PRACTICA VII. Citologa vaginal en perras. Duracin: 4 horas.

OBJETIVOS.

El alumno aprender a realizar un frotis vaginal, utilizar la tincin de Wright y de Shorr, as como la interpretacin de una citologa vaginal en perra.

Conocer la utilidad de esta tcnica para determinar las diferentes etapas del ciclo estral de las perras.

GENERALIDADES.

El ciclo estral es una secuencia coordinada de cambios ovricos, tero - vaginales y de comportamiento, que se ha desarrollado en los mamferos para asegurar la produccin y la fertilizacin de los gametos femeninos y el desarrollo intrauterino del feto (Jeffcoate, 2000). La influencia de las hormonas ovricas sobre el epitelio vaginal, ocasiona cambios citolgicos caractersticos que permiten determinar la etapa del ciclo estral en la que se encuentra la hembra, por lo que es un mtodo ampliamente utilizado en medicina veterinaria (De Buen, 2001).

La citologa vaginal proporciona informacin sobre la fase del ciclo estral, la presencia de inflamaciones de la vagina o en el tero, si el crvix est abierto, y de tumor venreo transmisible. La accin de los estrgenos sobre el epitelio vaginal provoca hiperplasia, hipertrofia, queratinizacin y exfoliacin de las clulas (Hansel, 1981; Jeffcoate, 2000; Malcom, 1999).

Considerando que el metaestro empieza cuando la proporcin de la clulas superficiales en el frotis vaginal es de al menos el 20%, la ovulacin tiene lugar unos 6 das antes del primer da del metaestro (Jeffcoate, 2000; Radostits, 2002).

En fases de accin estrognica mnima como el anestro, metaestro y la pubertad, las clulas presentes en el frotis son las intermedias. Miden de 20 a 40 micras y varan de acuerdo a su grado de maduracin. Son redondas o poligonales de contornos bien definidos, citoplasma abundante, ste dependiendo del pH celular, puede ser basfilo (morado) o eosinfilo (rosa). Ncleo redondo u oval, con membrana definida se observan cromcentros y cromatina sexual. Las parabasales son redondas u ovales de tamao variable miden de 12 a 30. El ncleo ocupa casi toda la superficie celular, su citoplasma es escaso generalmente basfilo y ocasionalmente est vacuolado; puede haber la presencia de neutrfilos.

Al iniciarse el proestro, las clulas se hacen mas diferenciadas y los tipos de clulas epiteliales que aparecen son las superficiales, son las ms maduras del epitelio, de forma poligonal y miden de 35 a 45 micras. Tienen un citoplasma transparente y ncleo picntico. Como la madurez del epitelio rara vez se lleva a cabo en ausencia de estrgenos, el ncleo picntico es un dato de actividad estrognica. En el citoplasma se pueden encontrar pequeos grnulos cidofilos con localizacin perinuclear o perifricos, stos contienen lpidos y su presencia es estrgeno-dependiente. Tambin hay eritrocitos y durante los primeros das pueden verse neutrfilos. Hacia la mitad del proestro, los neutrfilos desaparecen, al igual de que las clulas parabasales y las intermedias. Al final del proestro solo aparecern clulas superficiales, aunque todava se pueden ver glbulos rojos. La mitad del estro se caracteriza por la presencia de clulas superficiales, la mayora de las cuales son anucledas con el fondo del frotis limpio y claro. Durante el estro puede o no haber presencia de eritrocitos.

En el diestro hay numerosas clulas intermedias y parabasales, un fenmeno caracterstico es el elevado nmero de neutrfilos al inicio de esta fase (Dellman, 1999; Jeffcoate, 2000; De Buen, 2001; Radostits, 2002).

Las clulas basales o germinales son pequeas, redondas u ovales, de tamao uniforme 12 a 13 micras, con ncleo central de cromatina granular, a veces se observa un nucleolo evidente y ocasionalmente se puede observar mitosis; el citoplasma es basfilo

y escaso. A partir de estas clulas se lleva a cabo la regeneracin del epitelio, suelen observarse en atrofia, vaginitis o cuando existen lceras en la mucosa.

Las clulas naviculares son alargadas con forma de barco, tienen importancia en la citologa de hembras preadas donde adems tienen gran cantidad de glucgeno. Las escamas son clulas muertas por lo tanto carecen de ncleo, representan la etapa final de la maduracin del epitelio vaginal. Otras clulas no epiteliales como los eosinfilos, leucocitos, macrfagos y espermatozoides se pueden encontrar normalmente en los frotis vaginales.

Los cambios citolgicos en un frotis vaginal puede utilizarse para:

a) Monitorizar o detectar anomalas en las fases del ciclo estral. b) Determinar el periodo para la cubricin. c) Detectar cubriciones indeseadas. d) Determinar la etapa del ciclo estral que es el objetivo principal que se busca en esta prctica (Jeffcoate, 2000).

Cuadro 2. Tipos celulares que pueden aparecer en un frotis vaginal (Gadea, 2003).

Clulas bsales

Son las clulas mas jvenes del epitelio vaginal, precursoras de los otros tipos de clulas, raramente aparecen en el frotis. Son pequeas, redondas, regulares con ncleo grande y esfrico.

Clulas parabasales

Muy similares a las bsales solo que ms grandes, pueden tener vacuolas en su citoplasma, son uniformes en su tamao y forma.

Clulas intermedias

Estas clulas varan en tamao, generalmente son del doble, en comparacin con las clulas parabasales, sus bordes van desde redondeados hasta angulares. El ncleo se observa ovalado y de menor tamao.

Clulas Son las ms viejas del epitelio vaginal, Superficiales tienen el ncleo pequeo, ovalado y claramente picntico. Su citoplasma es abundante y queratinizado, sus contornos son irregulares, plegndose hacia si mismos.

Escamas

Estas clulas estn muertas, por lo tanto carecen de ncleo, representan la etapa final de la maduracin del epitelio vaginal.

Clulas naviculares

Son alargadas con forma de bote, tienen importancia en la citologa de las hembras preadas, donde adems tienen gran cantidad de glucgeno.

EQUIPO E INSTRUMENTOS: Porta objetos, microscopio ptico, lpiz punta de diamante.

MATERIAL ALUMNO: Bata, guantes de cirujano, hisopos de algodn largos.

MATERIAL BIOLGICO: Perras prepberes, pberes y en edad reproductiva.

REACTIVOS:

Solucin

salina

fisiolgica,

Colorante

de

Wright,

solucin

amortiguadora (Fosfato monopotsico, 6.63 g; fosfato di sdico, 2.56 g; agua c.b.p. 1000 ml), tren de tincin de Harri-Shorr.

MATERIAL DE DESINFECCIN: Desinfectante (hipoclorito al 1%), toallas de papel.

PROCEDIMIENTO.

1. Se pide al dueo o encargado de la paciente que la sujete, para colocarle un bozal, enseguida se sube en la mesa del trabajo, si el tamao o el temperamento de la perra dificultaran la toma de la muestra se realizar, sin subirla. 2. La toma de la muestra se realiza con un hisopo de algodn estril con una longitud mnima de 15 cm, humedecido previamente con solucin salina fisiolgica. 3. Los labios vulvares se separan con una mano y con la otra se introduce el hisopo, si la hembra es pequea se introducir aproximadamente 2 cm, en el caso de perras de talla mediana se introduce solo hasta la mitad del tamao total del hisopo. Para evitar la fosa del cltoris se debe abrir un poco los labios bulbares para ver el cltoris esto servir para como referencia para no colocar en este punto el hisopo.

4. Recoger la muestra mediante movimientos de rotacin sobre la mucosa vaginal (Figura 19). 5. Tras retirar el hisopo, ste se gira sobre un portaobjetos, ya identificado con ayuda del lpiz punta de diamante, y se seca al aire si se utiliza la tincin de Wright; si la tincin empleada es la de Shorr se fijar el frotis con alcohol.

Figura 19. Colocacin del hisopo para obtener la muestra de mucosa vaginal.1

Adaptado de Sisson,1981

Tincin de Wright.

1. Se coloca el colorante sobre el frotis, cubrindolo totalmente y se dejan pasar 2 minutos. 2. Se aade solucin amortiguadora sobre el frotis, sin derramar el colorante previamente colocado, durante 7 minutos, se observar sobre la superficie una coloracin metlica 3. Se decanta. 4. Se lava con agua de la llave por 30 segundos. 5. Se seca al aire. 6. Observar al microscopio. 7. Realizar la interpretacin, para determinar la etapa del ciclo estral o alguna posible alteracin.

Tincin de Shorr (Gadea, 2003). 1. Hacer 10 inmersiones en Alcohol de 70, cada inmersin dura 1 segundo. 2. Hacer 10 inmersiones en Alcohol de 50 3. Hacer 10 inmersiones en agua destilada 4. Poner en Hematoxilina de Harris, durante 2 minutos 5. Se realizan 2 inmersiones en agua destilada(en dos recipientes diferentes) 6. 1 minuto en Alcohol amoniacal 7. Hacer una inmersin en agua destilada 8. Hacer una inmersin en Alcohol de 70 9. 1 inmersin en Alcohol de 95 10. Poner el frotis 2 minutos en colorante de Shorr 11. Hacer una inmersin en Alcohol 95 12. Hacer una inmersin en Alcohol de 100 13. Dejar secar y observar al microscopio.

EVALUACION DE PRACTICA VII.

EVALUACIN VISUAL. 1. Identifica la tincin utilizada en la muestra que se te presenta.

2. Identifica el tipo de clula que se te muestra a continuacin.

3. Con las imgenes que se te presentan a continuacin, determina la etapa del ciclo estral en la que se encuentra la paciente.

4. Que recomendaciones daras al dueo de la paciente en caso de encontrar este tipo de clulas.

Diagrama Ecolgico Prctica VII. Citologa vaginal en perras.

Toma de muestra vaginal con ayuda de un hisopo largo. Utilizar guantes de ltex

Girar el hisopo sobre un porta objetos y teir.

Fin de la prctica

Depositar los frotis teidos en el recipiente de punzo cortantes

Depositar los guantes y los hisopos en una bolsa amarilla.

Incineracin

HOJA DE CONTROL DE LABORATORIO REPRODUCCIN ANIMAL E INSEMINACIN ARTIFICIAL PRCTICA VII CITOLOGA VAGINAL EN PERRAS.

Nombre del alumno: Grupo:

Fecha: Equipo:

SI Cumple con los lineamientos del laboratorio Investig previamente Cumpli con el material solicitado Trabajo individual Trabajo en equipo

NO

Observaciones:

Puntos obtenidos: 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Nombre y Firma del profesor de laboratorio