Captulo 1

Captulo 1

Introduo

As clulas dendrticas (DC) da pele, denominadas clulas de Langerhans (LC), foram descritas pela primeira vez em 1868 por Paul Langerhans. Posteriormente, em meados de 1970, Ralph Steinman identificou uma populao de clulas com forma dendrtica no bao (Steinman e Cohn, 1973). As clulas dendrticas, componente essencial do sistema imunolgico, localizam-se nos tecidos perifricos no linfides num estado imaturo, e so reactivas a sinais caractersticos de um processo infeccioso ou inflamatrio, ou ainda de destruio de tecidos. Estes sinais incluem produtos derivados de agentes patognicos, designadamente o lipopolissacardeo (LPS), o ARN de cadeia dupla de vrus, motivos de citosina e guanina (CpG) no metilados de ADN bacteriano e ainda citocinas inflamatrias, como o factor de necrose tumoral (TNF)-, a interleucina (IL)-1 e a IL-2. Perante estes estmulos, as DC sofrem um processo de maturao que se traduz pela produo de citocinas, quimiocinas e pela expresso aumentada de molculas envolvidas numa eficiente apresentao de antignios (Ag) aos linfcitos T. Entre estas molculas incluem-se as co-estimuladoras, CD40, CD80, CD86, DC-SIGN (molcula no integrina, captadora da molcula de adeso intercelular 3 e especfica das DC), e as molculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC) II contendo o Ag que ir ser reconhecido pelo receptor dos linfcitos T (TCR) (Flores- 13 -

Introduo Romo, 2001). Durante este processo de maturao, as DC abandonam os tecidos perifricos, entram nos vasos linfticos aferentes e migram para os gnglios linfticos onde interagem com os linfcitos T virgens (naive) e iniciam uma resposta imunolgica especfica. A demonstrar a complexidade e diversidade da biologia das DC, surgem estudos recentes, indicando que as DC so essenciais no bloqueio de linfcitos T potencialmente auto-reactivos que escaparam seleco negativa efectuada no timo. Assim, as DC desempenham um papel essencial na tolerncia perifrica (Steinman et al., 2000; Hawiger et al., 2001; Mellman e Steinman, 2001; Legge et al., 2002; Liu et al., 2002, Steinman et al., 2003) e o balano entre imunidade e tolerncia modulado pela dinmica e flexibilidade das clulas dendrticas. A poderosa actividade adjuvante que as DC possuem na estimulao de respostas celulares especficas por parte dos linfcitos tem contribudo para o desenvolvimento de estratgias imuno-teraputicas, designadamente de vacinas antimicrobianas potentes, e estratgias que visam a estimulao de respostas antitumorais. Por outro lado, o facto de as DC promoverem tolerncia perifrica tem contribudo para a sua utilizao teraputica no bloqueio de respostas imunolgicas que medeiam reaces alrgicas, doenas auto-imunes e rejeio de transplantes.

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Captulo 1 1.1. Clulas dendrticas: origem, diferenciao e distribuio no organismo As clulas dendrticas so continuamente produzidas a partir de precursores hematopoiticos da medula ssea. Estas clulas podem ser divididas em vrios tipos, de acordo com a expresso de marcadores de superfcie, com base em funes especficas que possuem e consoante a localizao no organismo. Os mecanismos que controlam a produo das DC ou dos seus progenitores, na medula ssea, no so completamente conhecidos e permanece por esclarecer se estes mecanismos dependem de factores provenientes de outros locais do organismo, alm da medula ssea, e se so afectados por estmulos ambientais externos, como produtos bacterianos (Grabbe et al., 2000). Existem vrios tipos de DC com diferentes funes biolgicas e os estudos que investigam este assunto referem dois modelos que explicam a provenincia dos diferentes tipos especializados de clulas dendrticas. O modelo da plasticidade funcional refere que os vrios tipos de DC representam diferentes estados de maturao de uma linhagem celular nica, em que a diversidade de funes depende exclusivamente de sinais locais presentes no ambiente envolvente (figura 1a). Alternativamente, o modelo da linhagem especializada sugere que os vrios tipos de DC derivam de linhagens celulares independentes (figura 1b). De acordo com este modelo, os sinais que determinam a separao das linhagens actuam numa fase inicial da diferenciao das DC e portanto num precursor destas clulas. Provavelmente, a realidade in vivo ser uma mistura destes dois modelos, em que um elevado grau de plasticidade funcional parece, cada vez mais, ser uma caracterstica geral das DC e dos seus precursores (Grabbe et al., 2000; Shortman e Liu, 2002).

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Introduo

Figura 1. Modelos de formao de clulas dendrticas funcionalmente distintas. a

- O modelo da plasticidade funcional sugere que todas as clulas dendrticas (DC) pertencem a uma nica linhagem celular hematopoitica. Os diferentes tipos de DC so formados por aco de factores presentes no ambiente envolvente e possuem uma elevada plasticidade funcional. b - O modelo da linhagem especializada sugere que os diferentes tipos de DC derivam de diferentes precursores formados numa fase precoce da via de diferenciao das DC. iDC, DC imatura; pDC, precursor da DC (retirado de Shortman e Liu, 2002).

As clulas dendrticas de murganho so consideradas totalmente diferenciadas quando expressam superfcie a protena CD11c (subunidade X da integrina CR4), as molculas co-estimuladoras CD80, CD86, CD40 e quando apresentam moderada a elevada expresso de molculas MHCII. No entanto, quando as clulas so activadas os nveis destas protenas podem ser aumentados, ocorrendo ento a maturao celular das mesmas com aquisio da capacidade de induzir a proliferao de linfcitos T. A expresso diferencial de protenas de superfcie, nomeadamente CD4, CD8, CD11b (subunidade M da integrina CR3) e o receptor multilectina especfico das DC, DEC-205 (CD205), permitem distinguir cinco tipos de clulas dendrticas nos tecidos linfides de murganhos de laboratrio no infectados, como indicado na tabela 1 (Shortman e Liu, 2002). Tal como referido anteriormente, o conhecimento da origem dos diferentes tipos de DC de murganhos permanece ainda por esclarecer. Inicialmente pensava-se que os diferentes tipos de clulas resultavam de linhagens de desenvolvimento separadas, sendo as DC CD8+ provenientes de precursores linfides e as DC CD8provenientes de precursores mielides (Reid, 1998). No entanto, estudos recentes
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Captulo 1 sugerem que o fentipo de superfcie das DC totalmente diferenciadas e as suas capacidades funcionais no esto pr-determinados nestes precursores iniciais hematopoiticos, uma vez que qualquer um destes precursores (linfide ou mielide) pode originar, em cultura, todos os tipos de DC (Martin et al., 2000; Traver et al., 2000; Martnez del Hoyo et al., 2002 a). Resultados recentemente publicados demonstram a ocorrncia de algum grau de separao de linhagens, mas numa fase de diferenciao posterior dos precursores hematopoiticos linfide e mielide, verificando-se, no entanto, algum grau de plasticidade funcional quer nos precursores, quer nos diferentes tipos de clulas dendrticas (Ito et al., 2001; Shortman e Liu, 2002) (figura 2). A existncia desta plasticidade funcional nas DC totalmente diferenciadas foi recentemente demonstrada, uma vez que o mesmo tipo de DC pode promover quer uma resposta por parte dos linfcitos T helper (Th) do tipo 1, quer do tipo Th2, dependendo da dose, do tipo de antignio, do meio envolvente no momento da maturao (Rescigno, 2002; Boonstra et al., 2003) e ainda do estado de maturao das DC. Todas estes factores podero modular a produo de IL-12 pelas DC e assim promover uma resposta Th1, que se caracteriza pela produo de IL-2 e interfero (IFN)-, ou pelo contrrio, favorecer respostas imunolgicas do tipo Th2 (com produo das citocinas IL-4, IL-5 e IL-10) (Lipscomb e Masten, 2002; Shortman e Liu, 2002; Boonstra et al., 2003). Um estudo recente demonstra ainda que todos os tipos de DC existentes em rgos linfides de murganho podem ser reconstitudos a partir de um precursor comum s clulas dendrticas que se caracteriza por ser desprovido de potencial de diferenciao linfide e mielide. Os autores deste estudo sugerem a existncia de uma via independente de diferenciao das clulas dendrticas (Martnez del Hoyo et al., 2002 b). Tabela 1- Tipos de clulas dendrticas e sua distribuio em tecidos linfides de murganho

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Introduo
DC linfides DC mielides
CD4 CD8 CD205 CD11b
alto alto

DC mielides
CD4 CD8 CD205 CD11b
+ -

DC mielides
CD4 CD8 CD205 CD11b
+ + -

Clulas Langerhans
CD4 CD8 CD205 CD11b
alto + baixo

CD4 CD8 CD205 CD11b

+

Percentagem total de DC em
-Bao -Timo -Gnglios linfticos -Gnglios

23 70 19

56 4 4

19 37 17

<4 26 20

<1 <4 33

linfticos 17

de drenagem da pele

Apesar dos estudos mais recentes sugerirem que o fentipo de superfcie das DC e as suas capacidades funcionais no esto pr-determinados nestes precursores iniciais hematopoiticos, os termos DC linfide e DC mielide ainda continuam a ser bastante utilizados na literatura. Estes resultados dizem respeito a murganhos de laboratrio no infectados. Os restantes 30% de DC do timo parecem ser principalmente CD4-CD8CD205+CD11b-, com algumas CD11b+ (retirado de Shortman e Liu, 2002).

No Homem, ao contrrio dos murganhos em que foram efectuados um elevado nmero de estudos, existe pouca informao sobre os diferentes tipos de DC presentes nos tecidos. O sangue representa a principal fonte de clulas dendrticas e, embora algumas DC do sangue estejam totalmente diferenciadas e aptas a induzirem proliferao dos linfcitos, o sangue essencialmente uma fonte de precursores de DC e de clulas dendrticas imaturas. Alm disso, as DC do sangue so extremamente heterogneas no que diz respeito expresso de uma srie de marcadores, e estas diferenas reflectem, essencialmente, diferentes estados de maturao e activao, e no diferentes linhagens das DC. Uma outra caracterstica que impede a comparao directa das DC humanas com as de murganho a ausncia da protena CD8 nas clulas dendrticas humanas, pelo que permanece por esclarecer o correspondente nos seres humanos das DC CD8+ de murganho (Lipscomb e Masten, 2002). Muitos dos conhecimentos adquiridos sobre os vrios tipos de DC humanas e as suas vias de desenvolvimento a partir de precursores (figura 2) provm, no do
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Captulo 1 isolamento directo de clulas dendrticas a partir de tecidos, mas de estudos do seu desenvolvimento em cultura a partir de precursores de DC ou de DC imaturas. Estes estudos sugerem a existncia de diferentes vias de desenvolvimento das DC, embora a correspondncia entre as DC produzidas em cultura e as existentes in vivo, permanea ainda por confirmar, tanto em murganhos como no Homem. Assim, no Homem tm sido descritos trs tipos de DC: 1) as clulas dendrticas da epiderme, ou clulas de Langerhans; 2) as clulas dendrticas da derme ou intersticiais localizadas em vrios tecidos perifricos; 3) as clulas dendrticas plasmacitides, produtoras de interfero do tipo I (IFN-/), localizadas no sangue e em tecidos (Bancherau et al., 2000; Grabbe et al., 2000; Liu, 2001, Rescigno, 2002). Apesar de existirem algumas diferenas entre as DC de murganho e humanas, tambm evidente a existncia de grandes semelhanas entre as mesmas, pelo que as clulas dendrticas de murganho fornecem um modelo apropriado para o estudo da biologia das clulas dendrticas. Algumas diferenas devem-se, provavelmente, ao processo de obteno das clulas (produo em cultura, isolamento a partir dos tecidos ou do sangue) e no reflectem diferenas fundamentais entre estas duas espcies. De referir ainda que, tanto as DC de murganho como as humanas so muito heterogneas no que respeita aos diferentes tipos de clulas existentes e s suas vias de diferenciao. Alm disto, as funes biolgicas das DC so fortemente moduladas por produtos microbianos e outros eventos potencialmente patolgicos para o organismo, designadamente a destruio de tecidos (Lipscomb e Masten, 2002; Shortman e Liu, 2002).

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Introduo

Figura 2. Vias de desenvolvimento das clulas dendrticas (DC) humanas. Alguns

tipos de linhagens das clulas dendrticas progridem para um estado de diferenciao terminal mas imaturo, sob a aco de citocinas endgenas, sendo necessrios estmulos exgenos para uma completa activao e maturao. Outras linhagens de clulas dendrticas permanecem provavelmente num estado precursor e requerem estimulao microbiana para produzirem clulas dendrticas totalmente maduras. CLA, antignio associado a linfcitos cutneos; pDC, precursor da DC; TGF-, factor de crescimento transformante ; TNF-, factor de necrose tumoral-; GM-CSF, factor estimulante de colnias de macrfagos e granulcitos; TLR, receptores Toll-like; CD40L, ligando do CD40; IL, interleucina; IFN, interfero (adaptado de Lipscomb e Masten, 2002 e Shortman e Liu, 2002).

1.2.

Imunobiologia das clulas dendrticas

1.2.1. Captao de antignios As clulas dendrticas imaturas so altamente endocticas, ao contrrio das DC maduras que perdem esta capacidade. Os mecanismos envolvidos na captao dos antignios pelas clulas dendrticas so a fagocitose atravs de receptores membranares, a endocitose mediada por receptores num processo dependente de

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Captulo 1 clatrina, e ainda a macropinocitose de fase fluda (Mellman e Steinman, 2001). Nas DC, o processo de macropinocitose constitutivo, no selectivo e permite a internalizao contnua de grandes volumes de fludo (Sallusto et al., 1995). As clulas dendrticas expressam diversos receptores envolvidos na captao de antignios, designadamente: a) receptores para as imunoglobulinas (Ig) G: FcRs (FcRII/CD32, receptor de baixa a moderada afinidade e FcRI/CD64, receptor de alta afinidade); b) receptores para IgE: FcRs (FcRI, receptor de alta afinidade e FcRII/CD23, receptor de baixa afinidade); c) receptores do complemento: CD11b (CR3), CD11c, CD88 (C5a); d) receptores scavenger, como a integrina v5 e CD36, envolvidos na fagocitose de clulas apoptticas ou necrticas (Hart, 1997; Banchereau e Steinman, 1998; Gordon, 2002); e) receptores de reconhecimento padro (PRRs) que reconhecem padres moleculares associados a agentes patognicos (PAMPs), ou seja, estruturas invariveis dos microorganismos, existentes na superfcie celular dos mesmos e ausentes nas clulas hospedeiras (Figdor et al., 2002). Os PRRs incluem os receptores de lectina tipo C e os receptores Toll-like (TLR). Os receptores de lectina tipo C ligam acares presentes em microorganismos, nomeadamente estruturas contendo manose, atravs de domnios de reconhecimento de hidratos de carbono, altamente conservados durante a evoluo (Figdor et al., 2002). Dentro deste grupo de receptores, incluem-se: o receptor de manose (CD206); o receptor especfico das DC e que liga a lectina C do tipo manano, DEC205 (CD205); a langerina (CD207) presente nas clulas de Langerhans e o DC-SIGN (CD209, cujos ligandos exgenos so o vrus de imuno-deficincia humana, Mycobacterium tuberculosis, Shistosoma mansoni, Helicobacter pylori) (Engering et al., 2002; van Kooyk e Geijtenbeek, 2002; Geijtenbeek et al., 2003; Van Die et al., 2003). Estes receptores de lectina tipo C podem tambm actuar como receptores de reconhecimento de auto-antignios.
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Introduo

Os receptores Toll-like (TLR) so protenas transmembranares expressas nas DC, macrfagos e clulas epiteliais. Estes receptores desempenham um papel crucial no reconhecimento de uma infeco bacteriana e promovem a activao de diferentes cascatas de sinalizao intracelular que culminam com a activao dos factores de transcrio protena activadora 1 (AP-1) e factor nuclear de transcrio kappa B (NFB) e ainda com a maturao das DC (Medzhitov, 2001; Rescigno, 2002). At data, foram identificados dez membros da famlia dos TLR responsveis pelo reconhecimento de diferentes ligandos. O TLR4 est envolvido no reconhecimento do LPS de bactrias Gram-negativas e de cidos lipoteicicos de bactrias Gram-positivas. O TLR2 reconhece o LPS da espiroqueta Leptospira interrogans e da Porphyromonas gingivitis, e ainda lipoprotenas bacterianas, o peptidoglicano de bactrias Gram-positivas, o lipoarabinomanano da Mycobacteria, o lpido fosfatidilinositol glicosilado do Trypanossoma cruzi e a parede celular de leveduras. Este vasto nmero de ligandos do TLR2 explicado, em parte, pela cooperao entre este receptor e outros dois receptores, designadamente o TLR6 e TLR1. Deste modo, a formao de heterodmeros entre o TLR2 e o TLR6, ou entre o TLR2 e o TLR1 ditam a especificidade no reconhecimento do ligando. O TLR3 expresso predominantemente em clulas dendrticas e funciona como receptor de ARN de cadeia dupla proveniente de vrus. O TLR5 est envolvido no reconhecimento da flagelina das bactrias e o TLR9 reconhece motivos CpG no metilados de ADN bacteriano. Embora os TLR estejam envolvidos no reconhecimento dos padres moleculares associados a agentes patognicos, no est ainda comprovado que participem no processo de internalizao dos mesmos. Estudos recentes sugerem, no entanto, a internalizao do TLR4 e TLR9 aps reconhecimento dos respectivos ligandos (Medzhitov, 2001; Rescigno, 2002; Imler e Hoffmann, 2003). 1.2.2. Processamento de antignios

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Captulo 1 As DC possuem a capacidade de captar antignios, por mecanismos dependentes e independentes de receptores, e de os degradar, com produo de pptidos antignicos que se ligam a molculas MHC. O processamento de antignios pelas clulas dendrticas ocorre essencialmente atravs de duas vias: uma via exgena, ou endossmica, e uma via endgena, ou proteassmica, em que os antignios so acoplados a molculas MHCII e MHCI, respectivamente (Watts, 1999; Davoust e Banchereau, 2000; Mellman e Steinman, 2001; Lipscom e Masten, 2002). Apresentao do antignio pela via MHC classe II ou endossmica Habitualmente, os antignios captados do meio extracelular por endocitose, fagocitose ou macropinocitose, so eficientemente acoplados a molculas do complexo major de histocompatibilidade classe II e reconhecidos posteriormente por linfcitos T CD4+. Aps captao, os antignios so dirigidos para endossomas onde ocorre clivagem em pequenos pptidos antignicos por enzimas proteolticas. Estes pptidos entram posteriormente em compartimentos vesiculares acdicos, ricos em molculas MHCII, onde ocorre a ligao dos pptidos antignicos s molculas de MHCII. Estas molculas, com o novo pptido antignico acoplado, atravessam o citoplasma em vacolos exocticos e dirigem-se para a superfcie celular. As MHCII podem ser recicladas por vias endocticas e adquirirem novos antignios nos compartimentos vesiculares ricos em molculas MHCII. As cadeias e que constituem as molculas MHC de classe II so sintetizadas no retculo endoplasmtico (RE) onde uma cadeia constante protege o domnio capaz de ligar polipeptdeos das MHCII de uma eventual ligao prematura a antignios endgenos. Esta cadeia constante posteriormente degradada, por proteases, num polipeptdeo pequeno (denominado de CLIP, polipeptdeo da cadeia constante associado a classe II). Este polipeptdeo ento substitudo pelo pptido antignico, nas vesculas ricas em MHCII, por um factor trocador de pptidos

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Introduo (designado de HLA-DM no Homem e H-2M nos murganhos) (Lipscomb e Masten, 2002). Nas clulas dendrticas imaturas, as molculas MHCII e os pptidos degradados acumulam-se em vesculas intracelulares. Aps activao das DC, os complexos MHCII/antignio migram para a superfcie celular. Mais recentemente foi proposto um outro mecanismo pelo qual pptidos antignicos so acoplados a molculas de MHCII em clulas dendrticas imaturas. Segundo este modelo, proteases extracelulares podem degradar antignios externos e originarem pptidos que se podem ligar directamente a molculas MHCII vazias presentes na superfcie das clulas dendrticas (Davoust e Banchereau, 2000). No entanto, a relevncia fisiolgica deste modelo permanece ainda por esclarecer. Apresentao do antignio pela via MHC classe I ou proteassmica Na via endgena ou proteassmica os antignios intracelulares so eficientemente acoplados a molculas do complexo major de histocompatibilidade classe I e reconhecidos posteriormente por linfcitos T CD8+. Assim, as protenas endgenas (prprias ou de origem patognica) so degradadas em pptdos pelo proteassoma. Por intermdio do transportador associado ao processamento de antignios (TAP), os pptidos dirigem-se para o RE. Neste organito, as molculas MHCI recm-sintetizadas ligam-se aos pptidos antignios e os complexos MHCI/ pptidos antignios so posteriormente transportados, por vesculas exocticas, para a membrana citoplasmtica. Apesar de durante muito tempo se pensar que a via proteassmica processava apenas antignios sintetizados dentro das clulas apresentadoras de antignio, designadamente antignios tumorais e polipeptdeos provenientes de vrus sintetizados no interior das DC durante uma infeco, actualmente sabe-se que antignios exgenos podem sofrer tambm degradao no proteassoma e em seguida migrar para o RE para ser acoplados s molculas MHCI, tal como os antignios endgenos (Shen et al., 1997; Rodriguez et al., 1999; Watts, 1999). Este processo
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Captulo 1 denominado de apresentao cruzada de antignios (cross-presentation) (Heath e Carbone, 2001 a; Melllman e Steinman, 2001) e ocorre apenas nalgumas clulas, designadamente nas DC. Recentemente foi demonstrado que os ligandos microbianos de alguns TLR, designadamente do TLR3 e TLR9, activam as DC e induzem apresentao cruzada de antignios a linfcitos T citotxicos (Datta et al., 2003). O processo de apresentao cruzada de antignios pode originar por parte dos linfcitos CD8+ tanto uma imunidade eficaz (cross-priming) como induzir tolerncia (cross-tolerance) (Heath e Carbone, 2001 b). Este mecanismo permite que as DC activem linfcitos T CD8+ (ou induzam tolerncia) contra antignios que no foram expressos nas prprias clulas dendrticas (Albert et al., 2001; Heath e Carbone, 2001 b), designadamente antignios tumorais aps as DC fagocitarem clulas tumorais e antignios de bactrias ou vrus aps fagocitose de clulas apoptticas infectadas. O facto de o processo de apresentao cruzada de antignios induzir imunidade ou tolerncia tem sido explicado por dois mecanismos alternativos, referidos na literatura. Um dos mecanismos refere a existncia de apenas um tipo de DC com plasticidade para ser tolerognico ou imunognico, dependendo da natureza do antignio (Heath e Carbone, 2001 b). Alternativamente, podero existir dois tipos de DC com funes especializadas para regular a imunidade ou induzir tolerncia (clulas dendrticas tolerognicas). Contudo, no existem evidncias directas que comprovem esta teoria (Austyn, 1999; Kalinsky et al., 1999; Sallusto e Lanzavecchia, 1999). Vrios estudos referem que DC imaturas captam antignios derivados de clulas apoptticas, tumorais ou transplantadas, presentes na periferia, e transferem os pptidos antignicos para DC residentes nos gnglios linfticos, provavelmente DC plasmacitides, as quais, em situaes de steady-state, induzem tolerncia (Inaba et al., 1998; Kalinsky et al., 1999; Iyoda et al., 2002). Este processo de apresentao cruzada de antignios pode ser manipulado e utilizado para fins teraputicos, designadamente na induo de respostas in vivo dos linfcitos T CD8+ a uma srie de antignios tumorais ou microbianos, ou ainda, na

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Introduo modulao de respostas auto-imunes e na sobrevivncia de transplantes (Bonham et al., 2002).

1.2.3. Mecanismos de migrao e maturao das clulas dendrticas As clulas dendrticas derivadas da medula ssea circulam no sangue como clulas precursoras, podendo migrar para os tecidos no linfides e a residirem como clulas dendrticas imaturas. As clulas intersticiais e as clulas de Langerhans so exemplos de DC imaturas que se localizam em zonas de interface com o ambiente externo, designadamente nas mucosas e na pele. O desenvolvimento de um processo infeccioso induz a libertao de vrios factores solveis, nomeadamente quimiocinas e citocinas. As quimiocinas so pptidos activadores de receptores acoplados a protenas G, expressos nos leuccitos e que regulam o recrutamento de clulas inflamatrias. Estes pptidos so produzidos nos tecidos perifricos por clulas endoteliais, clulas epiteliais e leuccitos, sendo a sua produo induzida em resposta a estmulos inflamatrios (quimiocinas inflamatrias). Alm disso, so tambm produzidas, de um modo constitutivo, por clulas endoteliais e leuccitos nos rgos linfides secundrios, regulando interaces entre clulas dendrticas, linfcitos B e T (quimiocinas constitutivas ou linfides) (Sallusto e Lanzavecchia, 1999). Na presena de um foco infeccioso, as quimiocinas promovem o recrutamento das DC imaturas que captam e processam os antignios presentes no local da infeco. Por aco de citocinas, algumas produzidas pelas prprias DC (IFN-/ em infeces virais, TNF-, IL-1 ), ocorre a activao das clulas dendrticas. Simultaneamente, as DC migram atravs dos vasos linfticos at aos gnglios linfticos mais prximos, onde se dirigem para as zonas ricas em linfcitos T virgens e, aps interaco com estas clulas, iniciam a resposta imunolgica (Banchereau e Steinman, 1998; Flores-Romo, 2001; Rescigno e Borrow, 2001). Durante o processo

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Captulo 1 de migrao, ocorre a maturao das DC que se caracteriza por uma srie de modificaes fenotpicas e funcionais, referidas na figura 3. A migrao das DC do sangue para os tecidos perifricos e o seu movimento dos tecidos perifricos para os tecidos linfides, durante o desenvolvimento de um processo inflamatrio, ocorre por aco das quimiocinas e acompanhado por uma expresso diferencial de protenas de adeso e de receptores de quimiocinas nas DC e nas clulas endoteliais. Assim, as DC produzem quimiocinas inflamatrias e linfides de um modo coordenado no tempo e no espao. As quimiocinas inflamatrias (protena inflamatria de macrfagos 1, MIP-1; quimiocina normalmente expressa e segregada por linfcitos T, regulada na activao, RANTES; protena quimiotctica de moncitos, MCP e ainda IL-8) so produzidas pelas clulas dendrticas imaturas e actuam de um modo autcrino e parcrino. De um modo autcrino, as quimiocinas inicialmente estimulam, e posteriormente diminuem, a expresso de vrios receptores de quimiocinas inflamatrias nas DC, permitindo-lhes responder sucessivamente a outras quimiocinas (Sallusto et al., 1998). De um modo parcrino, as DC sustm o processo inflamatrio atravs do recrutamento de moncitos, clulas dendrticas imaturas e outras clulas inflamatrias para o local onde se encontra o antignio. Quando as clulas dendrticas, j num estado maduro, atingem as zonas dos tecidos linfides ricas em linfcitos T, passam a produzir nveis elevados de quimiocinas linfides (quimiocina induzida pelo vrus Epstein-Barr, ELC/MIP-3; quimiocina derivada de macrfagos, MDC; quimiocina regulada por activao e do timo, TARC; quimiocina regulada por activao e pulmonar, PARC; protena induzida pelo IFN-, IP-10) (Sallusto et al., 1999; Flores-Romo, 2001; Lipscomb e Masten, 2002). Estas quimiocinas recrutam outras clulas dendrticas maduras, linfcitos T virgens e linfcitos T recentemente activados aumentando, deste modo, a probabilidade de ocorrerem mltiplas adeses entre estas clulas e as DC no interior dos rgos linfides (Sallusto e Lanzavecchia, 1999; Morse et al., 2002).

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Introduo Deste modo, a capacidade que as DC possuem para responder a quimiocinas inflamatrias ou linfides depende do estado de maturao das mesmas, uma vez que a sua maturao envolve ausncia de resposta s quimiocinas inflamatrias e aumento de resposta a quimiocinas linfides (figura 3). Este facto deve-se expresso diferencial dos receptores para as quimiocinas durante o processo de maturao das DC. Clulas dendrticas imaturas expressam receptores para as quimiocinas inflamatrias, designadamente CCR1, CCR2, CCR5 e CXR1. Durante a maturao das DC ocorre uma diminuio da expresso de CCR1, CCR5, CCR6 e CXCR1 e um aumento da expresso de CXCR4, CCR4, CCR7, ou seja, ocorre uma diminuio na expresso de receptores de quimiocinas inflamatrias e um aumento da expresso de receptores de quimiocinas constitutivas linfides (Sallusto e Lanzavecchia, 1999; Parlato et al., 2001). O receptor CCR7 assume particular importncia na migrao das DC para os tecidos linfides. Este receptor responde quimiocina dos tecidos linfides secundrios (SLC) e ELC/MIP-3. A SLC produzida pelas clulas endoteliais linfticas, e tanto a SLC como a ELC so produzidas pelas clulas dendrticas em zonas dos rgos linfides ricas em linfcitos T. A distribuio anatmica de SLC e a secreo de ELC atraem de um modo coordenado as clulas dendrticas, inicialmente dos tecidos perifricos para os linfticos aferentes e destes para as zonas dos tecidos linfides ricas em linfcitos T (Flores-Romo, 2001). O CCR7 tambm selectivamente expresso em linfcitos T e B virgens, permitindo a migrao destas clulas para os tecidos linfides (Sallusto et al., 1999). A funo fundamental do receptor CCR7 na migrao das DC para os rgos linfides foi claramente demonstrada em murganhos deficientes neste receptor, nos quais as DC maduras perderam a capacidade de migrar para os gnglios linfticos. O CCR7 demonstrou ainda ser crucial para a entrada das clulas de Langerhans nos vasos linfticos da pele, na migrao para os gnglios linfticos e no aparecimento da

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Captulo 1 dermatite de contacto alrgica em resposta a antignios de contacto (Wang et al., 2001; Lipscomb e Masten, 2002).

Figura 3. Migrao e maturao das clulas dendrticas (DC). As DC sofrem

maturao aps o contacto com citocinas e produtos bacterianos. Simultaneamente, migram atravs dos vasos linfticos at aos gnglios linfticos onde apresentam os antignios aos linfcitos T. Durante este processo de migrao e maturao, ocorrem alteraes fenotpicas e funcionais das DC. pDC, precursor da DC; iDC, DC imatura; mDC, DC madura; PGE2, prostaglandina E2; AMP, 5-monofosfato de adenosina cclico; LC, clulas de Langerhans (retirado de Lipscomb e Masten, 2002).

1.2.4. Co-estimulao dos linfcitos induzida pelas clulas dendrticas Nos rgos linfides, as clulas dendrticas transportadoras de antignios j processados vo interagir com os linfcitos T. No entanto, as adeses que se estabelecem entre os linfcitos e as DC no so suficientes, por si s, para ocorrer a activao dos linfcitos e o incio da resposta imunolgica, sendo fundamental ocorrer co-estimulao, um processo que assegura uma amplificao eficaz da sinalizao nos linfcitos T virgens.
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Introduo

As primeiras e mais importantes molculas co-estimuladoras caracterizadas foram o CD28, em linfcitos T virgens, e os correspondentes ligandos, CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2), cuja expresso sofre um aumento durante a maturao das DC (tabela 2) (Hart, 1997; Banchereau e Steinman, 1998). A molcula CTLA-4 (antignio 4 dos linfcitos T citotxicos) liga com maior afinidade ao CD80 e CD86 do que o CD28, estando a sua expresso aumentada nos linfcitos T activados (Walunas e Bluestone, 1998). O terceiro membro da famlia B7 o B7RP-1 (protena relacionada com B7-1). Esta protena liga-se protena imunolgica indutvel co-estimuladora (ICOS), cuja expresso tambm se encontra aumentada nos linfcitos T activados (Yoshinaga et al., 1999). A protena B7RP-1 expressa predominantemente nos linfcitos B, embora exista tambm em macrfagos e clulas dendrticas. No entanto, a sua funo nas DC no foi ainda esclarecida (Lipscomb e Masten, 2002). O quarto e quinto membros da famlia B7 so os ligandos PD-L1 (tambm denominado B7-H1) e PD-L2 que existem normalmente expressos nas DC e que se ligam ao receptor de morte celular programada-1 (PD-1) dos linfcitos T. Esta interaco exerce um efeito inibitrio na proliferao e na produo de citocinas por parte dos linfcitos T. Finalmente, a molcula B7-H3 (homlogo 3 da protena B7), que foi recentemente isolada e clonada, tem uma expresso elevada nas DC imaturas e baixa nas DC maduras, ao contrrio do observado para as outras molculas da famlia B7. O seu ligando ainda desconhecido e esta molcula est envolvida na co-estimulao de linfcitos T CD4+ e CD8+ e ainda na induo da produo de IFN- (Lipscomb e Masten, 2002).

Tabela 2- Molculas co-estimuladoras envolvidas na interaco entre clulas dendrticas e linfcitos T Clulas dendrticas Linfcitos T

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Captulo 1

Famlia B7 e receptores B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) B7RP-1 PD-L1 (B7-H1) PD-L2 B7-H3 CD28, CTLA-4 (CD152) CD28, CTLA-4 (CD152) ICOS PD-1 PD-1 Desconhecido Ligandos e receptores da famlia TNF CD40 OX40L TRANCE (RANK) ICAM-1 (CD54) DC-SIGN (CD209) SLAM (CD150) CD58 (LFA-3) CD40L (CD154) OX40 (CD134) TRANCE (RANK-L) Diversos LFA-1 (CD11a/CD18) ICAM-3 (CD50), ICAM-2 (CD102) SLAM (CD150) CD2

ICAM, molcula de adeso intercelular; LFA, antignio associado funo leucocitria; SLAM, molcula de activao e de sinalizao dos linfcitos; TRANCE, citocina induzida por activao e relacionada com o TNF; RANK, receptor activador do NF-B (retirado de Lipscomb e Masten, 2002).

Os ligandos e receptores da famlia do TNF, at ao momento cerca de cinquenta, so tambm co-estimuladores importantes na interaco entre clulas dendrticas e linfcitos T, particularmente o CD40 nas DC e o CD40L (CD154) nos linfcitos T (tabela 2). Durante interaces eficientes entre linfcitos T e DC, ocorre um aumento da expresso do CD40L nos linfcitos T que, progressivamente, vo sendo activados. O CD40L pode ento ligar-se ao CD40 presente nas clulas dendrticas, promovendo a sua maturao final e a libertao de IL-12, necessria para uma polarizao Th1. O CD40 e TRANCE (citocina induzida por activao e relacionada com o TNF) expressos em quantidades elevadas nas DC maduras, sustm a
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Introduo viabilidade das DC durante a sua interaco com os linfcitos T activados (Josien et al., 2000; Steinman, 2000). Outros membros da famlia do TNF, designadamente o OX40 nos linfcitos T e OX40L nas DC, desempenham um papel complementar na proliferao e produo de citocinas pelos linfcitos T e parecem promover respostas Th2 (Tanaka et al., 2000). Um outro grupo de receptores heterogneo tem sido descrito como regulador das interaces entre DC e linfcitos T (tabela 2). O antignio associado funo leucocitria 1 (LFA-1 ou CD11a/CD18) interage com a molcula de adeso intercelular-1 (ICAM-1) (CD54), sendo esta interaco necessria para uma eficiente estimulao da resposta imunolgica. A molcula DC-SIGN, especfica das DC, est envolvida na captao de antignios, em processos de migrao e adeso celular e ainda na formao da sinapse imunolgica com os linfcitos T (Geijtenbeek et al., 2002). Estudos recentes sugerem que a ligao entre as molculas DC-SIGN das DC e ICAM-3 dos linfcitos T virgens necessria para uma interaco eficiente entre o complexo pptido antignico/molcula MHCII das DC e o receptor TCR nos linfcitos T. De facto, a utilizao de anticorpos contra a protena DC-SIGN inibe a proliferao de linfcitos T induzida pelas DC (Geijtenbeek et al., 2000 b; Steinman, 2000). O DCSIGN tambm se pode ligar a ICAM-2, embora com menor afinidade, e esta interaco parece ser importante durante a migrao das DC atravs do endotlio (Geijtenbeek et al., 2000 a). A molcula de activao da sinalizao de linfcitos (SLAM) foi recentemente identificada nas DC. descrita como uma molcula co-estimuladora cuja expresso induzida durante a maturao das DC (Kruse et al., 2001). Tal como a SLAM, a glicoprotena CD83 tambm um marcador de maturao das clulas dendrticas. A sua expresso sofre um aumento durante a maturao das DC, o que sugere o seu envolvimento na induo das respostas imunolgicas (Lechmann et al., 2002).

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Captulo 1 Estudos recentes sugerem que a co-estimulao poder ditar o incio de uma resposta imunolgica ou, pelo contrrio, induzir tolerncia. Esses estudos referem que clulas dendrticas imaturas induzem directamente tolerncia nos linfcitos, uma vez que estas DC imaturas no possuem capacidade co-estimuladora dos linfcitos, ao contrrio das clulas dendrticas maduras que so responsveis pelo incio de uma resposta imunolgica (Davoust e Banchereau, 2000; Lutz et al., 2000; Steinman et al., 2000; Mellman e Steinman, 2001; Nouri-Shirazi e Guinet, 2002). Outros estudos sugerem ainda que o bloqueio das propriedades coestimuladoras das DC poder ser uma estratgia para aumentar o potencial tolerognico das DC (Lu et al., 1999). No entanto, muito recentemente foi sugerido que a maturao das DC necessria para induzir tolerncia de linfcitos T CD8+ e que o balano entre imunidade/tolerncia determinado por um sinal activado na presena de linfcitos T CD4+ e de clulas dendrticas (Albert et al., 2001; Shortman e Heath, 2001). 1.2.5. Eventos biolgicos aps a interaco entre clulas dendrticas e linfcitos Uma eficiente interaco entre clulas dendrticas e linfcitos traduz-se por uma induo da diviso dos linfcitos T virgens in vivo. Deste modo, aps a imunizao primria, os linfcitos que sofreram diviso adquirem um fentipo efector e migram dos gnglios linfticos para os tecidos no linfides e inflamados, de modo a executarem as suas funes biolgicas (Lambrecht, 2001; Lanzavecchia e Sallusto, 2001). O fentipo efector dos linfcitos influenciado pelas clulas dendrticas, uma vez que as DC podem modular a polarizao da resposta dos linfcitos T helper nos gnglios linfticos, em Th1 ou Th2. Os linfcitos Th1 e Th2 so clulas efectoras num estado de diferenciao terminal que se caracterizam por produzirem diferentes citocinas. As citocinas produzidas pelas clulas Th1 (IFN-, IL-2, linfotoxina-) promovem a imunidade celular activando processos fagocticos e citotxicos em clulas efectoras, designadamente em linfcitos T citotxicos, macrfagos e clulas natural killer. As citocinas produzidas
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Introduo pelas clulas Th2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13) activam a produo, pelos linfcitos B, de anticorpos especficos do antignio. Vrios factores contribuem para o balano Th1-Th2, designadamente as caractersticas e a dose do antignio (doses elevadas ou baixas), a natureza e quantidade das molculas co-estimuladoras (ICAM-1, CD40, CD80, CD86, OX40-L), o tipo, o estado de maturao e a quantidade de clulas dendrticas que atingem os gnglios linfticos, a natureza da interaco e durao da ligao MHC-TCR (de alta ou baixa afinidade) e ainda a produo de citocinas (IFN-, IL-12, IL-10 e IL-6) (Vieira et al., 2000; Moser e Murphy, 2000; Tanaka et al., 2000; Lambrecht, 2001; de Jong et al., 2002; Rescigno, 2002; Boonstra et al., 2003). Deste modo, agentes que induzem a libertao de IL-12 (IFN-, LPS, CD40L, ARN de cadeia dupla de vrus, ADN bacteriano) promovem respostas Th1, ao contrrio de agentes inibidores da produo de IL-12 que promovem respostas Th2. Entre os ltimos incluem-se compostos que elevam a produo de AMPc (designadamente histamina, agonistas adrenrgicos, prostaglandina E2), IL-10 e ainda glucocorticides (Kalinski et al., 1999; Kalinski et al., 2001; Lambrecht, 2001). No entanto, um estudo recente refere a existncia de outros mecanismos, independentes de IL-12, que podem promover respostas imunolgicas Th1 e que envolvem a activao da cinase regulada por sinais extracelulares (ERK) (Smits et al., 2002). Estes resultados indicam que a modulao das diferentes respostas imunolgicas Th, estimulada pelas clulas dendrticas, varivel e pode promover, por parte dos linfcitos, respostas Th1 ou Th2. Em suma, aps o estabelecimento da sinapse imunolgica entre DC e linfcitos ocorre o incio das respostas imunolgicas primrias. As clulas dendrticas fornecem trs sinais necessrios para ocorrer proliferao e diferenciao de linfcitos T virgens (figura 4). O sinal 1 diz respeito interaco entre os complexos major de histocompatibilidade I ou II acoplados aos antignios e o TCR presente nos linfcitos T CD8+ ou CD4+, respectivamente. O sinal 2 surge aps a interaco entre as molculas

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Captulo 1 acessrias da superfcie das DC (CD11a/LFA-1, CD40, CD54, CD80, CD86) e os respectivos ligandos na superfcie dos linfcitos. Este sinal necessrio para assegurar a diviso e diferenciao dos linfcitos T virgens em clulas efectoras. A secreo, ou a no secreo, de IL-12 contribui para a polarizao dos linfcitos T virgens em clulas Th1 ou Th2, respectivamente (sinal 3), (figura 4) (Lipscomb e Masten, 2002).

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Introduo

Figura 4. Modelo da interaco entre clulas dendrticas e linfcitos T. As clulas

dendrticas (DC) fornecem trs sinais necessrios para ocorrer proliferao e diferenciao de linfcitos T virgens. O sinal 1 diz respeito interaco entre as molculas MHC e o TCR; o sinal 2 surge aps a interaco entre as molculas co-estimuladoras nas DC e os respectivos ligandos nos linfcitos T; o sinal 3 contribui para a polarizao de linfcitos T virgens em linfcitos efectores Th1 ou Th2 (TCR, receptor dos linfcitos T; MHC, complexo major de histocompatibilidade; IL, interleucina) (retirado de Coates et al., 2002).

1.3. Dermatite de contacto alrgica: funo das clulas de Langerhans A dermatite de contacto alrgica (DCA) resulta de uma reaco de hipersensibilidade retardada, mediada por linfcitos T e dirigida a haptenos que entraram em contacto com a pele. Os haptenos so molculas de baixo peso molecular que penetram na pele e se ligam a protenas transportadoras, normalmente por uma ligao covalente, formando-se o complexo protena-hapteno (alergnio) que funciona como antignio. Este antignio captado e processado pelas clulas dendrticas da epiderme, nomeadamente pelas clulas de Langerhans (LC) que
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Captulo 1 representam 3-6% das clulas da epiderme (figura 5) e, provavelmente tambm por DC da derme. As clulas de Langerhans representam o paradigma da clula dendrtica, quer no Homem quer nos murganhos. Estas clulas possuem marcadores caractersticos e ausentes em outros tipos de DC. Em condies basais, e na epiderme, as LC so imaturas e expressam CD1a (ausente nos murganhos), caderina-E e a langerina (CD207), uma lectina transmembranar do tipo C. A langerina est envolvida na formao dos grnulos de Birbeck e um receptor de endocitose com efeitos potenciais no processamento e apresentao de antignios (Valladeau et al., 2000; Valladeau et al., 2002). Estudos recentes demonstram que alergnios de contacto, estmulos inflamatrios e produtos bacterianos aumentam a expresso da langerina (Geissmann et al., 2002; Stoitzner et al., 2003). Assim, as LC imaturas da epiderme processam o alergnio que entra em contacto com a pele e, posteriormente, transportam-no (ligado s molculas MHC) para os gnglios linfticos de drenagem prximos desta regio da pele, onde ocorre a activao dos linfcitos T virgens (Takashima et al., 2000). A migrao das LC ocorre em resposta produo local de citocinas inflamatrias, designadamente IL-1 e TNF, produzidas pelas prprias LC e pelos queratincitos (Cumberbatch et al., 1997; Stoitzner et al., 1999; Cumberbatch et al., 2000).

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Introduo Figura 5. Corte histolgico de pele humana. As clulas de Langerhans epidrmicas foram marcadas com um anticorpo contra a protena CD1a (retirado de Kanitakis, 1998). Estudos recentes sugerem que a interaco de citocinas e quimiocinas com os receptores apropriados dirigem a migrao e o movimento das LC para os gnglios linfticos (Kimber et al., 2000). So exemplos, a quimiocina MIP-3 (atravs do CCR6), produzida aps estmulos inflamatrios e detectada apenas em epitlios inflamados, e a quimiocina SLC (Caux et al., 2000; Sebastiani et al., 2002 a). Neste processo de migrao tambm fundamental o aumento da expresso da metaloproteinase 9, de integrinas 6, de ICAM-1, de CD44 e a diminuio da expresso de caderina-E, de CCR1 e CCR5 (Cumberbatch et al., 2000; Ratzinger et al., 2002). Estas alteraes fenotpicas e funcionais permitem a migrao das LC atravs da derme at aos vasos linfticos aferentes e gnglios linfticos, onde se encontram os linfcitos T virgens (figura 6).

Figura 6. As clulas de Langerhans captam os alergnios que entram em contacto com a pele e migram para rgos linfides onde apresentam os alergnios a linfcitos T. Durante o processo de migrao as clulas de Langerhans (LC)
sofrem maturao e adquirem a capacidade de estimular linfcitos T virgens (retirado de Janeway et al., 2001).

Os alergnios de contacto, per se, so capazes de causar algum grau de agresso s clulas da epiderme e induzir ou aumentar a produo local de citocinas (nomeadamente IL-1 e GM-CSF) e quimiocinas que contribuem, no s para a migrao, mas tambm para a maturao das LCs (Grabbe e Schwarz, 1998; Kimber
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Captulo 1 et al., 1998; Murphy et al., 2000). Alguns autores defendem que um certo grau de agresso provocado por estes alergnios (associado com a produo de citocinas relevantes) pode facilitar ou ser mesmo necessrio para induzir uma resposta imunolgica (Cumberbatch et al., 2000; Cumberbatch et al., 2002). O GM-CSF tem sido referido como um factor produzido na epiderme necessrio para a maturao das LC. Aps a maturao, que ocorre durante o processo de migrao, estas clulas expressam nveis elevados de CCR7, de molculas MHC e de molculas co-estimuladoras (CD40, CD86, CD80), que lhes vo permitir interagir e activar os linfcitos T virgens nos gnglios linfticos. Esta interaco responsvel pelo incio da resposta imunolgica adquirida (fase de sensibilizao da DCA) atravs da formao de linfcitos efectores T CD8+ de memria (e linfcitos T CD4+ efectores e reguladores). Os linfcitos T CD4+ diferenciam-se em diferentes tipos funcionais, designadamente Th1 e Th2. De igual modo, os linfcitos T CD8+ diferenciam-se em clulas funcionais do tipo 1 e do tipo 2. Os linfcitos efectores do tipo 1 produzem IL-2 e IFN-, enquanto que os linfcitos efectores do tipo 2 segregam IL-4, IL-5 e IL-10 (Kimber e Dearman, 2002). Os alergnios de contacto, como o 2,4-dinitrofluorbenzeno (DNFB) e oxazolona, induzem preferencialmente respostas do tipo 1, em contraste com os alergnios respiratrios que induzem respostas essencialmente do tipo 2 (Dearman e Kimber, 1992). Existem, no entanto, estudos que sugerem o envolvimento de respostas Th2 na fase de sensibilizao da DCA, induzida por DNFB (Yokozeki et al., 2000). O contacto posterior da pele com o mesmo hapteno desencadeia, no espao de 24 a 48 horas, uma reaco imuno-inflamatria aguda da pele que pretende eliminar o antignio detectado. A DCA manifesta-se, na sua fase aguda, por eritema, edema, ppulas, vesculas, e exsudao muito pruriginosas. Durante esta fase da DCA, denominada de fase efectora, os linfcitos T CD8+ e T CD4+ de memria que circulam na corrente sangunea entram em contacto com a pele exposta ao alergnio.

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Introduo O recrutamento destes linfcitos de memria regulado por diferentes molculas de adeso expressas na superfcie das clulas endoteliais, ou por quimiocinas libertadas por clulas residentes da pele, designadamente fibroblastos, queratincitos, e mastcitos (Albanesi et al., 2001; Sebastiani et al., 2002 b). Aps apresentao do alergnio aos linfcitos pelas LC, ou por outras clulas apresentadoras de antignio recrutadas para o local da inflamao cutnea, os linfcitos sofrem activao. Estes linfcitos activados especficos do alergnio produzem citocinas, designadamente IFN-, recrutam outras clulas inflamatrias (moncitos, clulas dendrticas) e amplificam a resposta inflamatria, que se traduz no aparecimento das leses clnicas que caracterizam a DCA. At recentemente, pensava-se que as clulas efectoras da DCA eram exclusivamente linfcitos T CD4+. No entanto, foi j demonstrado que os linfcitos T CD8+ e os linfcitos T CD4+ so clulas efectoras cruciais no desenvolvimento da DCA em resposta ao DNFB (Wang et al., 2000). Outros estudos efectuados em murganhos sugerem que os linfcitos T CD4+ podem desempenhar funes reguladoras e efectoras, sendo os linfcitos T CD8+ as clulas efectoras citotxicas responsveis pelas manifestaes clnicas da DCA (Cavani et al., 1998; Grabbe e Schwarz, 1998; Sebastiani et al., 2002 b). De facto, animais deficientes em molculas MHC I no desenvolvem DCA em resposta ao potente alergnio de contacto DNFB, enquanto que murganhos deficientes em molculas MHC II exibem uma DCA exacerbada (Bour et al., 1995). Outros estudos sugerem que os linfcitos T CD8+ so as clulas responsveis pelos efeitos citotxicos (inflamatrios) associados DCA induzida pelos alergnios de contacto nquel e DNFB (Moulan et al., 1998; Kehren et al., 1999). O potencial citotxico dos linfcitos T CD8+ efectores parece ser modulado por IFN- (Blauvelt et al., 2003) e envolve a via da perforina e do complexo Fas/ligando Fas. Assim, num modelo experimental de DCA induzido por DNFB, observou-se que, em murganhos deficientes nos dois sistemas acima mencionados (perforina e Fas/Fas

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Captulo 1 ligando), ocorria a produo de linfcitos T CD8+ especficos do alergnio DNFB, mas estes no desenvolviam DCA (Kehren et al., 1999). A maior parte dos haptenos que provocam DCA so molculas pequenas, lipoflicas ou ies metlicos (trinitrofenol, nquel, crmio, cobalto) que requerem ligao a protenas para se tornarem antignios. Estes compostos qumicos devem ser suficientemente electroflicos para reagirem, de um modo covalente, com os grupos nucleoflicos das protenas da pele. Assim, a sua capacidade de reagir com protenas est relacionada com a capacidade de induzir sensibilizao cutnea. Algumas molculas que causam DCA denominadas pr-haptenos no so electroflicas e no se ligam a protenas, mas so convertidas, na pele, em espcies electroflicas por reaces qumicas (designadamente a colofnia e turpentina), ou enzimticas (como a parafenilenodiamina ou o isoeugenol), uma vez que a pele um local importante de metabolismo extra-heptico (Smith Pease et al., 2003). As estruturas alvo dos haptenos so, normalmente, grupos tiol e resduos de lisina e cistena de aminocidos (Becker et al., 2003). Actualmente, existem vrios ensaios que utilizam animais quer na identificao de compostos qumicos com potencial para induzir sensibilizao cutnea, quer na quantificao da potncia de alergnios de contacto. Entre outros, referem-se o teste com o gnglio linftico regional LLNA, e o teste de maximizao em cobaia -GPMT (Basketter et al., 2000; Gerberick et al., 2001; Kimber et al., 2002). Estes testes permitem identificar, para cada alergnio, um valor limiar a partir do qual ocorre sensibilizao e aparecimento da DCA. Contudo, estes valores limiares variam entre diferentes espcies animais e entre diferentes indivduos da mesma espcie, e so ainda modulados por diversos factores. Entre estes, incluem-se a dose de alergnio aplicado por rea de pele, o tempo de exposio da pele ao alergnio (curto, prolongado, exposio nica ou repetida), a integridade da pele (pele ntegra ou inflamada) e ainda o veculo do alergnio de contacto (Basketter et al., 2002). A escala destas variveis frequentemente quantificvel e os testes acima mencionados
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Introduo fornecem informaes teis na identificao de limites de exposio a alergnios de contacto, abaixo dos quais no ocorre DCA. Pretende-se, com esta informao, que a morbilidade atribuda DCA seja controlada e que seja o mais baixa possvel. Nos ltimos anos, vrios laboratrios tm procurado implementar testes in vitro que permitam identificar compostos qumicos com potencial sensibilizante e, deste modo, substituir o uso de animais de laboratrio.

1.4. Fisiologia e fisiopatologia do monxido de azoto 1.4.1. Biossntese do monxido de azoto e efeitos biolgicos A partir da descoberta do monxido de azoto (NO) pela equipa de Moncada (Palmer et al., 1987), em 1987, o trabalho de investigao relacionado com o NO aumentou exponencialmente e com ele o conhecimento da multiplicidade dos seus efeitos, quer fisiolgicos quer patolgicos. O NO est envolvido na modulao da vasodilatao, na agregao das plaquetas e nas propriedades adesivas dos leuccitos, no controlo de doenas infecciosas e tumorais, nos processos auto-imunes, nas doenas degenerativas crnicas e ainda na comunicao neuronal (Ignarro, 2002). A multiplicidade das aces biolgicas do monxido de azoto deve-se, em parte, s suas propriedades fsico-qumicas. Este gs de pequenas dimenses (30 Da) e sem carga tambm um radical livre por ser portador de um electro desemparelhado, o que lhe confere uma grande reactividade. Os seus efeitos fisiolgicos podem ser exercidos na clula que o produz ou em clulas adjacentes, uma vez que o NO se difunde facilmente entre compartimentos celulares e solvel em meios biolgicos. O monxido de azoto possui uma semi-vida que varia de segundos a minutos, dependendo da sua concentrao e do ambiente fsico-qumico
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Captulo 1 envolvente, e tem como alvos intracelulares ADN (bases pirimidina), protenas, grupos prostticos (grupos heme) e lpidos (originando peroxidao lipdica), podendo ainda reagir com outras molculas inorgnicas (oxignio, superxido ou metais de transio). Considerando ainda que muitos dos alvos do NO so eles prprios molculas reguladoras (factores de transcrio e protenas envolvidas em vias de sinalizao intracelular) facilmente se compreende a diversidade de efeitos biolgicos do NO. De facto, frequentemente efeitos txicos e protectores, mediados por este radical, so observados em paralelo (Grisham et al., 1999). Nos mamferos, o NO endgeno sintetizado pela sintase do monxido de azoto (NOS), da qual so conhecidas trs isoformas distintas. A NOS neuronal (nNOS ou NOS 1) e a NOS endotelial (eNOS ou NOS 3) so tambm denominadas colectivamente de NOS constitutiva, uma vez que a sua expresso constitutiva nas clulas e a sua actividade regulada por fluxos de clcio intracelular que se ligam posteriormente calmodulina. Apesar de estas duas isoformas da NOS terem sido identificadas inicialmente em neurnios e clulas endoteliais, respectivamente, hoje sabe-se que a expresso das mesmas no se restringe a estes tipos celulares. A outra isoforma denominada NOS indutvel (iNOS ou NOS 2) uma vez que a sua expresso ocorre em resposta activao celular por citocinas (IL-1, TNF-) ou componentes bacterianos, como o lipopolissacardeo. Esta isoforma foi inicialmente descrita em macrfagos de murganho estimulados, mas actualmente sabe-se que pode ser expressa em clulas dendrticas, clulas endoteliais, clulas epiteliais, queratincitos, condrcitos, fibroblastos, clulas natural killer, entre outras. Contrariamente s outras duas isoformas, a actividade da iNOS no depende de clcio e calmodulina, uma vez que esta protena se encontra firmemente ligada NOS (Knowles e Moncada, 1994; Lamas et al., 1998; Alderton et al., 2001). As trs isoformas da NOS apresentam entre si aproximadamente 50% de homologia na sequncia de aminocidos, mas entre mamferos cada isoforma altamente conservada (aproximadamente 90% de homologia). Estas isoformas so

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Introduo activas apenas como homodmeros de polipeptdeos de 130-133 kDa (iNOS e eNOS) ou 160 kDA (nNOS). Cada isoforma formada por duas regies: uma regio Cterminal do tipo reductase, geradora de electres, que possui um elevado grau de homologia com a enzima citocromo P 450 reductase, e uma regio N-terminal do tipo oxidase. A poro N-terminal apresenta ainda uma regio hmica associada com o local de ligao ao substrato e todas as NOS apresentam na sua regio mdia um local de ligao para a calmodulina (Griffith e Stuehr, 1995). As trs isoformas da NOS catalisam a converso de L-arginina e oxignio molecular em N-hidroxi-L-arginina e posteriormente em NO e citrulina (figura 7). A reaco de sntese de NO necessita de NADPH (nicotinamida adenina dinucletido fosfato, forma reduzida) como co-factor e produz NO e L-citrulina estequiometricamente. Embora as trs isoformas catalisem a mesma reaco, elas diferem no que refere sua regulao, amplitude e durao de produo de NO, e ainda na distribuio intracelular. A isoforma eNOS uma protena ancorada membrana do aparelho de Golgi e as outras isoformas (nNOS e iNOS) so solveis e citoplasmticas. Em resposta a estmulos fisiolgicos (nomeadamente substncias vasoactivas ou neurotransmissores), o NO produzido rapidamente pela eNOS e nNOS, em clulas endoteliais e neurnios, respectivamente, durante perodos de tempo curtos (minutos) e em baixas concentraes (picomolar), e as respostas observadas nas clulas alvo (clulas musculares, neurnios, plaquetas) so rpidas e transitrias. Nestes sistemas, o NO interage directamente com a enzima guanilciclase, levando produo do segundo mensageiro, o monofosfato de guanosina cclico. Contrariamente, citocinas e produtos bacterianos induzem a expresso da iNOS que produz NO em quantidades elevadas (nanomolar), num processo lento e prolongado (horas ou dias) (Alderton et al., 2001). Neste sistema, os efeitos do NO so indirectos e mediados por espcies reactivas de xido de nitrognio (RNOS), com a frmula genrica NOx, que so produzidas na presena de oxignio molecular. Estes
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Captulo 1 compostos so extremamente instveis e interagem com alvos intracelulares envolvidos na regulao celular, provocando a nitrosilao de protenas e de compostos tiol, como a glutationa. Nos sistemas biolgicos e em solues aquosas, o N2O3 o maior RNOS formado a partir da oxidao do NO, sendo posteriormente hidrolisado e excretado sob a forma de nitritos ou nitratos. O NO pode ainda interagir com o anio superxido e produzir o anio peroxinitrito, txico e altamente reactivo, responsvel pela citotoxicidade e pelos efeitos pr-inflamatrios do NO (Coleman, 2001). Recentemente foi identificada uma sintase de monxido de azoto na mitocndria (mtNOS). A sua existncia foi demonstrada em vrias preparaes mitocondriais de diferentes rgos (corao, fgado), e em diferentes espcies animais (rato, porco). Esta enzima requer funcionalmente os mesmos cofactores e substrato referidos para as restantes isoformas constitutivas da NOS, e o NO produzido pela mtNOS parece modular o consumo de oxignio, a produo de ATP e a produo de radicais livres por inibir, de um modo reversvel, a citocromo oxidase (Giulivi, 2003).

Figura 7. Converso da L-arginina em L-citrulina por aco da sintase do monxido de azoto (NOS) na presena de cofactores (NO, monxido de azoto; NOS,
sintase do monxido de azoto; NADPH, nicotinamida adenina dinucletido fosfato, forma reduzida) - 45 -

Introduo

1.4.2. Mecanismos de regulao da produo de monxido de azoto pela isoforma indutvel da sintase do monxido de azoto A iNOS a isoforma da NOS mais envolvida em respostas imunolgicas, razo pela qual grande parte deste trabalho consistiu no estudo dos eventos intracelulares que regulam a expresso da isoforma indutvel da sintase do monxido de azoto em clulas apresentadoras de antignio, designadamente clulas dendrticas da pele. Ao contrrio do observado com as outras isoformas, a expresso da iNOS regulada por citocinas (TNF-, IFN-, e IL-1) e componentes bacterianos, e normalmente envolve a sntese de novo e a estabilizao do ARNm e da protena iNOS. A regulao da expresso da iNOS difere entre clulas humanas e clulas de roedores. Deste modo, as clulas de roedores expressam facilmente a iNOS em resposta ao LPS ou a citocinas pr-inflamatrias (IFN-, IL-1 e TNF-), enquanto que as clulas humanas requerem uma combinao de citocinas ou tratamentos mais complexos para ocorrer a expresso da iNOS (Bogdan, 2001). A relativa facilidade na induo da iNOS observada em roedores pode dever-se proximidade de elementos funcionalmente importantes na regio promotora do gene iNOS, ao contrrio do observado em clulas humanas em que os elementos crticos se encontram mais afastados (Ganster et al., 2001) Vrios mecanismos regulam a produo e a expresso da iNOS. Embora existam diferenas entre a regio promotora do gene que codifica a protena iNOS humana e a de murganho (Chu et al., 1998), os factores de transcrio que participam neste processo so similares, incluindo o factor nuclear de transcrio kappa B (NF- 46 -

Captulo 1 B, o qual ser abordado mais adiante em pormenor), a protena activadora 1 (AP-1), o transdutor do sinal e activador da transcrio (STAT)-1, factor regulador do interfero (IRF)-1, o factor nuclear da interleucina 6 (NF-IL6) e ainda a protena do grupo-I(Y) de alta mobilidade (Xie et al., 1994; Weisz et al., 1996; Taylor e Geller, 2000; Ganster et al., 2001; Pellacani et al., 2001). Dependendo da citocina ou do estmulo microbiano e ainda do tipo de clulas, diferentes vias de sinalizao podem modular a expresso da iNOS, designadamente as que envolvem as cinase de Janus (JAK1, JAK2 e tyk2), a cinase Raf-1, as cinases da famlia MAPK (cinase de protenas activada por agentes mitognicos) p38 MAPK, JNK (cinase do terminal amnico da protena c-Jun) e ERK1/2 (cinase regulada por sinais extracelulares), a protena cinase C (PKC), a protena cinase A (PKA), a cinase responsvel pela fosforilao da posio 3 do fosfatidilinositol (PI3K), e ainda as protenas fosfatase 1 e 2A (Bogdan, 2001). O prprio monxido de azoto exerce um efeito bifsico na transcrio do gene iNOS. Baixas concentraes de NO activam o NF-B e aumentam a expresso da iNOS, enquanto que concentraes elevadas de NO tm um efeito oposto, sendo, deste modo, prevenida uma produo exagerada de monxido de azoto (Connelly et al., 2001). O aumento da degradao da protena iNOS pela via do proteassoma outro mecanismo atravs do qual ocorre regulao da produo de NO. O factor de crescimento transformante (TGF)- suprime a produo de NO em macrfagos por aumentar a degradao da iNOS, e a diminuio dos nveis da iNOS em resposta estimulao com glucocorticides parece dever-se, parcialmente, degradao da iNOS (Osawa et al., 2003). A regulao da produo de NO pode ser feita tambm por vrias protenas que bloqueiam a dimerizao da iNOS, nomeadamente a protena de macrfagos associada com a NOS de 110 kDa (NAP110) e a protena do sistema nervoso central kalirin (Ratovitski et al., 1999 a; Ratovitski et al., 1999 b). A actividade da iNOS tambm modulada pela disponibilidade extracelular e intracelular do substrato L-arginina, que depende do sistema de transporte y+ e ainda
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Introduo da enzima arginase. Esta enzima degrada arginina em ureia e L-ornitina, prevenindo, deste modo, a produo de NO por diminuio da quantidade do substrato (Bogdan, 2001). A disponibilidade de tetrahidrobiopterina (BH4), essencial para a reaco de catlise mediada pela NOS, pode regular tambm a produo de NO (Bogdan, 2001). 1.4.2.1.Envolvimento do factor de transcrio NF-B na expresso da isoforma iNOS e na produo de NO: mecanismos moleculares de activao e desactivao do NF-B O NF-B engloba uma famlia de factores de transcrio cruciais na regulao de respostas imunolgicas e inflamatrias, sendo muitas vezes denominado de mediador central da resposta imunolgica. O NF-B activo promove a expresso de cerca de cento e cinquenta genes que codificam, essencialmente, protenas envolvidas nas respostas imunolgicas e inflamatrias, designadamente iNOS, ciclooxigenase 2, cerca de vinte e sete citocinas (designadamente IFN-, IL-18; TNF-, IL-1, quimiocinas), protenas envolvidas na apresentao de antignios (CD80, CD86), receptores envolvidos na adeso e migrao de leuccitos e ainda receptores envolvidos no reconhecimento imunolgico, como membros do complexo major de histocompatibilidade (Pahl, 1999). Deste modo, o NF-B regula as respostas imunolgicas naturais e adquiridas, sendo rapidamente activado em resposta a vrios estmulos como agentes patognicos (LPS), sinais de stresse e citocinas prinflamatrias (TNF, IL-1). Este factor de transcrio crucial na regulao da expresso da protena iNOS quer em clulas humanas, quer em clulas de roedores. A regio promotora do gene iNOS de murganho contm locais de ligao para o NF-B situados entre -85 e 76 pb (pares de bases) e entre -971 e -962 pb, a montante do local de iniciao da transcrio (Xie et al., 1994; Weisz et al., 1996). A regio promotora do gene iNOS humano apresenta diferenas relativamente do murganho, nomeadamente no que
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Captulo 1 se refere localizao dos locais de ligao do NF-B, tendo sido sugerido que o local fundamental se situa a -5.8 kpb a montante do local de iniciao da transcrio (de Vera et al., 1996; Taylor et al., 1998; Ganster et al., 2001). A famlia NF-B inclui vrios membros, designadamente RelA (p65), p50 (p105), p52 (p100), c-Rel e RelB. Estas protenas contm uma regio estruturalmente conservada, com cerca de trezentos aminocidos, prxima do terminal amnico e contendo os domnios de ligao ao ADN, de localizao nuclear e de dimerizao. As protenas c-Rel, RelB e RelA contm ainda uma regio prxima do terminal carboxlico, no homloga, com um domnio de transactivao que activa a transcrio de genes contendo locais de ligao ao NF-B (Chen e Ghosh, 1999; Mercurio e Manning, 1999 a). As restantes protenas do NF-B no possuem este domnio de transactivao mas tm a capacidade de se ligar a regies de consenso no ADN, funcionando como repressores da transcrio (Ghosh e Karin, 2002). As protenas p50 e p52 so geradas por processamento proteoltico das protenas precursoras p105 e p100, respectivamente. Qualquer membro da famlia NF-B pode formar homodmeros, com excepo do RelB. Cada membro desta famlia forma tambm heterodmeros com as restantes protenas NF-B, mas a subunidade p65 associada subunidade p50 ou p52 constituem os heterodmeros mais frequentes nas clulas de mamferos. As protenas p50 e p65 encontram-se distribudas por vrios tipos de clulas, enquanto que a subunidade RelB encontra-se em regies especficas do timo, gnglios linfticos e placas de Peyer, e a sua expresso est normalmente confinada a clulas dendrticas e a linfcitos B. A expresso da protena c-Rel est normalmente confinada aos linfcitos e s clulas hematopoiticas (Li e Verma, 2002). De referir ainda que a transcrio de RelB, c-Rel e p105 regulada pelo NF-B (Bren et al., 2001; Solan et al., 2002). As protenas do NF-B existem no citoplasma sob uma forma inactiva por estarem associadas a protenas inibidoras, denominadas de IB (figura 8). As

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Introduo protenas mais comuns so o IB-, IB- e IB-. Estas protenas possuem vrias repeties de anquirina, motivos contendo trinta e trs aminocidos, que medeiam interaces protena-protena. As protenas p100 e p105 contm repeties de anquirina similares e podem funcionar como molculas tipo-IB. No entanto, este domnio existente nestas protenas precursoras pode ser degradado e clivado por enzimas. Um outro membro menos usual da famlia IB o Bcl-3, que interage especificamente com homodmeros p50 e p52 e pode induzir a expresso de genes regulados pelo NF-B. Deste modo, esta protena parece ter uma funo diferente da exercida pelos restantes membros do IB (Karin, 1999). Inicialmente foi proposto que as protenas IB retm o NF-B no citoplasma por mascararem as sequncias de localizao nuclear (NLS) presentes nas subunidades do NF-B. Contudo, estudos recentes sugerem que a localizao citoplasmtica do complexo NF-B desactivado pelo IB resulta de um movimento contnuo entre os compartimentos nucleares e citoplasmticos, uma vez que, das duas NLS presentes no NF-B, apenas uma est mascarada pela protena IB-. Deste modo, a outra sequncia NLS permanece livre e permite a migrao do complexo para o ncleo. Por outro lado, o sinal de exportao nuclear (NES), localizado no terminal amnico da protena IB-, responsvel por expelir o complexo NF-B/IB do ncleo. Este processo, que visa expulsar do ncleo o complexo NF-B/IB mais eficiente do que o inverso, pelo que, os dmeros de NF-B inactivos pela interaco com as protenas IB- esto normalmente localizados no citoplasma. Este comportamento foi descrito apenas para a protena IB- e as implicaes fisiolgicas deste movimento contnuo entre os compartimentos nucleares e citoplasmticos permanecem ainda por esclarecer (Li e Verma, 2002). Quando ocorre estimulao celular adequada, a protena IB- rapidamente degradada e sintetizada de novo, uma vez que o gene IB- possui, na sua regio promotora, locais de ligao ao NF-B. A protena IB- sintetizada de novo possui
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Captulo 1 uma sequncia NLS que lhe permite entrar no ncleo para remover os dmeros de NFB dos seus locais de ligao ao ADN, e transport-los para o citoplasma, reprimindo a funo do NF-B. Deste modo, a degradao do IB- induz uma activao transitria do NF-B, ao contrrio do IB- cuja degradao leva a uma activao persistente do NF-B, dado que no possui a capacidade de remover os complexos NF-B ligados regio promotora dos seus genes alvo (Chen e Ghosh, 1999; Mercurio e Manning, 1999 a). Estudos realizados em murganhos deficientes nas vrias protenas do IB tm demonstrado alguma redundncia funcional relativamente s protenas IB-, IB- e IB-, que resulta, normalmente, numa activao sustentada do NF-B (Gerondakis et al., 1999; Li e Verma, 2002). A utilizao de modelos animais deficientes nas cinco protenas do NF-B tem demonstrado funes cruciais das mesmas na regulao das respostas imunolgicas naturais e adquiridas, na fisiologia dos linfcitos, na defesa anti-microbiana e na sobrevivncia celular. Murganhos deficientes na protena p65 sofrem degenerao heptica e morrem durante o desenvolvimento embrionrio. Pelo contrrio, murganhos deficientes nas restantes quatro protenas so imunodeficientes, mas no se observam alteraes no desenvolvimento embrionrio. Murganhos deficientes em mais do que uma protena do NF-B desenvolvem fentipos mais severos e morrem durante o desenvolvimento embrionrio ou aps o nascimento (Gerondakis et al., 1999; Li e Verma, 2002). Para a maior parte dos estmulos conhecidos, exceptuando a radiao ultravioleta e o perxido de hidrognio, a degradao do IB essencial para a libertao e subsequente activao do NF-B (figura 8). A fosforilao do IB, mediada pela cinase do IB (IKK), um evento crucial neste processo e ocorre em resduos especficos de serina, designadamente Ser32 e Ser36 do IB-. O IB- fosforilado ento ubiquitinado em resduos lisina (21 e 22) e posteriormente degradado pelo proteassoma 26S. Deste modo, os dmeros de NF-B so libertados
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Introduo no citoplasma, migram para o ncleo e induzem a transcrio de genes alvo (Mercurio e Manning, 1999 a; Chen e Ghosh, 1999).

Figura 8. Activao da via de sinalizao do NF-B. A activao do factor de transcrio NF-B mediada por vrias vias de sinalizao intracelular estimuladas por LPS, citocinas ou stresse. A cinase (IKK) do inibidor do NF-B (IB) constitui um ponto de convergncia das vrias vias de sinalizao e constituda pelas subunidades IKK, IKK e IKK ou NEMO. A activao deste complexo resulta na fosforilao e degradao do IB com libertao do NF-B para o ncleo e transcrio de genes alvo, designadamente o gene iNOS (adaptado de Yamamoto e Gaynor, 2001). O complexo IKK, de 700-900 kDa, constitudo por vrias protenas: IKK1 (IKK), IKK2 (IKK) e a subunidade reguladora moduladora essencial do NF-B (NEMO, tambm conhecida por IKK). A subunidade NEMO no possui actividade cinsica intrnseca mas contm motivos envolvidos em interaces protena-protena, enquanto que as cinases IKK1 e IKK2 podem fosforilar in vitro IB-, e . Este complexo IKK um ponto de convergncia para a activao do NF-B induzida por uma srie de estmulos e a ausncia de qualquer uma das protenas do complexo IKK provoca o bloqueio da activao do NF-B. Recentemente foram identificados dois componentes adicionais ao complexo IKK, designadamente a protena de choque trmico 90 e o CD37, cujas funes no foram ainda esclarecidas (Karin, 1999). Os mecanismos moleculares envolvidos na activao do complexo IKK no esto ainda bem identificados. Uma das hipteses sugere que a activao de um receptor responsvel por activar uma cinase do IKK com consequente fosforilao do IKK. Alternativamente, foi proposta a existncia de uma protena adaptadora, que poder direccionar o complexo IKK para perto do receptor com consequente alterao de conformao e estimulao da sua auto-fosforilao. Diversas cinases podero actuar como cinases do IKK, designadamente a MEKK (cinase da cinase da ERK) 1, a MEKK2, a MEKK3, a NIK (cinase indutora do NF-B), a TBK1 (homlogo da IKK,
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Captulo 1 recentemente identificado), a TAK1 (cinase activada pelo TGF-) e a PKC (uma protena cinase C atpica). No entanto, a funo exacta de cada uma destas protenas na via de sinalizao do NF-B requer investigao adicional (Mercurio e Manning, 1999 a; Li e Verma, 2002). De um modo geral, considera-se que a actividade do NF-B regulada pela degradao do IB com consequente activao deste factor de transcrio. No entanto, alguns estudos tm sugerido que a actividade do NF-B tambm regulada por modificao directa das suas protenas, designadamente por fosforilao e provavelmente por acetilao (Zhong et al., 1997; Wang e Baldwin, 1998; Yang et al., 2001). De acordo com estes estudos foi demonstrado que, aps a degradao do IB, a fosforilao da subunidade p65 no resduo serina 276 pela PKA essencial para uma ligao eficiente desta subunidade protena com capacidade de ligao ao CREB (protena com capacidade de ligao a elementos de resposta ao AMPc), um co-activador da transcrio. Outras enzimas com capacidade de fosforilar a protena p65, aumentando a sua actividade, incluem a cinase da casena II e o IKK2. Estudos genticos tm demonstrado que vrias protenas, incluindo a TBK1, a IKK1/2, a NIK e a PKC, so importantes no controlo da actividade do NF-B, provavelmente por fosforilao (Mercurio e Manning, 1999 b; Li e Verma, 2001). Estes estudos demonstram que a fosforilao do NF-B crucial para a sua funo e representa, provavelmente, um meio adicional de regulao deste factor de transcrio em resposta a diferentes estmulos. 1.4.3. O monxido de azoto e a imunobiologia da pele O NO produzido durante respostas imunolgicas e inflamatrias e est envolvido na imunidade inata, por ser citotxico contra organismos infecciosos, e na imunidade adquirida, por modular a morte e a funo das clulas do sistema imunolgico. A produo de NO uma caracterstica genuna das clulas do sistema
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Introduo imunolgico (clulas dendrticas, clulas natural killer, mastcitos, moncitos, macrfagos, clulas de Kpffer, microglia, eosinfiolos e neutrfilos), assim como de outras clulas envolvidas nas reaces imunolgicas (clulas endoteliais, clulas epiteliais, clulas musculares lisas dos vasos sanguneos, fibroblastos, queratincitos, condrcitos, hepatcitos). As isoformas iNOS e eNOS tm sido descritas em macrfagos, DC, clulas natural killer e ainda linhas celulares, clones, hibridomas e clulas tumorais de linfcitos T e B. No entanto, a expresso das isoformas da NOS em linfcitos T e B primrios permanece ainda por esclarecer (Bogdan, 2001). O uso de dadores de NO, de inibidores da NOS e a anlise de murganhos geneticamente modificados e deficientes na sintase do monxido de azoto tem demonstrado claramente que o NO governa uma srie de eventos no sistema imunolgico. Entre estes, incluem-se a diferenciao, proliferao e apoptose de clulas do sistema imunolgico, os efeitos imunossupressores, a produo de citocinas e quimiocinas, a expresso de molculas de adeso e co-estimuladoras e ainda a sntese e deposio de componentes da matriz extracelular (Bogdan, 2001). A produo de NO e a expresso da iNOS ocorre em clulas dendrticas, aps estimulao por bactrias e parasitas (Stenger et al., 1996; Dalpke et al., 2002; Rescigno et al., 2002; Norimatsu et al., 2003). Estudos recentes sugerem que as DC tm uma aco citotxica directa em linhas celulares tumorais por mecanismos que dependem parcialmente do monxido de azoto (Shimamura et al., 2002; Yang et al., 2002). O NO produzido pelas prprias DC pode modular as suas funes, designadamente a captao de antignios (Paolucci et al., 2000) e a apresentao de antignios a linfcitos (Hoffman et al., 2002). O monxido de azoto pode ainda inibir a proliferao de linfcitos (Lu et al., 1996; Yamamoto et al., 1998; Ozaki et al., 2002), ou mesmo induzir apoptose de linfcitos T e timcitos (Bonham et al., 1997; Xu et al., 1999; Aiello et al., 2000), assim como das prprias DC (Lu et al., 1996; Stanford et al., 2001). Em resumo, o monxido de azoto produzido por clulas dendrticas parece
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Captulo 1 modular as respostas imunolgicas dos linfcitos, sendo, por estas razes, considerada uma molcula crucial na imunidade inata e adquirida mediada pelas DC. Na pele o NO produzido por diferentes clulas residentes, designadamente queratincitos (Heck et al., 1992; Shimizu et al., 1997), melancitos (Rocha e Guillo, 2001), fibroblastos, clulas endoteliais, e clulas dendrticas da pele, as clulas de Langerhans (Bull et al., 1996; Qureshi et al., 1996; Mohenn, 1997; Ross et al., 1998). Este gs inorgnico um mediador autcrino e parcrino de processos muito diversos e complexos que ocorrem na pele (Bruch-Gerharz et al., 1998). Deste modo, o NO est envolvido na manuteno da homeostasia da pele (Krischel et al., 1998), na regulao da vasodilatao, na produo de melanina, na imunidade contra agentes patognicos e ainda na cicatrizao da pele (Heck et al., 1992; Thornton et al., 1998; Abd-El-Aleem et al., 2000; Frank et al., 2000; Witte e Barbul, 2002). A produo exagerada de NO tem sido demonstrada em patologias da pele, designadamente psorase (Sirsj et al., 1996; Morhenn, 1997; Rowe et al., 1997), dermatite atpica e dermatite de contacto alrgica (Ormerod et al., 1997; Ross et al., 1998; Ross e ReskeKunz, 2001; Sahin et al., 2001; Wallengren e Larsson, 2001). O papel do NO na dermatite de contacto alrgica (DCA) extremamente complexo. Em baixas concentraes o NO pr-inflamatrio, na medida em que induz vasodilatao e responsvel pelo recrutamento de neutrfilos. Em concentraes elevadas o NO diminui a expresso de molculas de adeso, suprime a activao e induz apoptose de clulas inflamatrias (Coleman, 2001). Estudos in vivo demonstram que a aplicao de cremes capazes de libertar NO promovem a inflamao (Ormerod et al., 1999), enquanto que cremes contendo inibidores da iNOS inibem a inflamao (Morita et al., 1995). A expresso da isoforma iNOS induzida durante a DCA (Ormerod et al., 1997; Ross et al., 1998; Sahin et al., 2001) e num modelo de DCA, provocado em murganhos pelo antignio de contacto DNFB, foi demonstrada a produo de NO pela iNOS (Ross et al., 1998). De acordo com estes estudos, a

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Introduo injeco de inibidores da iNOS por via intradermal suprime a DCA. Contudo, murganhos deficientes em iNOS desenvolvem uma resposta agravada na fase efectora da DCA, sugerindo que o NO est envolvido na resoluo clnica da DCA (Ross e Reske-Kunz, 2001) e reforando, deste modo, a complexidade do envolvimento do monxido de azoto nesta patologia cutnea.

1.5. Objectivos do trabalho Este trabalho teve como objectivo identificar algumas vias de sinalizao intracelular activadas nas clulas apresentadoras de antignio, designadamente clulas dendrticas da pele, aps o contacto com lipopolissacardeo (LPS), com citocinas e com alergnios de contacto. Como modelo experimental utilizou-se uma linha celular imatura, precursora das clulas dendrticas da pele de feto de murganho (FSDC). O monxido de azoto (NO) produzido pela isoforma indutvel da sintase do monxido de azoto (iNOS) durante a resposta imunolgica e modula as funes das clulas dendrticas, designadamente a captao e a apresentao de antignios aos linfcitos T. A expresso da iNOS e de vrias protenas envolvidas na resposta imunolgica modulada pelo factor nuclear de transcrio kappa B (NF-B), que se sabe estar envolvido na diferenciao, maturao e sobrevivncia das clulas dendrticas. O trabalho realizado nesta dissertao teve por objectivo o estudo do efeito do LPS na produo de NO e na expresso da isoforma indutvel da sintase do monxido de azoto (iNOS), bem como o estudo dos eventos de sinalizao intracelular activados por esta endotoxina, designadamente a activao do NF-B (captulo 3). O efeito do factor estimulante de colnias de macrfagos e granulcitos (GMCSF), uma citocina epidrmica, na produo de NO e na expresso da iNOS foi

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Captulo 1 tambm investigado. Foram, ainda, alvo de estudo os eventos de sinalizao intracelular activados pelo GM-CSF, designadamente a activao do NF-B (captulo 4). Neste trabalho foi tambm investigado o efeito de dois alergnios de contacto (2,4-dinitrofluorbenzeno e nquel), causadores de dermatite de contacto alrgica, na produo de NO, na expresso da iNOS e na activao do NF-B (captulo 5).

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