Fitoqumica e Farmacognosia II

TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira

leos Essenciais
Os leos essenciais compreendem uma mistura de substncias volteis extrada de plantas. So lquidos temperatura ambiente, volatizveis, o que os diferencia dos leos fixos. Muito raramente tm cor. Possuem uma densidade inferior da gua (exceo: leos essenciais do sassafrs e da canela) So arrastveis com o vapor de gua, mas so pouco solveis nela.

1. Pesquisa de algumas falsificaes 1.1 Pesquisa de falsificao pelo lcool Fcil falsificao pois os leos essenciais e o lcool so miscveis a) Ensaio da fucsina Procedimento 1 Colocar 2 mL de leo essencial num tubo de ensaio seco; 2 Tapar com algodo que contenha um fragmento de fucsina; 3 Aquecer o tubo de ensaio em banho-maria fervente (permite que a zona de condensao do lquido volatizado atinja o algodo) Resultado leo Essencial falsificado: observa-se o algodo tingido de vermelho Porqu? Se o lcool etlico estiver presente este aps o aquecimento volatiliza e ao condensar no algodo, vai dissolver o fragmento de fucsina, j que esta solvel a solues aquosas.

leo Essencial no falsificado: no se observa qualquer tipo de colorao no algodo Porqu? No estando presente nenhum componente aquoso na amostra, os leos essenciais, mesmo ao volatizarem no vo dissolver a fucsina, no tingindo deste modo o algodo.

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira 1.2 Pesquisa de leos, gorduras e resina b) Ensaio da mancha no papel Procedimento 1 Pegar num fragmento de papel de filtro; 2 Depositar no papel 2 gotas de leo essencial; 3 Colocar o papel de filtro numa estufa aquecida a 100 C, durante 30 min Resultado leo Essencial falsificado: aparecimento de uma mancha translcida persistente Porqu?

leo Essencial no falsificado: no visvel nenhuma mancha translcida que persista Porqu?

NOTA: um perfume se deixar uma mancha na roupa significa que tem gorduras ou resinas na sua constituio

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira 2. Determinao do perfil qualitativo de um leo essencial (leo essencial de hortelpimenta) por cromatografia em camada fina Hortel- pimenta: folhas destiladas de Mentha x piperita L. Solvente: tolueno Fase mvel: tolueno:acetato de etilo (95:5) Fase estacionria: slica GF254R Revelador: mistura vanilal-cido sulfrico Procedimento 1. Preparao da soluo problema Dissolver 0,1 g de amostra em tolueno R, num balo de 10mL Completar o volume com tolueno 2. Preparao da soluo padro Dissolver 50 mg de mentol em tolueno R, num balo de 10mL Completar o volume com tolueno 3. Preparar revelador Soluo I: preparar uma soluo a 5% de cido sulfrico em etanol (5 mL de cido sulfrico e 100 mL de etanol) Soluo II: preparar soluo a 1% de vanilina em metanol (1 mL de vanilina e 100 mL de metanol) 4. Preparao da cmara cromatogrfica Adicionar numa cmara cromatogrfica 5 volumes de acetato de etilo R (0,5mL) e 95 volumes de tolueno R (9,5 mL) 5. Preparao da placa cromatogrfica Aplicar 20l da soluo problema e 10l da soluo padro 6. Desenvolver no percurso de 15 cm 7. Revelao Aps deixar secar, observar luz UV de 254 nm Pulverizar a placa com a soluo I seguida da soluo II Voltar a observar luz UV de 254 nm Aquecer a placa a 100-105 C durante 10 min e depois observar luza natural

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira Resultado Soluo problema Substncia Estrutura Mentol

Ordem de eluio 1

Cor da banda Azul

Piperitona

Laranja

Cineol

Azul

Isomentona

Azul-esverdeada

Mentona

Azul-esverdeada

Acetato de mentilo

Azul

Hidrocarbonetos

Alcanos: CnH2n+2 Alcenos: CnH2n Alcinos: CnH2n-2 Ciclanos: CnH2n Ciclenos: CnH2n-2

Vermelha

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira Outras bandas de atenuao de fluorescncia Substncia Estrutura Carvona

Ordem de eluio

Cor da banda

Pulegona

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira 3. Determinao quantitativa dos constituintes caractersticos de um leo essencial 3.3. Doseamento dos steres por saponificao (a matriz usada o leo essencial de hortel-pimenta) Procedimento A. Saponificao 1. Introduzir, medindo rigorosamente, 2,000g da amostra num matraz de saponificao de 250 mL; 2. Adicionar 2 mL de lcool a 90% V/V; 3. Juntar 25,0mL de soluo alcolica de hidrxido de potssio 0,5M medindo rigorosamente com um pipeta (no esquecer de parar no trao pois so pipetas de resduo); 4. Aquecer com refluxo em banho de gua durante 30 min (cumprir bem este tempo!); Colocar a argola e o funil para fazer refluxo 5. Deixar arrefecer num banho de gua fria Retirar apenas a argola depois deste passo

Porque se usa lcool e uma soluo alcolica de hidrxido de sdio e no aquosa? R.: Porque se a soluo de hidrxido de sdio estivesse em gua o leo essencial no se conseguir dissolver neste, j que imiscvel em gua. Assim, h imiscibilidade entre o hidrxido de sdio e o leo essencial.

B. Titulao 1. Juntar 1 mL (20 gotas) de soluo de fenolftalena R; 2. Titular com cido clordrico 0,5M (n1 mL) Cuidado para no deixar bolhas na bureta 3. Efetuar um ensaio em branco (n2 mL) Coloca-se tudo exceto o leo essencial Gastaremos mais de cido clordrico para titular o ensaio em branco do que o ensaio que contem a amostra pois, no primeiro, o hidrxido de sdio no reagiu com nada.

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira Reaes

Resultados

Como a concentrao do KOH 0,5 M:

Assim, a massa de acetato de metilo dada por:

Como a massa pesada de leo essencial foi de 2,03 g:

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira Teor por cento m/m em steres expressos por acetato de mentilo

No posso usar esta forma, que se encontra na farmacopeia, diretamente.

Deve conter no mnimo 4,5% m/m e, no mximo, 10,0% m/m de steres, calculados em acetato de mentilo. Como possvel verificar o leo essencial estudado apresentou uma % m/m de steres superior ao tabelado. Contudo este valor inconclusivo pois deveriao ter sido feito 3 ensaios concordantes para se poder aferir a % m/m de steres, calculados em acetato de metilo, contidos no leo de essncia de hortel-pimenta. Se os valores de mantivessem, superiores ou inferiores, aps ter obtido 3 resultados concordantes, teria de rejeitar o leo essencial pois no se encontraria concordante com a 3.4. Doseamento dos compostos carbonlicos pelo cloridrato de hidroxilamina (a matriz usada o leo essencial de hortel-pimenta Consideraes Aldedos e cetonas reagem com os sais de hidroxilamina, com obteno de oximas e libertao de acido clordrico reao de oximao.

cloridrato de hidroxilamina oxima

doseado com uma base

Esta reao mais lenta para cetonas do que para aldedos, pelo que neste caso necessrio proceder ao aquecimento para que a reao se processe mais rapidamente. usada uma tcnica volumtrica para dosagem de cido clordrico libertado na oximao quantitativa. Alaranjado de metilo: pH abaixo de 3,1 vermelho, pH acima de 4,4 amarelo. Uma oxima uma classe de compostos orgnicos cuja frmula geral RR'C=NOH, onde R um grupo organila (R H) e R' pode ser um hidrognio (grupo hidro, R' = H) ou um grupo organila (R' H). Uma oxima o resultado

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira da condensao da hidroxilamina com um aldedo, ento pode-se cham-la de aldoxima, ou uma cetona, podendo-se denominar neste caso cetoxima. Procedimento A. 1. 2. 3. 4. Reao de oximao Introduzir 2,000g da leo essencial de hortel-pimenta; Adicionar 25,00 mL cloridrato de hidroxilamina R a 5% m/v em lcool R; Aquecer em banho de gua quente durante 1hora; Deixar arrefecer.

B. Titulao 1. Juntar 1 mg de alaranjado de metilo R (soluo fica vermelha); 2. Titular com soluo alcolica de hidrxido de potssio 0,5 M at viragem do indicador para amarelo alaranjado; 3. Aquecer em banho de gua, tornando-se a soluo vermelha; 4. Titular novamente at viragem para amarelo alaranjado 5. Repetir os passos 3 e 4, at a viragem do indicador no necessite de mais de 0,1 mL de soluo alcolica de hidrxido de potssio 0,5 M Resultados

Volumetria

Volume gasto (mL)

Massa de compostos carbonlicos correspondente (mg)

1 2 3 4 TOTAL

O leo essencial de hortel-pimenta deve conter, no mnimo, 15,0% m/m e, no mximo, 32% m/m de compostos carbonlicos calculados em mentona, doseados por esta tcnica. EXAME: Explicar quimicamente como se doseia a mentona ou o mentol, caso realizemos a cromatografia gasosa. Universidade do Porto |Faculdade de Farmcia |Mestrado Integrado em Cincias Farmacuticas|3ano 1semestre 9

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira 3.5. Doseamento dos lcoois livre por acetilao em presena de piridina (a matriz usada o leo essencial de hortel-pimenta) NO REALIZADO devido sua morosidade Consideraes Este um mtodo de dosagem dos lcoois por diferena, em que a um peso conhecido de leo essencial adicionado anidrido actico diludo em piridina (catalisador da esterificao dos lcoois) e se promove a acetilao a aquecimento moderado; O excesso de anidrido actico (previamente hidrolisado a cido actico) depois doseado com uma soluo de hidrxido de sdio.

Procedimento A. Reao de esterificao dos lcoois 1. Introduzir 1,000 g da amostra num matraz de acetilao de 125 a 150 mL previamente seco; 2. Juntar 3,0 mL de reagente de acetilao (1 volume de anidrido actico R + 3 volumes de piridina R); 3. Determinar a massa do reagente com aproximao ao miligrama; NOTA: durante a pesagem manter o balo fechado 4. Adaptar ao balo um refrigerante previamente seco; 5. Aquecer com refluxo em banho de gua durante 3h NOTA: ter o cuidado de manter o nvel de gua do banho sem ultrapassar 2 a 3 cm o nvel do lquido no balo; 6. Juntar 50 mL de gua pela extremidade superior do refrigerante; 7. Retirar o refrigerante e lavar as paredes do balo com 10 mL de gua; 8. Deixar repousar durante 15 min B. Titulao do excesso de anidrido actico 1. Titular com hidrxido de sdio 0,5 M (n1 mL) em presena de 1 mL de soluo de fenolftalena R; 2. Efetuar um ensaio em branco (n2 mL)

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira Reaes

mentol

cido actico anidrido

cido actico

Resultados massa do reagente = n1 = n2 = Calcular o teor por cento (m/m) em lcoois livres, expressos em mentol, usando a seguinte frmula:

O leo essencial de hortel-pimenta deve conter, no mnimo, 44,0% m/m de lcoois livre calculados em mentol, doseados por esta tcnica.

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira 4. Determinao quantitativa dos constituintes de um leo essencial por cromatografia gasosa Consideraes Os diferentes componentes do leo essencial so separados com base na afinidade para com as fases mvel e estacionria, sendo posteriormente detetados; Fase mvel: a amostra transportada no gs vetor, normalmente hidrognio, hlio, nitrognio ou rgon; Fase estacionria: coluna capilar com um slido recoberto por uma pelcula de um lquido no voltil; A coluna capilar encontra-se num forno com temperatura controlada, podendo se aplicar um gradiente de temperaturas; A velocidade de eluio dos diferentes componentes da amostra depende: _ do grau de interao de cada componente com a fase estacionria; _da sua volatilidade. Detetores de ionizao de chama (universais): _o efluente da coluna passa atravs de uma chama (hidrognio/ar), ocorrendo a queima das molculas orgnicas, com formao de ies; _gera-se uma corrente que proporcional aos ies formados, sendo por isso dependente da concentrao na amostra; _possuem: elevada sensibilidade, intervalo de linearidade largo e boa estabilidade da linha de base. Comparando o sinal obtido com o de compostos de referncia, analisados nas mesmas condies experimentais, possvel determinar o perfil qualitativo e quantitativo de leos essenciais Quantificao feita usando a rea dos picos, no intervalo de linearidade de cada composto.

4.1. Doseamento de mentona, acetato de mentilo e mentol no leo essencial de hortelpimenta Procedimento A. Soluo problema Pesar de 40 mg de leo essencial de hortel-pimenta para um balo de 10 mL Prefazer o volume com n-hexano Cuidado homogeneizar!

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira Ateno: este passo deve ser bem realizado pois a nossa amostra que ser injetada! B. Anlise cromatogrfica Volume de injeo: 1l Coluna: CP-Wax (25 m x 0,25 mm x 0,2 m) Fase estacionria: Polietilenoglicol Gs vetor: hlio Dbito: 1,5 ml/min Temperatura:

Deteo: ionizao de chama Resultados Este cromatograma no do leo essencial puro!

pico do solvente

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira Ordem de eluio 1 + apolar Substncia Limoneno Estrutura reas dos picos % compostos no leo essencial *

Mentona

Acetato de mentilo

4 + polar

Mentol

* Registar as reas correspondentes aos picos da mentona e mentol e calcular a percentagem destes compostos no leo essencial de hortel-pimenta pelo processo de normalizao:

Mentona 14,0 a 32,0 % Mentol 30,0 a 55,0 %

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TRABALHO 1: Doseamento de compostos volteis por GC/FID e volumetria cido-base: leo essencial de hortel-pimenta Ceclia da Silva Ferreira EXAME: aparece o cromatograma sem o n e o nome a identificar as substncias 1. Como identificar as substncias O pico do mentol o mais alto; O pico da mentona o 1 a aparecer com maior rea depois do pico do solvente; O pico do limoneno o 1 a aparecer com menor rea depois do pico do solvente; O pico do acetato de mentilo tem um tempo de reteno por volta dos 20,66 e uma rea pequena de 4172.

Porque que o acetato de mentilo d diferente valor no ensaio qumico e na cromatografia gasosa? R.: No ensaio qumico a reao de saponificao, no especfica, ocorrendo com todos os steres presentes no leo essencial, enquanto que na cromatografia gasosa a determina-se apenas o acetato de mentilo.

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