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Diagnstico de infeces virais

Diagnstico de infeces virais


Duas formas: - buscar o vrus ( ou seus efeitos) ou - buscar a resposta do organismo (especialmente anticorpos)

1- na busca do vrus

Diagnstico de viroses
Sinais

clnicos Deteco do vrus, antgenos ou genomas


Isolamento (+ deteco imunolgica) Quantificao (contagem de placas, DICC50) PCR Hemaglutinao (HA) ELISA Deteo imunolgica (IH ou IF) Microscopia eletrnica

Cultivo e identificao de vrus


- inoculao em animais - inoculao em ovos embrionados - cultivos celulares - mtodos imunoqumicos - microscopia eletrnica

Cultivos celulares
- cultivos primrios (clulas diplides) - linhas celulares (diplide, 40 passagens ) - clulas de linhagem (nmero de passagens indefinido)

CULTIVO DE VRUS

IN VITRO

- Vidro - Plstico - Garrafas Fechadas Ou Abertas (CO2) Garrafas Estacionrias Ou Rolantes Tubos de vidro ou plstico Tubos com lamnulas (tubos de Leighton) Placas de microtcnica 6, 12, 24, 96 orifcios

EFEITO TICO (ECP): EFEITO CITOP CITOPTICO (ECP):


o dano que o vrus causa clula ! - lise - arredondamento - vacuolizao - formao de sinccios - incluses - picnose - apoptose

ME (varredura)

Efeito citoptico

Herpesvrus (colorao por imunoperoxidase)

Efeitos citopaticos (ECP)

Controles

Colorao do ECP por Hematoxilina-eosina (HE)

Deteco de vrus

Clulas em cultivo
Efeito citoptico

Imunofluorescncia (anticorpo marcado)

Quantificao de vrus (formao de placas)

placas

Contagem de placas (unidades formadoras de placas ou plaque forming unit/ml), ou pfu

Quantificao de vrus Doses infectantes para cultivos celulares (DICC50)


10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

DICC50 = 104

50% Dose infectante para 50% dos cultivos celulares

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

+ + +

+ + +

+ + + +

+ + + +

Hemaglutinao (HA)

com vrus
hemcias se entrelaam e aderem s paredes

Sem vrus
Hemcias livres sedimentam

Hemaglutinao (HA)
Infelizmente, Nem todos os vrus hemaglutinam ! Alguns: Influenza ( gripe) Rubola Parvovrus Coronavrus Vrios arbovrus Adenovrus e vrios outros Parvo B19

Rubola

Arbovrus

Hemaglutinao (HA)

Hemaglutinao
Diluio
2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 Sem vrus

prozona

ttulo

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA DE CAPTURA)


Amostra a ser testada para a deteco de vrus

Enzima +Substrato solvel= cor no lquido

vrus

Anticorpo Detector

Anticorpo de captura

Exemplos de ELISAs

Imunoperoxidase (IPX)
Soro com anticorpos contra o vrus Enzima Anticorpo Detector Substrato insolvel clulas coradas

Microscpio

Clulas infectadas com vrus

Imunoperoxidase (IPX)
Material infectado (clulas ou tecidos) + soro especfico (ex: soro humano) + conjugado anti-IgG especfico (ex. anti-IgG humana conjugado peroxidase) + substrato apropriado ( ex carbazol) ______________________________________________ = reao colorida

Imunoperoxidase

Herpesvrus (colorao por imunoperoxidase)

Imunoperoxidase

Imunoperoxidase (IPX)

Negativo

Positivos

Deteco imunolgica
Imunohistoqumica (IPX) Imunofluorescncia

Antgenos de herpesvrus em cls. endoteliais

Herpesvrus em cultivo celular

Imunofluorescncia Direta
anticorpo marcado sobre material infectado material infectado (suspeito) + anticorpo especfico marcado com FITC + luz UV ________________________________________ reao colorida

Imunofluorescncia
Indireta
Material infectado (clulas ou tecidos) + soro especfico (ex: soro humano) + conjugado anti-IgG especfico (ex. anti-IgG humana/FITC) + luz UV ______________________________________________ = reao colorida

Imunofluorescncia- Herpes

Western blot (para a deteco de antgenos)

ANLISES COM ANTICORPOS MONOCLONAIS (Acms) Acms


Virus Tipo BHV-1 Colorado EVI 123/93 SV 265 BHV-5 V175 (semen) EVI 088/95 A663 N569 Amostra BD10 2G5 5A5 7F12 11H6

Reao da polimerase em cadeia (PCR)


primers

DNA viral

Primeiro ciclo

Segundo ciclo

20-40 ciclos

Milhes de cpias

Ndulos linfticos: HIV Swab cervical: HIV, HPV Sangue total: HIV, CMV Plasma, soro: HIV, HTLV, HCV, HBV Liquido cefalorraqudeo: enterovirus Esputo, saliva, aspirado naso-farngeo: VRS, Influenza Materia fecal: Rota

EXTRAO DE ACIDOS NUCLEICOS qumicos: tiocianato de guanidina proteinase K detergentes fsicos: temperatura agitao centrifugao

PURIFICAO lavados ACIDO NUCLEICO DNA ou RNA

PRECIPITAO alcool e sais

Amplificao pela reao da polimerase em cadeia (PCR)

DNA FITA DUPLA DESNATURAO

4 PRIMEIROS CICLOS DA PCR: 4 primeiros ciclos fragmento a amplificar

HIBRIDIZAO

POLIMERIZAO

53

ADN

n de cadeias ciclo 1 duplicadas 4 de comprimento 0 correto:

ciclo 2 0

ciclo 3 2

ciclo 8

MODIFICAES da PCR

RT-PCR
RNA ADN fs RT AAAAA AA

Nested-PCR

Multiplex

ADN fd PCR par de primers PCR par de primers

ADN fd

1er PCR DNA fd 2do

PCR Possveis mltiplos pares de primers

Gel de ARN Rotavirus

Gel de PCR (influenza)

Anlise do DNA viral com enzimas de restrio


Lam SV265 Lam gE- 265 gE30
A B C D E F G, H, I J K L

20 15 10

6 4 3

Kbp

HERPESV RUS RFLP HERPESVRUS RFLP


BHV

Kb 23,1

5a

5a

5a

5a

5a 5a

5a 5a

Kb 23,1

- RFLP
9,4 9,4 6,5

6,5

4,4

4,4

2,3 2,0

2,3 2,0

BamHI

BstEII

EcoRI

HindIII

At aqui, s vimos mtodos de deteco do agente ! Como podemos detectar anticorpos?

2- na busca de anticorpos

Diagnstico de viroses

Quando os sinais clnicos j passaram Quando houve algum contato com o vrus Deteco de anticorpos:
(usualmente soro ou LCR) Soro-neutralizao Imunodifuso Inibio da hemaglutinao (IH) Hemaglutinao passiva Imunoperoxidase para anticorpos Imunofluorescncia indireta ELISAs (diversos) Western blot outros

Diagnstico sorolgico: Porqu amostras de soro pareadas ?

2- na busca dos anticorpos


Nvel de Anticorpos

D o e n a 0

IgM

IgG Anticorpos AnticorposIgG

30

60

90

Dias

Deteco de exposio ao vrus (sorologia)

Soro/Vrus neutralizao
Diluir o soro seriadamente: ex:
1/2 1/4 1/8 1/16.1/512 Adicionar volume igual de vrus (100 DICC50) a cada tubo ( ou orifcio da placa) Incubar a 37oC Colocar mistura sobre clulas ltima diluio que evita multiplicao viral o ttulo

--

1/2

1/4

1/128

1/256

1/512

Sem soro

IMUNODIFUSO

Soro c/anticorpos anti- H3N2 (reao cruzada parcial

Antgeno

Soro c/anticorpos ou s/anticorpos

Antgenos

Identidade

IMUNODIFUSO
Sem identidade

Soro controle + +

?
Ag +

?
+

?
Soros em teste

Identidade

Hemaglutinao (HA)

com vrus
hemcias se entrelaam e aderem s paredes

Sem vrus
Hemcias livres sedimentam

Inibio da Hemaglutinao (HI)

Inibio da HA (ou IH)


Ac

Inibio da Hemaglutinao
Controle Vrus HA

Diluies
8 sem 1 sem do soro

1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280


Controle negativo

Hemaglutinao passiva (Coombs)

Usada para antgenos no hemaglutinantes ou Para anticorpos Antgenos adsorvidos a hemcias

AGLUTINAO EM LTEX

Diluente Ltex com Ag adsorvido Soro com Acs

Lmina de vidro

POSITIVO soro +

NEGATIVO soro -

Imunoperoxidase para anticorpos (IPX/Ac)


Material infectado conhecido (clulas ou tecidos) + soro suspeito (ex: soro humano) ou LCR, ou outro(?) + conjugado anti-IgG especfico (ex. anti-IgG humana conjugado peroxidase) + substrato apropriado ( ex carbazol) ______________________________________________ = reao colorida

Imunoperoxidase para anticorpos (IPX/Ac)


Soro suspeito +? -? Enzima Anticorpo Detector Substrato insolvel clulas coradas

Microscpio

Clulas infectadas com vrus

ELISA INDIRETO
Soro a ser testado para anticorpos Enzima => cor Anticorpo Detector

Antgeno aderido placa

ELISA de bloqueio
Enzima Soro suspeito +? -? onde ligar ? ? Anticorpo Detector Substrato solvel sem cor

Microscpio

Clulas infectadas com vrus

Lisado de Virus

ELISA Indireto
1 GERAO
Ag celular Ac paciente
E

Substrato

Cor

Ac anti IgG humana Marcada com Enzima

Reaes Falso positivas

Artrite reumatide Anti- HLA No detecta baixos ttulos de anticorpos Somente detecta IgG

Soporte Solido

ELISA Indireto
2 GERAO
Proteinas recombinantes
HIV-2 env HIV-1 env
HIV-1gag

Substrato

Ac paciente

Cor
Ac anti IgG humana Marcado com Enzima
E

Reduo de falsos

positivos

Deteco de Ac anti HIV-1 e HIV-2 No detecta baixos ttulos de Anticopos Somente detecta IgG
HIV-1 env HIV-1 env HIV-2 env HIV-2 env HIV-1 env
HIV-1gag HIV-1gag

HIV-2 env

HIV-1gag

Suporte Solido

ELISA SANDWICH
3 GERAO
Proteinas recombinantes Peptidos sinteticos
HIV-2 env HIV-1 env
HIV-1gag

Substrato

Ac paciente

HIV-2 env

v -1 en HIV l 1 po HIV-

HIV-1 pol

-2 e

HIV

Suporte Solido

HIV-1 env
nv

E
Boa especificidade Deteco de Ac anti HIV-1 e HIV-2 Detecta baixos ttulos de Anticorpos Detecta IgG e IgM
HIV-1 env HIV-2 env
HIV-1gag

HIV-1 env

HIV-2 env

HIV-1gag

ELISA 4 GERAO
Substrato

Proteinas recombinantes

HIV-2 env HIV-1 env


HIV-1gag

Peptidos sinteticos

HIV-O

HIV-2

Ac paciente

Ag viral

Ac conjugado

Muito boa especificidade


v 1 en HIVl 1 po HIV-

-2 e

nv

v -1 en HIV l 1 po HIV-

HIV

v 2 en

HIV-

Suporte Solido

HIV-O

Detecta baixos ttulos de anticorpos Boa sensibilidade para Ac. anti HIV-2 e Ac anti-grupo M e O de HIV-1 Detecta IgG e IgM Detecta antgenos virais tambm (HIV-1 y HIV-2)

E
HIV-2

HIV-1 env

HIV-2 env

HIV-1gag

Imunofluorescncia
Indireta para a deteco de anticorpos:

Material infectado conhecido (clulas ou tecidos) + soro suspeito (ex: soro humano) + conjugado anti-IgG especfico (ex. anti-IgG humana conjugado fluorescena) + luz UV ______________________________________________ = reao colorida

Imunofluorescncia Indireta- Herpes


Diluies do soro em teste 1:10 1:20 1:40

Titulando um soro com anticorpos

TESTES RPIDOS

Western blot (para a deteco de anticorpos)


Western Blot

Critrios: WB Positivo: p24,gp41,gp120/160 (pelo menos 2 bandas) WB Negativo: Ausencia total de bandas

Limitaes da sorologia
exposio, mas no quando ela ocorreu !!! Para correlao com a doena:
Detecta

Soros pareados IgM Lquido cfalo raquidiano

FIM
(POR HOJE!)

Vacinas vivas: com amostras vivas atenuadas ou modificadas quantidade de vrus pequena multiplicao no organismo do hospedeiro nmero de imunizaes menor

Vacinas inativadas: com amostras inativadas ou mortas quantidade de vrus grande no se multiplicam no hospedeiro necessitam adjuvantes imunizaes repetidas

Efeito da vacinao e doses de reforo nos nveis de anticorpos


Anticorpos

2a

3a

4a

1a

A presena de anticorpos indica: contato prvio com o agente, ou - vacinao


-

Infeces Persistentes
- aps infeces in tero - vrus no reconhecido como estranho - hospedeiro dissemina vrus - hospedeiro pode no desenvolver anticorpos

O QUE INFECO LATENTE ?


- ocorre nas infeces por herpesvrus - vrus aloja-se no gnglio nervoso ou clulas do sistema imune

- sem leses aparentes - periodicamente reativado - periodicamente dissemina vrus ao meio ambiente