres subunidades: (elongacin), (exonucleasa 3) y . Tiene otras subunidades, como (abrazaderas). Las tres DNA Pol presentan actividad exonucleasa 3, lo que les concede la propiedad de reparar sus propios errores durante la replicacin. DNA Pol I tiene adems actividad exonucleasa 5 fundamental para eliminar los Fragmentos Cebadores. La replicacin se inicia en el punto Origen (Ori C) de origen, en el DNA circular. Es un proceso Bidireccional: se forman dos Orquillas de Replicacin que se desplazan desde O en sentidos contrarios. En cada Orquilla de Replicacin, hay replicacin continua en una de las hebras, la Cadena Conductora (de 5 a 3), y discontnua en la complementaria, o Cadena Retardada (de 3 a 5); en esta ltima los fragmentos discontinuos reciben el nombre de Fragmentos de Okazaki. La formacin de estos fragmentos de Okazaki en la Cadena Retardada es lgica teniendo en cuenta que DNA Pol sintetizan siempre de 5 a 3, y dado que ambas cadenas son antiparalelas: En la hebra complementaria (Retardada), DNA Pol acta en sentido contrario al sentido de abertura de la Orquilla.

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Tanto en el fragmento continuo como en cada fragmento de Okazaki, la sntesis comienza por un fragmento cebador de RNA, sintetizado por una Primasa (DNA Pol especializada). Las dos Orquillas de Replicacin se encuentran en el polo opuesto a Ori C terminando la replicacin del plsmido. 4 Etapas de Replicacin del DNA en procariontes: 1. El DNA circular se encuentra inicialmente superenrollado. Se produce el desenrollamiento de 245 pares de BN en Ori C. DNA-A (tetrmero ATPasa) reconoce y desenrolla en Ori C 13 pares de BN. DNA-B y DNA-C reconocen el complejo DNA DNA-A. DNA-B helicasa, con ayuda de 6 enzimas DNA-C desenrollan la hlice. 2. DNA-A se disocia del complejo, DNA-B prosigue el desenrollamiento. El desenrollamiento se produce por superenrollamiento negativo, inducido por DNA-Girasa (Tropoisomerasa II) que elimina las tensiones que estabilizan el superenrollamiento positivo. 3. La protena SSB (Single Strand Binding) mantiene estabilizadas las cadenas desenrolladas, unindose a ellas. 4. La enzima Primasa lee la cadena molde, reconociendo y sintetizando los fragmentos cebadores de RNA: Forma el complejo Primosoma. 5. DNA Pol III se une a 3 libre del cebador e inicia la sntesis de DNA o elongacin (contnuo, o fragmentos de Okazaki). Las subunidades abrazaderas se unen a la hebra molde de DNA. La subunidad exonucleasa 3 detecta y corrige los errores recin producidos en la nueva hebra. Una misma DNA Pol III en cada orquilla de replicacin cataliza las sntesis de las cadenas Conductora y Retardada. (Hiptesis Bucle). La polimerizacin tiene lugar por el ataque Nuclefilo del OH unido en 3 terminal, al trifosfato de 5 del NTP, que al polimerizar pasa a NMP. 6. DNA Pol I entra en accin. Tiene tres subunidades con actividad enzimtica: Exonucleasa 5: Elimina los fragmentos cebadores en 5 del DNA. Polimerasa 5 > 3 Rellena los huecos de los fragmentos cebadores con DNA. Desplaza las muescas. Exonucleasa 3: Corrige los errores recin cometidos en la sntesis. 7. La enzima DNA Ligasa une los fragmentos de DNA de las hebras fragmentadas, devolviendolas a la normalidad. HIPTESIS: Se forma un Bucle en la Cadena Retardada (ver fotocopia) permitindose la lectura y sntesis simultnea de ambas

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cadenas, de 5 a 3. Por ello DNA Pol III es un polmero asimtrico. Al terminar una fragmento de Okazaki se suelta un bucle y se forma uno nuevo en el siguiente fragmento cebador. 5 La Replicacin del DNA en eucariontes: Es un proceso similar al de la replicacin del DNA en procariontes, pero ms complejo. En eucariontes se presenta un DNA ms largo y ms compactado. Presenta, al igual que en procariontes, una sntesis contnua y una discontinua sincronizadas. Se encuentran varios puntos de origen de replicacin a lo largo de un cromosoma, que coinciden presuntamente con sus puntos de unin al citoesqueleto. Durante la Replicacin activa hay numerosas Orquillas de Replicacin, pero estas avanza ms lentamente que en procariontes. Los fragmentos de Okazaki son ms cortos. El proceso de sntesis, eliminacin y relleno de fragmentos cebadores es similar al caso de procariontes. Se conocen cinco tipos de DNA Pol: DNA Polimerasa: Replica y repara la hebra retardada. DNA Polimerasa: Subordinada a , repara errores en la hebra retardada. DNA Polimerasa: Mitocondrial. DNA Polimerasa: Replica y repara la hebra conductora. DNA Polimerasa ha sido descubierta recientemente.

6 Mecanismos de Reparacin de la Replicacin del DNA: Existen distintos tipos de lesiones del DNA que suceden con frecuencia durante la replicacin, pues al separarse las hebras pierden estabilidad. Las Enzimas Reparadoras rastrean la hebra de DNA en busca de errores continuamente. La Fotodimerizacin de dos TMP adyacentes es una de las lesiones ms frecuentes. Se produce ante rayos UV, que pueden dar lugar cncer. La incorporacin de un dmero de Timina unido por dos puentes de H impide la correcta replicacin del DNA. Se inicia todo un mecanismo de deteccin y reparacin en procariontes: 1. La Escinucleasa (con actividad endonucleasa) corta el fragmento que incluye el dmero en la hebra replicada. 2. DNA Pol I sintetiza el DNA correspondiente al hueco, y DNA ligasa incorpora el fragmento reparado en la hebra replicada. En procariontes y algunos eucariontes se encuentra DNA fotoliasa, que absorbe los rayos UV. Con la energa de un fotn rompe un dmero de Timina en BN originales. La Desaminacin Hidroltica es otra lesin frecuente del DNA. Se trata de la substitucin de grupos Amino por grupos Ceto. Transforma 72

los NMP, por ejemplo, transforma A en Hipoxantina, G en Xantina, y C en U. La DNA Glicosilasa rompe los enlaces N-Glicoslicos de la BN modificada. Las endonucleasas cortan el fragmento que contiene la BN modificada. Finalmente entran en accin DNA Pol I y DNA ligasa. Existen muchos factores del medio que influen en la modificacin de BN, como las radiaciones ionizantes, el oxgeno radiactivo, las reacciones oxidantes, o prdidas espontneas de BN.

B/ La Transcripcin; del DNA al mRNA:

1 Generalidades: La Transcripcin es un proceso fundamental de la expresin de la informacin gentica. La informacin contenida en un fragmento del DNA cromosmico, que recibe el nombre de Gen, es capaz de atravesar la membrana nuclear en forma de mRNA, en busca de un Ribosoma que realice la Traduccin. RNA Polimerasa es la enzima responsable de llevar a cabo el proceso de Transcripcin de los genes. Sintetiza los RNA siempre de 5 a 3. Para su accin, requiere de la presencia de precursores activados NTP (ATP, GTP, CTP y UTP), la presencia de Mg2+, y un molde de DNA, generalmente dicatenario. 2 La Transcripcin en procariontes: RNA Pol es la principal enzima relacionada con la Transcripcin en procariontes. Coactua con protenas moduladoras de su actividad. Lee la hebra de 3 a 5 (sintetizando mRNA de 5 a 3). La cadena leda recibe el nombre de Hebra Antisentido, pues es complementaria a la secuencia de RNA, y complementaria a la otra hebra que recibe el nombre de Hebra Molde (no leda). Las funciones de RNA Pol son numerosas: 1. Localiza los Centro de Iniciacin o Promotores. 2. Separa localmente las hebras de DNA en el punto +1, donde se inicia la Transcripcin de la hebra antisentido. 3. Selecciona el NTP adecuado. 4. Cataliza la formacin de enlaces fosfodiester por ataques nuclefilos. 5. Localiza las Seales de Terminacin de la transcripcin. RNA Pol se forma de seis subunidades: (2 subunidades) reguladoras y responsables de la Iniciacin de la Transcripcin. Forman parte del ncleo central de la protena. se encarga de llevar a cabo la iniciacin y elongacin. Forma parte del ncleo central. es la subunidad abrazadera que se une al molde de DNA. Forma parte del ncleo central. localiza el Promotor, lugar en que se inicia la elongacin.

73

 de funciones desconocidas. El proceso de Transcripcin transcurre Iniciacin, Elongacin y Terminacin.

en

tres

etapas:

3 Desarrollo de la Transcripcin en procariontes: La primera etapa del proceso es la Iniciacin. El inicio del gen es reconocido y RNA Pol se une al molde de DNA. 1. Reconocimiento del Promotor o secuencia de iniciacin. Una de las ms conocidas es TATA box. Es reconocido por la subunidad de RNA Pol. Se encuentran en el extremo 5 de cada gen, pudiendo abarcar unos 40 pares de BN. EJEMPLO: TATA box:
-35

TTGACA-------------------TATTAT-----(A o G)

-10

+1

2. Una vez localizado el punto +1 donde se inicia la Transcripcin del gen, se forma el complejo llamado Burbuja de Transcripcin. Para la formacin de este complejo, en el que interviene RNA Pol y DNA, el DNA es parcialmente desnaturalizado en 18 pares de BN, o 1,6 vueltas de hlice. La burbuja se une inicialmente desde el punto -10, y sobrepasa el +1. 3. Se forma el primer corto fragmento de RNA que forma un hbrido DNA-RNA. Este hbrido cuenta unas 10 BN. 4. Al terminar de formarse el fragmento iniciador de RNA, se produce un cambio conformacional en RNA Pol, y la subunidad se disocia, permitiendo el desplazamiento de la enzima por el molde. La segunda etapa recibe el nombre de Elongacin. Durante esta etapa, RNA Pol recorre la hebra Antisentido transcribiendo la informacin del gen. La Burbuja de Transcripcin se desplaza a lo largo de la hebra de DNA, pero tanto su longitud como la del hbrido DNA-RNA que se forma tras su paso son constantes La subunidad de RNA pol cataliza la formacin de los enlaces fosfodiester de los nucletidos incorporados, de forma similar a la replicacin del DNA, cambiando T por U. Cuando RNA Pol se desplaza, el DNA rota en su interior, y se crean tensiones que ralentizan la velocidad de la burbuja de Transcripcin. Las Tropoisomerasas rebajan dichas tensiones. La ltima etapa es la Terminacin. Tiene lugar de un modo muy selectivo, al igual que la Iniciacin. En el DNA, el final de los genes est marcado por determinados Fragmentos Pausa, donde disminuye notablemente la velocidad de Transcripcin. En estos fragmentos pausa hay numerosas seales de terminacin: Secuencias Palindrmicas de A y T, que al ser transcritas

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forman en el RNA estructuras en Orquilla o Bucle, con fuertes uniones C-G. NUS A permanece durante la elongacin unido a RNA Pol, evitando la asociacin de la subunidad . Facilita el reconocimiento de las seales de terminacin. EJEMPLO: Secuencia Palindrmica de terminacin: -------CGGCG---------CGCCGUUUUUUUUUUUU Al girar 180 la hebra, las secuencias en verde son complementarias y quedan unidas por numerosos puentes de H. Producidas estas estructuras en Orquilla, el hbrido DNA-RNA queda desestabilizado, y la Burbuja de Transcripcin se disocia. Una ristra de U al final de las seales de liberacin facilita la liberacin del RNA desestabilizando ms el hbrido, siendo la unin UA ms dbil. La protena detecta las seales de terminacin que no son reconocidas por RNA Pol. Tambin interviene el factor pero su funcin es an desconocida. 4 La Transcripcin en Eucariontes: Es, de nuevo, un proceso similar pero algo ms complejo. Intervienen tres tipos de RNA Polimerasas: RNA Pol I: En genes de rRNA (18S, 5,8S, 28S). RNA Pol II: En genes de mRNA para traduccin a protenas. RNA Pol III: Genes para snRNA, tRNA y rRNA (5S). Adems de estas, existen otras en mitocondrias y cloroplastos. Todos los RNA transcritos primarios de eucariontes necesitan sufrir un Proceso de Maduracin antes de poder ser considerados activos y alcanzar su conformacin definitiva. Se distinguen tres tipos de maduracin de RNA transcrito primario: 1. Eliminacin de Secuencias: Pueden ser secuencias externas de 5 o 3 necesarias para iniciacin y terminacin. Tambin pueden ser Intrones; secuencias internas que no contienen informacin necesaria para prtenas. 2. Adicin de Secuencias No Codificadas: Por ejemplo, la adicin en tRNA de CCA. 3. Modificaciones Covalentes: La ms frecuente es la metilacin de las BN. En ocasiones tambin metilacin de las ribosas en 2. Casos de Metilaciones: Ribosa A 2-O-Metilribosa 6-Dimetiladenina 75

T Dihidrouridina Ribotiuridina Pseudouridina

La maduracin aumenta la estabilidad del RNA y le permite adquirir su estructura activa. En tRNA se eliminan la secuencia gua en 5 y la secuencia poliU en 3. Tambin es eliminado un intrn de 14 BN. Se aade la secuencia CCA, indispensable para la unin de los aa que sern incorporados a protenas. En la baceria E. coli si tiene lugar la maduracin del RNA transcrito primario. Una misma molcula de RNA, cargada de intrones, dar lugar despus de maduracin a tRNA, rRNA 16S, rRNA 23S y rRNA 5S. En algunos casos, como E. coli, los propios intrones catalizan su eliminacin. LA MADURACIN EN E. COLI Exn Intrn

MADURACIN

rRNA 16S

tRNA

rRNA 23S

rRNA 5S

Posteriormente a la eliminacin de intrones, los exones suelen ser empalmados. Este proceso de Splicing es catalizado por encimas especficas. Finalmente se forma una caperuza CAP en el extremo 5 del RNA, que protege ante ataques de exonucleasas, y puede ser reconocido por los Ribosomas en el citosol. El primer nucletido en 5 del RNA es un NTP. Por accin de una Fosfatasa pierde su P en . Despus se produce una Guanilizacin a costa de GTP. G queda unido por medio de tres grupos P al extremos 5 del mRNA, antes de que ste pueda abandonar el ncleo celular.

B/ La Traduccin; del mRNA a las Protenas:

1 Generalidades: Se trata del proceso de Biosntesis de Protenas, y es por lo tanto tambin un proceso fundamental para toda clula viva. Se utiliza el molde de mRNA que transporta la informacin de un gen. En concreto, la secuencia de BN (4 elementos) determina el orden de la secuencia de -L-aa proteicos (20 elementos). Debido a la diferencia en el nmero de elementos, 1 codn = 3 BN = 1 aa. Varios codones distintos pueden codificar un mismo aa. 76

La traduccin de un lenguaje al otro se realiza respetando el Cdigo Gentico Universal, que es idntico en, prcticamente, todos los seres vivos. tRNA transporta los aa que van a ser incorporados al pptido (aminoacil-tRNA). Tiene un papel de intermediario en la Traduccin. rRNA entra en juego formando una parte constitutiva de los Ribosomas; maquinaria necesaria para la Traduccin. 2 Estructura del tRNA: tRNA juega como intermediario entre Molde y Protena. Presenta una estructura en Hoja de Trbol. Muchas regiones de la molcula son complementarias y se unen facilitando y estabilizando el plegamiento (50%). Se trata de una nica cadena de RNA, de unas 73-93 BN. Presenta una Cola con los extremos 5 y 3 donde se produce la unin del aminocido. Presenta adems tres Lazos no apareados en estructuras de orquilla y tambin un pequeo Brazo Adicional Variable no apareado. En el extremo 5 se encuentra una caperuza CAP de guanina. En el extremo 3 se produce siempre la unin de la secuencia CCA, que permite la unin del aa en OH de 3 de A (raramente en 2 de C) En algunas BN puntuales se produce Metilacin (modificacin covalente). Por ejemplo, la transformacin U > T impide el apareamiento quedando libre para otra interaccin. La metilacin concede carcter hidrofbico en ciertos fragmentos que pueden interaccionar con protenas o Ribosomas. Las regiones apareadas suelen determinar la estructura de la molcula. Las regiones no apareadas adquieren papeles funcionales; son las siguientes: Extremo 3 terminal unido a Secuencia CCA donde se une el aa. Lazo TC: Las BN T y proceden de la Metilacin de U. Lazo Anticodn, Formado por 7 BN, posee en situacin central las 3 BN complementarias al codn cuyo aa es transportado en 3-CCA. Brazo Adicional Variable (l variable) Lazo DHU (DiHidroUridina; UH2): Varias BN U son metiladas transdormndose en D (UH2). Las modificaciones covalentes que tienen lugar en determinadas BN est relacionado con el desapareamiento de BN de las regiones que las incluyen. EJEMPLO: Lazo Anticodn: (A: Purina Modificada) -C-U-X-Y-Z-A-AANTICODN

El lazo anticodn, y concretamente las 3 BN del anticodn, interaccionan con el molde de mRNA al que son complementarias, concretamente con el codn.

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La estructura 3D del tRNA es distinta. Las regiones de BN apareadas giran en doble hlice desplazando los lazos. El resultado final es una molcula en forma de L, con el lazo anticodn en un extremo, y 3-CCA en el otro. La cola del tRNA que incluye el extremo 3 terminal no interacciona con otras regiones, y presenta bastante flexibilidad. Rich y Klug descubrieron que algunas BN no apareadas presentan interacciones tipo terciario, forzando la aparicin de la estructura L. Tambin est implicado en estas interacciones el esqueleto de Ribosa-P. 3 La Activacin de Aminocidos: Se da este nombre a la formacin del enlace 3-CCA aa. Esta unin es imprescindible para la biosntesis de protenas, pues los aa son incapaces de reconocer el molde de mRNA. NH3+ CH CO P-A-P-C-P-C tRNA R O La formacin de los enlaces peptdicos es, como vimos anteriormente, desfavorable termodinmicamente. La situacin se revierte cuando el aa es activado por el tRNA. En 1957, Zamecnik y Hoagland descubrieron que el proceso de activacin de los aa es catalizado por enzimas Aminoacil-tRNASintetasas (Sintasas, sin ATP). El proceso tiene lugar en dos etapas: 1. Se produce la unin del aa con el fosfato en de ATP. Se forma aa-AMP. Se consume adems del ATP, la energa de PPi a 2Pi. 2. Se forma la unin aa-tRNA catalizada por las Aminoacil-tRNASintetasas. Se desprende el AMP. Las Aminoacil-tRNA-Sintetasas son altamente especficas a la hora de relacionar cada aa con su tRNA. Existe al menos una para cada aa. Son capaces de corregir errores. 4 La Unin Anticodn mRNA: A pesar del cambio de T por U, mRNA es una rplica exacta de la informacin gentica del DNA, que viaja hasta los Ribosomas donde podr ser traducida a protena. Como hemos visto, esta traduccin es realizada por los tRNA respetando un cdigo gentico universal en todos los organismos, excepto mitocondrias, cloroplastos y algunos protozoos. Gamow descubri en 1955 que los tripletes de BN o Codones corresponden a uno de los 20 aa concreto. Hay 64 posibles tripletes, por lo cual cada triplete corresponde a un aa, pero un aa puede ser codificado por distintos tripletes: el cdigo est Degenerado. EJEMPLOS: Ser: 6 codones sinnimos. Gly: 4 codones sinnimos.

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Lys: 2 codones sinnimos.

Tres de los tripletes, UAA, UGA y UAG, son codones STOP, o seales de terminacin. El codn iniciador AUG es reconocido por un tRNA iniciador (tRNAi) especial que transporta siempre formil-Met. Adems de servir como triplete iniciador, AUG marca la Pauta de Lectura, pues define en toda la secuencia de aa donde comienza cada codn. Cualquier desplazamiento en un nmero no divisible por 3 cambiara todos los codones y, radicalmente, la protena. Las interacciones Codn Anticodn se producen por emparejamiento de las BN segn las normas de Watson y Crick, pues en codn y anticodon las BN se disponen de forma antiparalela. Posicin Flexible o de Balanceo: Se trata de la posicin 3 del codn (5 de anticodon), que recibe este nombre debido a que las BN no siempre coinciden en esta posicin. Por ello algunos tRNA pueden unirse a varios codones, cuando la posicin de balanceo no coincide, mientras las dos primera BN lo hacen. Estos codones son los Codones Sinnimos. EJEMPLO: GCA GCC GCU Posicin Flexible 5 Anticodn I (Inosina) U, G A, C Ala tRNA Anticodn: CGI (I = Inosina)

N Codones sinnimos 3 2 1

Posicin 3 Codn que puenen unirse A, C, U U,G C o A respectivamente

En algunos casos los codones sinnimos no comparten sus 2 primeras BN, por ejemplo AGA y CGU que codifican Arg. En estos casos, los aa son transportados por distintas molculas de tRNA, con distintos anticodones, que reciben el nombre de Isoaceptores. 5 La maquinaria esencial para la sntesis de protenas; Los Ribosomas: Los Ribosomas, adems de una serie de protenas son, junto con tRNA, esenciales para que la Traduccin pueda tener lugar. Entre las protenas encontramos: Factores de Iniciacin (IF). Factores de Elongacin (EF). Factores de Terminacin (RF).

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Los Ribosomas son molculas derivadas de la combinacin de rRNA y Protenas Ribosmicas. En Eucariontes se encuentran al 50%, mientras en Procariontes se forman de 2/3 de rRNA y 1/3 de protenas. Los Ribosomas se forman de dos Subunidades, una grande y una pequea. Las hebras de rRNA presentan numerosas regiones helicoidales por apareamiento de BN. Tambin presentan numerosos repliegues y lazos. Son protenas flexibles y deformables que constituyen el armazn donde se enzamblan las distintas Protenas Ribosmicas. El Ribosoma de Procariontes tiene un coeficiente de sedimentacin de 70S, un dimetro de 200 Amstrongs y una masa de 2700 kDaltons. Sus subunidades son de 30S y 50S: 30S se forma de rRNA 16S y Protenas (21). 50S se forma de rRNA 23S, rRNA 5S y Protenas (34). 6 Funcionalidad de los Ribososmas: El Ribosoma es, en conjunto, un complejo cataltico que desempea numerosas reacciones durante la Biosntesis de Protenas: Aproxima los Reactivos y los orienta correctamente. Alinea el molde de mRNA. Participa en la seleccin del codn iniciador AUG. Controla la fidelidad de la Traduccin. Interviene en la Terminacin y la liberacin del material. Siempre lee el molde de mRNA de 5 a 3, realizando la sntesis proteica de a-t (NH3+) a c-t (COOH). Para descubrir el orden de sntesis de los pptidos se utilizaron reticulocitos de conejo, que sintetizan activamente hemoglobina: 1. Se aaden aa marcados radiactivamente. 2. Detencin: Se eliminan los aa marcados antes del tiempo de sntesis de una cadena completa de Hg. 3. Aislamiento de las protenas. Las cadenas que pudieron terminar su sntesis durante el corto pulso de aa marcados presentaban radiactividad en su extremo c-t. Pudieron demostrarlo tambin utilizando Pptidos Sintticos. Conociendo los aa codificados se pudo identificar cual de ellos presenta su grupo amino (o carboxilo) libre: AAA = Lys AAC = Asn
DESPLAZAMIENTO DEL RIBOSOMA 5

AAA (AAA)n AAC

NH3+-Lys (Lys)n Asn-COOH 7 La Sntesis de Protenas en Procariontes: 80

Un molde puede dar lugar a varia protenas, y tener varios lugares de Iniciacin precedidos por secuencias ricas en Purinas. Dado que el mRNA se Transcribe de 5 a 3, mismo sentido de lectura que el Ribosoma, en procariontes el molde mRNA puede comenzar a ser ledo segn es sintetizado. Hay de hecho un estrecho acoplamiento en el tiempo y en el espacio de la Transcripcin y la Traduccin, que debido a la membrana nuclear no podra tener lugar en Eucariontes, lo cual permite la maduracin del mRNA. Un mismo mRNA puede ser Traducido por varios Ribosomas a la vez. Este conjunto de Ribosomas se llama Polisoma. 7.1La Iniciacin: Participan IF1, IF2 e IF3. tRNA iniciador (tRNAi) es siempre el primer tRNA que se une, que corresponde al codn iniciador AUG, marcando la Pauta de Lectura. Siempre lleva unido formil-metionina (f-Met) (radical formilo en NH3+). No es el mismo que transporta normalmente Met. En algunos casos el codn iniciador puede ser GUG (Val) 1. Disociacin de las dos subunidades del Ribosoma. 2. IF3 se une a 30S evitando la reasociacin con 50S. Facilita la colocacin del molde y colabora en la colocacin del tRNAi. 3. IF2 unido a GTP se une a 30S y reconoce tRNAi, situndolo en el lugar que le corresponde. 4. IF1 se une a 30S colaborando con IF3 e IF2. 5. Se produce la colocacin del molde de mRNA en 30S. Una secuencia rica en Purinas del rRNA 16S se aparea con la hebra molde de mRNA. 6. IF2 reconoce AUG y lo coloca en el lugar del Ribosoma en el que debe interaccionar con el Anticodn de tRNAi. El resultado de este proceso recibe el nombre Complejo de Iniciacin 30S. Se forma de rRNA 30S, molde de mRNA, tRNAi con fMet y Factores de Iniciacin. 7. Se desprende IF3 pudiendo asociarse la subunidad 50S. 8. Se produce la hidrlisis de GTP de IF2, desprendindose entonces IF2 e IF3. El resultado final del proceso es el Complejo de Iniciacin 70S. Se forma de rRNA 30S, rRNA 50S, molde de mRNA, y tRNAi con f-Met. La Pauta de Lectura queda marcada. 7.2 La Elongacin: Participan EF Tu, EF Ts y EF G (o Translocasa). Los lugares A (aminoacil) y P (peptidil) de 50S del Ribosoma juega un papel fundamental en la biosntesis de protenas. En ellas se unen respectivamente, el aminoacil-tRNA nuevo y el peptidil-tRNA. El lugar E (vaco) ha sido descrito recientemente. Presuntamente alberga los tRNA que acaban de ceder su aa al pptido.

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1. EF Tu Selecciona el siguiente aminoacil-tRNA y lo coloca en el lugar A en funcin del codn expuesto. Hidroliza GTP. 2. EF Ts cataliza el intercambio GDP > GTP en EF Tu para dejarlo activado ante la llegada del nuevo codn. En un primer paso EF Tu pierde su GDP. A continuacin EF Tu y EF Ts con GTP forman un dmero. Finalmente EF Tu es liberado activo, con GTP. 3. Peptidil Transferasa cataliza la unin de c-t de f-Met con a-t del nuevo aa. Esta enzima forma parte de 50S, y cataliza el ataque nuclefilo de NH3+ a COO- sin gasto energtico. EJEMPLO: Peptidil-tRNA: NH3+ f-Met CO NH Arg COO ACC - tRNA
a-t 3 5

4. Se produce la Translocacin del molde, que avanza un codn. Interviene EF G o Translocasa, que hidroliza GTP: Peptidil-tRNA libera el pptido y es arrastrado al lugar E. Aminocil-tRNA recibe la unin del pptido con el aa que transportaba, siendo arrastrado al lugar P. El lugar A queda vaco y expone un nuevo codn. Se repite el proceso desde el paso 1. La sntesis de toda la Estructura Primaria de una Protena tiene lugar por la repeticin de este proceso, codn tras codn. 7.3 La Terminacin: Participan RF1, RF2 y RF3. Forman dmeros pudiendo reconocer distintas Seales de Terminacin: Dmero RF1 RF3 RF2 RF3 Seal de Terminacin que reconoce UAA ; UAG UAA ; UGA

Al reconocer una Seal de Terminacin, estos dmeros modifican Peptidil Transferasa, de forma que cambia su actividad y cataliza la liberacin del pptido, hidrolizando GTP. Terminada la sntesis, los componentes son liberados, y las subunidades se disocian de nuevo. IF3 se une directamente a 30S, mantenindola lista para una nueva Traduccin. 7.4 Balance Energtico: Procesos que consumen Energa Celular Activacin de los aa Activacin de los aa Enlaces ricos en energa consumidos durante la Traduccin 1 ATP por aa 1 PPi por aa

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Iniciacin: IF2 Elongacin: EF Tu Elongacin: EF G Terminacin: RF3

1 GTP por protena 1GTP por codn (o aa) 1 GTP por codn (o aa) 1 GTP por protena

8 La Sntesis de Protenas en Eucariontes: En este caso, un molde de mRNA da lugar a una nica protena. Hay una nica seal de iniciacin no precedida por secuencia rica en purinas. Los Ribosomas son de mayor tamao, 80S. Las subunidades son: 40S: rRNA 18S y Protenas. 60S: rRNA 28S, rRNA 5,8S, rRNA 5S y Protenas. Existen numerosos Factores que intervienen en la Traduccin: 9 Factores de Iniciacin (Includo IF3). 3 Factores de Elongacin (EF 1 EF 1 , y EF 2, corresponden respectivamente a EF Tu, EF Ts y EF G). Un nico factor de terminacin (RF). tRNAi no lleva unido f-Met sino Met, pero es igualmente distinto a los otros tRNA que unen Met normalmente. El pptido recin sintetizado incluye Secuencias Seal que determinan su destino final en las clulas y los tejidos. Despus de ser reconocidas, estas secuencias son eliminadas durante la Maduracin. 9 Las Rutas de Transporte de protenas en Eucariontes: Veremos el caso de las protenas lisosmicas, de membrana celular, y de secrecin a la matriz extracelular. Contienen una secuencia de 20 aa en a-t que determina su destino final, y que no aparece en su estructura madura. La seal, una vez sintetizada, es reconocida por las SRP (partculas receptoras de seales). SRP tiene Receptores en la membrana del RE, y arrastra a la protena con el Ribosoma y el molde de mRNA, formndose el REr. Estos receptores se encuentran cercanos a Riboporinas integrales de membrana del REr, por donde las protenas pueden penetrar al orgnulo segn son sintetizadas por el Ribosoma. Una vez finalizada la sntesis, Peptidasa Seal rompe la Secuencia Seal en el interior del RE. La protena pasa al Aparato de Golgi donde es modificada, clasificada, y enviada a su destino final en el tejido a travs de: Grnulo de Secrecin. Pre-Lisosoma. Membrana celular. 10 El Plegamiento de las Protenas en Eucariontes:

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La protena necesita sufrir un Proceso de Maduracin donde los aa son modificados, de manera a poder obtener el correcto plegamiento. Este proceso se inicia durante la Traduccin y se completa al liberarse la cadena. A menudo este plegamiento es retardado por las Protenas Tutoras (Chaperonas (ATPasas lentas) y Chaperoninas), que evitan contactos erroneos y deshacen enlaces inadecuados entre los aa de la propia protena u otros compuestos del medio. Hsp, Protena de Choque Trmico, acompaa a las protenas durante su plegamiento. Hps 70 participa adems en el envo de protenas del citosol a la matriz endocondrial (interior mitocondrial). Tiene receptores en la membrana de la mitocndria, cercanos a canales que permiten el paso controlado de pptidos. Finalmente se produce el plegamiento en la Matriz Endocondrial. 11 Maduracin de las Protenas: Existen varios tipos de maduracin de protenas. Algunos pasos de la maduracin son constantes: Siempre tiene lugar la eliminacin de Met (f-Met en procariontes) poco despus del comienzo de la sntesis. Siempre tiene lugar la eliminacin de Secuencias Seal cuando ha sido completado el proceso de transporte de la Protena a su destino. Las modificaciones que afectan al plegamiento y la conformacin de las protenas se clasifican en dos grandes grupos: 11.1 Modificacin de aminocidos: Unin de substituyentes en los aa: Acetilacin (en a-t o R de Lys) (En histonas). Carboxilacin (en R de Asp o Glu) (Glu en Protrombina). Fosforilacin (en R de Ser, Tyr o Thr) (Regulador de la actividad proteica). Hidroxilacin (en R de Pro o Lys) (En colgeno: Hyp, Hyl). Metilacin (en R de Lys y Glu). Glucosilacin o unin de glcidos formndose un polisacrido, frecuente en protenas de membrana (Glucocalix) y de secrecin (Agrecanes): Unin a travs de O (en R de Ser y Thr). Unin a travs de N, enlaces N-Glicoslicos (en Asp). Modificacin por lpidos: Aumenta la hidrofobicidad de la protena y por lo tanto su anclaje a la membrana lipdica (en a-t, Ser, Thr y Cys): Acilacin: Por cidos grasos. Prenilacin: Por Terpenos. Formacin de puentes disulfuro entre dos Cys.

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Unin de Grupos Prostticos, como por ejemplo, Hemo. Adenilacin. ADP-Ribosilacin. Sulfatacin.

11.2 Procesamiento Proteoltico: Cambios en la actividad de la protena por su conformacin. Puede tener lugar por activacin de proenzimas proteolticas, como el caso de la Tripsina y cimgenos digestivos. Tambin se da el caso de activacin de precursores de hormonas peptdicas por Protelisis Irreversible, como por ejemplo, el caso de la Insulina: Se sintetiza Preproinsulina. Al llegar al RE, es eliminado el primer pptido seal de secrecin por protelisis, quedando Proinsulina. Alcanza el AG donde tiene lugar la segunda protelisis y se obtiene la protena Madura: Insulina. Es secretada al torrente sanguneo.

Parte II: EL METABOLISMO

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I/ Conceptos bsicos:
A/ INTRODUCCIN:
1 Generalidades: Recibe el nombre de Metabolismo el conjunto de todas las reacciones qumicas que se producen en un organismo. El mantenimiento del organismo depende de todas y cada una de ellas. El Catabolismo es el conjunto de reacciones de Degradacin por oxidacin. Produce energa. Suele suceder en mitocondrias. El Anabolismo es el conjunto de reacciones de Biosntesis por reduccin. Gasta energa. Suele suceder en el citoplasma. Las Rutas Anfiblicas son rutas de degradacin que crean precursores para la biosntesis. Cada reaccin metablica est integrada en una compleja red de reacciones, controladas a su vez por distintos sistemas, a distintos niveles. 2 Control del metabolismo: La regulacin del metabolismo tiene lugar por medio de distintos mecanismos: Por regulacin de la actividad de cada enzima: Halosterismo. Polimerizacin/Despolimerizacin. Modificaciones covalentes reversibles. Por regulacin de los niveles de concentracin de enzima, por medio de la sntesis y degradacin de la enzima. Por la separacin de Anabolismo y Catabolismo en distintas rutas. Por los sistemas de endomembranas o compartimentacin celular que permiten la separacin fsica de las rutas en orgnulos. Por la compartimentacin tisular en tejidos y rganos con distintas funciones metablicas. Por la existencia de Isoenzimas: Distintas formas enzimticas con la misma actividad, pero distintas cintica y localizacin celular y tisular. (Por ejemplo, Lactato dh (deshidrogenasa). Por mecanismos de comunicacin celular, que mediante hormonas y neuropptidos permiten el correcto funcionamiento, ntegro y coordinado, de cada tejido y rgano, en un organismo. Por el Estado Energtico Celular, o niveles de ATP (y GTP), necesario para numerosas reacciones. Es responsable de la carga energtica o Potencial de Fosforilacin.

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B/ TERMODINMICA:
1 Bases de la Termodinmica: Las variaciones energticas acompaan a todas las reacciones qumicas, y tambin a las metablicas. Las variables de la termodinmica son las propiedades experimentales observables de un Sistema. Se trata de P, T, V, U (E interna), H (entalpa), S (entropa), G (E libre de Gibbs). Cuando un sistema bioqumico sufre una modificacin, utilizamos estas variables para caracterizar fsicamente la reaccin. Las principales variables implicadas son G y H. Para calcular estas variables slo se tienen en cuenta los estados inicial y final. Cuando el sistema capta del entorno son positivas, mientras que si cede tienen signo negativo. Para los estudios experimentales se han establecido las Condiciones Standard como: P = 1atm, T = 25C, y COSM = 1M. Se emplea el superndice 0 para sealar que se han respetado dichas condiciones (G, H) Para los sistemas biolgicos, se definen como Condiciones Biolgicas Standard las mismas condiciones anteriores con un medio acuoso a pH = 7, es decir, [H+] = 1M. En estos casos el superndice empleado es 0 (G0, H0). 2 Clasificacin Termodinmica de las Reacciones: Las reacciones se clasifican en termodinmica en funcin de si el sistema capta o cede al entorno. En funcin de la entalpa, el sistema cede o capta calor Q del medio: Exotrmicas: Cede Q; H<0. Endotrmicas: Capta Q; H>0. Para valorar la espontaneidad de la reaccin utilizamos la Energa libre de Gibbs. Exergnicas: Espontneas; G<0. Endergnicas: No espontneas; G>0. Cuando G = 0, la reaccin est en equilibrio. G = H T. S En esta reaccin, H representa el contenido calrico del sistema y T.H representa la energa perdida durante la reaccin por movimientos moleculares. G = -R . T . ln Keq Donde, para la reaccin aA + bB Keq = [C]C.[D]D/ [A]A.[B]B cC + dD:

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Las reacciones espontneas liberan cierta energa. Otras reacciones no espontneas suelen acoplarse a estas en el metabolismo, captando su energa liberada y pudiendo producirse. GT = G1 + G2

Por ejemplo, si las dos reacciones tienen un intermediario comn, pueden acoplarse del siguiente modo: A + B C G1 = 0,8 kCal . mol-1 GT = C + D E G2 = -3 kCal . mol-1

A + B + D E -1 -2,2 kCal . mol ; Espontnea.

C/ COMPUESTOS DE ELEVADA ENERGA DE HIDRLISIS:

1Generalidades: Existen sustratos, como los Nucletidos Trifosfato, o el PPi, cuya hidrlisis es utilizada para impulsar muchas reacciones metablicas endergnicas. Reciben el nombre de Compuestos de Elevada Energa de Hidrlisis. Su hidrlisis libera una importante cantidad de energa, y frecuentemente conlleva la liberacin de un grupo fosfato P. A menudo estos P son transferidos a otros sustratos por enzimas. (Por ejemplo; Exoquinasa). Este tipo de Compuestos se clasifica a su vez en 5 tipos: Anhdridos: ATP, GTP, 1,3-BPG. Enolatos: Fosfoenolpiruvato (PEP). Fosfoguanidios: Arg-P, Creatina-P. Bioesteres: Acetil CoA. Compuestos sulfonados: S-Adenosilmetionina. La gran cantidad de energa liberada por estas hidrlisis puede deberse a distintas causas: Disminucin de la repulsin electrosttica entre cargas (en P se debe a las cargas negativas del oxgeno). Disminucin de las posibles formas resonantes. Estabilizacin de los productos por tautomera cetoenlica (por ejemplo, en el caso del paso de PEP a Piruvato). Los productos presentan mayor solvatacin que los sustratos. 2 El ATP y el GTP: Los Nucletidos Trifosfato llevan una importante carga energtica debida a la unin del ltimo fosfato en . Son, ante todo el ATP, las principales fuentes de energa en Biosntesis, Trabajos Mecnicos y Transporte Activo transmembrana. Las reacciones endergnicas se acoplan a la fosfatacin del ATP en ADP + Pi, ejerciendo as como moneda de cambio energtica en el 88

metabolismo. Posteriormente el ADP se fosforila gracias al P de un sustrato. La fosforilacin puede ser: Fotosforilacin Oxidativa: En Respiracin o Fotosntesis. Fosforilacin a Nivel de Sustrato: Directamente en el transcurso de las rutas de degradacin. La Carga Energtica (CE, entre 0 y 1), y el Potencial de Fosforilacin (Pot P) son los principales parmetros calculados del ATP en un tejido: CE = ([ATP] + [ADP]) / ([ATP] + [ADP] + [AMP]) Pot P = [ATP] / ([ATP] + [Pi])

D/ COMPUESTOS REDUCTOR:

DE

ELEVADA

ENERGA

DE

PODER

1 Reacciones de Oxido-Reduccin (Red-Ox): Se trata de un grupo especial de reacciones acopladas que proporcionan gran parte de la energa de los organismos. Se define como Reductor a aquel compuesto capaz de oxidarse cediendo sus electrones al entorno. La oxidacin suele acompaarse por Deshidrogenacin. Se define como Oxidante a aquel compuesto capaz de reducirse captando electrones del entorno. La reduccin suele acompaarse por Hidrogenacin. Dado que durante la oxidacin, el Reductor pasa a ser Oxidante, y viceversa, se puede definir la pareja Red/Ox para una especie qumica dada. Hablamos de una Reaccin Red-Ox cuando se acopla la reduccin y oxidacin respectivas de dos parejas Red/Ox; una sola pareja no cedera o captara electrones si otra pareja no los captase o cediese. Durante una reaccin Red-Ox, una especie qumica se oxida mientras la otra se reduce. 2 La Energa en las Reacciones Red-Ox: La Energa de este tipo de reacciones recibe tambin el nombre de Potencial de Reduccin o Poder Reductor, y se mide en Voltios. Se conoce el Poder Reductor (E, ver tabla) de cada especie en condiciones biolgicas estndar. Los E estn basados en el estndar de Hidrgeno: E0 = 0 V. Calculando E0 a partir de los E0 de ambas parejas Red/Ox podemos determinar si la reaccin transcurre en sentido directo o inverso: E0 = E0Ox + E0Red

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E0 >0: Reaccin espontnea E0 <0: Reaccin inversa espontnea E0 =0: Hay Equilibrio E0 es inversamente proporcional a G0; en concreto: G0 = -n . F . E0 En condiciones no Standard: E = E0 R.T / n.F . ln ([Productos] / [Reactivos]) 3 Poder Reductor en el Metabolismo: El Poder Reductor de un organismo se debe principalmente a las Coenzimas NADH, NADPH y FADH2. Estas Coenzimas adquieren un importante papel en el metabolismo por varios motivos: Por su capacidad de acoplarse y facilitar la reduccin de precursores metablicos en rutas de Biosntesis. A su vez, las formas oxidantes pueden acoplarse a Oxidaciones en rutas de Degradacin. Por ltimo, por su capacidad de ceder electrones a las Cadenas de Transporte Electrnico Mitocondriales de la Respiracin, permitiendo la sntesis de varios ATP, moneda de cambio energtica.

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I/ Metabolismo de Degradacin de la Glucosa:

A/ DEGRADACIN DE LA GLUCOSA A CO2:
1 Primera fase de la Gliclisis: La Glucosa (-D-Glucopiranosa) es degradada por nuestro organismo cada vez que ingerimos comida. Su degradacin es til tanto para producir energa, como precursores para otras rutas de Biosntesis.

- Las Enzimas Hexoquinasa (no especfica) y Glucoquinasa catalizan su transformacin en -D-Glucopiranosa-6-P, gastando un tomo de ATP para fosforilar el sustrato. A continuacin, Fosfoglucoisomerasa cataliza la isomerizacin del sustrato, mediante la apertura del anillo y su posterior reciclacin. La Aldosa se transforma as en Cetosa. La reaccin es reversible. De este modo se forma -D-Fructofuranosa-6-P (Fructosa-6-P). A su vez, esta va a ser Fosforilada de nuevo por medio de la Fosfofructoquinasa, que va a fosforilar el sustrato a expensas de un ATP, formando -D-Fructofuranosa-1,6-di-P (Fructosa-1,6-di-P)

La ruptura aldlica de esta molcula, catalizada por Aldolasa, da lugar a dos molculas distintas; Dihidroxiacetona-P y DGliceraldehdo-3-P. A su vez, Triosafosfato Isomerasa cataliza la isomerizacin de Dihidroxiacetona-P a D-Gliceraldehdo-3-P. Estas reacciones son reversibles.

DHA-P

G-3-P

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2 Segunda fase de la Gliclisis: Una vez que toda la glucosa se ha transformado a G-3-P, gastando la energa de 2 ATP/glucosa (se forman dos G-3-P), comienza la segunda fase de la Gluclisis, el la que hay una produccin neta de energa. Para comenzar tiene lugar la oxidacin del Carbono 1 de G-3-P y su consecutiva fosforilacin de G-3-P en 1,3-di-Fosfoglicerato, por la Gliceraldehdo-3-P-dh. Esta reaccin fuertemente exergnica libera energa qumica, permitiendo la reduccin de un NAD+ en NADH. Se trata de nuevo de una reaccin reversible.

1,3-di-P-G pierde entonces su grupo P, que sirve para fosforilar un ADP a nivel de sustrato, formndose 1 ATP, Gracias a la Fosfoglicerato Quinasa. Fosfoglicerato Mutasa cambia entonces la posicin del P de 3 a 2, formndose 2-Fosfoglicerato.

La enzima Fosfoenolpiruvasa, a continuacin, deshidrata el 2PG transformndolo en Fosfoenolpiruvato (PEP), compuesto de muy elevado contenido energtico.

La accin de Piruvato Kinasa, fuertemente Exergnica, Transforma el PEP en Piruvato, producto final de esta ruta. Tiene entonces lugar una segunda Fosforilacin de ADP a nivel de sustrato, formndose 1 ATP. Sin embargo, PEP tiene ms energa que an contiene el Piruvato. 92

La tendencia espontnea de la energa a disiparse hace que PEP tenga una alta tendencia a disociarse: Se trata de un Enol (alcohol secundario con doble enlace. El equilibrio entre las formas Enol y Ceto est muy desplazada hacia la forma Ceto. Enol Ceto

Cuando PEP est fosforilado, P bloquea el grupo Enol, evitando que se transforme en Ceto. Por ello la accin de piruvato kinasa desencadena el desplazamiento brutal a Ceto, y la consiguiente liberacin de energa. El producto final que deriva de la Gluclisis es una molcula de Piruvato. 3 Regulacin de la Glicolisis: En el proceso de Glicolisis se distinguen tres reacciones irreversibles intracelulares: Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvato quinasa. Las tres son adems marcadamente exergnicas, tanto es as que para la biosntesis de Glucosa desde Piruvato, deben ser rodeadas por rutas alternativas. Fosfofructoquinasa es una enzima alostrica que regula la velocidad general de la glicolisis: ATP es su sustrato (centro activo) y tambin su inhibidor (centro regulador). KM<<<KI, por lo que el centro activo presenta mucha mayor afinidad que el regulador; ATP slo llega a este ltimo cuando se encuentra en alta concentracin. De hecho, las relaciones ATP/ADP y ATP/AMP regulan a esta enzima: ATP (al igual que NADH) la inhibe mientras ADP y AMP la excitan. Por ello se puede decir que el estado energtico de la clula controla muy sensiblemente la gliclisis. Tambin es inhibida alostricamente por Citrato, producto intermedio del ciclo TCA, y por AG (cidos grasos), combustibles celulares energticamente muy cargados. Otras enzimas reguladas son Gliceraldehdo-3-P dh (excitada por NAD+) y Piruvato kinasa (inhibida por ATP). 4 Degradacin anaerbica del Piruvato: Este tipo de degradacin recibe el nombre de Fermentacin: se trata de la reduccin (de Ceto a Alcohol) anaerbica del Piruvato. En funcin del tipo de organismo, los productos de la Fermentacin pueden ser distintos, distinguindose principalmente las Fermentaciones lctica y la alcohlica. Tiene lugar en microorganismos, como las levaduras y bacterias homolcticas; Bacillus y Lactobacillus. Tambin sucede en 93

el msculo esqueltico de vertebrados superiores, tanto ms cuanto mayor es la deficiencia en aporte de oxgeno libre, como los instantes de elevada demanda energtica. FERMENTACIN ALCOHLICA: CO2 NADH NAD+ CH3-CO-COOCH3-CHO Piruvato Acetaldehdo Piruvato descarboxilasa CH3-CH2OH Etanol Alcohol dh

Las Isoenzimas Lactato dh catalizan la fermentacin lctica, y se encuentran en los tejidos de animales superiores. Existen 5 formas isoenzimticas, formadas por dos tipos de subunidades, M y H: M 4, M3H, M2H2, MH3, H4. El coenzima NADH porta los e- necesarios para la reduccin del piruvato. Generalmente este NADH proviene de la reaccin de la enzima Gliceraldehdo-3-P-dh, acoplndose ambas reacciones. La fermentacin se caracteriza de hecho por reoxidar este NADH. En presencia de oxgeno, este NADH cede su e- a la cadena Respiratoria. FERMENTACIN LCTICA: Piruvato M4 Lactato + CH3-CO-COO + NADH + H CH3-CHOH-COO- + NAD+ M3H, M2H2, MH3, H4 Lactato dh M4 es exclusiva del msculo esqueltico. Es la nica forma enzimtica que cataliza la formacin de Lactato a partir de Piruvato (fermentacin). Las otras formas, sin embargo, transforman el Lactato en Piruvato, ya que el primero resulta txico. Catalizan la misma reaccin, pero en sentidos opuestos. Los productos finales de la Gliclisis en el msculo esqueltico es por lo tanto Lactato, salvo en el msculo Cardaco, donde es Piruvato. 5 Descarboxilacin aerobia del Piruvato en Acetil-CoA: En presencia de oxgeno libre, el Piruvato va a penetrar en el interior mitocondrial para transformarse en H2O y CO2, producindose la oxidacin ms importante de la ruta de degradacin de la Glucosa, y en la que ms energa se va a producir: Ciclo de Krebs o de los cidos Tricarboxlicos (TCA). La primera descarboxilacin, previa al TCA, tiene lugar al igual que este en el interior mitocondrial. Es una descarboxilacin oxidativa, pues adems de perder un CO 2, se oxida el grupo Ceto del Piruvato. Esta descarboxilacin oxidativa libera gran cantidad de energa. Para que esta no se disipe en forma de calor, queda contenida en un nuevo enlace (ester tilico) que se forma entre el Acetato y la Coenzima A, formndose Acetil-CoA; una molcula de posicin central en el metabolismo. El balance general de la reaccin es: CH3-CO-COO- + CoA-SH + NAD+ 94

CH3-CO-S-CoA + CO2 + NADH + H+ Para la compleja labor de evitar la disipacin de la energa de esta reaccin, entra en accin un Complejo Multienzimtico: Piruvato dh. PM = 7.000.000 Da. Geometra definida: Dodecahedro. Las enzimas estn unidas en estructuras superiores por enlaces no covalentes, lo que supone un avance evolutivo aumentando la eficacia de las enzimas: Evita que el sustrato difunda, aumentando [S] en las cercanas del complejo. Adems, la regulacin del complejo por modificacin de un solo componente es ms precisa y eficaz. Este complejo se compone de tres tipos enzimticos, que utilizan distintos Coenzimas o Cofactores. Piruvato dh (PDH) + coenzima Pirofosfato de Tiamina (TPP). Dihidrolipoil Transacetilasa (DLT) + coenzima cido Lipoico. Dihidrolipoil dh (DLDH) + coenzima FAD.

PDH-TPP descarboxila el Piruvato (1), en Acetaldehdo (CH3CHOH), quedando unido a l formando Pirofosfato de 2Hidroxietiltiamina. Recibe el nombre de aldehdo activado, al estar unido a PDH-TPP. El aldehdo activado es transferido al coenzima cido Lipoico, que se encuentra a su vez unido a DLT por una amida transacetilasa (Lys). Entonces tiene lugar la oxidacin del aldehdo a cido carboxlico, formndose Acetato, y quedando unido al cido Lipoico (2). Este ltimo queda a su vez reducido a cido Dihidrolipoico, forman

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Posteriormente entra en juego la CoA, y va a tener lugar la Transesterificacin (3). El resto acetato es transferido a CoA, formndose finalmente Acetil-CoA. El cido dihidrolipoico debe ser reoxidado; slo entonces entra en juego la tercera enzima del complejo. Los e - del cido dihidrolipoico pasan al FAD de esta tercera enzima (4) formando FADH2 (reducido), y quedando oxidado de nuevo en cido Lipoico. Por ltimo, la reoxidacin de FADH2 es mediada por un NAD + libre que va a ser reducido a NADH (5). El complejo multienzimtico queda as intacto de nuevo. 6 Regulacin del Complejo Piruvato dh: La regulacin de este complejo multienzimtico se vuelve necesario, por la importancia de sus productos en la Respiracin Celular. Este regulacin tiene lugar por fosforilacin/desfosforilacin, y cada proceso es mediado por una enzima reguladora, respectivamente; Piruvato dh Kinasa y Piruvato dh Fosfatasa. ATP Pdh activo Pi Pdh Fosfatasa H2O Pdh Kinasa ADP Pdh-P inactivo

Acetil-CoA y NADH (productos del complejo) excitan a la enzima Pdh Kinasa (inactivando Pdh), mientras piruvato, NAD + y CoA-SH (sustratos del complejo) lo inhiben. Por otro lado, Ca2+ activa Pdh Fosfatasa, activando por lo tanto al complejo Pdh. Este in es liberado previa contraccin muscular, indicando la inmediata necesidad de gran cantidad de energa metablica. Como vimos anteriormente, esta regulacin se haca ms efectiva, pues slo se regulaba la actividad de una de las enzimas del complejo: Se trata en concreto de la enzima Piruvato dh: Cuando se fosforilan 3 residuos Ser de esta enzima, todo el complejo queda inactivado, y al ser hidrolizados se reactiva. Los Arsenitos orgnicos e inorgnicos son fuertes inhibidores del complejo PDH. Tienen gran afinidad por los grupos SH, por lo que se unen al cido Dihidrolipoico impidiendo su reoxidacin. El envenenamiento por arsnico provoca altas concentraciones de piruvato en sangre. Su abundancia en los residuos Cys-SH de Queratina de la piel y las uas perduran como signo de envenenamiento despus de la muerte. Napolen pudo enfermar debido a la volatilizacin del arsnico el papel de forrar paredes debido a la humedad y los hongos. Darwin pudo morir a causa del Tnico de Hawler, que por su riqueza en arsnicos tena efectos bactericidas, pero causa eccemas, vmitos, artritis y nauseas. Podemos decir que se auto-envenen. El Mercurio tiene un efecto similar sobre el complejo PDH, y tambin se une a Cys. Aunque actualmente est prohibido, se utiliz

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como pesticida. Los fabricantes de sombreros de fieltro utilizaban sales de Mercurio para suavizar el pelo de las pieles de liebre, por la ruptura de los puentes disulfuro. Estas sales podan volatilizarse provocando enfermedades neuronales (de ah el Sombrerero Loco de Alicia). 7 Descarboxilacin de Acetil-CoA en el Ciclo TCA: En este paso final de la degradacin de la Glucosa en condiciones aerobias, se genera la mayor cantidad de energa neta. Si de 1 Glucosa habamos obtenido 2 Piruvato, y por lo tanto 2 acetil-CoA y 2 CO2, a continuacin tenemos el balance de la reaccin para una Acetil-CoA: CH3-CO-S-CoA + 3 NAD+ + GDP + Pi + FAD + H2O CoA-SH + 2 CO2 + 3 NADH + GTP + FADH2

CICLO TCA

Enzimas Implicadas:

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(1) (3) (5) (7)

Citrato Sintasa Isocitrato dh Succinil-CoA Sintetasa Fumarasa

(2) (4) (6) (8)

Aconitasa -Cetoglutarato dh Succinato dh Malato dh

El ciclo TCA est catalizado por enzimas solubles del la matriz mitocondrial. Una de ellas, Succinato dh, es integral de la membrana interna mitocondrial. (1) Condensacin aldlica. Se forma el primer cido Tricarboxlico del ciclo: El Citrato. La fuente de energa del enlace covalente que se forma entre los sustratos, Acetato y Oxalacetato, es el propio enlace de Acetil-CoA, y an sobra energa de esta reaccin fuertemente exergnica. (2) La Aconitasa cataliza en realidad dos reacciones distintas, para cambiar la posicin del grupo Hydroxi de posicin 3. En primer lugar facilita la perdida de una molcula de agua, formndose un doble enlace y Cis-Aconitato. En segundo lugar adiciona una molcula de agua, formandose finalmente el Isocitrato. Se trata de hecho de una enzima estereoespecfica: tanto la eliminacin como la adicin de molculas de agua tiene lugar de forma trans. Este paso es esencial: Citrato es un alcohol terciario, y no se puede oxidar a Ceto. El cambio de posicin del grupo Hydroxi a alcohol secundario en Isocitrato, permite su posterior oxidacin a ceto. Fluoracetato (F-CH2-COO-) es de hecho un veneno utilizado como pesticida contra coyotes en USA. Inhibe la accin de la Aconitasa. Este compuesto se une con CoA-SH formndose Fluoracetil-CoA (F-CH2-CO-S-CoA). Este es reconocido por la enzima, formndo Fluorcitrato, que bloquea el ciclo (fortsimo inhibidor irreversible). Al alimentarse de los cadveres, los consumidores de los ecosistemas tambin resultaron afectados. (3) Descarboxilacin oxidativa. Tiene lugar en dos pasos. En el primero se oxida el alcohol secundario a Ceto, formndose 1 NADH. Posteriormente tiene lugar la descarboxilacin, liberndose 1 CO2 y formndose -Cetoglutarato. (4) Descarboxilacin oxidativa. En primer lugar se produce la prdida del CO2 de -carboxilo. A continuacin se produce la oxidacin fuertemente exergnica de grupo Ceto a Carboxilo formndose NADH. Toda la energa queda contenida en el enlace del producto con CoA-SH, formando Succinil-CoA. La enzima -Cetoglutarato dh es un complejo multienzimtico anlogo a Piruvato dh. Se forma de tres tipos de enzima: -Cetoglutarato dh + coenzima TPP. Dihidrolipoil-trans-succinasa + coenzima cido Lipoico. Dihidrolipoil dh + coenzima FAD. (5) Succinil-CoA Sintetasa (o Kinasa) cataliza la formacin de GTP por fosforilacin a nivel de sustrato. La alta energa del P en posicin proviene de la hidrlisis (ruptura de la unin Ester tilico)

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de CoA-SH y la consiguiente formacin de Succinato. Por lo tanto proviene indirectamente de la reaccin (4). (6) Succinato dh es la nica enzima fuertemente unida a la membrana interna mitocondrial. Transforma el enlace sencillo entre los carbonos 3 y 4 en doble enlace. Se forma FADH 2, con los dos H despendidos del Succinato. Se forma Fumarato. Las enzimas deshidrogenasa (dh) suelen reducir coenzimas para oxidar el sustrato. En funcin de la energa desprendida en la reaccin, pueden reducir NAD+ en reacciones altamente energticas (de alcohol o aldehdo a ceto, de aldehdo a cido) o FAD + en reacciones no suficientemente exergnicas para formar NADH (de enlace sencillo a doble enlace). (7) La enzima Fumarasa cataliza la hidratacin del Fumarato en los carbonos 2 y 3, y la consecuente formacin de Malato. (8) Malato dh oxida el Malato en Oxalacetato (OA -), formando un NADH. As queda cerrado finalemente el ciclo. Ahora una nueva molcula de Acetil-CoA llega a la mitocondria, y se une con el OA - en la reaccin (1). Como balance, podemos apreciar que en una vuelta de ciclo se oxidan los dos carbonos correspondientes a Acetil-CoA, en dos descarboxilaciones sucesivas, catalizadas por Isocitrato dh y Cetoglutarato dh. Cabe destacar que los carbonos que son incorporados al ciclo TCA no son descarboxilados hasta la segunda vuelta de ciclo; en la primera pasan a formar una parte constitutiva del OA -, durante la cual son descarboxilados los C del acetato incorporado anteriormente. Tambin podemos apreciar que la combustin completa de una molcula de glucosa es mucho ms reentable energticamente en condiciones aerobias (1 glucosa = 38 ATP). 8 Regulacin del ciclo TCA: Este ciclo, vital para la absoluta totalidad de clulas aerobias, est controlado por una fuerte regulacin, que se divide en dos tipos fundamentales: General y Particular. La Regulacin General o Global afecta a la totalidad del ciclo, y se relaciona con su alta sensibilidad a la proporcin NADH/NAD +, dado que NAD+ es un sustrato del ciclo en tres pasos distintos. Cuando la concentracin de NADH es alta, la clula dispone de energa suficiente y el ciclo se ralentiza. La Regulacin Particular se limita a tres pasos concretos, catalizados de hecho por las enzimas Citrato Sintasa, Isocitrato dh, y -Cetoglutarato dh. Estas enzimas estn sometidas a regulacin independiente. Citrato Sintasa es inhibida por NADH y Succinil-CoA. La K M de la enzima por OA-, su propio sustrato, es del orden de la concentracin fisiolgica del mismo. Por lo tanto cuando OA- desciende por debajo

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de su nivel fisiolgico normal Citrato Sintasa deja de funcionar y todo el ciclo es bloqueado. Isocitrato dh es una enzima alostrica, inhibida por NADH y excitada por el ADP. Por ltimo, -Cetoglutarato dh es inhibida por NADH y por Succinil-CoA en alta concentracin.

B/ PARTICULARIDADES TRICARBOXLICOS:

DEL

CICLO

DE

LOS

CIDOS

1 Estereoisometra de la Aconitasa: Como vimos al final del ciclo TCA, los dos C de acetato no son descarboxilados hasta la segunda vuelta de ciclo. Se descubri al marcar el Acetato de Acetil-CoA con 14C, y observar que durnate la primera vuelta de ciclo no se obtuvo ningn CO2 marcado en su C, pero s desde la segunda vuelta del ciclo. El Citrato (sustrato de Aconitasa) es una molcula simtrica, pero sin propiedades pticas. Para su deshidratacin, en el ciclo TCA, se comporta como molcula asimtrica. Recibe el nombre de molcula Pro-quiral. La Aconitasa reconoce y solamente une determinados carbonos, selectivamente, en sus tres centros de anclaje. De esta manera, el H2O perdido se encuentra siempre entre el OH y H del C opuesto al que corresponde a la Acetil-CoA que acaba de reaccionar para formar el Citrato, y por lo tanto, al final del ciclo, los C de dicha Acetil-CoA se encuentran formando Oxalacetato. 2 Carcter anfiblico del ciclo TCA: Se trata e un doble carcter metablico: Catablico (produccin de energa) y Biosinttico (formacin de precursores para otras rutas). Las rutas biosintticas acopladas al ciclo TCA (TCA inverso) tiene mltiples finalidades; precursores: OA-: Aspartato. -Cetoglutarato: Glutamato. Malato: Glucosa. Succinil-CoA: Grupo prosttico Hemo. Citrato: Lpidos citoplasmticos (colesterol). La biosntesis tiene lugar mayoritariamente en el citoplasma. De esta forma aparece una barrera fsica que separa los ciclos TCA y TCA inverso, facilitando y organizando biosntesis/catabolismo. La Acetil-CoA que llega al citosol suele proceder de las Acetil-CoA mitocondrias. Sin embargo, la membrana OA interna Acetil-CoA mitocondrial es impermeable a este compuesto, que debe ser transportado por un M mecanismo indirecto. Interviene la enzima Citrato Liasa. E OA M Citrato B Liasa R A TCA Citrato Citrato N A 100 INTERIOR MITOCONDRIAL CITOSOL

Citrato Liasa escinde el Citrato produciendo los mismos componentes que se han utilisado en el interior mitocondrial para formarlo. Para ello hidroliza una molcula de ATP. De hecho AcetilCoA sirve en el Citosol para la biosntesis de cidos grasos y esteroles, de alta energa (reservas), cuya sntesis precisa la alta energa del enlace Ester Tilico de CoA. De este modo se drenan intermediarios del ciclo TCA al exterior mitocondrial, para formar precursores de biosntesis. No hay que olvidar que la mitocondria no puede carecer de intermediarios del ciclo TCA, pues dicho ciclo es exclusivo para crear energa para la clula. Por ello existen tambin las reacciones Anaplerticas. 3 Reacciones Anaplerticas; Carboxilacin del Piruvato: Se trata de todo el conjunto de reacciones previstas para reponer intermediarios en el ciclo TCA, en caso de carencia. Describiremos a continuacin las dos principales reacciones anaplerticas: Carboxilacin del Piruvato para la reposicin del OA -; Ciclo del Glioxilato. La Carboxilacin del Piruvato est catalizada por la enzima Piruvato Carboxilasa + coenzima Biotina. Necesita hidrolizar un ATP. Tiene lugar en el interior mitocondrial. CH3-CO-COO- + CO2
-

OOC-CH2-CO-COO-

La Biotina es un coenzima caracterstico de enzimas carboxilasas. Se une a una Lys de la enzima por un enlace covalente en el grupo cido de su cadena lateral.

101

En concreto, Piruvato Carboxilasa es un Homotetrmero, con un coenzima Biotina en cada monmero (4 en total). Presenta regulacin alostrica, siendo fuertemente excitada por Acetil-CoA. De hecho presenta un requerimiento absoluto de Acetil-CoA intramitocondrial, y solo es activada cuando los niveles de este son superiores a los fisiolgicos normales. La carboxilacin en el seno de la enzima es mediada por la Biotina: coenzima capaz de transportar el CO2 hasta el Piruvato (en forma Carboxibiotina), y la energa necesaria para el nuevo enlace, que proviene de la propia unin Botina-CO2. CO2 + ATP + E-Biotina E-Biotina-COO- + CH3-CO-COOE-Biotina-COO- + ADP + Pi
-

OOC-CH2-CO-COO- + E-Biotina

4 Reacciones Anaplerticas; Ciclo del Glioxilato: Estas reacciones son exclusivas de los Glioxisomas; corpsculos subcelulares, presentes exclusivamente en Microorganismos y Vegetales. Se trata de un ciclo que presenta reacciones acopladas a las del ciclo TCA, pero carece de la descarboxilacin propia de dicho ciclo. Este ciclo puede ser considerado Anaplertico, pues se forma Succinato, intermediario del ciclo TCA, que tambin es precursor de la glucosa. Sin embargo, su principal funcin es la sntesis de Glucosa a partir de metabolitos de dos carbonos. Durante el ciclo se incorporan dos Acetil-CoA, generando Glucosa. Las Acetil-CoA suelen provenir de la degradacin de los cidos grasos (AG). En primer lugar, Isocitrato abandona la Mitocondria, y penetra en el Glioxisoma. Ah tiene lugar la reaccin (1), catalizada por Isocitrato Liasa. Esta enzima escinde el Isocitrato en una molcula de Succinato y una de Glioxilato. El succinato puede abandonar el Glioxisoma para ser transformado en Malato en la mitocondria por el ciclo TCA. El Malato abandona la mitocondria para servir de precursor a la Glucosa en el Citoplasma. La Glucosa, a su vez, sirve de precursor para casi todos los componentes celulares. La enzima Malato Sintasa cataliza la formacin de Malato a partir de Glioxilato, incorporando Acetil-CoA, en el interior del Glioxisoma. El resto de reacciones (de Malato a Isocitrato) son catalizadas por enzimas comunes al ciclo TCA (Malato dh, Citrato Sintasa y Aconitasa) en el Glioxisoma. 102

Este ciclo es muy til para microorganismos cuya nica fuente de carbono son metabolitos de 2C. En vegetales son imprescindibles para la transformacin de las reservas energticas de triglicridos que se degradan durante la germinacin. Los Triglicridos se descomponen en 3 AG y una molcula de Glicerol. Los AG pueden transformarse en Acetil-CoA por -oxidacin, de forma que su energa se puede incorporar al ciclo del Glioxilato. A menudo este ciclo es considerado como un by-pass del ciclo TCA. Fosfoenolpiruvato (PEP), intermediario de la sntesis de Glucosa, inhibe de hecho a la enzima Isocitrato Liasa. Los Animales somos incapaces de sintetizar Glucosa a partir de metabolitos de menos de 3C. Adems, podemos transformar Hidratos de Carbono en Grasas, pero nunca Grasas en Hidratos de Carbono.

C/LA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRNICO DE LA RESPIRACIN Y LA FOSFORILACIN OXIDATIVA:

1 Generalidades: Estas cadenas transportan los electrones desde los coenzimas (NADH, FADH2) que han sido reducidos por enzimas deshidrogenasas, hasta el oxgeno molecular O2 (o H2O2) que pasa a formar agua. Se trata de un proceso muy complejo bioqumicamente, y en el que intervienen multitud de protenas asociadas a la membrana y cofactores asociados. Su finalidad es crear ATP, energa celular. Esta sntesis de ATP recibe el nombre de Fosforilacin Oxidativa. En procariontes, esta cadena de transporte electrnico tiene lugar en la membrana plasmtica. En eucariontes esta cadena se encuentra asociada a la membrana interna mitocondrial. Al ser permeable esta membrana, sucede en concreto tanto en la matriz como en el espacio intermembranoso mitocondriales.

Ox H+ Ox H
+

e-

Coenzima Oxidada

2 e2eRespiracin Celular 2H+ 2e

-

e-

ATP H2O

CATABOLISMO

Coenzima Reducida

O2

103

Durante las oxidaciones inorgnicas, los sustratos reaccionan directamente con el oxgeno. Sin embargo, durante la oxidacin orgnica o metabolica de la Respiracin, primero se produce la deshidrogenacin del Sustrato en el catabolismo, y posteriormente los electrones son transportados por la cadena respiratoria hasta el oxgeno. Los tomos de la molcula que se oxida no se incorporan directamente a la molcula que se oxida. Adems de crear energa, la cadena respiratoria facilita la reoxidacin de los coenzimas necesarios para el Catabolismo. 2 Mecanismo de la cadena respiratoria: NADH cede sus electrones a nivel del Complejo I, NADH dh. Este complejo multienzimtico es muy complejo. Los electrones son cedidos entonces a Ubiquinol (CoQ) (Q / QH2). Se genera as un primer ATP. FADH2 cede sin embargo sus electrones al Complejo II, FADH2 dh, y este a su vez se los cede a CoQ, sin sntesis de ATP. Por ello, a la oxidacin de un NADH se acopla la sntesis de 3 ATP, mientras que a la oxidacin de un FADH 2 se acopla la sntesis de 2 ATP (nuevos estudios apuntan a 2,5 ATP y 1,5 ATP respectivamente). NADH ATP CADENA DE TRANSPORTE ELECTRNICO COMPLEJO I UBIQUINOL COMPLEJO III CITOCROMO C ATP 104 FADH2 ATP

COMPLEJO IV

En ambos casos, los dos electrones terminan reduciendo una molcula de Ubiquinol. CoQH2 va a ceder los electrones al siguiente complejo multienzimtico, formandose una molcula de ATP; se trata del Complejo III, Ubiquinol dh. Este complejo termina reduciendo una molcula de Citocromo C. Esta va a ceder los dos electrones al ltimo complejo multienzimtico, formndose de nuevo un ATP; se trata del Complejo IV, Citocromo C dh. 3 Los Citocromos: En el proceso intervienen tres Apoprotenas; los Citocromos: Cit a (Complejo IV), Cit b (Complejo III y II) y Cit C (Complejo III y libre). Tienen la capacidad de absorber luz, y se distinguen por la longitud de onda a la que presentan la mayor adsorcin. Cit b presenta un grupo Hemo igual al de Hemoglobina (Fe unido a Protoporfirina IX, grupo unido por enlaces no covalentes de Vinilo). Cit c presenta un grupo prosttico de Protoporfirina IX Fe modificado. Est unido por enlaces covalentes Tioeter con Cys de la protena.

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Cit a presenta una Protoporfirina IX Fe modificada con dos substituyentes: Un grupo formilo y uno propileno. Existen, a su vez, subclasificaciones dentro de un grupo de Citocromos, por ejemplo, Cit a1, Cit a2 Estos se diferencian por la protena a la que se unen y no de su grupo prosttico. Es muy importante destacar que en este caso los grupos Hemo no unen O2 reversiblemente, quedando el Fe Oxigenado y no Oxidado, como ocurre en la Hemoglobina. Los Citocromos son transportadores de electrones, y por lo tanto su tomo Fe debe experimentar oxidaciones y reducciones reversibles. No depende del grupo Hemo sino del tipo de protena a la que se une. Caractersticas, Grupo Hemo: Hemoglobina Citocromo Fe II eFe II e
-

Fe-O2 Fe III

De hecho, la funcin biolgica de los Citocromos es la de reducirse captando reversiblemente electrones, para transportarlos y luego oxidarse al cederlos. El Cit c es el ms estudiado. Presenta su grupo Hemo encerrado en una cavidad de la protena. Los enlaces de combinacin 5 y 6 del Fe estn bloqueados por Hys (= Hb) y Met de la protena, respectivamente. 4 El transporte de electrones en la Cadena Respiratoria: El Complejo I, NADH dh: Este complejo multienzimtico, tambin llamado NADH CoQ reductasa, est constituido por un total de 24 protenas distintas. Presenta entre 16 y 18 tomos de S, y entre 4 y 6 enrejados S-Fe, unidos por enlaces covalentes Tioeter a sus protenas. Cada enrejado es capaz de transportar un electrn. Contiene tambin una molcula de Mononucletido de Flavina (FMN).

Ejemplo; Enrejado Fe4S4

Este complejo capta los electrones de NADH y los cede a la Coenzima ubiquinol (CoQ).

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Espacio intramembranoso mitocondrial 2 H+ Complejo I NADH + H+ NAD+ FMN Fe4S4 CoQ ATP e-

La CoQ se encuentra libre en el interior de la membrana interna mitocondrial. Se trata de una Quinona con n cadenas de Isopreno (hidrofbicas). Por ejemplo, en mamferos, Q 10 tiene 10 unidades de Isopreno. El Complejo III; Ubiquinol dh: Tambin llamado CoQ Cit c Reductasa, este complejo multienzimtico se compone de 8 cadenas polipeptdicas distintas, que unidas en Octmeros forman Homodmeros. Contiene Cit b, Cit c1 y enrejados Fe-S. 2 H+ Espacio intermembranoso mitocondrial Cit c Complejo III CoQ ATP FADH2 El Complejo IV; Citocromo c dh: Tambin llamado Citocromo c Oxidasa, est constituido por 7 cadenas polipeptdicas distintas, que de nuevo forman un homodmero de dos heptmeros. Contiene Cit a, Cit a3 y una apoprotena con Cobre (Cu II), que juega el papel del Fe. Este complejo no es tan estudiado y el orden de transferencia de e es supuesto. Cit b FeS Cit c1

Cit c

2 H+ Cit c

Espacio intermembranoso mitocondrial

Complejo IV Cit a Cu II Cit a3 O2 + 2 H+ H2O ATP

Al igual que los electrones, los H+ procedentes del sustrato terminan siendo captados por el O2, para formar agua, aunque el oxgeno no reacciona directamente con el sustrato que se oxida.

107

5 La Fosforilacin Oxidativa: La cadena de transporte electrnico libera la energa suficiente energa como para acoplarse a la sntesis de ATP: Esta sntesis es conocida como Fosforilacin Oxidativa. La energa proviene en concreto del estado de alta energa que se forma a nivel de la membrana mitocondrial. Esta energa es empleada para la fosforilacin oxidativa. En un principio se pensaba que el estado de alta energa estaba relacionado con cambios conformacionales en las protenas. Mitchell desarroll la Hiptesis quimiosmtica, y gan por ello un premio Nobel. Hiptesis Quimiosmtica: El estado de alta energa radica en un gradiente de protones H+ que se crea a ambos lados de la membrana mitocondrial. La cadena de transporte electrnico fuerza la salida de H+ en contra del gradiente de concentracin, de forma que [H +] es mayor en el espacio intermemebranoso mitocondrial que en la matriz mitocondrial y en el citosol. Este transporte en contra de gradiente precisa un aporte de energa; se trata de hecho de la energa liberada en la cadena de transporte electrnico: Transporte de H+ en Cadena Respiratoria: Sustrato-H2 + NAD
+

Sustrato dh Sustrato + NADH + H NADH + H+ + FMN NAD+ + FMNH2 FMNH2 + Fe (III)S Complejo I FMN+ 2 H + Fe(II)S Fe(II)S + 2 H+ + Q
+ +

Fe(III)S + QH2 QH2 + Cit c (ox) Complejo II Q + Cit c (red) + 2 H+ Cit c (red) + 2 H+ + O2 Complejo III Cit c (ox) + H2O Dado que la membrana es impermeable a los protones, estos iones deben ser transportados activamente. La distribucin vectorial (asimtrica) de los distintos complejos constituyentes de la cadena respiratoria a lo largo de la membrana mitocondrial interna, les hace capaces de captar los protones siempre del lado de la matriz, y cederlos en el espacio intermembrana. 108

Debido al fuerte gradiente de concentracin, los protones van a tender a entrar espontneamente en la matriz mitocondrial. Las protenas capaces de permitir su entrada son bombas transportadoras tipo F, que acoplan este transporte cargado de energticamente por la respiracin a la sntesis de ATP. Por ello esta protena transportadora recibe el nombre de ATP-Sintetasa.

ATP-Sintetasa es un heterodmero formado por las subunidades F0 y F1. Ambas se encuentran unidas por un tallo. Se trata del Motor Molecular de las clulas, pues transforma la energa inica en qumica. F0 se encuentra en la membrana mitocondrial interna. Se forma de 4-5 cadenas distintas, altamente hidrofbicas, que atraviesan la membrana y facilitan el paso de protones. Reciben el nombre de Proteolpidos. F1 es un dominio globular de la matriz mitocondrial. Se forma de cinco tipos cadenas distintas ( , , , y ), e incluye el centro activo de actividad ATP-sintetasa, donde se transluce la energa liberada por el transporte de protones. Frmula molecular: 33. Paul Boyer propuso que, al pasar el gradiente de protones a travs de F0, induce un giro en el tallo (similar al de un motor de 3 cilindros), facilitando un cambio conformacional en la regin globular F1 que permite la sntesis de ATP. Recibi tambin un premio Nobel. Sin la presencia de F1, F0 presenta potente actividad ATPasa, por lo que fue considerada como tal durante mucho tiempo.

D/ VAS DE REOXIDACIN DEL NADH CITOPLASMTICO:

1 Generalidades: 109

El NADH es fundamental en el citoplasma celular, pues se acopla a la oxidacin del Gliceraldehdo-difosfato en la gliclisis. Su reoxidacin es por lo tanto fundamental para el metabolismo de la glucosa. Esta reaccin suele suceder por Respiracin celular, Fermentacin Lctica y Fermentcin Alcohlica. Dado que la membrana es impermeable al NADH, su poder reductor (sus electrones) debe ser bombeado o transportado hasta la matriz mitocondrial. Llega hasta all por medio de un Mecanismo Indirecto Lanzadera. Se distinguen dos tipos: Lanzadera de Malato Aspartato y Lanzadera de Glicerol 3-fosfato.

2 Lanzadera de Glicerol fosfato: DHAP, intermediario de la Glucolisis, puede ser reducido a Glicerol Fosfato en el citoplasma, por la enzima Glicerol dh, oxidando un NADH para recuperar un NAD+. Glicerol Fosfato es una molcula capaz de difundir a travs de la membrana y penetrar en el interior mitocondrial con los electrones de NADH. En el interior mitocondrial, la reduccin de un FAD a FADH 2 se acopla a la reoxidacin de Glicerol fosfato en DHAP. Esta ltima molcula tambin puede difundir a travs de la membrana, para salir de nuevo al citosol, donde podr oxidar otro NADH. No existe consumo neto de DHAP. El FADH2 de la matriz mitocondrial cede a su vez los electrones a CoQ de la cadena de transporte electrnico, acopldose la sntesis de 2 ATP por cada molcula de NADH oxidada en el citoplasma. Esta va est presente en musculatura blanca y msculos de insectos. 3 Lanzadera de Malato:

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Malato dh cataliza la sntesis de Malato por reduccin de OA -, oxidando un NADH. Malato puede atravesar la membrana, y en la matriz mitocondrial va a reoxidar a OA -, reduciendo un NAD+ a NADH, que ceder los electrones a la cadena de transporte electrnico. Dado que OA- no puede atravesar la membrana, deber regresar al citosol combinndose con Glutamato para originar Asp y a-Cetoglutarato, que s la pueden atravesar. Esta reaccin, y su reaccin inversa que ocurre en el citosol, son mediadas por la enzima Transaminasa (aminotransferasa). No hay consumo neto de OA-.

E/ BALANCE DE LA DEGRADACIN DE LA GLUCOSA:

A nivel evolutivo, el paso de vida anaerobia a vida aerobia es un gran paso en cuanto a la energa que se puede obtener de la glucosa. En condiciones aerobias el balance energtico es de 38 ATP/glucosa, mientras en condiciones anaerobias, es de 2 ATP/glucosa (propios de la gliclisis). Infarto de Miocardio y Embolia daan irreversiblemente el corazn y el sistema nervioso respectivamente. Esto se debe al alto consumo de ATP necesario para el mantenimiento de bomba transportadora ATPasa de Na+/K+, responsable del equilibrio quimiosmtico de la clula y el mantenimiento del volumen celular. La interrupcin del paso de la sangre en una arteria impide el paso de O2 suficiente, por lo que se ralentiza considerablemente la produccin de ATP. Cuando el ATP de una clula es insuficiente para mantener su equilibrio quimiosmotico, esta se hincha, su membrana se permeabiliza y los componentes celulares pueden salir al exterior. La alta concentracin de Lactato dh en el exterior celular suele ser responsable directo de la muerte por infarto. Por otro lado, en ausencia de O2 suficiente, se produce mucho cido lctico por la va glucoltica anaerobia. Este producto es txico para el organismo: Cuando se acumula, hace descender el pH celular, y como consecuencia se inicia la actividad de protenas lisosomales que degradan macromolculas y daan irreversiblemente las estructuras celulares, causando su muerte.

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La glucosa es un componente fundamental de la dieta, pero existen sin embargo otros monosacridos y disacridos que pueden resultar nutritivos. Entre ellos encontramos los disacridos Sacarosa (Glucosa + Fructosa), y Lactosa (Glucosa + Galactosa). Estos son fosforilados por accin de kinasas, y son introducidos como intermediarios en la Glucolisis. Una patologa destacable es la ausencia de Lactasa. Recibe el nombre de Intolerancia a la Lactosa. Solamente la raza caucasiana resiste la Lactosa. En ausencia de esta enzima, la lactosa no puede ser digerida y resulta indigesta. Su acumulacin en el tracto digestivo facilita la proliferacin en exceso de determinadas bacterias que forman parte de la flora normal, y que generan gases irritantes. Existe la leche sin lactosa. Otra patologa destacable, la Galactosemia, se debe a la ausencia de Uridil transferasa. Ambas patologas son, lgicamente, genticas y hereditarias.

II/ Metabolismo de Biosntesis de Glucosa:

A/ LA GLUCONEOGNESIS:
1 Generalidades: Se trata de la biosntesis de glucosa a partir de precursores de menos tomos de carbono. Por ejemplo, los seres Auttrofos son capaces de formar glucosa a partir de carbono mineral (CO 2). Los Quimitrofos necesitan para ello metabolitos orgnicos de al menos dos carbonos. En seres quimitrofos, el ciclo del Glioxilato es una ruta importante de sntesis de Glucosa (visto en II/B/4). En animales superiores, el ciclo del Glioxilato permite la sntesis de glucosa a partir de metabolitos de al menos tres carbonos. Es fundamental, pues existen varios tejidos, como el Nervioso o el Sanguneo, que slo pueden aceptar como nutriente la glucosa. Tanto es as que, por ejemplo, en ayuno, el 80% de la glucosa de nuestro cuerpo es consumida por el cerebro. En las reservas celulares de glucosa, en forma de Glucgeno, disponemos de energa para un da. Despus del ayuno, tiene lugar la Gluconeognesis especialmente en el Hgado pero tambin en el Rion. Entre todos los posibles precursores, podemos destacar por su especial importancia: Lactato (formado en msculo esqueletico por la Gliclisis anaerbia). Alanina ( este aa abunda en el Msculo, debido al ciclo PiruvatoAla). Otros aminocidos (aa glucognicos). Glicerol (procede del metabolismo de degradacin de Triglicridos).

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De tal manera que, en ausencia de glucosa durante un ayuno corto, nuestras clulas activan mecanismos de degradacin de protenas musculares en aminocidos y degradacin de las reservas de grasas (TG) para gormar Glicerol, para crear precursores de la Gluconeognesis. En caso de un ayuno prolongado, el cerebro puede llegar a adaptarse a utilizar como combustible cuerpos cetnicos que derivan de la degradacin de las grasas. Las reservas de grasas de nuestro cuerpo pueden servir para un mes de ayuno. A partir de ese momento pueden comenzar a degradarse protenas de rganos tan importantes como el Corazn. 2 Gluconeognesis a partir del Lactato: La contraccin muscular precisa de un gran aporte energtico, y produce para ello una importante cantidad de Lactato a partir de la Glucosa. Por ello es frecuente la Gluconeognesis a partir de Lactato. Este proceso tiene lugar en el Hgado, principal rgano Gluconeognico. El Lactato del Msculo es cedido a la sangre, y va a ser as captado por el Hgado. Este forma de nuevo Glucosa y la cede a la circulacin sangunea, de forma que pueda ser captada por cualquier tejido que la requiera. Todo este ciclo recibe el nombre de Ciclo de Cori, pues fue descubierto por el Matrimonio Cori. Por lo general, La Gluconeognesis utiliza las mismas reacciones que utiliza la Gluclisis, pero en sentido contrario. Sin embargo, como ya hemos visto, existen tres reacciones irreversibles en la Gluclisis, que debern ser rodeadas por otras enzimas en el sentido de la Gluconeognesis. Se trata de las reacciones catalizadas por: Hexoquinasa. Fosfofructoquinasa. Piruvato kinasa. REACCIONES GLICOLITICAS IRREVERSIBLES ATP Hexoquinasa ADP + Pi REACCIONES REVERSIBLES COMUNES Glucosa Glucosa-6-P ATP Fosfofructoquinasa ADP + Pi Fructosa-6-P Pi Fructosa-1,6-dP fosfatasa REACCIONES GLUCONEOGNICAS QUE RODEAN A LAS GLICOLTICAS IRREVERSIBLES Pi Glucosa-6-P fosfatasa H2O

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Fructosa-1,6-dP Triosa-P ADP + Pi Piruvato kinasa ATP Piruvato Lactato PEP OA-

H2O

GDP + Pi PEP carboxiquinasa GTP ADP + Pi Piruvato Carboxilasa ATP

La sntesis de Glucosa comienza con la transformacin de Lactato en Piruvato, por accin Lactato dh. A continuacin tienen lugar dos reacciones tpicamente Gluconeognicas, catalizadas por Piruvato carboxilasa y PEP carboxiquinasa. La primera ocurre en la Matriz mitocondrial, mientras la segunda lo hace en el Citosol. La reaccin de Piruvato carboxilasa + coenzima Biotina es la reaccin anaplertica ms importante del ciclo TCA (vista en II/B/3). Hidroliza un ATP. La reaccin que transforma OA- en PEP, catalizada por PEP carboxiquinasa, hidroliza tambin un P de alta energa de GTP. En conjunto, la transformacin de Piruvato en PEP requiere un alto gasto energtico. CH3-CO-COO- + CO2 + ATP
-

OOC-CH2-CO-COO- + ADP + Pi
-

OOC-CH2-CO-COO- + GTP

OOC-C-OPO32- + GDP + CO2 CH2

El fosfato de mayor energa del metabolismo es el de PEP. Se trata de un compuesto de alta energa qumica, superior a la del ATP o el GTP. Durante la primera reaccin, la energa que corresponde a la hidrlisis del ATP queda contenida en la formacin del nuevo enlace con el CO2. En la segunda reaccin, la hidrlisis del mismo enlace combinada con la hidrlisis de un GTP, proporcionan la energa suficiente para la formacin del PEP.

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Las reacciones entre PEP y Fructosa-1,6-dP son todas ellas reversibles. Utilizan ATP y NADH tanto como son producidos en sentido Glicoltico. Como es sabido, las rupturas de enlaces energticos del catabolismo crean energa, tanto como su formacin en la biosntesis la gasta. La reaccin tpicamente gluconeognica catalizada por Fructosa-1,6-dP fosfatasa hidroliza el ester fosfrico del C 1 de la Fructosa. Su producto, Fructosa-6-P, se isomeriza reversiblemente a Glucosa-6-P. Glucosa-6-P fosfatasa hidrolza el ltimo ester fosfrico, formando finalmente Glucosa libre, que puede salir a la circulacin sangunea. Esta enzima es tambin tpicamente gluconeognica, y por lo tanto los tejidos que no realizan gluconeognesis carecen totalmente de ella. 3 Patologas de inhibicin de la Gluconeognesis: Patologa gentica y hereditaria de carencia o malformacin de alguna enzima tpicamente Gluconeognica. La ingestin de alcohol inhibe la Gluconeognesis a partir de Lactato. Por ello los bebedores tienen altos niveles de cido Lctico, y adems no queman grasa, de manera que tienden a engordar. Todo ello se debe a la Acidosis Lctica La Acidosis lctica es un proceso que facilita la reduccin del + NAD a partir de la oxidacin del Etanol ingerido a Acetato. Este proceso facilitado por Alcohol dh elimina NAD+ que podran ser utilizados por Lactato dh para formar Piruvato a partir del Lactato, inhibiendo este paso de la Gluconeognesis.

B/ EL GLUCGENO Y SU METABOLISMO:
1 Introduccin al Glucgeno: El Glucgeno es un polisacrido que constituye la mayor fuente de Glucosa de reserva en animales vertebrados. Su acumulacin en la clula tiene lugar en forma de partculas discretas, de PM de al menos 2.10 7 g.mol-1. Es conocido tambin como el Almidn Animal. Est contituido por mltiples cadenas de Amilosa y Amilopeptina: Amilosa: Polmero lineal de -Glucosa, con enlaces glicoslicos (1-4). Amilopeptina: Ramificaciones del glucgeno. Se unen a las cadenas de Amilosa por enlaces glicoslicos (1-6).

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El Glucgeno tiende a almacenarse especialmente en el Msculo y en el Hgado. El Glucgeno Heptico tiene una densidad de 65 g/kg de tejido. Responde directamente a los niveles de Glucosa en la dieta. El Glucgeno Muscular, unos 14 g/kg de tejido, depende fundamentalmente del nivel de ejercicio fsico, siendo ms escaso despus de un ejercicio prolongado. Se explica por los requerimientos energticos de la contraccin muscular. 2 Biosntesis del Glucgeno: El precursor es la Glucosa-6-P, que va a ser transformada por la accin de una Mutasa en Glucosa-1-P. A continuacin, Glucosa-1-P es activada mediante su unin con un UTP. En esta reaccin, catalizada por UDP-Glucosa pirofosforilasa, se transfiere a la Glucosa-1-P (en P) la porcin UMP, liberando PPi. Finalmente, la Glucosa es transferida por Glucgeno sintasa al C 4 de un pequeo polisacrido de Glucgeno en crecimiento, por un enlace Glicoslico (1-4), liberndose la molcula de UDP. La naturaleza de la cadena no cambia con su extensin, pudiendo repetirse indefinidamente el proceso.

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En la formacin de las ramificaciones de Amilopeptina interviene la enzima Glicosil-4,6 transferasa, que escinde una cadena de amilosa de al menos 11 residuos, captando bloques de 7 residuos, y cataliza su unin en el grupo Hidroxilo C 6 de una cadena vecina, en un punto que dista de al menos 4 residuos de la anterior ramificacin. La captacin de Glucosa para la biosntesis de Glucgeno se encuentra estrictamente controlada: Todo el exceso de glucosa consumida se acumula indefinidamente en forma de grasas (TG). 3 La degradacin del Glucgeno: Las unidades de Glucosa se pierden una a una por la accin de la enzima Glucgeno Fosforilasa, formando nuevamente Glucosa-1-P. El balande de la reaccin es: (Glucgeno)n + PO4H2(Glucgeno)n-1 + Glucosa-1-P

La ruptura del enlace glucoslico es inducida por el Fosfato, y por ello la reaccin recibe el nombre de Fosforlisis (similar a 117

hidrlisis cuando la molcula responsable es el agua). El grupo fosfato va a ser adicionado a los productos. Esta enzima slo ataca las uniones (1-4). El resultado de su accin son oligmeros (pequeos polmeros) de glucgeno, altamente ramificados. Estos reciben el nombre de Dextrinas lmite. Son atacadas por enzimas capaces de reconocer los enlaces (1-6). 4 Generalidades sobre la regulacin del metabolismo del Glucgeno: La sntesis y degradacin del Glucgeno se encuentran reguladas conjuntamente. En caso contrario nos encontraramos con un ciclo absurdo que conducira a la disipacin ineficaz de la energa. Las situaciones o estmulos que favorecen su sntesis inhiben su degradacin y viceversa. Las enzimas objetivo de este sistema de regulacin son Glucgeno sintasa y Glucgeno fosforilasa. 5 Regulacin de Glucgeno fosforilasa: Glucgeno fosforilasa es un homodmero constitudo por unos 842 aa, y sometida a dos tipos de regulacin: Alostrica y por Modificacin Covalente. La regulacin alostrica es una regulacin puntual, y se produce como respuesta a una baja carga energtica. La regulacin por modificacin covalente de la estructura proteica de la enzima es inducida por hormonas, y responde a una necesidad general del organismo. Existen, al igual que en el caso de la Hb, en equilibrio dos conformaciones; tensa (T) e inactiva, y relajada (R) y activa. En ausencia de regulacin alostrica, la enzima se encuentra simpre en conformacin tensa. Cuando la clula muscular precisa energa, se elevan los niveles intracelulares de AMP. AMP es un regulador alostrico activador de esta enzima, y la estabiliza en su forma R.

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Cuando sin embargo, la carga energtica de la clula muscular es alta, y en esta abundan ATP y Glucosa-6-P, estos se unen a la Fosforilasa para inducir alostricamente un cambio conformacional, y estabilizando la forma T. En cuanto a la regulacin hormonal por modificacin covalente, Glucgeno fosforilasa puede ser fosforilada por Fosforilasa kinasa, en la Ser 14 de cada subunidad. Esta fosforilacin a expensas de un ATP induce un cambio conformacional (de forma b a forma a) que la transforma en activa (forma R). Solamente en el hgado, la propia glucosa puede ejercer como inactivador alostrico de la enzima, devolviendola a su forma a-T. Ambas formas activas (a y b), a pesar de no ser idnticas, son muy similares, y el Glucgeno es accesible al sitio activo. 6 Control hormonal sobre la regulacin de Glucgeno fosforilasa: Es determinante sobre la conformacin a o b de la enzima, es decir, sobre su modificacin covalente por fosforilacin. Las hormonas Glucogenolticas inducen la fosforilacin de esta enzima, y por lo tanto la degradacin del Glucgeno (Glucogenolisis). Entre ellas encontramos el grupo de las Catecolaminas (Noradrenalina, Adrenalina, Epinefrina). Son producidas por la Mdula Adrenal, y liberadas en respuesta a situaciones de emergencia, como sensacin de riesgo o sustos, puesto que hace falta gran cantidad de energa para la huda. Tienen receptores especficos en Msculos e Hgado.

Est implicada toda una cascada enzimtica de fosforilacin en la regulacin de Glucgeno Fosforilasa. Para comenzar la Adrenalina 119

se una a receptores unidos a protena G, especficos de la membrana de sus clulas diana; las clulas musculares. As queda activada la enzima Adenil ciclasa: cicla el ATP en cAMP, que acta como segundo mensajero en el interior celular. cAMP activa una protena kinasa fosforilandola, y esta a su vez va a fosforilar a expensas de un ATP a la segunda enzima de la cadena: Fosforilasa kinasa. Esta ltima, finalmente, activa por fosforilacin a expensas de ATP a la enzima Glucgeno fosforilasa, estabilizndola en la forma a, y estimulndo la degradacin del Glucgeno. Una vez ejercida la accin de una hormona, para que el sistema endocrino sea eficaz como conjunto, esta debe ser eliminada: para ello actan las Fosfoproteinas fosfatasa, que desfosforilan a las enzimas kinasas. Esto sucede finalmente cuando cAMP se destruye en AMP, por accin de la enzima Fosfodiesterasa (ataca el enlace diester fosfrico intramolecular de cAMP). Cafena y Teofilina, presentes en el t y el caf, inhiben la accin de la Fosfodiesterasa. Al dificultar la degradacin del cAMP estimulan la Glucogenolisis, y se produce energa metablica necesaria para el nerviosismo, caracterstico de su ingestin.

CAFENA TEOFILINA La transduccin de seales hormonales al interior celular es un mecanismo fundamental para la regulacin de las funciones metablicas vitales. Suele suceder por fosforilacin/desfosforilacin del dominio globular de protenas receptoras transmembrana. El efecto fundamental de la cascada enzimtica de kinasas es la amplificacin de la seal hormonal en el interior celular. Cuando una kinasa es activada, permanece as durante algunos segundos: tiempo suficiente para activar por fosforilacin muchas kinasas del siguiente eslabn de la cadena. De esta manera, en este caso, para una Adrenalina se forforilan cientos de enzimas Fosforilasa kinasa, y para una de estas, cientos de Glucgeno fosforilasa. La activacin de la protena kinasa por accin de cAMP depende de un cambio conformacional: La protena inactiva se forma de cuatro subunidades: dos R (reguladoras) y dos C (catalticas). Dos molculas de cAMP se unen a las subunidades R, provocamdo un cambio conformacional que impide su unin con las subunidades C. Las dos subunidades C libres, estn activas y presentan actividad kinasa (pudiendo fosforilar a Fosforilasa kinasa) hasta el momento de la ruptura de cAMP. 120

Fosforilasa kinasa se forma de 4 subunidades distintas organizadas en un Homotetrmero: ()4. es la subunidad cataltica, y el resto son reguladoras. La subunidad es conocida como Calmodulina; al unir iones de calcio (liberados siempre previa contraccin muscular), y solo entonces, permite la activacin de Fosforilasa kinasa. Las otras dos subunidades deben quedar fosforiladas para permitir la total activacin de la kinasa (estudios recientes apuntan solo a ). Glucagn es una hormona polipeptdica (de unos 29 aa) secretada por el Pncreas en respuesta a muy bajos niveles de azcar en sangre, mucho despus de la ltima ingestin de alimentos. Responde entre otras cosas al requerimiento del Sistema Nervioso. Es tambin una hormona Glucogenoltica, y presenta receptores especficos solamente en el Hgado. 7 Regulacin de Glucgeno sintasa y su control hormonal: Esta enzima es tambin un Homotertrmero, de PM = 350 kD. Al igual que la anterior, presenta sistemas de regulacin Alostrico y Covalente acoplados, pero a diferencia de esta, la fosforilacin de la enzima (conformacin a) estabiliza su forma T (inactiva). La conformacin b es activa de por s. Glucgeno fosfatasa pasa de conformacin a, a conformacin b por accin de la Fosfatasa kinasa, regulada tambin por fosforilacin desfosforilacin. La fosforilacin tiene lugar en residuos Ser de cada subunidad, a expensas del P de ATP. Puede ser catalizada por las mismas enzimas: Kinasa dependiente de cAMP, Fosforilasa kinasa, pero tambin por otras kinasas (mecanismo no especfico). Por ello, la Adrenalina no solo tiene poder Glucogenoltico en Msculo e Hgado, sino que adems inhibe la sntesis del Glucgeno. La Insulina, secretada tambin por el Pncreas, pero en respuesta a muy altos niveles de Glucosa en sangre, estimula la forma activa de Fosfatasa kinasa, y por lo tanto la sntesis de Glucgeno. Se trata de otra hormona polipeptdica, que al igual que el Glucagn, es secretada por los Islotes , o Clulas de Langerhans. Despus de cada comida, estimulan tanto la sntesis de Glucgeno como la de las Grasas. La Diabetes (ausencia o patologa de la Insulina) puede ser infantil (hereditaria) o adquirida. Esta ltima suele desarrollarse en adultos como consecuencia del sobrepeso. Es una enfermedad muy abundante en paises desarrollados, especialmente en los Estados Unidos debido a su mala alimentacin. Glucosa-6-P es un activador Alostrico de Glucgeno sintasa. En altos niveles intracelulares, se une a esta enzima en su conformacin a, estabilizando forma R, y por consiguiente la sntesis de glucgeno. Podemos concluir que el metabolismo del Glucgeno est regulado por procesos importantes de Fosforilacin (movilizacin de las reservas) / Desfosforilacin (Procesos biosintticos).

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8 Ruta de las Pentosas, o del Fosfogluconato: Esta ltima ruta de Hidratos de Carbono es una Va Multifuncional: 1. Biosntesis activa de lpidos: Produccin de NADPH citoplasmtico, cuyo poder reductor es esencial en la sntesis de cidos grasos, colesterol y fosfolpidos, en el Tejido Adiposo, las Glndulas Mamarias, el Hgado y la Mdula Adrenal. NADP + es un derivado fosforilado de NAD+ que no cede electrones a la cadena respiratoria. En el Citosol, la reduccin de este coenzima permite el transporte de electrones hasta las rutas de biosntesis. 2. Produccin de Ribosa-5-P, precursor fundamental en la Biosntesis de cidos nucleicos. 3. Produccin de energa metablica. Se creean precursores para la Gliclisis, hay produccin indirecta de ATP. 4. En vegetales y microorganismos, es indispensable para la sntesis de Glucosa a partir de CO 2, durante la fase oscura de la fotosntesis. Esta Ruta est dividida en dos fases fundamentales: Fase Oxidativa: Glucosa Ribulosa-5-P Fase No Oxidativa: Ribulosa-5-P intermediarios de la Gluclisis. Se pueden obtener pentosas partiendo de Fructosa-6-P y 3Gliceraldehdo. La Fase Oxidativa tiene como principal objetivo la sntesis de NADPH. La enzima Glucosa-6-P dh oxida la Glucosa-6-P, reduciendo un NADP+, en Glucano Lactona. Lactonasa lo transforma en 6-PGluconato. Posteriormente, 6-P-Gluconato sufre la descarboxilacin oxidativa (Alcohol > Ceto), transformandose en Ribulosa-5-P. Esta oxidacin, catalizada por 6-P-Gluconato dh, reduce un segundo NADP+. Ribulosa-5-P es el primer intermediario de la Fase No Oxidativa, cuyo conjunto de reacciones es reversible, y cuyos objetivos principales son la sntesis de precursores.

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(1) Glucosa-6-P dh (2) 6-P-Gluconato dh

(y Lactonasa).

Ribulosa-5-P

(3) Isomerasa (4) Epimerasa (5) Transcetolasa + coenzima (6) Transaldolasa TTP (7) Transacetolasa En primer lugar sucede la Isomerizacin de la Ribulosa-5-P en Ribosa-5-P y Xilulosa-5-P por dos enzimas distintas; dos pentosas. Transacetolasa TTP transfiere un Glicoahdehido (2C) de la Xilulosa a la Ribosa, formndose respectivamente una triosa: 3-PGliceraldehdo, y una heptosa: Pseudoheptulosa. La transferencia de este grupo es facilitada por el coenzima TTP, en un proceso anlogo a los catalizados por Piruvato dh y Cetoglutarato dh. Durante la transferencia se forma Pirofosfato de dihidroxietiltiamina: E-TTP-CHOH-CH2OH.

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A continuacin, Transaldolasa transfiere un fragmento de 3D de la heptosa a la triosa, formndose respectivamente una tetrosa: Eritrosa-4-P, y una hexosa: Fructosa-6-P. Finalmente, Transacetolasa cataliza la transferencia de un nuevo grupo Glicoaldehdo (2C) de una Xilulosa-5-P (una pentosa) a la Eritrosa-4-P, formndose as finalmente Gliceraldehdo-3-P, y otra Fructosa-6-P. Adems de formar precursores, esta fase facilita el intercambio entre triosas, tetrosas, pentosas, hexosas e incluso heptosas. Ambas fases funcionan en dependencia de las necesidades metablicas de las clulas: Funcionan como respuesta a la necesidad de NADPH en fase oxidativa, y tambin de ATP pues se crean precursores para la Gluclisis y el ciclo TCA en la fase no oxidativa. Responde tambin a necesidad de sntesis activa de cidos nucleicos. En este caso la Ribosa-5-P es obtenida a partir de los precursores de la Gliclisis, gracias a la fase oxidativa en sentido opuesto (ascendente): es decir, a partir de Fructosa-6-P y 3-P-Gliceraldehdo. 9 Glutatin y Patologa de la Ruta de las Pentosas en Eritrocitos: La ausencia o malformacin gentica y hereditaria (debida a la malformacin de un solo gen) de la enzima Glucosa-6-P dh en Eritrocitos puede conducir a Anemias hemolticas agudas, especialmente despus de la ingestin de determinados medicamentos. Se trata de una malformacin patolgica grave. Esta patologa afecta al 11% de la poblacin negra de los Estados Unidos, y ms de 200 millones de personas en Africa central. El tripptido Glutatin es responsable de la conservacin de grupos tilicos libres en protenas (SH), indispensables para su funcionalidad. Tambin evita la destruccin de la membrana celular por peroxidacin lipdica (la oxidacin ligada al envejecimiento). Durante la respiracin aerobia se producen mltiples oxidaciones, originndose perxidos como H 2O2, y tambin perxidos orgnicos. Estas molculas son altamente lesivas para las clulas, pues son responsables de la oxidacin y destruccin de mltiples compuestos. En concreto, entre otras cosas, el Glutatin se encarga de eliminar los perxidos dainos para la clula, con la ayuda de Glutatin peroxidasa. Por ejemplo, reduce el Perxido de Hidrgeno a agua, quedando oxidado: La oxidacin se traduce en la unin de dos molculas de Glutatin, por puentes disulfuro. Finalmente, la enzima Glutatin reductasa se encarga de reducir de nuevo las molculas de Glutatin, utilizando un NADPH como donador de electrones. Por ello, la enzima Glucosa-6-P dh es fundamental para proporcionar NADPH al eritrocito, no solo reducindolo a nivel del sustrato, sino permitiendo la accin posterior de 6-P-Gluconato dh.

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El gen responsable de la Anemia Hemoltica aguda est ligado al cromosoma X. Por lo tanto los machos que heredan el gen X defectuoso no producen nada de enzima normal, y siempre estn afectados letalmente. Las hembras, sin embargo, pueden ser homozigotas o heterozigotas. Slo las heterozigotas pueden producir Glucosa-6-P dh suficiente para cumplir sus funciones vitales, pero producen el 50% de lo que produce una persona normal sana. Curiosamente, este gen recesivo prevalece entre la poblacin negra de frica central. Se debe a la enorme ventaja que este gen proporciona a las mujeres heterozigotas frente al Paludismo o Malaria, mayor causa mundial de mortalidad. Esto se debe a que la bacteria causante, Plasmodium falciparium, necesita para su desarrollo altos niveles de NADPH. Al infectar a personas con niveles inferiores a los normales (concretamente ), los parsitos no logran proliferar. Si estas mujeres toman Pamaquinina, un frmaco que acta contra la Malaria reducindose para oxidar el NADPH en NADP + (atacando as a la bacteria), pueden morir.

III/ Metabolismo de Lpidos:

A/ LOS PRINCIPALES LPIDOS:
1 Estructura y Nomenclatura: Se trata de compuestos altamente hidrofbicos, debido a la hidrofobicia de sus cadenas Acilo contituyentes, los cidos Grasos (AG). De hecho, los cidos grasos son los componentes fundamentales de todos los lpidos. Los AG derivan de Hidrocarburos de cadena larga, de tal manera que en su extremo presentan un grupo Carboxilo. Su frmula general es:

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CH3-(CH2)n-COOSu nomenclatura se basa en la raz del hidrocarburo que le corresponde, terminado en oico (por ejemplo, con 16 C y saturado: Hexadecanoico, 16:0). En el caso de que presente insaturaciones, se emplea la misma terminologa, sin olvidar la terminacin eno del hidrocarburo (por ejemplo, con 16 C y un doble enlace: Hexadecenoico, 16:1). Se emplea una para indicar con un superndice la posicin de los dobles enlaces contando desde C 1 (carboxilo) (por ejemplo, Octadecano trienoico (18:3) 6,9,12). Se puede emplear una para indicar la posicin de las insaturaciones, partiendo desde el carbono , es decir, el ms alejado del grupo carboxilo (por ejemplo, el mismo AG: 6,9,12). A pesar de este ejemplo, esta nomenclatura es habitual en AG 3 y 6. Estos AG son caractersticos de vegetales, y los animales no pueden introducir insaturaciones en esas posiciones; sin embargo son esenciales para la membrana celular, por ello son fundamentales en la alimentacin. 2 Los cidos Grasos de las clulas: Adems de un nombre sistemtico, los cidos grasos biolgicos ms frecuentes en las clulas suelen tener un nombre propio habitual. Por lo general en las clulas, tienen un nmero par de tomos de C, comprendido entre 16 y 20. Las insaturaciones se encuentran en posicin cis, y esto es fundamental para la membrana celular. Hidrogenando los AG cis con aceite de oliva (fritura) pueden eliminarse los dobles enlaces u obtener la configuracin trans. Este tipo de dieta, caracterstica de los estadounidenses, es perjudicial para las membranas. La dieta Mediterrnea, rica en cido oleico crudo, es beneficiosa y evita enfermedades cardiovasculares. Los lpidos deben ser transformados por el metabolismo, para ejercer su funcin biolgica. Existen tres principales tipos de Macromolculas orgnicas que contienen lpidos como componentes fundamentales: Fosfolpidos (de membrana). Triglicridos (reservas energticas). Esteroles

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3 Los Triglicridos: Los TG, importantes reservas energticas, Constituyen las Grasas del tejido adiposo. Derivan de tres AG y una molculas de Glicerol (Glicerina Trialcohol). Cada grupo cido de los AG se une a un grupo Alcohol del Glicerol, por una unin Ester.

Cuando de los tres grupos Alcohol del Glicerol, solo dos posiciones estn esterificadas, recibe el nombre de Diglicrido (DG). Para conocer las posiciones de los AG se numeran los C de Glicerol (por ejemplo, 1,2-Diglicrido). Cuando hay una nica posicin esterificada recibe el nombre de Monoglicrido (MG). Entonces se indica especficamente el C esterificado. 4 Los Fosfolpidos: Los PL intervienen como membranas plasmticas celulares. componentes bsicos de las

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Derivan de 1,2-DG. El grupo alcohol 3 est esterificado por un cido Fosfrico, que a su vez esterifica una base nitrogenado (normalmente distinta de las de ADN y ARN), ente las cuales destacan Etanolamina, Serina, Colina Su nomenclatura se limita a inclur un Fosfatidil- delante del nombre de la BN (por ejemplo, Fosfatidiletanolamina, PE). Algunos PL tienen esterificada una sola posicin alcohol con un cido graso. Estos reciben el nombre de Lisofosfolpidos (por ejemplo Lisofosfatidiletanolamina, LPE). Los Esfingolpidos son PL especiales, muy importantes para el SN. 5 Los Esteroides: Todos los Esteroides tienen en comn un grupo fundamental: se trata del Ciclopentanoperhidrofenantreno:

Contiene dos grupos Metilo (18 y 19) y un sustituyente particular en 17 que permite diferenciar a los distintos esteroides biolgicos entre ellos. Existen distintos Esteroles en el organismo, y pueden tener distintas funciones. Entre ellos encontramos la Cortisona, el Colesterol (constituyente de la membrana plasmtica indispensable para su fluidez), las Sales Biliares (necesarias para la digestin de las grasas), Vitaminas y varias Hormonas Sexuales. Cortisona y sus derivados son hormonas secretadas por las cpsulas suprarrenales en bajsima concentracin. Se trata de un frmaco antiinflamatorio insustituible para mltiples enfermedades. Es junto con los Antibiticos el principal frmaco del siglo XX. Se utiliza contra Cancer, Alergias, Inflamaciones

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La Cortisona fue descubierta en la cpsula suprarrenal de buey. Su baja produccin la haca incomercializable. Su sntesis qumica a partir de Esteroides vegetales es muy compleja: se debe introducir un grupo Hidroxilo justo en posicin 11. Son necesarias 11 reacciones y tiene un rendimiento del 0,015 %. El microbilogo Peterson descubri microorganismos con Hidroxilasas especficas que catalizaban esta reaccin con un rendimiento del 100 %.

B/ METABOLISMO DE DEGRADACIN DE LPIDOS:

1 La Digestin de los Triglicridos en la Luz Intestinal: Los TG son un principal componente energtico de la dieta humana. Son muy insolubles en agua, lo cual es un problema para su digestin y adsorcin. Los movimientos peristticos del tubo digestivo facilitan la emulsin de las grasas, transformndolas en pequeas gotitas. Estas gotitas se hacen an ms solubles gracias a la accin de las Sales Biliares, producidas por la vescula biliar del hgado. Las sales recubren las gotitas de TG en forma de pelcula. Estos compuestos esterolicos biliares, con accin detergente, presentan una cabeza hidroflica y una cola hidrofbica. A continuacin, los TG son hidrolizados por una potente Lipasa, que es liberada a la luz intestinal por el pncreas. Hidroliza en concreto los enlaces de las posiciones distintas des TG, es decir, 1 y 3. TG DG + AG 2-MG + 2 AG

Esta Lipasa es en s misma inactiva, y su activacin depende de una pequea protena; Colipasa. Se une a la enzima induciendo un cambio conformacional en ella, pudiendo quedar en contacto su centro activo con los TG. Colipasa es producida por el Pncreas en forma de Procolipasa. Su activacin por protelisis es a su vez inducida por un pH muy bajo, caracterstico del tracto digestivo. 2-MG, AG y Sales Biliares forman micelas mixtas que finalmente pueden ser absorbidas por las clulas de la mucosa intestinal. 2 Degradacin de los Triglicridos en la mucosa intestinal: En el interior celular, los cidos grasos y el MG se transforman de nuevo en TG. Los AG, en el interior celular, nunca se encuentran libres sino unidos a CoA: R-COO- + CoASH R-CO-SCoA

Esto no solo facilita la solubilizacin del AG, sino que adems Activa su grupo Carboxilo, hacindolo ms reactivo. Los TG, reconstruidos en las clulas de la mucosa intestinal, deben pasar a la sangre. En este proceso su solubilidad es de nuevo

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un problema, y demasiados TG en la dieta pueden causar patologas circulatorias. En el Retculo Endoplasmtico de las clulas, los TG se unen con protenas, fosfolpidos y colesterol formando unas partculas llamadas Quilomicrones (QM), capaces de salir de la mucosa intestinal al drenaje linftico, y de ah al torrente sanguneo a travs del conducto torcico. Estos complejos son tambin llamados Lipoprotenas, transportan los TG en la sangre, facilitando su solubilizacin en medios acuosos. 3 Lipoprotenas de la sangre:

LIPOPROTENA

Las lipoprotenas presentan una monocapa de fosfolpidos, algo de colesterol y Apoprotenas en su superficie, haciendo de la partcula en conjunto un compuesto hidrosoluble. En el interior hidrofbico, se mezclan esteres de colesterol y TG homogeneizados. Las Lipoprotenas de la sangre, adems de los QM, se clasifican en funcin de su densidad. De tal manera que, a mayor relacin Lpido/Protena, menor ser su densidad: VLDL (Lipoprotena de muy baja densidad). LDL (Lipoprotena de baja densidad). HDL (Lipoprotena de alta densidad). Los QM, de muy baja densidad, se corresponden a los lpidos de la dieta, y se distingue de las otras Lipoprotenas por su composicin. Adems, su tiempo de permanencia en sangre es especialmente corto (5 min), mucho ms que el de VLDL (2-3 horas). VLDL transporta los TG endgenos, producidos por el propio organismo en el hgado. LDL transportan el colesterol malo.

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HDL transportan los excesos de colesterol (denominado bueno), que deben ser eliminados. Deben en concreto ser llevados hasta el hgado para su metabolismo. 4 Recorrido de los Quilomicrones en la sangre: Una vez que llega al torrente sanguneo, el QM no permanecer en l durante ms de 5 minutos. De hecho, las clulas musculares, esquelticas y cardacas, y las clulas adiposas captarn rpidamente estas partculas. Dichas clulas van a hidrolizar los QM por accin de Lipoprotena Lipasa. Esta enzima se encuentra en la superficie de las clulas endoteliales de los capilares sanguneos de estos tejidos, de tal manera que su reaccin ser catalizada a nivel del plasma sanguneo y slo sus productos sern adsobidos por los tejidos. Primero, la Lipoprotena lipasa debe ser activada por la Apoprotena C II del QM. Entonces la enzima esterasa comienza a hidrolizar los TG de los QM: Primero en AG + DG, y despus DG en AG + MG, de forma que los AG son adsorbidos por el tejido. La estructura QM MG es muy inestable, de forma que se produce una disociacin espontnea de la partcula. Los MG entran al interior celular donde son transformados en AG y Glicerol. Las Lipoprotenas remanentes se dirigen a travs de la sangre directamente al hgado. 5 Destino de los Triglicridos en clulas Adiposas y Musculares: En el interior celular, los AG provenientes de los TG de la dieta pueden tener dos destinos: Biosntesis de lpidos (especialmente en Adipositos) u obtencin de energa metablica o ATP por -oxidacin (en clulas musculares). Ocurre exactamente lo mismo con las VLDL que con los QM. El Hgado, principal rgano de metabolismo de Lpidos, exporta el colesterol y los TG endgenos en este tipo de Lipoprotenas, de gran tamao, pudiendo se tiles como fuente de lpidos para tejidos muscular y adiposo. En estos tejidos, de nuevo, son hidrolizados a expensas de Lipoprotena lipasa. La Lipoprotena latente es en este caso una partcula LDL, de menor tamao ya que ha perdido casi todo su contenido. de las LDL retorna al hgado donde puede cargarse de nuevo en VLDL, mientras la otra de LDL puede dirigirse a los tejidos extrahepticos (perifricos del hgado), donde sirve como fuente de Colesterol y Apoprotenas. En estos ltimos tejidos, LDL se une a receptores especficos de las membranas celulares, y se introducen en la clula por un proceso de endocitosis. Una pequea vescula con los receptores abandona el Endosoma, y es reciclada en la membrana. El resto del Endosoma se fusiona con un Lisosoma formndose un Lisosoma secundario, donde las LDL son digeridas y degradadas.

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El Colesterol libre en exceso se acumula en la membrana, en forma de Esteres de Colesterol. La esterificacin de este compuesto con un AG (Acil-CoA) es catalizada por la enzima Acil-CoA-Colesterol acil-transferasa. Colesterol + Acil-CoA Ester de Colesterol + CoASH

Las Apoprotenas son descompuestas en sus aminocidos constituyentes. 6 Funcin de las Apoprotenas de alta densidad, HDL: HDL son sintetizadas en el Hgado, y liberadas al plasma sanguneo. Se encargan de recoger los excesos de Colesterol de la superficie de las clulas. Cuando aparecen el la circulacin, son partculas de muy pequeo tamao, exentas de Colesterol. A medida que pasa el tiempo, van cargndose de este compuesto, y transformndolo inmediatamente en Esteres de Colesterol. En este caso, la esterificacin corre a cargo de la enzima del plasma Lecitina Colesterol acil-transferasa (LCAT). El fosfolpido Lecitina (Fosfatidil Colina) es tranformada en Lisolecitina (Lisofosfatidil Colina), cediendo su AG en 2 al Colesterol.

COLESTEROL Colina Una vez que HDL se carga de Esteres de Colesterol perifrico (en exceso), una parte de ellos van a ser transferidos a VLTL, y otra va a regresar al Hgado para su metabolismo, entre otras cosas para la sntesis de las Sales Biliares, que se acumulan en la Vescula Biliar. 7 Enfermedades cardacas relacionadas: Una anomala hereditaria se debe a la defectuosidad de un gen, que se traduce en la ausencia de receptores de LDL en las clulas del tejido extraheptico. La Homozigosis es muy rara (1 entre 1.000.000 de habitantes), y produce en los afectados una concentracin de colesterol en sangre cinco veces superior a la de una persona normal. Los enfermos no suelen superar la edad de 20 aos. La Heterozigosis es sin embargo muy abundante (1 entre 500 habitantes). Presentan la de receptores que una persona normal, y sus niveles de colesterol en sangre son sensiblemente elevados. Estos enfermos pueden padecer enfermedades cardacas a los 40 o 50 aos.

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Las Estatinas son Frmacos que ayudan a regular los niveles de colesterol en sangre. Inhiben la sntesis de Colesterol Endgeno. Por otro lado, ante pequeas lesiones arteriales, se depositan paulatinamente los lpidos formando Ateromas. Estos constituyen un engrosamiento de la pared arterial, pudiendo obstruir la luz arterial. En estos casos, la disminucin del flujo sanguneo, que puede llegar a bloquearse, puede producir Infarto de Miocardio (si se produce en la arteria Coronaria), o Embolia Cerebral (en la arteria Cerebral), causas de muerte de las ms abundantes en pases desarrollados. Con el tiempo, los Ateromas se Calcifican y endurecen, dificultando an ms la circulacin. Esta enfermedad es conocida bioqumicamente como Aterosclerosis (Arteriosclerosis). Los altos niveles de LDL en sangre pueden crear enfermedades coronarias, sin embargo, los altos niveles de HDL las evitan. Las hembras, gracias a la produccin de estrgenos, estimulan los elevados niveles de HDL, siendo menos afectadas. El bajo peso, ejercicio fsico violento, y el consumo moderado de alcohol tambin elevan los niveles de HDL. El consumo de tabaco, sin embargo, aumenta el riesgo. 8 Movilizacin de los cidos Grasos del tejido Adiposo: El tejido Adiposo es un importante reservorio donde se acumulan los cidos grasos, importante fuente de energa a nivel cuantitativo (ms an que la glucosa). Estos AG se encuentran en forma de TG, y son suficientes para abastecernos durante un mes. La movilizacin de los TG tiene lugar como respuesta a una demanda de energa general del organismo, por un intenso ejercicio fsico, o carencia de nutrientes. Triglicrido lipasa, Diglicrido lipasa y Monoglicrido lipasa catalizan respectiva y ordenadamente la prdida de los tres AG del TG, que van difundiendo del adiposito y siendo cedidos a Albmina, protena que puede transportar estas hidrofficas molculas a travs de la sangre. Sern tomados por tejidos requirentes de energa. Se piensa que TG lipasa y MG lipasa podran ser la misma enzima. El Glicerol restante pasa al torrente sanguneo, que va a transportarle hasta el hgado donde va a ser metabolizado. A expensas de la hidrlisis de un ATP en ADP, Glicerol kinasa cataliza la fosforilacin del Glicerol en su C 3, dando Glicerofosfato. La clula adiposa carece de esta enzima. CH2OH-CHOH-CH2OH CH2OH-CHOH-CH2OPO32-

Este producto va a ser transformado, reduciendo un NAD +, en Dihidroxiacetona fosfato (DHAP) metabolito de la ruta intermediaria Glicoltica. Podr ser isomerizado en G-3-P para produccin de energa, o podr ser utilizado en la va Gluconeognica. CH2OH-CO-CH2OPO32-

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Albmina es una pequea protena monomrica del plasma sanguneo (PM = 66.000 kD). Est estabilizada por numerosos puentes disulfuro, y 10 puntos de anclaje para AG, con distintas afinidades: entre ellos destacan dos o tres sitios primarios, de gran afinidad. Al igual que la degradacin del Glucgeno (Glucgeno fosforilasa) la movilizacin de esta segunda importante reserva energtica orgnica est sometida a una fuerte regulacin y control hormonal. Hormonas: ADIPOSITO - Adrenalina + - Glucagn SANGRE Adenil ciclasa + AMPc ATP Receptor Movilizacin de AG

AMPc, segundo mensajero, activa una cascada enzimtica de fosforilacin de protenas kinasas, que desemboca en la fosforilacin de Triglicrido lipasa, quedando esta en forma activada. La accin de una fosfatasa la devuelve a su estado inicial. La hormona Insulina estimula la desfosforilacin de la TG lipasa del tejido adiposo, y estimula adems procesos de Biosntesis. Es secretada despus de alimentarse. 9 La -Oxidacin de los cidos Grasos ( -Ox): Los AG son el principal combustible para gran nmero de clulas, especialmente para el msculo. Aparecen en las clulas de todos los tejidos, procedentes de la sangre donde son transportados por la protena Albmina desde el tejido Adiposo. Tambin pueden aparecer como producto de la hidrlisis de TG endgenos en determinadas clulas. Primero, los AG se acilan directamente con CoASH en toda clula. Esta reaccin catalizada por Acil-CoA sintetasa hidroliza una molcula de ATP en AMP + PPi. El ester tilico que se forma es de muy elevado contenido energtico, y precisa la fosfatacin de dos P del ATP. Adems, de la energa de separacin del pirofosfato (PPi) en 2 Pi. La enzima Acil CoA sintetasa es una enzima asociada a membrana, con doble localizacin en las clulas: Tanto en la membrana del Retculo Endoplasmtico (para Biosntesis de Lpidos), como en la membrana externa de la mitocondria (para la -Ox). Esta ltima localizacin es esencial, pues la -Ox es un proceso que tiene lugar en el interior mitocondrial. En concreto, esta enzima

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cataliza de un mismo paso la acilacin con CoASH del AG, y facilita su transporte al espacio Intermembrana Mitocondrial. De hecho, ambas membranas son impermeables a Acil-CoA, y su transporte tiene lugar mediante la accin de Carnitina, una pequea molcula orgnica. Carnitina puede acilar el AG a travs de su grupo Hidroxilo de C 3.

La enzima I cataliza la transferencia del grupo Acilo de la CoA a la Carnitina. Resulta CoASH libre, y Acil-Carnitina, capaz de atravesar la membrana interna mitocondrial. (esta E se encuentra en el lado externo de la membrana interna?) En el interior mitocondrial, la enzima II transfiere el grupo Acilo de la Carnitina al CoASH libre del interior mitocondrial. 135

Acil-CoA en el interior mitocondrial se integra en el ciclo de la Ox de los AG.

CICLO TCA

La primera reaccin, catalizada por Acil-CoA dh, oxida el AG por deshidrogenacin del enlace sencillo entre los C y a doble enlace. Al igual que en el ciclo TCA, estas reacciones estn siempre catalizadas por deshidrogenasas FAD-dep. A diferencia del resto de las enzimas de la -Ox (libres en la matriz mitocondrial) esta enzima se encuentra anclada a la cara interna de la membrana mitocondrial interna, de forma que recibe directamente los Acil-CoA que penetran gracias a Carnitina. La segunda reaccin, catalizada por Hidratasa, adiciona al doble enlace los elementos del agua, oxidando el C b del AG, y formando el consecuente D -OH-Acil-CoA (de ah el nombre -Ox). Es, al igual que Aconitasa, una enzima muy estereoespecfica, pues adiciona siempre el agua al ismero trans, obtenindose siempre el ismero ptico D. El grupo -Alcohol es transformado, por la enzima -OH-Acil-CoA (deshidrogenasa NAD-dep) en grupo Ceto, de forma que el producto es el -Ceto-Acil-CoA correspondiente. NADH y FADH2 formados ceden electrones a la cadena de transporte de electrones de la respiracin. Tiolasa produce un ataque nuclefilo del grupo SH de un nuevo CoASH libre, al grupo Ceto deficiente de electrones, con la consiguiente escisin del AG en este punto, y la unin de CoASH en el nuevo AG formado por dos C menos. Obtenemos as un Acetil-CoA del extremo cortado de Acil-CoA inicial. El Acil-CoA resultante sufre a su vez una nueva ronda de -Ox, perdiendo de nuevo dos carbonos, y as sucesivamente. Por otro lado, todos los Acetil-CoA formados pueden integrarse en el ciclo TCA. Esta oxidacin es fuertemente reentable; por ejemplo, una molcula de cido Palmtico (16 C) produce en la mitocondria 129 ATP, mientras una glucosa produce 38 ATP. 136

10 Degradacin de los Fosfolpidos: Las encimas implicadas son, de nuevo, Esterasas, que hidrolizan los enlaces Ester. Se trata de las Fosfolipasas. En un fosfolpido encontramos cuatro enlaces ester, y existe una fosfolipasa especfica para cada uno. La enzima Fosfolipasa A1 hidroliza el ester AG en posicin 1 formndose un 1-Lisofosfolipido. La enzima Fosfolipasa A2 hidroliza el ester AG en posicin 2 formndose un 2-Lisofosfolpido. La enzima Fosfolipasa C hidroliza el ester Fosfato en posicin 3 formndose un Diglicrido. La enzima Fosfolipasa D hidroliza el ester Fosfato Base Nitrogenada fosmandose un cido Fosfatidlico (Fosfatidato). La accin conjunta de las cuatro enzimas produce Glicerol, 2 AG, un Pi y una Base Nitrogenada. El veneno de Cobra y otros ofidios es similar a Fosfolipasa A 2. Sus altos niveles en sangre producen ataques a Fosfolpidos de membrana de los Eritrocitos, originando 2-Lisofosfolpidos, con efecto detergente: se produce micelarizacin de los Fosfolpidos y de las membranas, y consecuentemente Hemolisis Aguda. Al ingerir el veneno, su efecto no llega a afectar a las clulas pues es digerido previamente, pudiendo incluso servir como alimento.

C/ METABOLISMO DE BIOSNTESIS DE LPIDOS:

1 Biosntesis de Cuerpos Cetnicos: Esta sntesis sucede en mitocondrias hepticas, y sus productos, los Cuerpos Cetnicos, son Acetoacetato y Hidroxibutirato. Una vez biosintetizados, los Cuerpos Cetnicos son cedidos de por el hgado a la circulacin sangunea, y pueden as ser tomados por numerosos tejidos como fuente de energa. Podramos resumir el proceso con el siguiente esquema: HGADO (Mitocondria) Acetoacetil-CoA Acetoacetato SANGRE

Acetil-CoA

-OH-Butirato

-OH-Butirato
TC A

Acetoacetato

Acetil-CoA

Acetoacetil-CoA MSCULO, CEREBRO

137

(HMG-CoA) Sntesis de Fosfolpidos

En un primer paso, tiene lugar la condensacin de dos molculas de Acetil-CoA en una reaccin reversible catalizada por Tiolasa. Son, de hecho, las mismas enzima y reaccin del ltimo paso de la -oxidacin, pero sucede en sentido contrario. A continuacin se une una tercera molcula de Acetil-CoA, en una reaccin catalizada por -Hidroxi--metil-Glutaril-CoA sintasa. Se produce -Hidroxi--metil-Glutaril-CoA, o HMG-CoA. Se trata de un cido dicarboxlico de 5 C, derivado de HMG, y similar al cido Glutmico, -Ceto-Glutarato. Hasta este punto, las reacciones son exactamente iguales a las que ocurren durante la biosntesis del Colesterol, y los productos son los mismos. La diferencia radica en que la sntesis de Colesterol termina en el Citosol.

138

Una -Hidroxi--metil-Glutaril-CoA liasa escinde del HMG-CoA una molcula de Acetil-CoA, dando lugar al primer Cuerpo Cetnico: el Acetoacetato. La enzima -Hidroxi-Butiril-CoA dh, reduce reversiblemente el Acetoacetato a -Hidroxibutirato, el segundo Cuerpo Cetnico. Esta enzima es exclusiva de las mitocondrias hepticas, pero tambin se encuentra en el Citosol de casi todas las clulas, catalizando el paso contrario. La proporcin total de uno y otro cuerpo cetnico depender fundamentalmente de la proporcin de NAD+/NADH que exista en la mitocondria, de forma que a ms NAD+ se ceder ms Acetoacetato a la sangre, y viceversa. Los dos tejidos que utilizan la mayor parte de estos compuestos como energa, captndolo de la sangre, son los msculos y el sistema nervioso. Para poder ser utilizado, el Acetoacetato debe ser transformado en Acetoacetil-CoA. Este proceso se acopla al paso de Succinil-CoA a Succinato, de forma que la CoA es transferida por Cetocido transferasa. Finalmente, Tiolasa cataliza su reaccin, en el mismo sentido de la -oxidacin, formndose dos Acetil-CoA que pueden incorporarse al ciclo TCA. La utilizacin de Cuerpos Cetnicos por el organismo como fuente de energa depende de las fluctuaciones de los niveles de Glucosa en la sangre. Asimismo, despus de una comida siempre se utiliza la Glucosa, pero cuando esta escasea comienza a ser exclusiva para el tejido nervioso por sus especiales requerimientos. El tejido adiposo comienza entonces a liberar AG, de los cuales una buena parte es utilizada por el hgado para la sntesis de cuerpos cetnicos, de tal manera que estos pueden constituir una importante fuente de energa para los msculos. Tanto durante un ayuno prolongado como para las personas con Diabetes, la Glucosa es muy escasa en la sangre, y el cerebro puede adaptarse a utilizar cuerpos cetnicos como fuente de energa, aunque este rgano es incapaz de utilizar AG pues no pueden atravesar la barrera hematoenceflica. De hecho en ayunos prolongados, diabticos y bebs (leche materna), se produce la descarboxilacin espontnea en la sangre de Acetato a Acetona (relacionada con el olor del aliento). La acidez producida puede conducir a una disminucin del pH sanguneo, y por lo tanto a diversas enfermedades patolgicas, como la disminucin de la afinidad de Hb por O2. CH3-CO-CH2-COOCH3-CO-CH3

2 Biosntesis de cidos Grasos: La biosntesis en Vertebrados sucede en el hgado, de tal manera que todo AG de un animal procede del hgado o de la dieta. Ms concretamente, sucede en el Citosol de todas las clulas que los sintetizan. 139

Como rutina diaria, despus de las comidas se produce la oxidacin de la Glucosa para produccin de energa, la reposicin de las reservas de Glucgeno, y la transformacin del exceso de glucosa en cidos grasos, que son acumulados en forma de Triglicridos en las Grasas del tejido Adiposo. Las reservas de Glucgeno sirven aproximadamente para un da de vida. Al escasear la Glucosa, los cidos grasos se transforman en la principal fuente de energa del organismo, pudiendo servir durante todo un mes. De hecho, durante la noche, la mayor parte del oxgeno que respiramos es utilizado para quemar cidos grasos procedentes del tejido Adiposo. Los AG como reserva masiva de energa tiene de hecho sus beneficios. El principal es tal vez su inferior densidad y por lo tanto peso, que el del Glucgeno: tanto es as que si acumulsemos en Glucgeno lo que acumulamos en Lpidos, pesaramos toneladas. Tambin por la gran cantidad de energa que puede contener una sola molcula (balance de la degradacin de AG). Esta biosntesis sucede en el Citoplasma celular, y utiliza como precurso la Acetil-CoA resultante de la degradacin de la Glucosa. Ocurre a expensas de dos enzimas fundamentales: Acetil-CoA carboxilasa + Coenzima Biotina cido Graso sintasa La primera, Acetil-CoA carboxilasa, cataliza la transformacin de Acetil-CoA en Malonil-CoA. Es una enzima Carboxilasa tpica, que utiliza Biotina como coenzima. El cido Malnico es un cido dicarboxlico de tres carbonos. Este paso supone la activacin de Acetil-CoA para que entre en esta va biosinttica. CH3-CO-SCoA + CO2 + ATP
-

OOC-CH2-CO-SCoA + ADP + Pi

Se forma un enlace donde queda retenida gran parte de la energa de hidrlisis del ATP, de forma que esa energa puede ser utilizada para la biosntesis durante la ruptura del enlace. En Procariontes, esta enzima est constituda por tres protenas distintas: una pequea une la Biotina, la segunda cataliza la formacin de Carboxibiotina, y la tercera, una Transcarboxilasa, transfiere el carboxilo de Biotina a Acetil-CoA. En Eucariontes, se trata de un Homodmero, con PM = 230.000 Da en cada subunidad. Es inactiva en su forma dimrica, sin embargo, en presencia de Citrato, polimeriza volvindose activa. El Polmero puede alcanzar unos PM = 6.000.000 Da. El regulador primario de esta enzima es sin embargo la propia Acetil-CoA: cuando est presente en altos niveles intracelulares induce su despolimerizacin en inhibicin. A continuacin actua la enzima AG sintasa: se trata de un importante complejo multienzimtico tpico, que cumple siete funciones distintas. En procariontes est constituda por siete protenas distintas, mientras en los Animales se trata de nuevo de un Homodmero, con PM = 240.000 Da en cada subunidad. De hecho,

140

cada subunidad contiene las siete actividades enzimticas necesarias para la sntesis. Su mecanismo de accin para la sntesis de AG es un complejo proceso mediado exclusivamente por este complejo multienzimtico. Presenta dos grupos tilicos de especial importancia: Cys-SH. Para Acetil-CoA. Ser-(Resto de Fosfopanteteina). Para Malonil-CoA.

Fosfopantetena

Cisteamina

El Resto de Fosfopantetena incluye el cido Pantotenoico, y tiene una estructura similar a la de la CoA. Esta unido a un residuo Ser de una protena ACP (Acil Carried Protein), transportadora de Acilos. Es esencial para la biosntesis de cidos Grasos tanto Eucariontes como procarionates. Adems, cada subunidad contiene una molcula de ATP. Para comenzar, AG sintasa Transtioesterifica el Acetilo de una Acetil-CoA al extremo de su grupo Fosfopantetena, liberando una molcula de CoASH, y lo transfiere a su grupo Cys-SH. A continuacin, AG sintasa esterifica el Malonilo de una MalonilCoA en el extremo de su grupo Fosfopantetena, liberando de nuevo CoASH.

AG sintasa S-CO-CH2-COOCys

CoASH CoASH S-CO-CH3 -Cetocido CO-CH2-CO-CH3

A continuacin se produce la condensacin de Acetilo y Malonilo, y consecuentemente la prdida el CO2 que haba sido incorporado por Acetil-CoA carboxilasa, creciendo la cadena en 2C. El producto restante es una molcula de -Ceto-cido, que queda unida al SH del resto de Fosfopantetena. La descarboxilacin del Malonilo proporciona la energa necesaria para la formacin del nuevo enlace covalente (que a su vez proviene de un ATP). Entonces se produce la reduccin del grupo Ceto del -Cetocido. En primer lugar es reducido a CHOH a expensas de dos NADPH que va a ser oxidado. A continuacin se forma un doble enlace 141

liberdose una molcula de agua, y finalmente el doble enlace se reduce a enlace sencillo a expensas de otros dos NADPH. Todo ello sucede estando el grupo unido al resto de Fosfopantetena. Finalmente, este grupo va a ser transferido a Cys-SH de la enzima. S-CO-CH2-CO-CH3 2 NADPH 2 NADP+ S-CO-CH2-CHOH-CH3 H2O S-CO-CH CH-CH3 2 NADPH 2 NADP+ Cys-S-CO-CH2-CH2-CH3 Butiril-Enzima Este proceso biosinttico necesita la captacin de electrones, que son cedidos por NADPH. Aqu la ruta de las Pentosas fosfato adquiere una gran importancia, pues es capaz de proporcionar este NADPH. Por ello podemos considerar como los dos precursores de AG a Acetato (Acetil-CoA) y NADPH. En esta primera ronda hemos obtenido una molcula de cido Butrico (AG de 4C) unido a la enzima. Sin embargo, esta cadena puede seguir creciendo por consecutivas repeticiones del conjunto de reacciones, que comenzara por la unin de un nuevo resto de Malonil-CoA en el resto de Fosfopantetena libre. Tras su condensacin y reduccin se obtendr un AG de 6C, y as sucesivamente. El AG crece de 2C en 2C, lo que explica que los AG tengan nmero par de carbonos. El producto final de la sntesis de AG en Animales es cido Palmitito, y sin embargo, en Procariontes es Palmitoil-CoA. En la superficie de la enzima, el AG puede alargarse como mximo en 16C, y finalmente es liberado de ella por hidrlisis, por accon de una actividad enzimtica especial. Existen, sin embargo, en las clulas abundantes AG distintos, como por ejemplo Esterico (18:0) u Oleico (18:1, 9). Este ltimo destaca entre los mono-insaturados. Van a existir en las clulas mecanismos de modificacin de los AG endgenos (Palmtico), tanto de elongacin como de desaturacin. En el caso de la elongacin, sucede en Mitocndrias y Retculo Endoplsmico. El AG va a ser prolongado mediante sucesivas adiciones de Malonil-CoA (recordemos que es la forma activa de Acetil-CoA en sntesis de AG), y su consiguiente descarboxilacin por un proceso muy similar al de AG sintasa.

142

Para la desaturacin entran en accin las enzimas Acil-CoA desaturasas, asociadas a la membrana del Retculo Endoplsmico, que median una reaccin de oxidacin. Necesita un mecanismo de transporte de electrones que se encuentra de hecho asociado tambin a la membrana del Retculo Endoplsmico. Los animales somos incapaces de introducir desaturaciones por debajo del carbono 9 desde el 16, y carecemos de AG endgenos 3 y 6, importantes como vitaminas y para la membrana celular, y exclusivos de vegetales. La biosntesis de AG, a pesar de poder acumular toda la Glucosa en exceso, esta sin embargo sometido a una regulacin especial, centrada especficamente en la enzima Acetil-CoA carboxilasa, formadora del esencial Malonil-CoA. Esta enzima es activada por Citrato, y cuando sus niveles son bajos no hay sntesis de AG. En niveles altos, indica una fortsima actividad del ciclo TCA y de la Gluconeognesis, por lo tanto altos niveles de Glucosa, de aporte de Acetil-CoA y de OA -, activndose la sntesis de AG. Es en cambio Inhibida por Acil-CoA, producto final de esta Biosntesis: se trata de un sistema de Retroinhibicin. 3 Va del Citrato: Como vimos los precursores necesarios para esta Biosntesis son Acetil-CoA, que cede tomos de carbono, y NADPH, que cede los electrones necesarios para la reduccin. Sin embargo, la membrana interna mitocondrial es impermeable al Acetil-CoA formado a partir del Piruvato en el interior mitocondrial, y la sntesis ocurre en el Citosol. Para la biosntesis de AG, Acetil-CoA debe salir de la mitocondria por una va indirecta: la Va del Citrato. Se trata de un sistema de transporte especfico para cidos Tricarboxlicos que permite el transporte de Acetil-CoA sin gasto neto de Citrato.

Int. Mitocondria Oxalacetato Acetil-CoA

Citosol Piruvato Mbr. CO2 Int. Malato MitoconOxalacetato drial Citrato Acetil-CoA

Citrato

143

La primera reaccin, que sucede en el interior mitocondrial, es propia del ciclo TCA. Condensa en Citrato Acetil-CoA + OA -. El Citrato puede atravesar la membrana mitocondrial y salir al citosol. En el Citosol tiene lugar la reaccin catalizada por Citrato liasa, que escinde de nuevo el Citrato en OA - y Acetil-CoA, de tal manera que esta ltima puede incorporarse a las rutas de sntesis de AG. Esta reaccin debe hidrolizar una molcula de ATP en ADP + Pi, para formar el enlace de elevado contenido energtico entre CoA-SH y Acetato. El Oxalacetato restante va a transformarse primero en Malato, y finalmente en Piruvato por accin respectiva de las enzimas Malato dh, que oxida un NADH para reducir OA -, y Malato dh NADP+ dep, que reduce un NADP+ para descarboxilacin oxidativa de Malato. En NADPH procede generalmente de la Ruta de las Pentosas, pero puede de hecho proceder tambin de la Enzima Mlica (Malato dh NADP+ dep) gracias a esta va. De hecho, los NADPH con electrones cedidos a la sntesis de AG suelen provenir de la oxidacin del Malato a Piruvato, que provienen a su vez de un NADH:
-

OA-

OOC-CO-CH2-COONADH + H+

NAD+ OOC-CHOH-CH2-COOMalato NADP+ CO2 NADPH + H+

-

OOC-CO-CH3

Piruvato A su vez, el NADH del Citosol proviene de la Gliclisis, es decir, que dichos electrones provienen de la Glucosa de la dieta. Podemos deducir entonces que, aunque indirectamente, los dos precursores para la sntesis de AG provienen en realidad de la Glucosa Va Gluclisis. Encontramos aqu una estrecha relacin entre Metabolismo de Hidratos de Carbono y Metabolismo de Lpidos. 4 La Biosntesis de Triglicridos: Los precursores, AG y Glicerol, provienen de la Glucosa como acabamos de ver (Glicerol proviene de DHAP). Esta biosntesis sucede tambin en el Citosol de las clulas. Algunas enzimas implicadas estn asociadas a la Membrana del Retculo Endoplsmico. Glicerol va a sufrir tres acilaciones sucesivas (en cada grupo OH por una unin ester) formndose el Triglicrido. En un primer paso, DHAP es transformado por reduccin en Glicerol-3-P, en una reaccin reversible, y a expensas de un NADH, por accin de Glicerol-3-P dh. A continuacin Glicerol-3-P sufre la primera acilacin en su C 1, a expensas de un Acil-CoA, gracias a Glicerofosfato acil-transferasa, 144

liberndose CoASH. El producto es un Lisofosfatidato. Acto seguido, Lisofosfatidato acil-transferasa introduce en 2 un segundo AG transportado en forma de Acil-CoA, formndose Fosfatidato. Antes de la tercera acilacin, debe tener lugar la hidrlisis del P de posicin 3, catalizada por Fosfatidato fosfohidrolasa. El resultado es un Diglicrido, precursor tanto de TG como de Fosfolpidos (PL). De esta manera, por ltimo, Diglicerido acil-transferasa cataliza la esterificacin del tercer AG de Acil-CoA, formndose as finalemente el TG. CH2OH-CO-CH2OPO32NADH + H+ CH2OH-CHOH-CH2OPO3 Acil-CoA R1-COO-CH2-CHOH-CH2OPO3 Acil-CoA R1-COO-CH2-CH2-CH2OPO3 COO R2 H2O R1-COO-CH2-CH2-CH2OH COO R2 Acil-CoA R1-COO-CH2-CH2-CH2-OOC-R3 COO R2 Las dos primeras enzimas Acil-transferasas introducen especficamente los AG en la posicin que les corresponde. Glicerofosfato at selecciona adems especficamente AG saturados, especialmente cido Palmtico. Lisofosfatidato at suele introducir AG insaturados. De tal manera que prcticamente todos los TG y PL endgenos de las clulas animalespresentan sus posiciones 1 y 2 esterificadas respectivamente con un AG saturado y un AG insaturado. Sin embargo se encuentran excepciones como los PL de las glndulas mamarias, o los Fosfatidil Colina del material de recubrimiento alveolar, fundamental para los intercambios gaseosos: presenta cido Palmtico tanto en 1 como en 2. 5 Biosntesis de Fosfolpidos a partir de Diglicridos: Adems de DG, esta sntesis (cuyos procesos son poco conocidos) necesita utilizar Bases Nitrogenadas como precursores. En primer lugar, la base es fosforilada a expensas de ATP. A contiuacin tiene lugar la activacin de la Base por CTP, de forma que su fosfato puede esterificarse en el carbono 4 del DG, formndose finalmente el PL. CoASH
222-

NAD+ CoASH CoASH

Pi

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Cabe destacar las similitudes entre Fosfatidil Colina, Serina, y Etanolamina, tanto que de hecho PC y PE slo se distinguen en tres grupos metilo, y PS y PE por un grupo carboxilo. Existen multitud de interrelaciones metablicas entre estos tres PL mayoritarios. PE puede transformarse en PC por metilacin directa. Sadenosil-metionina (Metionina activada) es el donador universal de grupos metilo. PE puede transformarse tambin en PS, por un intercambio de la Base completa, mientras PS puede pasar a PE por simple descarboxilacin. 6 Biosntesis de Colesterol a partir de HMG-CoA: Esta sntesis tiene tambin lugar en el Citosol celular. Sus precursores son Acetil-CoA y electrones provenientes del NADPH. De hecho, en las primeras etapas de su formacin, las reacciones que tienen lugar y enzimas implicadas son idnticas a las de la sntesis de Cuerpos Cetnicos: esto es as hasta la formacin de HMG-CoA (-Hidroxi--metil-Glutaril-CoA). En este caso, HMG-CoA va a ser reducido por HMG reductasa, formandose Mevalonato, a expensas de NADPH y liberandose CoASH. Este encima es de las ms importantes de esta ruta, y est sometida a una fuerte regulacin. HMG-CoA CoAS-CO-CH2-COH-CH2-COOCH3 NADPH + H+ HOH2C-CH2-COH-CH2-COO CH3
-

CoASH + NADP+

Mevalonato A continuacin, el cido Mevalnico va a ser fosforilado a la forma de PPi, a expensas de 2 ATP. Finalmente va a ser descarboxilado dando lugar al Isoprenil PP, precursor directo de todos los esteroides. Mevalonato HOH2C-CH2-COH-CH2-COO CH3 2 ATP O63-P2-O-CH2-CH2-COH-CH2-COOCH3 CO2 Isoprenil PP
-

2 ADP Mevalonil PP

146

O63-P2-O-CH2-CH2-C CH2 CH3 A continuacin tiene lugar la condensacin de varias unidades de Isoprenil PP, y toda una serie de reacciones Metablicas que desembocan en la formacin del primer y fundamental esteroide: Lanosterol. A partir de este se pueden obtener todos los otros esteroides. Por ejemplo, para la formacin de Colesterol deben sucederse otras 20 reacciones ms.

Principales pasos de Biosntesis del Colesterol y otros Esteroides

7 Regulacin de HMG reductasa: La regulacin de esta enzima tiene de Nuevo lugar a dos niveles distintos. Para empezar es regulada por su cantidad en sangre. De hecho, cuando la dieta es rica en colesterol, la sntesis de esta enzima queda bloqueada. Por otro lado la enzima presente en clulas en un momento dado puede regular su actividad por dos vas distintas: 147

Niveles intracelulares de Mevalonato, compuesto que inhibe a la enzima. Regulacin por modificacin covalente de HMG reductasa inducida por hormonas. En este ltimo caso, la regulacin es anloga a la de muchas otras encimas, y se produce por fosforilacin/desfosforilacin. HMG reductasa kinasa puede fosforilar la enzima a expensas de ATP, volvindola inactiva. Las Fosfoprotenas fosfatasas desfosforilan por hidrlisis (con consumo de H2O) a la enzima devolvindola a su forma activa. HMG reductasa kinasa es a su vez fosforilada por otras kinasas; entre ellas encontramos las kinasas cAMP dependientes. Adems las Fosfoprotenas fosfatasas son tambin las mismas que actuan en el metabolismo del Glucgeno: La fosforilacin de enzimas suele inhibir los procesos Biosintticos y favorecer los Degradativos.

IV/ Metabolismo Nitrogenados:

de

los

Compuestos

148

A/ METABOLISMO DE DEGRADACIN DE AMINOCIDOS:

1 Generalidades sobre el metabolismo general de los Aminocidos: El conjunto de aminocidos del organismo reciben el nombre de aa pool, y pueden tener dos procedencias distintas: de la dieta, o endgenos (de protenas endgenas). ESQUEMA GENERAL Tubo digestivo Proteinas Aminocidos Esqueleto carbonado NH4+ Purinas Pirimidinas Porfirinas Aminas ADN ARN Protenas endgenas aa pool Urea Aparato excretor

Propionil-CoA

Acetil-CoA; Acetoacetato; Piruvato; -Cetoglutarato; Succinil-CoA; Fumarato; OA-

La principal misin de los aa en nuestro organismo es la de servir como precursores para la biosntesis de Protenas. Adems, son la principal fuente de Nitrgeno de la mayora de organismos. Sin embargo, a diferencia de las grasas, la concentracin de protena permanece constante en el organismo, por lo que la mayor parte de los aa de la dieta deben ser metabolizados y utilizados como precursores para otras sntesis, o excretados. Como rutina diaria, una persona adulta suele recambiar (tanto degradar como sintetizar) unos 400 g de protena. De tal manera, los aminocidos de la dieta sirven tanto como precursores para compuestos nitrogenados (Naranja) gracias a los grupos amino, cmo como intermediarios del metabolismo central (azul) gracias al esqueleto carbonado. El nitrgeno en exceso tiende a formar amonaco (NH 4+); un compuesto altamente txico para las clulas que ser excretado. 2 Digestin de Protenas de la dieta: La primera etapa tiene lugar en el estmago. Determinadas clulas liberan Pepsingeno; una proteasa en forma inactiva o Zimgeno. Esta es activada en el estmago por una modificacin covalente facilitada por hidrlisis, formndose Pepsina, su forma activa. La pepsina ataca a las protenas ingeridas en la dieta, rompiendo ciertos enlaces peptdicos (hidrlisis parcial), transformndola en peptidos de tamaos variados y algunos aa libres.

149

La segunda etapa comienza cuando el alimento alcanza el intestino delgado. Ah se produce la hidrlisis completa de los resto de protena en sus aminocidos constituyentes. Esta hidrlisis es mediada por una Batera de proteasas producidas por el Pncreas; Tripsingeno/Tripsina, Quimiotripsingeno/Quimiotripsina, Proteoelastasa/Elastasa y Procarboxipeptidasa/Carboxipeptidasa, adems de otras protenas dedicadas a la digestin de otros compuestos. Estas protenas son secretadas en forma de Zimgenos (Ver Parte I; IV/A/3), pues de nos ser as digeriran las clulas del tejido pancretico. Cuando sucede, se puede producir panceatitis aguda, acompaada de hemorragias y fuertes dolores. En slo 12 horas el pncreas es digerido a lquido. Adems las protenas hidrolizadas pueden pasar a la sangre y extenderse por mltiples tejidos. 3 Desaminacin de los aminocidos: Como hemos visto, la mayor parte de estos aa van a ser catabolizados en rutas oxidativas. La degradacin tiene lugar en dos etapas fundamentales: 1. aa es desaminado, produciendo Amoniaco y Esqueleto Carbonado. La mayor parte del Amoniaco, txico, ser excretado. Una parte ser utilizada en rutas de Biosntesis de Compuestos nitrogenados. 2. El Esqueleto Carbonado es metabolizado de tal manera que puede incorporarse a las rutas centrales del metabolismo intermediario, siendo finalmente transformado en CO 2, H2O y energa celular, o sirviendo como precursor para formar Glucosa FORMAS MS ESTABLES DEL AMONIACO Gaseoso Acuoso NH3 + H2O NH3 NH4+ + OH-

Existen varias reacciones de desaminacin. Entre ellas, la primera en todos los aa, salvo Lys, Arg, y Tre, es una Transaminacin facilitada por una enzima transaminasa (aminotransferasa) que utiliza como coenzima Piridoxal-P. Se produce, en concreto, la transferencia del grupo amino del aa a un -cetocido resultando el -cetocido del aa y el aa del -cetocido. Se trata de una reaccin perfectamente reversible (K = 1). Piridoxal-fosfato es un P compuesto fundamental en transaminasas, y tiene un importante papel como coenzima en el metabolismo, destacable en el de

150

aminocidos. Adems, forma junto con Piridoxina y Piridoxamina la Vitamina B6. Las transaminasas presentan un centro activo con dos localidades claramente diferenciadas para el aa y el -cetocido. La mayor parte de este tipo de enzimas son de hecho especficas para el par -Cetoglutarato/ Glutamato. De hecho, la mayor parte de lo aa se transaminan con Cetoglutarato, de manera que la mayor parte de los grupos amino de los aa en exceso van a aparecer como constituyente grupo amino de Glu.
-

OOC-CH-NH3+ + -OOC-CH2-CH2-CO-COOR1 -Cetoglutarato

-

OOC-CO-R1

COO+ -OOC-CH2-CH2-CH-NH3+ cido Glutmico

La consecuencia de esto es que todo el exceso de aa de la dieta se van a traducir en la aparicin de esa misma cantidad de cetocidos (esqueletos carbonados de los aa) y de Glutamato. Este aa posee una importante funcin aparte de ser parte constitutiva de protenas: Recoge el exceso de Nitrgeno Amnico de los aminocidos, transportndolo hasta una segunda reaccin de desaminacin de manera a introducirlo en el Ciclo de la Urea. La segunda reaccin de desaminacin es, de hecho, la desaminacin oxidativa del Glutamato. Esta reaccin, catalizada por Glutamato dh, es perfectamente reversible (K = 1). Reduce NAD(P) +. El sentido de la reaccin depende fundamentalmente de las concentraciones de reactivos y productos. Sus productos son Amoniaco y -Cetoglutarato. En Eucariontes, esta enzima est presente en Mitocondrias y en el Citoplasma. COOOOC-CH2-CH2-CH-NH3+ NAD(P)+ H2O
-

NAD(P)H + H+ OOC-CH2-CH2-CO-COO- + NH4+

PAPEL CENTRAL DEL GLUTAMATO EN EL METABOLISMO DE COMPUESTOS NITROGENADOS: aa Transaminasa -Cetoglutarato Glu Glutamato dh -Cetocido Gln CICLO DE LA UREA 151 NH4+

Entre otras funciones, Glu sirve como precursor en la sntesis de Glutamina (Glu), por unin de Amoniaco cuyo enlace de alta energa requiere la hidlisis de un ATP, gracias a la enzima Glutamina sintetasa. La reaccin inversa es catalizada por otra enzima, la Glutaminasa, que cataliza la hidrlisis del enlace amida.
-

COOH2O + ATP ADP + Pi COO+ + OOC-CH2-CH2-CH-NH3 + NH4 NH2-CO-CH2-CH2-CH-NH3+ H2O

En los anlisis de sangre, los niveles de transaminasas suelen ser tenidos en cuenta. En altos niveles puede provocar degeneracin e inflamacin hepticas. Se miden en concreto las dos transaminasas ms abundantes, GPT (Glutamato-Piruvato transaminasa) y GOT (Glutamato-OA- transaminasa), que transaminan, con el par Cetoglutarato/Glutamato, la Ala formando Piruvato y el Asp formando OA- respectivamente. Cada aminocido, despus de desaminarse, tiene una ruta degradativa particular de forma que su esqueleto carbonado es transformado en un compuesto que puede incorporarse al metabolismo intermediario central, para formar energa o como precursor. 4 Eliminacin del Amoniaco en exceso consumido por los organismos: En funcin de los organismos, existen tres sistemas de eliminacin de este txico compuesto. Los ms complejos estn relacionados con adaptaciones a ambientes terrestres, donde la prdida de agua debe ser minimizada. Seres Amoniotlicos: Se trata fundamentalmente del sistema utilizado por los microorganismos (seres constitudos por una o pocas clulas) y por aquellos seres que habitan en entorno acuoso. Eliminan el amoniaco como directamente al medio. Seres Ureotlicos: Muchos vertebrados. El amoniaco se transforma en Urea. Seres Uricotlicos: Aves y algunos Reptiles. El amoniaco se transforma en cido rico. El mecanismo mejor estudiado es el que se corresponde con el humano: Urotlico, por lo que nos centraremos en la biosntesis de Urea. La sntesis de Urea tiene lugar en el hgado. De ah, es cedida a la sangre de manera que finalmente es recogida por los riones y eliminada en la orina. Por lo tanto, todo el exceso de N amnico que debe ser eliminado debe para comenzar llegar hasta el hgado.

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Salvo el msculo, la mayor parte de nuestros tejidos transaminan el exceso de los aa a Glu, y este va a ser transformado en Gln a expensas de otra molcula de amoniaco gracias a Glutamina sintetasa. La Glutamina es el aa con capacidad de transporte del NH4+ desde la mayor parte de los tejidos hasta el hgado, a travs de la sangre. Una vez en el hgado, la accin sucesiva de Glutaminasa y Glutamato dh origina 2 NH4+ y -Cetoglutarato. En el caso del msculo, existe una gran cantidad de Piruvato producido por la oxidacin de glucosa en la Gliclisis. En este tejido, los aa suelen transaminarse con el par Piruvato/Ala. Al igual que Gln, Ala es un aminocido neutro capaz de transportar hasta el hgado el N amnico.

Una vez el el hgado, Ala se transamina con el -Cetoglutarato formndose de nuevo Glu y piruvato. Finalmente, por accin de Glutamato dh, el amoniaco termina encontrndose tambin libre en el hgado, donde va a ser metabolizado para que pueda ser excretado posteriormente. El NH4+ libre del hgado ser metabolizado en el Ciclo de la Urea: este ciclo fue tambin descubierto por Krebs, antes que el ciclo TCA. 5 El Ciclo de la Urea: Este ciclo comienza en la mitocondria heptica, y termina en el Citosol. La Urea formada puede ser transportada hasta los riones a travs de la sangre. En primer lugar acta bicarbonato (CO2 + OH- HCO3-), que va a quedar fosforilado a expensas del Pi de un ATP y aminado a expensas del Amoniaco libre del Hgado. Se hidroliza otro ATP que aporta la energa necesaria para estos energticos enlaces. La enzima intramitocondrial implicada en esta relacin es Carbamoil-fosfato sintetasa I. A continuacin, Ornitina transcarbamilasa transfiere el resto Carbamoil-P al -aa no proteico Ornitina (muy similas a Lys), formndose as L-Citrulina. Citrulina es transportada, con el Amoniaco que antes se encontraba libre, hasta el citosol de la clula heptica. En el Citosol, Citrulinava a condensarse con un Asp a traves de su grupo -amino, por accin de Arginosuccinato sintetasa, 153

producindose el Arginosuccinato, a expensas de un ATP el cual se hidroliza en AMP + PPi, y luego PPi en 2 Pi. Arginosuccinato es hidrolizado por accin de Arginosuccinasa, produciendo Fumarato (esqueleto carbonado de Asp) por un lado, y Arginina (Arg). Este ltimo aa proteico contiene de hecho 4 grupos Amina: uno es su grupo -amino, un segundo facilita la unin del Grupo Guanidio (CN3H5+) con el esqueleto carbonado, otro proviene del amoniaco libre, y el tercero procedente de Asp; estos dos ltimos van a ser excretados. El Fumarato formado va a ser transformado por las reacciones propias del TCA en OA-, de forma que este se transamina con Glu para dar Asp de nuevo. Por lo tanto, esta segunda amina procede en realidad tambin del Glutamato, aunque no por la desaminacin de Glutamato dh. La Urea aparece en la ltima reaccin de Hidrlisis del Carbono Arg catalizada por Arginasa. Se produce la hidrlisis del grupo Guanidio entre el nitrgeno integrado en el esqueleto carbonado y el Carbono constituyente. El resultado son Urea y Ornitina. La Urea pasa al torrente sanguneo. La Ornitina va a ser transportada al interior de la mitocondria heptica, quedando as el ciclo cerrado. 6 Descarboxilacin de aminocidos: Las reacciones de Descarboxilacin de aminocidos son muy importantes para su utilizacin como precursores en rutas de Biosntesis de Aminas de destacable importancia Fisiolgica. Cada descarboxilacin est catalizada por una enzima descarboxilasa especfica, que utiliza como coenzima Piridoxal-P, dando lugar a las correspondientes aminas de potentsimo efecto fisiolgico. Hys es transformado en Histamina, potente vasodilatador relacionado con los procesos de Alergia. Trp es transformado en Serotonina, importantsimo neurotransmisor relacionado con las sensaciones de Tristeza, Ansiedad y Bienestar. En un primer paso, es Hidroxilada por Hidrolasa, y a continuacin descarboxilada. Prozac es un frmaco que acta inhibiendo la unin de Serotonina en sus receptores.

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H2O

CO2

Tyr es transformado, por carboxilacin previa hidroxilacin, en una serie de aminas muy importantes como son Noradrenalina y Adrenalina, y neurotransmisores como Dopamina (neurotransmisin adrenrgica). Dopamina es un NT relacionado con sensaciones de Placer y Jbilo. Se piensa que est relacionada con la adiccin a las drogas, y que en bajos niveles puede estar relacionada con el Parkinson.

H2O

CO2

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Glu se transforma en Aminobutrico (GABA).

Tanto Glu de por s como GABA son importantes NT: Glu es un NT excitante, mientras GABA inhibe la transmisin de ciertos impulsos nerviosos. El Glutamato monosdico, sintetizado a nivel industrial va fermentacin por microorganismos, potencia de forma sinrgica el sabor de los alimentos. Se utiliza como componente de Sopas preparadas, Avecrem, salsa de Soja En oriente este compuesto es muy utilizado. Ajinomoto es una sal que es muy comn en pases orientales, como china, desde que fue fabricada industrialmente por primera vez, por una empresa japonesa. Recibe el nombre de sndrome del Restaurante chino a toda una serie de alteraciones metablicas que afectan al sistema nervioso central. El exceso de Glu, por su accin como NT, excita las neuronas produciendo nerviosismo y en algunos casos dolor de cabeza. 7 Metabolismo del Propionil-CoA: Propionil-CoA es un metabolito de tres puede resultar tanto de la degradacin del los aminocidos, como de la -oxidacin de es un producto minoritario ya que en metabolismo trabaja con nmeros pares de producto es Acetil-CoA. tomos de carbono, que esqueleto carbonado de AG. En este ltimo caso la mayora de AG el tomos de carbono y el

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Una serie de dos reacciones va a permitir la entrada de estos compuestos carbonados en el metabolismo intermediario central, gracias en concreto a su transformacin en Succinil-CoA.

2 1
Esqueleto carbonado de aa

En primer lugar, Propionil-CoA sufre una carboxilacin a expensas de un ATP, catalizada por Propionil-CoA carboxilasa + coenzima Biotina. El resultado, Acetil-Malonil-CoA (Metilmalonil-CoA) es sometido a una isomerizacin catalizada por una enzima Mutasa, que utiliza como coenzima Vitamina B12 (covitamina de estructura muy compleja). Sorprendentemente, es capaz de cambiar de lugar, selectivamente, un tomo de C y uno de H. La carencia de Vitamina B12 es una patologa frecuente conocida como Anemia perniciosa. El motivo de esta carencia es la ausencia de Glicoprotenas que transportan esta vitamina a travs de las clulas intestinales: las Transcobalaminas. Esta vitamina es un compuesto bioqumico de alta importancia metablica. Por lo comn una persona presenta 1,8 g en su cuerpo. Para tratar la anemia, se debe alimentar frecuentemente el hgado con fuertes dosis de Vitamina B12.

B/ METABOLISMO DEL FRAGMENTO MONOCARBONADO:

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1 Generalidades sobre el metabolismo del Fragmento Monocarbonado: El Fragmento Monocarbonado (FMC) es el metabolito de un solo tomo de Carbono de menor estado de oxidacin que CO 2. Tiene una gran importancia en el metabolismo de Compuestos Nitrogenados, pues sirve como precursor en mtiples vas de Biosntesis (sntesis de Aminocidos, sntesis de Bases Nitrogenadas). Principales Fragmentos Monocarbonados (de menor a mayor estado de oxidacin) Mximo estado de oxidacin del Carbono. Grupo Metilo Metileno Metilideno Aldehdo Cetnico Dixido de Carbono (inorgnico) Frmula -CH3 -CH2-CH-CHO -COCO2

No se trata de una carboxilacin comn, a expensas de dixido de carbono, sino que se trata de la adicin de un carbono de un metabolito orgnico de menor estado de oxidacin que el primero. Gran parte de las reacciones de este conjunto estn catalizadas por enzimas que utilizan como coenzima la forma reducida del cido Flico, cido Tetrahidroflico (FH4 / N5N10 Metilen FH4), y sus derivados: Los Folatos. Estos compuestos se encuentran en especial abundancia en verduras de color verde, como las acelgas y espinacas. Su deficiencia conduce a Anemias con debilidad. Es especialmente peligroso en mujeres encinta, pues puede conducir en deficiencias en el hijo. La forma Reducida FH4 es la ms importante por su funcin de Coenzima, capaz de transportar los FMC. Los dobles enlaces entre los carbonos 5 y 6 y los carbonos 7 y 8 quedan reducidos por la unin de cuatro tomos de H. La parte ms importante en la transferencia de FMC son los elementos N 5, C 9, y N 10.

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N5N10 Metilen Tetrahidroflico 2 Origen del Fragmento Monocarbonado: FMC encuentra su origen en el aa Ser, en forma Metileno, gracias a la reaccin ms importante del metabolismo del FMC. Est catalizada por Serina hidroximetil transferasa + coenzima Piridoxal P. Se transfiere el grupo Metileno de Ser (carbono ) quedando Glicocola, al FH4 en sus N5 y N10 formando N5N10 Metilen Tetrahidroflico, en una reaccin perfectamente reversible que puede suceder tanto en uno como en otro sentido. El Metileno puede reducirse a Metilo gracias a expensas de NADH, quedando solamente unido a N5, formando N5 Metil Tetrahidroflico. De tal manera el Metilo puede ser empleado como precursor para Metionina. Este aminocido activado se transforma en Donador Universal de Grupos Metilo. Por otro lado, el Metileno de FH 4 puede servir como precursor de Timina, fundamental en el metabolismo del ADN. Adems puede oxidarse por una dh NAD+ dep transformndose en Metilideno (de mximo estado de oxidacin, igual que aldehdo y Ceto), y formndose as N5N10 Metiliden Tetrahidroflico. Los FMC ms oxidados suelen servir como precursores para Bases Nitrogenadas Pricas. 3 La Metionina como Donador Universal de grupos Metilo: Durante la activacin de la Metionina, se une a su S (formando un grupo Sulfonio S+) el Nuclesido Adenosina, proveniente de un ATP. PPP se hidroliza a PPi + Pi, y a continuacin a 3 Pi. Dicha energa es empleada para la formacin de este inestable compuesto, gracias tambin a la accin enzimtica. Se forma as S-Adenosil Metionina: Una molcula extraordinariamente inestable, con altsima tendencia a ceder el grupo Metilo que se encuentra unido al S de Met. Adenina S-Adenosil Metionina

Metionina Ribosa

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A partir de este compuesto se producen las reacciones de Metilacin del metabolismo. La metilacin de un aceptor produce SAdenosil Homocistena y Aceptor-CH3. La posterior escisin espontnea de Adenosina forma el aminocido Homocys: el grupo metilo extremo de Met ha sido transferido de manera que se forma este aa, similar a Cys pero con un carbono ms. Altos niveles de Homocys son perjudiciales para el organismo, ademas Met debe ser recuperado. Aqu entra en accin N 5 Metil Tetrahidroflico, que cede por metilacin el FMC para esta reaccin, recuperndose Met, en la reaccin catalizada por Homocys-FH4 metil transferasa + coenzima Vit B12. La acumulacin de Homocys puede desencadenar potentes enfermedades cardiovasculares, y su relacin con el Alzeimer est casi demostrada (lesin de vasos sanguneos cerebrales). Deben administrarse Folatos y Vit B12. 4 Biosntesis de Aminocidos: Los microorganismos procariontes son capaces de biosintetizar todos los aminocidos proteicos a partir de sales Amoniacales o Amoniaco. Los animales no podemos sintetizar todos. Los Aminocidos Esenciales son aquellos que deben ser recibidos en la dieta, y son distintos en cada especie. La variedad de la dieta es muy importante por los aa esenciales. Cada aa tiene su va de sntesis particular. Las Familias Biosintticas de aa son grupos de aa que son sintetizados a partir de un mismo precursor, como OA-, PEP, o 3-Fosfoglicerato (la mayora de ellos son hidratos de carbono del metabolismo intermediario central). Los piensos para animales deben ser preparados por ello con el conjunto de los 20 aa proteicos. Los Piensos Compuestos se forman con varias materias primas todas ellas distintas. Por ejemplo, un pienso 100 % trigo carece de Lys. 5 Biosntesis de Nuclesidos Pricos: Los principales precursores de los Nuclesidos es la Ribosa-5-P y las Bases Nitrogenadas, obtenida en la va de las Pentosas, y las Bases Nitrogenadas. La Ribosa debe ser primero activada, para poder unirse a continuacin a su Base Nitrogenada. Para ello se produce la reaccin catalizada por Ribosa-5-P pirofosfokinasa, durante la cual se produce la unin en C 1 del PPi (liberandose AMP). El producto es la Ribosa activada, 5-Fosforribosil-1-PP (PRPP). A partir de aqu se construye, elemento por elemento, el anillo de la Base Prica. Varios precursores reaccionan uno detrs de otro, contruyendo el anillo: Amina de Asp CO2 Gly

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N10 Formil FH4 FH4 Amidas de Gln

N10 Formil

El producto final de la sntesis de una Purina sobre la ribosa es IMP; Inopina Mono Fosfato (unida por su N9). Este producto ser transformado por otra serie de reacciones en AMP y GMP, Nuclesidos esenciales para ARN y ADN. N1 procede en concreto de Asp por una reaccin idntica a la que sucede en el Ciclo de la Urea.

6 Biosntesis de Nuclesidos Pirimidnicos: A diferencia del caso anterior, aqu se sntetiza la Base Pirimidnica de manera independiente a la Ribosa activada, y finalmente las dos molculas son unidas. Los precursores son CO 2, Gln y Asp.

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Para comenzar se produce la sntesis de Carbamoil-P por accin de la enzima citoplasmtica Carbamoil-fosfato sintetasa II, anloga a Carbamoil-fosfato sintetasa I intramitocondrial del Ciclo de la Urea. Utiliza en lugar de Amoniaco libre el grupo amino de Gln, y un CO 2, formando Carbamoil-P. A continuacin, Aspartato-Carbamoil transferasa une en forma de anillo ambas molculas, formando finalmente la Pirimidina y un Pi libre: el cido Ortico. Su correcto procesamiento metablico da lugar a Uracilo UMP, que va a ser fosforilado por dos ATP en UTP, pudiendo entonces ser transformado, a expensas de la amina de Gln y un ATP, en CTP. 7 Biosntesis de Desoxirribonucletidos: Su sntesis utiliza un Ribonucletido difosfato o trifosfato como precursor. Este va a ser transformado en su desoxirribonucletido por accin de Ribonucletido reductasa. La sntesis de Timina se inicia en desoxi-UMP, que va ser transformada en dTMP por Metilacin a expensas de N 5N10 Metilen FH4, donador universal de FMC, gracias a la enzima Timidilato sintasa.

N5N10 Metilen FH4 Gly Ser

FH4 NADP+

FH2 NADPH

Serina hidroximetil reductasa

Dihidrofolato reductasa

El conjunto absoluto de estas reacciones es imprescindible para la sntesis y el metabolismo de ADN y ARN, siendo la nica va de formacin de algunos nucletidos como Timina. El descubrimiento de esta ltima va ha sido fundamental para el desarrollo de Quimioterpidos Anticancergenos. Los blancos de estos frmacos son Inhibilato sintasa y Dihidrofolato reductasa.

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Inhibiendo la sntesis de Timina se puede refrenar el crecimiento tumoral y eliminar a las clulas cancergenas. Para el tratamiento de leucemias infantiles pueden suelen ser tratadas con la presencia de Metotexato en dosis letales durante varias horas. Este compuesto es un anlogo de los Folatos, que inhibe la accin de Dihidrofolato reductasa. Para la recuperacin del paciente se debe introducir altsimas dosis de Timina y/o derivados del cido Flico. 8 Catabolismo de Nuclesidos: El catabolismo de Nuclesidos es un proceso comn para todos los compuestos de esta naturaleza. Tiene lugar en tres principales pasos: 1. Desaminacin de la BN. 2. Eliminacin del resto Ribosa-P. 3. Degradacin de los productos carbonados. En humanos, el producto final de N de Purinas forma cido rico, y va a ser excretado en la orina. Los altos niveles de cido rico por una alteracin metabolica pueden acumularse en las articulaciones siendo responsable de patologas como Artritis o Gota. Las pirimidinas son metabolizadas de forma que se integran en el metabolismo intermediario central. La ausencia del gen que codifica Adenosina desaminasa conduce a la Inmunodeficiencia severa. Esta patologa responsable de la formacin de gran cantidad de dATP a partir de desoxiadenosina, que por retroinhibicin inhibe a las otras Nucletido reductasa impidiendo la sntesis de los otros Nucletidos Trifosfato. Se traduce en el bloqueo de la sntesis de DNA en Linfocitos, y la muerte de dichas clulas.

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