Anda di halaman 1dari 7

ISOLASI DAN DIGESTI DNA KROMOSOM ISOLATION AND DIGESTION OF CHROMOSOMAL DNA Mukhlissul Faatih Jurusan Pendidikan Biologi

FKIP Universitas Muhammadiyah Surakarta Jl. A. Yani Tromol Pos I Pabelan Kartasura Surakarta Telp. (0271) 717417 ext 171 ABSTRAK solasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam proses rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri DNA, RNA dan substansi dasar lainnya. Ekstrak sel kemudian dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis dinding dan membran sel; (3)Ekstraksi dalam larutan; (4)Purifikasi; dan (5)Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul. Dengan menjalankan prosedur dengan benar akan diperoleh DNA kromosom dan plasmid dengan kemurniannya cukup tinggi, dapat dilihat dari penampakan hasil elektroforesis yang baik. Ketelitian dan kecermatan dalam pelaksanaan penelitian, sangat menentukan hasil kemurnian DNA kromosom dan plasmid. Kata Kunci : Isolasi, purifikasi, digesti, dan DNA. ABSTRACT solation of DNA/RNA is the first step that must be completed in process of genetic engi neering. The basic principal of total DNA/RNA isolation is breaking down and extracting cells components. Cells extract then was further purified, producing pellets which is contain of DNA, RNA, and other substances. DNA isolation has several steps, i.e. (1)cells isolating, (2)cells membrane and wall lysing, (3)extracting, (4)purifiying, and (5)precipitating. Two principal in the DNA isolation are cells centrifuge and precipitate. Centrifugation separates the cells substance due to their molecular weight. Completing this procedures will give a high-pured DNA, showed in the electrophoresist banding results. Keywords : Isolating, purification, digestion, dan DNA.

PENDAHULUAN

komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. DNA memiliki struktur pilinan utas Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua ganda yang antiparalel dengan komponenmacam, yaitu basa purin dan pirimidin.
Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. (Mukhlissul Faatih)

61

Basa purin terdiri atas adenin (A) dan jenis molekul dengan cara memberikan guanin (G) yang memiliki struktur cincingaya sentrifugal sehingga substansi yang ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri lebih berat akan berada di dasar, sedangkan atas sitosin (C) dan timin (T) yang substansi yang lebih ringan akan terletak memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika di atas. Teknik sentrifugasi tersebut guanin berikatan dengan sitosin, maka dilakukan di dalam sebuah mesin yang akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, bernama mesin sentrifugasi dengan sedangkan ketika adenin berikatan dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 timin maka hanya akan terbentuk dua rpm rotation ( per minute ) atau 3000 rpm. ikatan hidrogen. Satu komponen pemIsolasi DNA/RNA merupakan bangunbuilding ( block ) DNA terdiri atas langkah awal yang harus dikerjakan dalam satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan rekayasa satu genetika sebelum melangkah ke pasang basa yang disebut nukleotida.proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi toSebuah sel memiliki DNA yang tal DNA/RNA dari jaringan adalah dengan merupakan materi genetik dan bersifat memecah dan mengekstraksi jaringan herediter pada seluruh sistem kehidupan. tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak Genom adalah set lengkap materi genetik sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi terorganisasi menjadi kromosom. DNA sehingga dihasilkan pelet sel yang medapat diisolasi, baik dari sel hewan, manungandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip sia, maupun pada tumbuhan. DNA maisolasi DNA plasmid hampir sama dengan nusia dapat diisolasi melalui darah. Darah isolasi total DNA/RNA dari jaringan. manusia terdiri atas plasma darah, globulus Langkah pertama untuk mendapatlemak, substansi kimia (karbohidrat, prokan DNA plasmid adalah dengan tein dan hormon), dan gas (oksigen, nitromenumbuhkan sel-sel bakteri yang megen dan karbon dioksida). Plasma darah ngandung plasmid rekombinan. Setelah itu terdiri atas eritrosit (sel darah merah), sel dipanen, dinding serta membran sel leukosit (sel darah putih) dan trombosit dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. (platelet). Komponen darah yang diisolasi Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dengan serangkaian perlakuan sehingga dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi dimana terdapat DNA di dalamnya. DNA DNA yang dilakukan dalam penelitian ini pada tumbuhan juga dapat diisolasi, menurut standar prosedur yang sudah biasa contohnya pada tumbuhan bawang merah dilaksanakan. Homogenisasi sel dengan (Allium cepa ) dan pada pisang Musa ( sp.). prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh Isolasi DNA memiliki beberapa karena proses ini menyebabkan disrupsi sel tahapan, yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis dindan tercucinya komponen-komponen sel ding dan membran sel; (3)Ekstraksi dalam lain selain DNA. Penambahan kloroform larutan; (4)Purifikasi; dan (5)Presipitasi. setelah sentrifugasi memisahkan larutan Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi menjadi fase cair dan padat dimana fase DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presicair merupakan DNA dan fase padat pitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah adalah campuran protein dan DNA. memisahkan substansi berdasarkan berat

62

Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol. 10, No. 1, 2009: 61 - 67

METODE PENELITIAN

sehingga timbul benang-benang halus DNA. Untuk penelitian prosedur isolasi 11. Benang-benang halus DNA diambil DNA jaringan total diperlukan koloni dan dicuci dengan etanol 70% bakteri, Buffer lisis (100 mM Tris HCl, pH 12. Disentrifugasi 12000 rpm, 10 menit, 8; 100 mM NaCl; 50 mM EDTA; 2% supernatan dibuang, pelet dikeringkan. SDS), Proteinase-K, Phenol, Etanol, 13. Ditambahkan TE, hingga volume 200 ml Sedangkan untuk isolasi plasmid dengan diperlukan kultur bakteri, Lysing Langkah kedua adalah prosedur solution 1 (50 mM Glukosa, 25 mM Tris- isolasi DNA plasmid, yaitu: HCl dan 10 mM EDTA, pH 8,0), Lysing 1. Diambil sebanyak 1-2 koloni bakteri solution 2 (0,4 N NaOH dan 2% SDS), dari lempeng agar, dipindahkan Lysing solution 3 (3 M kalium asetat pH 4,8), kedalam tabung yang telah berisi 5 ml LB medium, Trypton, Yeast ekstrak, NaCl, LB-medium dan antibiotik. dan Aquabidest. 2. Digojok kuat-kuat dalam shaker incuo Adapun alat yang diperlukan adalah bator 37C, semalam mikropipet, sentrifus mikro, Eppendorf, 3. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 microtube dan conical tube. menit. Pelaksanaan penelitian dimulai 4. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi prosedur isolasi DNA kromosom, yaitu: dengan 100 ml Lysing solution 1, 1. Bakteri ditumbuhkan pada medium LB, didiamkan dalam es selama 5 menit. 0 digojog pada suhu 37 C,selama 1 malam. 5. Ditambahkan 200 Lysing ml solution 2, 2. 15 ml kultur disentrifugasi 3000 rpm, diinkubasi pada es selama 5 menit. 0 15 menit, pada suhu 4 C. 6. Ditambahkan 150 Lysing ml solution 3, 3. Supernatan dibuang, pada pelet dicampur dengan cara membolakditambahkan 750 l buffer lisis balik-kan, diinkubasi dalam es selama (100mM Tris HCl pH 8,100mM 5 menit. NaCl,50 mM EDTA,2% SDS ), lalu 7. Disentrifus dengan kecepatan 12.000 divortek. rpm selama 10 menit. 4. 10l ( 10 mg/ml) Proteinase-K ditam8. Supernatan diambil dalam filter, pelbahkan. let dibuang. 0 5. Diinkubasi pada suhu 55 C selama9. 30 Ditambah phenol CIAA sebanyak volmenit. ume supernatan, dicampur dengan 6. Disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 vortek 0 rpm, selama 15 menit, pada suhu 4 C.Disentrifugasi dengan kecepatan 10. 7. Dipindahkan supernatannya pada 12.000 rpm selama 5 menit. tabung eppendorf 1,5 ml. 11. Lapisan atas diambil, ditambahkan 8. Kemudian ditambahkan 700 l pheCIAA dengan perbandingan 1:1 (v/v) nol, digojog pelan. 12. Dicampur dengan vortek 9. Disentrifugasi 12000 rpm selama 10 13. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, lapisan atas dipindahkan dalam menit, kemudian lapisan atas diambil tabung eppendorf 1,5 ml. 14. Ditambah 1/10 volume 3M Na asetat, 10. Ditambahkan etanol dingin, perban- dan 2 kali volume ethanol absolut dingan 1:1 (v/v), dicampur pelan-pelandingin.
Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. (Mukhlissul Faatih)

63

15. Dicampur dengan dibolak-balik, pemeriksa. Oleh karena itu selama pengero didiamkan dalam -20 C selama 10 jaan harus mengenakan sarung tangan dan menit. berbicara sesedikit mungkin. 16. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 Buffer lysis dan Proteinase-K disini menit, lalu pellet dicuci dengan ethadipakai sebagai reagen pelisis supaya nol 70% komponen DNA dalam sitoplasma sel bisa 17. Disentrifugasi 12.000 rpm selama keluar 10 dan diisolasi. Phenol digunakan menit untuk mengendapkan komponen protein 18.Pellet dikeringkan, ditambah l, 50 lain yang tidak dikehendaki sedangkan TE DNA dielektroforesis. etanol 70% sebagai pencuci hasil isolasi. Hasil isolasi DNA diperlihatkan dengan di Langkah ketiga adalah melakukan elektroforesis pada agarose gel (gambar 1). prosedur digesti kromosom, plasmid dan pUC19 dengan Eco RI, yaitu: Kromosom, plasmid dan pUC 19 (Konsentrasi 0,5 g/l) 2l Buffer Eco RI 2lEco RI 8 lNuclease Free Water Volume Akhir 20l Campur dengan baik
0 Inkubasi 37 C, 2 jam (Untuk melihat hasil pemotongan dilakukan running )

Line: 1

Gambar 1. Hasil Elektroforesis Gel Agarose (1%) dari Total DNA kromosom.

Keterangan : Line 1 : marker; Line E. 2 : coli ; Line 3 E. : coli ; Line 4 Salmonella : sp.; Line 5 E. : coli ; Line 6 Salmonella : DNA adalah asam nukleat yangsp.; Line 7 E. : coli ; Line 8 Salmonella : sp; mengandung materi genetik dan berfungsi Line 9 Salmonella : sp. untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Dari hasil elektroforesis menunDilihat dari organismenya, struktur DNA jukkan pita DNA tampak jelas (berarti prokariot berbeda dengan struktur DNA jumlah DNA yang terdeteksi banyak), eukariot. DNA prokariot tidak memiliki prosedangkan bagian bawah gel agarose masih tein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan terdapat berkas. Kemungkinan hal itu DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki disebabkan adanya protein lain atau ada protein histon. Pada isolasi DNA, pengerbagian-bagian sel yang terikut (debris sel) jaannya harus sangat hati-hati karena pada DNA saat isolasi DNA. Jadi pada isolasi sangat mudah rusak oleh enzim DNAse DNA yang ini kita mendapatkan DNA yang terdapat pada kulit, saliva maupun air belum mata benar-benar murni. HASIL DAN PEMBAHASAN
64
Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol. 10, No. 1, 2009: 61 - 67

Line:

Tabel 1. Konsentrasi DNA KromosomSetelah dilakukan inkubasi, sitoplasma sel Hasil Isolasi yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu disentrifugasi selama 15 menit Absorbansi Konsentrasi Rasio dengan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya DNA DNA 0/ 26 260 280 (g/ml) supernatan yang terbentuk dibuang dan 280 E. coli kemudian dilakukan ekstraksi di dalam 1 0.276 0.158 13. 8 1. 75 larutan. Hal tersebut bertujuan agar dida2 1.415 1.11 70. 75 1. 27 pat ekstrak nukleus sel. Tahap berikutnya 3 0.207 0.195 10. 35 1. 06 4 1.275 0.663 63. 75 1. 92 adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk mem-bersihkan nukleus sel dari zatSalmonella zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu pre1 1.117 0.976 55. 85 1. 14 sipitasi bertujuan untuk mengendapkan 2 0.793 0.531 39. 65 1. 49 protein, se-hingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung coiling ( ), yang menyebabNilai perbandingan serapan pada kan DNA menjadi terlihat. panjang gelombang 260 dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian DNA (tabel 1). DNA dinyatakan murni apabila memiliki nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (A 260:A 280) berkisar 1,8-2. Hasil pengamatan kualitas DNA dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rata-rata isolat menghasilkan DNA plasmid dengan nilai perbandingan serapan A 260:A 280 < 1,8. Hal ini menunjukkan masih besarnya kontaminasi RNA dalam sampel. Hal ini memang telah diperkirakan sebelumnya, karena tidak ada perlakuan dengan RNAse dalam isolasi DNA kro- Gambar 2. Hasil Elektroforesis Plasmid DNA mosom ini. DNA kromosom dengan nilai A260:A280 >1,8 kemungkinan menganKeterangan: Line 1: Marker; Line 2: dung asam nukleat dan nilai A260:A280 Plasmid E. coli ; Line 3: Plasmid Salmonella <1,6 kemungkinan mengandung kontasp .; Line 4: plasmid E. coli(yang diambil seperti protein serta senyawa1 2 minan 3 4 5 untuk digesti); Line 5: plasmid Salmonella senyawa organik lainnya. sp. Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding Hasil elektroforesis DNA plasmid dan membran sel, pengekstraksian dalam (gambar 2) menunjukkan pita-pita yang larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap tebal dan smear , berarti dalam penelitian pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi ini menghasilkan isolasi DNA plasmid yang sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri. belum murni (terdapat berkas debris sel Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding atau DNA kromosom) dan dalam jumlah dan membran sel dengan larutan pelisis sel.banyak. Pada line 2 dan 3E. yang plasmid
Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. (Mukhlissul Faatih)

65

coli dan Salmonella sp. tidak terlihat adanya menghomogenkan larutan. Larutan pita, disebabkan oleh konsentrasi yang presipitasi protein terdiri atas kalium asetat terlalu rendah atau bahkan plasmid tidak atau Na-asetat yang jika berikatan dengan terisolasi. Line 4 dan 5 terlihat adanya protein pita mengakibatkan terbentuknya yang menunjukan bahwa plasmid sudah senyawa baru yang memiliki kelarutan yang terisolasi dari sampel. Ukuran sebenarnya lebih rendah, sehingga menyebabkan plasdari plasmid ini belum dapat ditentukan mid mengendap. Hasil dari sentrifugasi melalui gel agarose elektroforesis karena adalah terdapatnya pelet DNA plasmid tidak adanya penanda berat molekul yang pada dasar tabung yang kemudian sesuai. Dalam beberapa isolat (line 4 ditambahkan dan etanol 70% dan dibolak-balik 5) dapat dilihat adanya pita DNA plasmid kembali. Pemberian etanol bertujuan samar. Pita DNA ini dapat berarti adanya untuk membersihkan DNA plasmid dari plasmid yang berukuran sama yang telah pengotor-pengotornya. Hasil akhirnya terpotong menjadi linear akibat proses adalah DNA plasmid yang berada pada tepi isolasi DNA plasmid. dasar tabung. Langkah akhirnya adalah Dalam pelisisan dinding sel digunadengan pemberian Tris-EDTA yang kan antibiotik, lalu disentrifugasi untuk bertujuan untuk melarutkan kembali DNA memperoleh sel. Selanjutnya digunakan plasmid untuk dipreservasi. larutan pelisis sel lysing solution yang mengandung EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk komplekschelate ( ) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balik dengan gerakan memutar yang membentuk angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10 menit. Sel yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dimbil dalam filter, sedangkan pellet dibuang. Tahap Gambar 3. Hasil digesti DNA dan plamid selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi kromosom. Digesti menggunakan bertujuan untuk membersihkan plasmid ECoR I. dari zat-zat lainnya, kedalam larutan tadi Keterangan : Line 1: marker lambda DNA kemudian diberikan fenol CIAA lalu divorECoR I/HindIII; Line 2: Plasmid PUC 19 tek dan disentrifugasi, dilakukan berulang. Salmonella sp. Hal tersebut bertujuan untuk meng- utuh; Line 3: Kromosom utuh; Line 4: digesti PUC hasil isolasi E. ( optimalkan kerja CIAA. Sehingga supercoliline no 4); Line 5: digesti Kromosom natan yang mengandung plasmid dipisahE. coli (kelompok 4); Line 6: Digest kan, pellet dibuang. Tahap berikutnya yaitu kromosom E. coli(kelompok 2); Line 7: presipitasi; dilakukan dengan cara menedigest kromosom Salmonella sp. (kelompok teskan larutan presipitasi protein dan 2); Line 8: digest kromosom Salmonella kemudian divortex yang bertujuan untuk (kelompok 1)
66
Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol. 10, No. 1, 2009: 61 - 67

kemurnian DNA kromosom dan plasmid

DNA kromosom dan plasmid hasil terpotong. Kromosom mempunyai restricisolasi dipotong dengan enzim restriksi tion site Eco RI banyak dan panjang fragendonuklease Eco RI, kemudian dilakukan ment yang dihasilkan bervariasi, sehingga analisa melalui elektroforesis (gambar terlihat 3). pita-pita yang sangat smear rapat ). ( Line 2 terlihat pita yang lebar, disebabkan ada plasmid yang supercoil sehingga mempunyai ukuran yang lebih pendek SIMPULAN dibanding yang relaks. PUC masih dalam keadaan sirkuler sehingga ukurannya tidakIsolasi DNA kromosom ataupun DNA bisa dibandingkan dengan marker. Line 3 : plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur isolasi sel; lisis adalah kromosom utuh sehingga tidak bisa dinding dan membran sel; ekstraksi dalam dibandingkan dengan marker. Line 4 : Hasil larutan; purifikasi; dan presipitasi. digesti PUC, PUC 19 hanya memiliki satu Diperoleh DNA kromosom dan plasmid site untuk Eco RI sehingga hasil digesti menghasilkan membentuk satu pitadengan kemurniannya cukup tinggi dilihat dari hasil elektroforesis yang baik. Ketedengan ukuran (lihat dimarker). Line 5 litian dan kecermatan dalam pelaksanaan sampai 8 : perbedaan pola pita dan smear penelitian, sangat menentukan hasil ini, hal ini disebabkan karena konsentrasi DNA yang berbeda dan jumlah DNA yang

DAFTAR PUSTAKA Artama, W.T.1991. Rekayasa Genetika . Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM. Yogyakarta. Ausabel. F.M, et al. 1992 . Short Protocols in Moleculer Biology, . John Third Wiley ed & Sons. Inc. USA. Brown, A.T. 1991. Pengantar Kloning(Alih Gen bahasa: S.A. Muhammad dan Praseno). Yayasan Esensia Medika. Yogyakarta. Kimbal, John W. 1989. Biologi. Edisi kelima cetakan Penerbit kedua.Erlangga. Jakarta. Lehninger, A.L. 1982 . Dasar - dasar Biokimia. .P jilid enerbit 1 Erlangga. Jakarta. Lodish, Harvey, et al . 2001. Molecular Cell Biology, Fourth Edition. W.H. Freeman and Company. New York. Murray. R.K, at al . 1995, Biokimia Harper edisi , ke-22. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika . Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM. Yogyakarta. Sambrook, L., et al. Molecular Clonning : A laboratory , second Manual edition . Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Schmid, R.D. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic .W iley-VCH. Engineering Germany. Watson, James D.Tooze, John. Kurtz, David DNA T.Rekombinan 1988. . P enerbit Erlangga. Jakarta. Weaver, R.F. 1999. Molecular Biology . WCB McGraw-Hill Publisher. USA.
Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. (Mukhlissul Faatih)

67