LA HABANA, CUBA 2011

PhD Claudio Rodrguez Martnez, Centro Nacional de Biopreparados claudio@biocen.cu

CONTROL DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS

CC de los Reactivos
Cada nuevo lote de reactivos, discos, tintes, antisueros y sistemas de identificacin Cepas para comprobar positivas y negativas Documentar los resultados
PhD Claudio Rodrguez Martnez

reacciones

Control de calidad del agua destilada Para la preparacin de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua destilada* que haya sido sometida a:

AGUA: PRINCIPAL REACTIVO

controles peridicos que aseguren su calidad:

- Conductividad 25 (microohms)cm 0,4 Mcm de resistividad (o < 1,3 para agua purificada) determinados a 25 C - pH = 5,5 7,5 - Contaminacin microbiana (recuento heterotrficos <1000 ufc/ml - no estril), preferiblemente < 100 ufc/ml (22 C/68 4 h) - Ausencia de sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes - Olor - Color aparente - Turbidez - Dixido de carbono o carbono orgnico total (< 1 - 10 mg/l) - Dureza - Iones (ej. Cl residual <0,01 mg/l) - Cationes (ej. Na < 1 mg/l - Metales pesados (< 1 mg/l) - Metales pesados individuales (Pb, Cd, Cr, Cu, Ni, Zn < 0,05 mg/l cada/u) - Amonio (N orgnico < 0,1 0,2 mg/l) - Nitratos < 0,2 mg/ml

Se debe llevar un registro actualizado de los mismos

Rodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Medios de Cultivo. Curso Maestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011

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AGUA: PRINCIPAL REACTIVO limitaciones estudio profundo ?

Se recomienda el siguiente mtodo sencillo y apropiado para determinar la calidad del agua, aparte de la determinacin de su pH

Reactivos: a) Solucin acuosa de nitrato de plata (NO3Ag ) NO3Ag ......... 5.1 g Agua destilada ............ 300 ml b) Acido ntrico Mtodo: Colocar en un vaso qumico limpio: 10 ml de agua destilada a examinar 2 gotas de cido ntrico 1 ml de solucin de NO3Ag

Evaluacin: El agua deber continuar completamente clara. Si aparece una ligera turbidez blanquecina, indicar que la calidad es deficiente.

Manual de Tcnicas Bsicas OPS/OMS N 439, pg. 58. Control de Calidad Microbiolgico del Agua Destilada. 1983 http://www.plusformacion.com/Recursos/r/Manual-control-calidad-microbiologia. Visitado 6.04.2011. http://www.monografias.com/trabajos75/manual-control-calidad-microbiologia/manualcontrol-calidad-microbiologia3.shtml. Visitado 04.04.2011. 12.41.

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AGUA: PRINCIPAL REACTIVO ENSAYOS PARA COMPROBAR AUSENCIA DE CONTAMINACIN MICROBIANA

Agregar 1 mL de agua destilada a examinar a un tubo de Caldo tioglicolato. Agregar 1 mL de agua destilada a examinar a una placa de agar sangre. Incubar a 35 C por 4 das. Llevar un libro rcord del control de calidad del agua.
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ISO 17025: 1999

FRECUENCIA DE MUESTREO DE OTRAS PRUEBAS Y REACTIVOS Prueba Reactivos, discos y tiras Catalasa Oxidasa Coagulasa Beta lactamasa (cefinasa) Solubilidad (bilis) Deteccin de antgenos bacterianos LAP PYR Nuevo lote + cada da de uso Nuevo lote + cada da de uso Nuevo lote + cada da de uso Nuevo lote + cada da de uso Nuevo lote + cada da de uso Nuevo lote + cada da de uso Nuevo lote + cada da de uso Nuevo lote + cada da de uso Frecuencia

Grupo colaborador GEGMIC. Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiologa Clnica CCI-SEIMC-00. 16-05-04 Versin: 1

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FRECUENCIA DE MUESTREO DE OTRAS PRUEBAS Y REACTIVOS Prueba Novobiocina Bacitracina Optoquina ONPG Factores X, V y XV Tributirina cido nalidxico para Campylobacter ID Antisueros Juegos o galeras de identificacin Frecuencia Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada semana de uso Nuevo lote + una vez cada mes de uso Segn el fabricante

Grupo colaborador GEGMIC. Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiologa Clnica CCI-SEIMC-00. 16-05-04 Versin: 1

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MICROORGANISMOS DE ENSAYO Y RESPUESTAS Reactivo

Indol Indol (rpido) Oxidasa Catalasa (H2O2) ONPG (galactosidasa) Indoxilacetato

M.O.
E. coli K. pneumoniae E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa E. coli S. aureus S. agalactiae E. coli P. mirabilis C. jejuni C. lari

Reaccin
Positiva: anillo rojo en la superficie Negativa: sin anillo rojo en la superficie Positiva: azul verdoso Negativa: sin cambio de color (2 min) Positiva: prpura (30 s) Negativa: sin cambio de color Positiva: formacin de burbujas Negativa: sin burbujas Positiva: amarillo Negativa: sin cambio de color Positiva: azul verdoso Negativa: azul plido

Grupo colaborador GEGMIC. Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiologa Clnica CCI-SEIMC-00. 16-05-04 Versin: 1

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MICROORGANISMOS DE ENSAYO Y RESPUESTAS

Reactivo Coagulasa PYR Optoquina CAMP M.O. S. aureus S. epidermidis E. faecalis S. agalactiae S. pneumoniae S. mitis S. agalactiae S. pyogenes Bacitracina S. pyogenes E. faecalis Bilis, solubilidad S. pneumoniae E, faecalis Hipurato C. jejuni E. faecalis Reaccin Positiva: formacin de cogulo (4 h) Negativa: no formacin de cogulo (4 h) Positivo: rosa o naranja-rojo Negativo: sin cambio de color o ambar Sensible: 14 mm Resistente: 6 mm Positiva: hemlisis ms intensa en el inicio de la flecha Negativa: hemlisis sin cambio de intensidad Sensible: halo de inhibicin (24 h) Resistente: sin halo de inhibicin (24 h) Soluble: no se observa colonia Insoluble: colonia ntegra Positiva: azul prpura Negativa: sin cambio de color o amarillo
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Grupo colaborador GEGMIC. Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiologa Clnica CCI-SEIMC-00. 16-05-04 Versin: 1

MICROORGANISMOS DE ENSAYO Y RESPUESTAS

Reactivo Factores V, X y XV Seroagrupacin de Streptococcus betahemolticos

M.O. H. influenzae S. pyogenes S. agalactiae S. dysgalactiae subs. equisimilis C S. faecalis

Reaccin Positiva: crecimiento entre X y V (24 h) crecimiento alrededor de XV (24 h) Positivo: aglutinacin slo con grupo A Positivo: aglutinacin slo con grupo B Positivo: aglutinacin slo con grupo C Positivo: aglutinacin slo con grupo D

S. dysgalactiae Positivo: aglutinacin slo con grupo G subs. equisimilis G

Grupo colaborador GEGMIC. Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiologa Clnica CCI-SEIMC-00. 16-05-04 Versin: 1

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CONTROL DE LA CALIDAD DE LOS TINTES

Preparar placas con microorganismos aislados en el trabajo rutinario, utilizando cepas frescas
Reactivo Gram Gram Gram Zielh-Neelsen Zielh-Neelsen Kellung Kellung Verde malaquita Verde malaquita M.O. Staphylococcus sp. E. coli Mezcla de ambos Mycobacterium sp. E. coli S. pneumoniae E. coli Clostridium sp. E. coli Indicador Morado Rosado Mezcla de ambos colores Rosadas Azul Deteccin de cpsula positiva Deteccin de cpsula negativa Espora de color verde. Resto de la clula rosada Clula completa rosada BAAR positivo BAAR negativas Respuesta esperada Gram-Positivo Gram-Negativo

Pezzlom, ed. Aerobic Bacteriology. In: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology. Procedures Handbook. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992:1.5.1-1.5.18.

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ALGUNAS CAUSAS DE ERROR DURANTE EL CONTROL DE LA CALIDAD DE LOS TINTES

Si

se observa precipitacin (ejemplo del violeta cristal, proceda a filtrar el tinte).

La

evaporacin puede ser causa de mal funcionamiento de los tintes.

Las placas o lminas que no han sido previamente limpiadas o con

restos de grasa, pueden ser causa de mala fijacin y deficiente tincin de la muestra.

Sobrecalentamiento

de la placa o lmina durante la fijacin. El exceso de calor provoca un dao fsico en la pared celular de las bacterias que puede afectar la retencin de los colorantes.

Lavado muy fuerte de la placa durante la tincin.

Caballero JE. Manual de control de calidad en Microbiologa clnica. Monografias.com. http://www.monografias.com/trabajos/mmbiologia/mmbiolo gia.shtml. Visitado 04.04.2011. 1.46 am

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ALGUNAS CAUSAS DE ERROR DURANTE LA TINCIN (continuacin)

Proporcin no adecuada de los componentes de la tincin. Algunos

tintes como safranina y fucsina bsica pueden contaminarse. Si se sospecha esto, cultive 1 ml en tioglicolato, o descarte el tinte.

Caballero JE. Manual de control de calidad en Microbiologa clnica. Monografias.com. http://www.monografias.com/trabajos/mmbiologia/mmbiologia.shtml. Visitado 04.04.2011. 1.46 am

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CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS MEDIANTE DISCO

condiciones

Mtodo de Kirby-Bauer modificado Discos de dimetro = 6.35 mm Discos de potencia correcta pH del AMH = 7.2 - 7.4 Inculo estandarizado contra patrn de turbidez Medicin exacta de zonas
CLSI M 100-S18

Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Supplement M 100-S18. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA. 2008. Vol. 28, No. 1.

cepas ATCC recomendadas

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Haemophilus influenzae ATCC 49247 y 49766 Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 E. coli ATCC 25922 E. coli 35218 Staphylococcus aureus ATCC 25923 y ATCC 29213 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Enterococcus faecalis ATCC 29212

Microbiology QA Practices and Procedures. Laboratory Quality Assurance Program. College of Physicians and Surgeons of Saskatchewan. 2004

(Para ser utilizado con discos de alto contenido de aminoglucsidos)

Pasados 30 das

1 vez por semana

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ANTISUEROS DE AGLUTINACIN

o Emplear cepas de coleccin o Usar cultivos puros, frescos, de reactividad conocida aislados o Aplicar suero negativo, suero dbilmente reactivo, altamente reactivo
TML\MSH Microbiology Department. Policy & Procedure Manual. MI\QC\v03. Section: Quality Control Manual Subject. 2001 PhD Claudio Rodrguez Martnez

AGLUTINACIN POR ANTGENOS DE ESTREPTOCOCOS

El resultado positivo se revela por la aparicin de una aglutinacin ntida de ltex en 2 min en un crculo No tomar en cuenta las aglutinaciones dbiles que pudieran aparecer Una aglutinacin intensa en varias suspensiones de ltex, representa una mezcla de grupos o una cepa autoaglutinable. Volver a hacer el aislamiento de la colonia y el test de ltex Analizar utilizando cepas control como Streptococcus pyogenes ATCC 19615
TML\MSH Microbiology Department. Policy & Procedure Manual. MI\QC\v03. Section: Quality Control Manual Subject. 2001

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AGLUTINACIN POR Salmonella sp. Sea estricto en el tiempo de la reaccin. Miembros del grupo Salmonella estn antignicamente relacionados a Citrobacter y Arizona. Los antgenos de stos microorganismos tienen estructuras compartidas, por lo que puede haber reacciones cruzadas. Por esto es importante que la prueba de aglutinacin por Salmonella solo se realice a aquellas cepas que muestran un patrn bioqumico del gnero Salmonella.
TML\MSH Microbiology Department. Policy & Procedure Manual. MI\QC\v03. Section: Quality Control Manual Subject. 2001 PhD Claudio Rodrguez Martnez

TENGA EN CUENTA

OTROS INGREDIENTES DE LOS MEDIOS A CONTROLAR

peptonas y extractos agar

(variables en su valor nutritivo)

(variable en su capacidad gelificante y pureza)

sustancias amortiguadoras de pH
(variables en su pH y capacidad amortiguadora)

sales biliares, bilis, desoxicolato de sodio,

colorantes (diferente poder de inhibicin)

ISO/TS 11133-2:2000

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Reactividad del agar

Preparar 100 ml de caldo nutritivo, al cual se adiciona 1.5 g de agar. Reposar 15 min Calentar agitando frecuentemente hasta ebullicin durante 1 min Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min. Enfriar aproximadamente a 45 C y verter en placas de Petri estriles. Sembrar por estra cruzada, cultivos puros de 24 h de los siguientes microorganismos: Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 Incubar 24 h a 35 C Resultado esperado: Buen crecimiento de los microorganismos de prueba

DIBICO. MEDIO DE CULTIVO. Bacteriologa General. Catlogo 1001

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Ensayos y criterios de aceptacin del agar

Color: blanco crema Textura: polvo fino Cenizas: 3 5 % Prdida por desecacin: < 10% pH sol. al 1,5 %: 5,5 7,5 Fortaleza de gel: 600 - 800 g/cm2 Punto de gelificacin: 35 39 C Punto de fusin: 80 90 C Cuenta total: < 1000 ufc/ml
Davis LG, Dibner MD, Battey JF. 1986. Basic methods in molecular biology. Elsevier, New York, N.Y. Ausubel FMR, Brent R, Kington E, Moore D, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. 1994. Current protocols in molecular biology, vol. 1. Current Protocols. New York, N.Y. PhD Claudio Rodrguez Martnez

CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUPLEMENTOS

sangre en general sangre de carnero

Cada vez que se reciba Esterilidad un nuevo lote Homogeneidad Viscocidad Color Apariencia, Presencia de cogulos Hemlisis Determinacin de hemoglobina (entre los 13.0 - 15.0 g/dl) Siembra en agar sangre y tioglicolato para determinar su esterilidad Examinar el agar sangre preparado con sangre de carnero, por adecuada formacin de hemlisis, especialmente utilizando estreptococos hemolticos
Basu S y col. Quality control of culture media in a microbiology laboratory. DesaiR&D Department, Microbiology Division, Span Diagnostics Ltd., Udhna, Gujarat, India 2005; 23(3): 159-63. Manual de control de calidad en Microbiologia clnica. El Centro de Tesis. 1997. Monografias.com S.A.

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EL ESTANDAR McFARLAND

Tubos de vidrio que contienen 1 % de Cl2Ba + cantidades crecientes de SO4H2 al 1 % precipitado de SO4Ba turbidez Para cada cepa bacteriana - equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentracin de bacterias (en clulas/ml)
Rodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Medios de Cultivo. Curso Maestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011

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EL ESTANDAR McFARLAND
1)

La densidad de la turbidez del Estndar McFarland deber ser verificada utilizando un espectrofotmetro con direccin de luz adecuada y cubetas apropiadas para determinar absorbancia. Para realizar el control de un estndar McFarland de 0.5, la absorbancia se deber registrar entre 0.08 a 0.10 a una longitud de onda de 625 nm. La suspensin de sulfato de bario deber transferirse en alcuotas de 4 a 6 ml dentro de tubos con rosca. Estos tubos debern guardarse a temperatura ambiente en un lugar fresco y oscuro. Antes de ser empleados, los patrones debern agitarse para una adecuada homogeneizacin. Mensualmente los patrones son descartados y vueltos a preparar, o en su defecto se debe comprobar su densidad.
PhD Claudio Rodrguez Martnez

2)

3)

4)

5)

VIDA TIL EN ESTANTE DE LOS REACTIVOS MICROBIOLGICOS

Prueba Vida til recomendada y perodo de re-evaluacin durante el perodo 1 ao/6 meses 2 aos/12 meses 1 ao 1 ao 1 ao 1 ao Segn el fabricante Segn el fabricante Segn el fabricante

Reactivos Discos antimicrobianos (a 20 C) Lminas Tinciones Factores X, V y XV Catalasa, oxidasa, beta lactamasa Test de DNA Antisueros Juegos o galeras de identificacin

Pezzlom, ed. Aerobic Bacteriology. In: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology. Procedures Handbook. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992:1.5.1-1.5.18.

PhD Claudio Rodrguez Martnez

VIDA TIL EN ESTANTE DE LOS REACTIVOS MICROBIOLGICOS

Prueba Reactivos Discos antimicrobianos (a 20 C) Lminas Tinciones Factores X, V y XV Catalasa, oxidasa, beta lactamasa Test de ADN Antisueros Juegos o galeras de identificacin
Pezzlom, ed. Aerobic Bacteriology. In: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992:1.5.1-1.5.18.

Vida til recomendada y perodo de re-evaluacin 1 ao/6 meses 2 aos/12 meses 1 ao 1 ao 1 ao 1 ao Segn el fabricante Segn el fabricante Segn el fabricante

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RESUMEN DE LO TRATADO
El laboratorio debe tener un programa, procedimientos, protocolos y registros para el CC de los medios, el agua y los reactivos. El CC debe abarcar todo el procedimiento, desde la recepcin hasta el descarte, y depender del propsito del medio y del mtodo. Las normas, guas y regulaciones ofrecen diferentes posibilidades que deben ser adecuadas a la experiencia de los laboratoristas y condiciones de cada laboratorio. El CC de los medios debe incluir parmetros fsico-qumicos, funcionales y de esterilidad. El esquema de CC depende de la fuente de suministro, y se simplifica si se adquieren de proveedores certificados y en forma de MLPU.
PhD Claudio Rodrguez Martnez