UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS ACADEMIA DE BIOQUMICA

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUMICA GENERAL

FECHA DE ACTUALIZACIN AGOSTO 2011

Contenido
PRACTICA #. 1................................................................................................................................................ 4 EXPLICACION Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO......................................................................... 4 Practica # 2 .................................................................................................................................................... 7 BIOSEGURIDAD ............................................................................................................................................. 7 PRCTICA #3 ............................................................................................................................................... 10 USO, CALIBRACIN Y MANEJO DEL POTENCIMETRO ............................................................................... 10 PRCTICA #4 ............................................................................................................................................... 12 TITULACIN ACIDO-BASE ............................................................................................................................ 12 PRACTICA # 5............................................................................................................................................... 14 REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS................................................................................. 14 PRACTICA # 6............................................................................................................................................... 18 SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS. ............................................................ 18 Practica # 7 .................................................................................................................................................. 21 REACCIONES DE IDENTIFICACION DE PROTEINAS ...................................................................................... 21 Practica # 8 .................................................................................................................................................. 25 DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENAS ................................................... 25 Prctica #. 9 ................................................................................................................................................. 29 FOTOCOLORIMETRIA .................................................................................................................................. 29 Prctica #. 10 ............................................................................................................................................... 35 ANALISIS ENZIMATICO CUALITATIVO.......................................................................................................... 35 Prctica #. 11 ............................................................................................................................................... 37 CINETICA ENZIMATICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO .............................................. 37 SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA............................................................................................................. 37 Prctica #. 12 ............................................................................................................................................... 40 CINETICA ENZIMATICA 2: EFECTO DEL inhibidor sobre la actividad enzimtica ........................................ 40 Prctica #. 13 ............................................................................................................................................... 42 CINETICA ENZIMATICA 3: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA ...................................................................... 42 Prctica #. 14 ............................................................................................................................................... 46 CUANTIFICACION DE COLESTEROL SERICO ................................................................................................. 46 Prctica #. 15 ............................................................................................................................................... 48 EXTRACCIN DE GLUCOGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS......................... 48 Prctica #. 16 ............................................................................................................................................... 52

EFECTO DE LAS COENZIMAS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ............................................................... 52 Prctica #. 17 ............................................................................................................................................... 56 EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ............................................................. 56 Prctica #. 18 ............................................................................................................................................... 60 DETERMINACION DE UREA Y CREATININA SERICA ..................................................................................... 60

PRACTICA #. 1 EXPLICACION Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO Desarrollar destreza en el manejo tanto de material como de instrumentacin aplicable a tcnicas de experimentacin en el rea bioqumica. PRERREQUISITOS 1.- Conocimientos sobre diluciones, soluciones y mezclas. 2.- Definicin de cido, base y amortiguador. 3.- Conocimiento bsico del manejo del potencimetro y el fotocolormetro. 4.- Que es una solucin Molar, Normal y % w/v INTRODUCCION Para llevar a cabo con xito un experimento en cualquier laboratorio es necesario que se manejen tcnicas bsicas de experimentacin tales como: - Tcnicas de medicin de lquidos. - Tcnicas de pesado de slidos. - Tcnicas de mezclado de lquidos y slidos. Todas estas tcnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que cotidianamente se llevan a cabo en el laboratorio de Bioqumica. A continuacin se dan algunos datos sobre cada una de estas tcnicas. Medicin de lquidos: Los instrumentos de medicin de lquidos ms utilizados son: pipetas, probetas y matraces volumtricos. Las pipetas sirven para medir volmenes de hasta 25 ml. En este rango de volumen, las pipetas tienen un uso muy frecuente en el laboratorio por su exactitud y confiablilidad. hay dos tipos generales de pipetas: las serolgicas y las volumtricas. La pipetas serolgicas miden volmenes diversos debido a que estn graduadas en diferentes medidas, por ejemplo, una pipeta de 1.0 ml. esta graduada en dcimas de mililitro y por lo tanto sirve para la medicin de cualquier volumen menor de 1.0 ml. Las pipetas ms frecuentemente usadas son de 1.0, 2.0, 5.0 y 10.0 ml.. Las pipetas volumtricas slo miden volmenes fijos ya que estn graduadas para medir un solo volumen, por ejemplo, una pipeta volumtrica de 1.0 ml. solo servir para medir este volumen. Algunas pipetas estn diseadas para que al momento de liberar el lquido que se est midiendo quede una pequea porcin en la punta de las mismas, esta porcin debe dejarse contenida en la pipeta porque de otra manera se introducir un error en la medicin. La manera de reconocer este tipo de pipetas es por las letras TD ( To Deliver ) que se encuentran en la parte superior de la pipeta. Otras pipetas estn diseadas para liberar todo el volumen incluyendo la porcin que se queda en la punta, este tipo de pipetas se reconocen por las letras TC ( To Contain ), en este caso, si no se libera el total del lquido medido se incurre en un error de medicin. 4

Las buretas varan en tamao, generalmente de 1 a 100 ml. El flujo del lquido es controlado por una llave de vidrio o de tefln. Si es de vidrio requiere lubricacin. Las buretas deben llenarse por arriba de la marca de cero y posteriormente abrir la llave cuidadosamente para que fluya el lquido y el menisco se ajuste a cero. Dentro de los usos indicados para las buretas se encuentran las titulaciones y para medicin de volumenes de lquidos txicos, cidos, sustancias corrosivas, etc. Las probetas son cilindros graduados que miden volmenes por arriba de los 25 ml. todas ellas son usadas para medir volmenes diversos, por ejemplo, con una probeta de 50 ml. se pueden medir volmenes de 26, 38 o 42 ml etc.. Estos volmenes se denotan por marcas que se encuentran entre una graduacin y otra. las probetas ms frecuentemente utilizadas son: 50, 100, 250, 500 y 1000 ml.. Para medir volumen en una probeta se tiene que tomar en cuenta la siguiente regla: La superficie de un lquido dentro de una probeta siempre forma una curva o menisco. El diseo de la probeta esta hecho para medir volmenes exactos al igualar la parte inferior del menisco con la graduacin. Si se mide el volumen con la parte superior del menisco, se incurrir en un error. Los matraces volumtricos, tambien llamados de aforacin, sirven para medir volmenes exactos y son usados cuando se hacen soluciones porcentuales y molares. Los matraces ms frecuentemente usados son de 50, 100, 500 y 1000 ml.. El uso de estos matraces sigue la misma tcnica de medicin que las probetas. Todos los recipientes arriba mencionados son material de vidrio, por lo tanto, estn expuestos a cambios de tamao en altas y bajas temperaturas y esto puede modificar drsticamente la exactitud de la medicin. El diseo de este material de cristalera est hecho para medir volmenes a una temperatura promedio de 25C. Medicin de slidos: La balanza granataria y la balanza analtica son las ms utilizadas en la medicin de reactivos qumicos de textura slida. La granataria tiene una exactitud de aproximadamente una dcima de gramo, se utiliza para pesar cantidades mayores de un gramo y cuando la precisin no sea menor de 0.1 g. La balanza analtica se utiliza cuando el peso deseado requiera una precisin menor de 0.1 g. Es uno de los instrumentos ms sensibles y permite pesar hasta dcimas de miligramo. Sin embargo, el uso de ambos tipos de balanzas requiere de cuidados bsicos comunes tales como: limpieza completa de todas las partes de la balanza; mantener la tara especfica de la balanza antes de cualquier pesada y hacer pesadas racionales con respecto a la capacidad de la balanza. Las balanzas de torcin son tiles en el laboratorio de bioqumica como una herramienta para el buen uso de la centrfuga ya que para equilibrar los tubos de centrfuga siempre debe hacerse en base al peso y no al volumen del contenido. La centrfuga es un aparato que permite separar slidos de lquidos. Es un instrumento que separa suspensiones a alta velocidad. El material slido se queda en la base del recipiente (sedimento) y la porcin lquida en la parte superior del recipiente (lquido sobrenadante).

Los recipientes utilizados en la centrfuga generalmente son tubos de ensayo y estos siempre deben balancearse en cuanto a peso y al ser colocados en la centrfuga siempre debe ser en direcciones opuestas. Mezclado de lquidos y slidos: Las soluciones normales, molares y porcentuales as como los diferentes tipos de diluciones son las mezclas ms utilizadas en el laboratorio. Frecuentemente, las soluciones involucran mezclas de slidos en lquidos o de lquidos en lquidos en tanto que las diluciones solo involucran mezclas lquidos en lquidos. De la destreza con que se lleven a cabo estas mezclas depende el xito de la experimentacin en el laboratorio. El fotocolormetro permite cuantificar concentracin de sustancias en base al color desarrollado. La concentracin de una sustancia en solucin generalmente es determinada por una reaccin de color, siendo el principio general que a mayor concentracin de la sustancia en la solucin mayor ser la intensidad del desarrollo del color. Los fotocolormetros son instrumentos que nos sirven para hacer estas determinaciones.

PRACTICA # 2 BIOSEGURIDAD
OBJETIVO Que el alumno se familiarice con el material Peligroso Biologico infeccioso, su manejo y desecho adecuado, de acuerdo a las normas mexicanas NOM-087 y NOM 052. INTRODUCCION Residuos peligrosos biolgicos infecciosos Qu son los residuos peligrosos biolgicos infecciosos? Los residuos peligrosos biolgicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que se generan durante las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en los centros de salud, laboratorios clnicos o de investigacin, bioteros, centros de enseanza e investigacin, principalmente; que por el contenido de sus componentes puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.

Cules son considerados los RPBI? De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados los siguientes: La sangre La sangre y los componentes de sta, slo en su forma lquida, as como los derivados no comerciales, incluyendo las clulas progenitoras, hematopoyticas y las fracciones celulares o acelulares de . la sangre resultante (hemoderivados). Los cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en la produccin y control de agentes biolgico-infecciosos. Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biolgico-infecciosos. Los patolgicos Los tejidos, rganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la ciruga o algn otro tipo de intervencin quirrgica, que no se encuentren en formol. Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico, excluyendo orina y excremento. 7

Los cadveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatgenos en centros de investigacin y bioterios. Los residuos no anatmicos Son residuos no anatmicos los siguientes: Los recipientes desechables que contengan sangre lquida. Los materiales de curacin, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes fluidos corporales: lquido sinovial, lquido pericrdico, lquido pleural, lquido Cfalo-Raqudeo o lquido peritoneal. Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado para contener stos, de pacientes con sospecha o diagnstico de tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico. Los materiales desechables que estn empapados, saturados o goteando sangre, o secreciones de pacientes con sospecha o diagnstico de fiebres hemorrgicas, as como otras enfermedades infecciosas emergentes segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico. Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatgenos. Los objetos punzocortantes Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biolgicas durante el diagnstico y tratamiento, nicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodrmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturs y estiletes de catter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deber desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal.

Por qu representan un riesgo a la salud o al ambiente? Por sus caractersticas, ya que pueden contener agentes biolgicos infecciosos que se definen como cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando esta presente en concentraciones suficientes (inculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un hospedero susceptible y en presencia de una va de entrada).

Existe regulacin para los RPBI? Con la finalidad de prevenir alguna situacin de emergencia debida al mal manejo de los RPBI, la autoridad Ambiental (SEMARNAT) public el 7 de noviembre de 1995 la Norma Oficial Mexicana NOM8

087-SEMARNAT-1995, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten atencin mdica. Debido a que esta Norma present algunos problemas de interpretacin como en su aplicacin, se gestiono en coordinacin con la Secretara de Salud, su modificacin, derivndose el 1 de noviembre de 2001 el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2000, Proteccin Ambiental Salud Ambiental Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y especificaciones de manejo. De este proyecto se derivaron 370 comentarios, mismos que fueron contestados y publicados en el Diario Oficial de la Federacin el da 20 de enero de 2003. Finalmente el 17 de febrero de 2003 se publica en el Diario Oficial de la Federacin la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin Ambiental Salud Ambiental Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y especificaciones de Manejo.

A quines aplica la NOM-087-SEMARANT-SSA1-2002? Con base en el campo de aplicacin de esta norma es de observancia obligatoria a todos aquellos que por sus actividades generen los RPBI descritos en la Norma, sin importar el volumen de sus generacin, aclarando que aquellos que su generacin sea menor a 25 kilogramos al mes, podrn ubicarse como generadores de Nivel I, esto para el tiempo de almacenamiento de sus RPBI.

Existe otra Norma Oficial Mexicana donde aparezcan los RPBI? Existe la Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005 que establece las caractersticas, el procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los residuos peligrosos, sin embargo esta es de carcter General, por lo que para los RPBI prevalecen las condiciones establecidas en la NOM087-SEMARNAT-SSA1-2002.

Cul es la infraestructura para el tratamiento de los RPBI? A partir de la publicacin de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, se desarrollo la infraestructura para el tratamiento de este tipo de residuos, con la condicin de que dicha norma establece que los residuos denominados patolgicos sean incinerados, por ese motivo se incremento el nmero de hornos para el tratamiento de los residuos, sin embargo han sido muchos equipos que han cerrado por no cumplir con los parmetros establecidos en la Norma Oficial Mexicana NOM-098SEMARNAT-2002, Proteccin ambiental-Incineracin de residuos, especificaciones de operacin y lmites de emisin de contaminantes. Actualmente la incineracin es uno de los procesos de tratamiento ms observados por las asociaciones no Gubernamentales por ese motivo se concluye que las empresas que actualmente cuentan con esta autorizacin son capaces de cumplir con los parmetros establecidos en la NOM-098. 9

PRCTICA #3 USO, CALIBRACIN Y MANEJO DEL POTENCIMETRO

OBJETIVO: Que el alumno conozca el instrumento de medicin, principios y fundamento para aplicarlo en las caractersticas cido base de las soluciones. INTRODUCCIN: El potencimetro, es un sensor utilizado en el mtodo electroqumico como equipo de medicin, en la cuantificacin del potencial Hidrgeno (pH) de cualquier disolucin. La determinacin del pH, consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones, con diferente concentracin de protones. En consecuencia, se conoce la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio ante el pH. Un electrodo para medir el pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolucin en la que queremos encontrar el pH. El soporte del electrodo es de vidrio comn y no es conductor, mientras que el bulbo sensible se encuentra formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH). Se llena el bulbo con la solucin de HCl 0.1N saturado con AgCl. El voltaje en el interior del tubo es constante (pH 7) de manera que la diferencia de potencial solo depende del pH del medio externo. El alambre que se sumerge al interior (normalmente Ag/AgCl) permite conducir este potencial hasta un amplificador. El pH metro es relativamente inmune a las interferencias de color, turbidez, material coloidal, cloro libre, substancias oxidantes y/o reductoras. La medicin es afectada solo cuando la superficie de la membrana est sucia con grasa o material orgnico insoluble en agua, que le impide hacer contacto con la muestra, por lo que se recomienda la limpieza escrupulosa de los electrodos. Los electrodos deben ser enjuagados con agua destilada entre muestras (el uso adecuado de la pizeta es de vital importancia), posteriormente deber secarse el electrodo preferentemente con papel klenex o papel sanitario de textura suave pero que no deje pelusa, nunca debe secarse con tela porque podra cargase electrostticamente. Como los electrodos de vidrio de pH cuantifican la concentracin de H+ relativa a sus referencias, deben ser calibrados peridicamente para asegurar la precisin, es por eso que se utilizan soluciones especficas llamadas buffers de calibracin (disoluciones reguladoras de pH conocido). Estas soluciones son: solucin buffer (fosfato) de pH 7 color amarillo, solucin buffer (biftalato) de pH 4 color rojo, solucin buffer (borato) de pH 10 color azul.

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El pHmetro digital porttil Conductronic pH 10, modelo 1024, electrodo y batera cuadrada. Debe mantenerse siempre humedecido. Para su calibracin a un punto: 1. Conecte el electrodo al instrumento y encienda la tecla ON. 2. Introduzca el electrodo en la solucin patrn de pH 7 y permita la lectura que la lectura se estabilice (aproximadamente 30 seg). 3. Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp oC a la temperatura de la solucin patrn (buffer). 4. Ajuste la perilla de calibracin calbrate, hasta que el medidor indique el valor pH 7.0 de la solucin patrn (buffer). 5. Retire el electrodo de la solucin patrn (buffer) y enjuguelo muy bien con agua destilada (pizeta), pero no seque el electrodo. 6. Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp. oC a la temperatura a la temperatura de la solucin a medir. 7. Introduzca el electrodo en la solucin a medir y lea el valor pH del medidor. Si el valor de la solucin no est entre 3 unidades de pH de la solucin patrn (7.0 pH), se necesita hacer una calibracin a dos puntos (con dos buffers de diferente pH, 7 y 4, o 7 y 10 dependiendo de las soluciones que vaya a manejar). 8. Despus de cada medicin, retire el electrodo y enjuguelo muy bien con agua destilada (pizeta) Calibracin a dos puntos 1. Siga los pasos de calibracin a un punto hasta el paso 5 2. Sumerja el electrodo en la segunda solucin patrn de pH 4.00 o pH 10.00. La temperatura de esta solucin patrn debe ser idntica a la de la primera 3. Ajuste el control de pendiente slope, hasta que el medidor indique el valor del pH de la segunda solucin patrn. 4. Retire el electrodo, enjuguelo con agua destilada y proceda a efectuar las mediciones. No olvide enjuagar el electrodo muy bien con agua destilada (pizeta) despus de cada medicin. Precauciones El pHmetro debe siempre mantenerse en su estuche si no se est utilizando, con respecto al electrodo deber mantenerse en la solucin buffer de pH 4.0, misma que se encuentra en el pequeo recipiente en el que descansa el electrodo. 11

PRCTICA #4 TITULACIN ACIDO-BASE

OBJETIVO Observar una reaccin acido-base fuerte utilizando un indicador de pH y comprobar el pH de la solucin mediante el uso del potencimetro. INTRODUCCION Es una tcnica o mtodo de anlisis cuantitativo muy usada, que permite conocer la concentracin desconocida de una disolucin de una sustancia que pueda actuar como cido o base, neutralizndolo con una base o cido de concentracin conocida.1 Es un tipo de valoracin basada en una reaccin cido-base o reaccin de neutralizacin entre el analito (la sustancia cuya concentracin queremos conocer) y la sustancia valorante. Un indicador de pH es una sustancia que permite medir el pH de un medio. Habitualmente, se utilizan como indicador sustancias qumicas que cambian su color al cambiar el pH de la disolucin. El cambio de color se debe a un cambio estructural inducido por la protonacin o desprotonacin de la especie. Los indicadores cido-base tienen un intervalo de viraje de unas dos unidades de pH, en la que cambian la disolucin en la que se encuentran de un color a otro, o de una disolucin incolora, a una coloreada. Los ms conocidos son el naranja de metilo, que vira en el intervalo de pH 3,1 - 4,4, de color rojo a naranja, y la fenolftalena, que vira desde un pH 8 hasta un pH 10, transformando disoluciones incoloras en disoluciones con colores rosados / violetas. Los indicadores de pH tienen una constante de protonacin, K, que informa sobre el desplazamiento de la reaccin de protonacin de la forma bsica del indicador.

Se dice que el cambio de color de un indicador es apreciable cuando la concentracin de la forma cida o de la forma bsica es superior o igual a 10 veces la concentracin de la forma bsica o la forma cida respectivamente. MATERIALES 2 buretas 50 mL 2 Matraz erlenmeyer 150 ml HCl 0.1N NaOH 0.1N Fenolftaleina METODOLOGIA 1. Verter NaOH y HCl en buretas graduadas. 2. Tomar 20 mL de HCl y colocarlo en un matraz erlenmeyer. 12

3. Medir el pH de la solucion un potencimetro 4. Agregar 4 gotas de fenolftalena y mezclar 5. Agregar gota por gota NaOH a los 20 mL de HCl siempre mezclando 6. Observar cambios de coloracin.

7. Una vez obtenido el cambio de coloracin del indicador de pH medir una vez ms el pH de la solucin ahora titulada. RESULTADOS Volumen de NaOH utilizado durante la titulacin de HCl_____________ Concentracin de NaOH y de HCl en la solucin final ______________ Establecer la relacin entre el indicador de pH y el pH obtenido con el potencimetro.

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PRACTICA # 5 REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS

OBJETIVO Al trmino de esta practica el alumno sera capaz de diferenciar a los aminocidos utilizando tcnicas colorimtricas mas comunes para identificarlos, as cmo, relacionar la estructura de los aminocidos con su reactividad y sus funciones en el organismo. PREREQUISITOS 1.- Conocer las caracteristicas diferenciales de la estructura de los aminocidos. 2.- Identificar las diferencias y semejanzas de los aminocidos con otros monmeros (por ejemplo : carbohidratos y lpidos). 3.- Identificar las propiedades qumicas en base a su polaridad. INTRODUCCION Los aminocidos son los monmeros que dan la estructura de los polmeros conocidos como protenas o polipptidos, 20 tipos de aminocidos, son los principales componentes de las protenas, los cuales poseen las siguientes caracteristicas estructurales:

Contienen un carbn asmetrico (con excepcin de la glicina) llamado carbono alfa. Al cual se le unen cuatro radicales que son: - un grupo carboxilo (COO-) - un grupo amino (+NH3) - un tomo de hidrgeno (H) - un radical de composicin variable que permite diferenciar a los aminocidos (R). Llamado cadena lateral. Debido a las caracteristicas fisicoqumicas de la cadena lateral, es posible relacionar su posicin, dentro de la estructura proteca ya que si es de caracteristicas no polares (hidrofbico), al contacto con el agua tender a esconderse; o en su defecto, si es de caracteristicas polares (hidroflico), tender a interaccionar con el agua. Desde luego, para saber cual es la estructura de la cadena lateral debemos de conocer cual es el pH de la solucin ya que dependiendo del pH la cadena lateral estar protonada (H+) o 14

desprotonada, este parmetro se puede conocer utilizando los pKa de cada aminocido y la ecuacin de Henderson-Hasselbach lo cual permite determinar cual es la estructura predominante a un pH dado. Los cambios de carga observados en el aminocido mostrado, dependen del pH en que se encuentre el aminocido, ya que como se observa en la figura anterior, bajo condiciones cidas el aminocido est totalmente protonado y en condiciones alcalinas est totalmente desprotonado, esto se debe a que los aminocidos son cidos dbiles y por lo tanto tienen una constante de disociacin por cada grupo o radical capaz de comportarse como cido o base dbil. Esto permite conocer el punto isoeltrico de un aminocido, el cual se define como el pH en el cual la carga neta es cero. Los aminocidos que son utilizados para la sntesis de protenas son 20, los cuales se les ha identificado como aminocidos naturales y los no naturales son los que an cuando siendo aminocidos, no forman parte estructural de las protenas (no estn codificados en el cdigo gentico). El cuerpo humano es incapaz de sintetizar los 20 aminocidos requeridos para la formacin de todas las protenas y por lo cual partiendo de esta base, los aminocidos se dividen en : esenciales; porque es necesario que el individuo ingiera en la dieta y no esenciales; los cuales son producidos por el propio organismo y por lo tanto no es crtico si el individuo no los consume en su dieta. Cabe hacer notar, que los 20 aminocidos son importantes para el buen desarrollo del organismo. MATERIAL.1.-15 tubos de ensaye 5.-pipetas de 5.0 ml 2.-gradilla 6.-pipeta de 10.0 ml 3.-pipetas de 1.0 ml 7.-Bureta 4.-pipetas Pasteur METODOLOGIA Nota.- A menos que se especifique, todos los volmenes a aadir estn dados en mililtros (ml) Experimento No. 1 Prueba de sullivan REACTIVOS AGUA CISTEINA NH4OH NaCN NITROPRUSIATO DE BLANCO 0.5 ---------2 gotas 0.5 2 gotas PATRON ----------0.5 2 gotas 0.5 2 gotas PROBLEMA ---------------2 gotas 0.5 2 gotas 15

SODIO Sol. Problema --------------------0.5

Experimento No. 2 Reaccin de identificacin de fenoles para-sustituidos (tirosina) REACTIVOS AGUA TIROSINA PROBLEMA NITROSONAFTOL BLANCO 1.0 ----2 gotas PATRON --1.0 --2 gotas PROBLEMA ----1.0 2 gotas

Mezclar y calentar en bao a ebullicin durante 5 minutos. ACIDO NITRICO 2 gotas 2 gotas 2 gotas

La aparicin de un color rosa violceo es positiva. Experimento No. 3 Reaccin de identificacin de aminocidos con ninhidrina La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un agente oxidante que reacciona con todos los alfa aminocidos dando un color purpura. La prolina e hidroxiprolina da un color amarillo. REACTIVOS AMINOACIDO PROBLEMA NINHIDRINA AGUA BLANCO ----1.0 1.0 PATRON 1.0 --1.0 --PROBLEMA --1.0 1.0 1.0

Mezclar y calentar en bao de agua hirviendo durante 10 min. La aparicin de un color azul violceo es positiva con excepcin de la prolina y la hidroxiprolina. RESULTADOS En la siguiente tabla indicar si los resultados del problema fueron positivos o negativos. Tubo EXP. No. 1 EXP. No. 2 EXP. No. 3

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1 2 3 4 Por lo cual conclumos que el o los aminocidos presentes en la muestra son:______________ CUESTIONARIO 1.- Mencione 5 diferencias fundamentales tanto qumicas como bioqumicas que permiten diferenciar a los aminocidos de los carbohidratos y de los lpidos. 2.- Existe un enorme grupo de aminocidos no naturales, mencione 10 ejemplos e indique su importancia bioqumica. 3.- Cmo se calcula el punto isoelctrico de un aminocido? 4.- Cual es el fundamento de la reaccin de Pauly. 5.- Que importancia mdica tiene la identificacin de los aminocidos.? 6.- Cul es el mecanismo de identificacin de aminocidos al utilizar ninhidrina. 7.- Cul es la funcin del cianuro de sodio en la reaccin del nitroprusiato?

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PRACTICA # 6 SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS.

OBJETIVO Al termino de esta practica el alumno ser capaz de identificar por lo menos dos tcnicas de separacin de aminoacidos, as como relacionar las caracterasticas fisicoqumicas de la estructura en funcin de la tcnica de separacin. Adems describir las ventajas y desventajas de la tecnica utilizada, comparndola con otras. PRE-REQUISITOS 1. Cules son las caractersticas diferenciales de los aminocidos naturales en base a su estructura 2. Cul es el fundamento de la reaccin de ninhidrina con los aminocidos. INTRODUCCIN Se llama cromatografa al mtodo que se sigue para la resolucin o separacin de mezclas de componentes en zonas concentradas o en diferentes fases de aquellas en que se encontraban inicialmente. Esto es independiente, de las fuerzas que provocan el paso de dichas sustancias de una fase a otra. Debido a lo anterior, la cromatografa presenta una gran versatilidad, eficiencia y conveniencia que permite su aplicacin en un gran nmero de tcnicas en el laboratorio. Las tcnicas de cromatografa permiten separar mezclas de: Gases Iones simples Molculas orgnicas e inorgnicas (aminocidos, azcares, vitaminas, drogas, lpidos, esteroides) Macromolculas (protenas, polisacridos, cidos nuclecos) Partculas (componentes subcelulares, bacterias) Las tcnicas cromatografcas permiten conocer: El peso molecular de la sustancia de inters Identificar una o mas sustancias de una mezcla La concentracin de las molculas presentes La cromatografa basa su separacin en: La diferencia en velocidad de migracin de las sustancias presentes en la mezcla a travs de los poros del soporte llamado adsorbente. La migracin se efectua por el flujo de un gas o un liquido llamado fase mvil, el cual viaja a travs del adsorbente llamado fase estacionaria La separacin de los componentes se lleva a cabo por una combinacin de procesos, los cuales son: Particin del soluto (componente a separar) entre la mezcla de solventes (fase mvil) 18

Adsorcin de los solutos con la fase estacionaria (interacciones superficiales) Atraccin electrosttica de solutos (iones) con carga opuesta.

La clasificacin de las tcnicas de cromatografa en base al mtodo en Cromatografa en columna Cromatografa en capa fina Cromatografa en papel Cromatografa de gases

En el caso de la cromatografa en capa fina, su separacin se basa en una mezcla se procesos: adsorcin y particin. sta tcnica de separacin de aminocidos es utilizada para determinar fallas metablicas o renales (aminoaciduria), y la muestra que se utiliza es un concentrado de orina. MATERIAL -Equipo para cromatografa en capa fina - Horno a 80 C -Pipetas pasteur -Papel METODOLOGA NOTA. No tocar con las manos la placa cromatogrfica porque se contamina por la presencia de aminocidos en las manos. 1. Hacer unas marcas con lpiz sobre la placa a un centmetro de la base de la placa. No raye a todo lo largo de la placa, nicamente marque en las orillas 2. A esta altura colocar una gota de la solucin de aminocidos conocidos separados a un centmetro cada uno y colocar una muestra problema. 3. Dejar secar al aire, sin soplar. 4. Aadir fase mvil a la cmara cromatografica: 40 mL butanol: 10 mL cido actico: 50 mL agua y cerrar 5. Colocar las placas de cromatografa en la cmara cuidando de no empalmar una con otra. Las placas deben quedar con la muestra de aminocidos en la parte inferior para hacer una cromatografa ascendente. 6. Cerrar la cmara y dejar que ascienda el solvente por la placa hasta un poco antes que salga alrededor de 1 hr. Sacar las placas y marcar con lpiz hasta donde avanz el solvente. 7. Sacar las placas y marcar con lpiz hasta donde avanz el solvente. 8. Secar por 5 minutos en horno a 80C 9. Rociar con la solucin de ninhidrina toda la placa y calentar en el horno por 5 min. 10. Medir los frentes del solvente y del soluto para cada mancha y calcular sus respectivos relacin de frentes con la siguiente frmula: Rf= Frente de soluto Frente de solvente 19

11. Compare el Rf de los aminocidos conocidos con los obtenidos para el problema para identificar el o los aminocidos presentes en la mezcla. RESULTADOS Problema No.___________ La muestra contiene:_____________ CUESTIONARIO 1. Si el Rf para la L-glicina es de 0.45 cual seria el rf para la D-glicina. Explique su respuesta. 2. En base a los resultados obtenidos por todo el grupo, indique de manera ascendente como se separaran los siguientes aminocidos, utilizando la misma mezcla de solventes. Ala, Met, Phe, Tyr, His, Glu, Gln. 3. En caso de que se estuviera analizando una mezcla de aminocidos presentes en una muestra de orina, que componentes de sta adems de los aminocidos se teirn con la ninhidrina. 4. Por qu los Rf son especficos de la tcnica de separacin de los solventes utilizados.

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PRACTICA # 7 REACCIONES DE IDENTIFICACION DE PROTEINAS

OBJETIVO: Al trmino de esta practica, el alumno deber ser capaz de describir algunas de las tcnicas de deteccin cualitativa de protenas en base a los componentes de su estructura. PR-ERREQUISITOS: 1.- Definicin de Pptido, Polipptido y Protena. 2.- Clasificacin de las Protenas. 3.- Niveles de complejidad estructural de las Protenas.

INTRODUCCION: La palabra Protena proviene del griego preeminente, que significa primero; fu inicialmente propuesta por Berzeluis en 1838 para referirse a unas serie de compuestos orgnicos nitrogenados con cierta complejidad que se encuentran altamente distribuidos en la naturaleza y son la base para actividades tanto estructurales y funcionales de todo organismo vivo. Las protenas estas compuestas por aminocidos naturales ordenados en una secuencia discreta y unidos entre s por enlaces peptdicos que siempre involucran los radicales amino y carboxilo de cada aminocido. La variabilidad de las protenas se debe a una serie de aspectos tales como: complejidad estructural, residuos aminoacdicos que la forman, propiedades qumicas y fsicas y funciones especficas de cada protena en el organismo que la contiene. Se concluye, por lo tanto, que el anlisis qumico de las protenas en base a sus propiedades es muy amplio y su aplicacin en el campo mdico, clnico y de investigacin es muy importante. Basndose en los anlisis fsicos y qumicos de ellas, se han planteado cuatro niveles estructurales de conformacin, se han postulado las posible formas estructurales , su naturaleza electrosttica , su capacidad de solubilidad as como sus funciones dentro del organismo. MATERIAL.1.- 12 tubos de 20 x 150 mm 2.- 3 pipetas de 1.0 ml. 3.- 1 pipeta de 10.0 ml. 4.- 1 Gradilla 5.- Sol. de albmina 0.1% 6.- Sol. de peptona 0.1% 7.- Sol Gelatina 0.1 % 8.- Sol. Tirosina 0.1 % 9.- Sol. NaOH 10.0 % 10.- Sol. Sulfato de Cu 0.5 % 11.- Ac. ntrico concentrado 12.- Hidrxido de amonio 21

METODOLOGIA.Experimento No. 1 Reaccin de Biuret: Existen diversas tcnicas de deteccin y cuantificacin de protenas algunas ms complicadas que otras y algunas ms confiables que otras. Una de las reacciones ms utilizadas es la de Biuret; en esta reaccin, el sulfato de cobre alcalino reacciona con compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos, ya que el radical carbamilo que se forma en el enlace peptdico es muy afn a los iones de cobre. Se le da el nombre de Biuret porque este es un compuesto que da una reaccin tpicamente positiva con el sulfato de cobre alcalino. La formacin del color violeta es directamente proporcional al nmero de enlaces peptdicos que contenga la protena y no es sensible a pptidos. Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro: Tubo Agua destilada Albmina Peptona Gelatina Tirosina NaOH CuSO4 1 1 mL ----2 mL 0.5 mL 2 -1 mL ---2 mL 0.5 mL 3 --1 mL --2 mL 0.5 mL 4 ---1 mL -2 mL 0.5 mL 5 ----1 mL 2 mL 0.5 mL

Agitar y dejar reposar los tubos durante 15 min. Observar la coloracin y su intensidad. Reportar los resultados de la siguiente forma: (++) = violeta intenso, (+) = Ligeramente coloreado, (-) = no formacin de color. Experimento No. 2 Reaccin Xantoproteca: Esta reaccin afecta la integridad estructural de los residuos aminoacdicos de las protenas. En este caso, Los aminocidos que contienen un ncleo aromtico, forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con cido Ntrico concentrado. Al aadir una solucin alcalina se forman sales de estos derivados que son de color naranja. Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro: Tubo 1 2 3 4 5

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Agua destilada Albmina Peptona Gelatina Tirosina HNO3

1 mL ----1 mL

-1 mL ---1 mL

--1 mL --1 mL

---1 mL -1 mL

----1 mL 1 mL

Mezclar y calentar a bao de agua a ebullicin durante 5 min. y enfriar a temperatura ambiente durante 10 min. Agregar por estratificacin y SIN MEZCLAR 0.5 mL de Hidrxido de Amonio a todos los tubos. La formacin de un anillo color naranja en la interfase es resultado positivo. Reportar con un signo positivo (+) los tubos donde se haya formado el color naranja RESULTADOS Experimento Reaccin de Biuret Reaccin Xantoproteica DISCUSION: 1.- Describir y explicar mediante un esquema la reaccin entre el Reactivo de Biuret y los enlaces peptdicos. 2.- Correlacionar los pesos moleculares y los componentes aminoacdicos de la albmina, peptona, gelatina y tirosina. 3.- Explique porque cada protena se comporta de diferente manera en las reacciones de Biuret y Xantoproteica. 4.- Analice las dos reacciones y diga si son confiables para una determinacin a nivel clnico. CUESTIONARIO: 1.- Mencione y describa dos reacciones que sean anlogas a la xantoproteica. 2.- Mencione dos reacciones que sirvan para cuantificar protenas 3.- Describa el metodo de Sanger y mencione que papel juega en la identificacin de protenas. 4.- Defina el trmino Secuenciacin protica. 5.- Mencione tres reacciones de identificacin que se utilicen en la secuenciacin de protenas. 6.- Analice detalladamente una tcnica que se utilice para secuenciar a las protenas. 23 Testigo Algumina Peptona Gelatina Tirosina

7.- Describa la tecnica de Millon y especifique el tipo de protenas que puede identificar.

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PRACTICA # 8 DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENAS

OBJETIVOS Al trmino de la prctica, el alumno ser capaz de describir el efecto de los solventes sobre las propiedades electroqumicas de las protenas de diferente PM de acuerdo a las siguientes variables. a) Solubilidad de las protenas en diferentes soluciones de sales. b) Propiedades electroqumicas de las protenas. c) Efecto del acido actico sobre el punto isoelctrico de una protena. PRERREQUISITOS INVESTIGAR LOS SIGUIENTES CONCEPTOS A) B) C) D) Salting In y Salting Out. Agentes precipitantes de protenas. Propiedades fisicoqumicas del agua. Ecuacin de Henderson/Hasselbach.

INTRODUCCIN Las protena son macromolculas compuestas por unidades de alfa aminocidos que se unen entre s mediante enlaces peptdico y que alcanzan un peso molecular igual o superior a 5000 D. El enlace peptdico, caracterstico de estos compuestos, resulta de la reaccin del grupo carboxilo de un aminocido con el grupo amino del otro aminocido, lo cual da lugar a un enlace covalente de tipo carbamida y que tiene algunas caractersticas peculiares como: a) El enlace C-N tiene cierto carcter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez a la molcula. b) El oxigeno y el nitrgeno quedan en posicin trans. c) Todos los elementos que componen el enlace se encuentran ubicados en el mismo plano. d) La rotacin de la molcula formada queda restringida a los carbonos alfa. El gran nmero de aminocidos que componen la molcula proteica determina que su estructura sea extraordinariamente compleja, y que para poder estudiarla nos veamos precisados a dividirla artificialmente en los llamados <<niveles de organizacin de la estructura proteica >>, de los cuales se describen habitualmente 4, aunque algunos autores llegan a describir 5 o ms. Por supuesto que toda organizacin estructural que implique determinado orden requiere de la presencia de una fuerza estabilizadora, que en el caso de las protenas estara constituida por diferentes tipos de enlaces o interacciones fsicas y qumicas que se enuncian en el cuadro siguiente:

Nivel de organizacin

Enlaces que lo mantienen

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Primario Secundario Terciario

Enlace peptdico. Puentes de hidrogeno entre los elementos del enlace peptdico. Puentes de hidrgeno entre las cadenas laterales de los aminocidos, interaccin hidrofbica, interaccines ectrostatica, puentes disulfuro, enlace ster. Los mismos que para el nivel terciario ms las fuerzas de Van der Walls.

Cuaternario

La complejidad estructural de las protenas se manifiesta desde el punto de vista funcional en una gran diversidad de funciones biolgicas.
En las proteinas existen aminoacidos hidrofobicos e hidrofilicos. Luego del doblamiento en solucin acuosa, los aminocidos hidrofobicos usualemente se encuentran en areas protegidas, mientras que los aminocidos hidrofilicos interactan con las molculas del solvente, permitiendo la formacin de puentes de hidrgeno con las molculas de agua del medio. Si hay suficiente superficie hidrofilida, la protena puede ser disuelta en agua. Cuando la concentracin de sales aumenta, algunas de las moleculas de agua son atraidas por los ions salinos, lo cual disminuye la cantidad de moleculas de agua disponibles para su interaccion con la protein. Como resultado de esto, las interacciones protena-proteina se hacen mas fuertes que las interacciones protena-solvente por lo que las protenas coagulan formando interacciones hidrofobicas entre ellas, proceso al cual se le conoce como Salting-out.

MTODOS Experimento No. 1 Efecto de la solubilidad de las protenas por la adicin de sales. Fundamento qumico. La adicin de una sal a una solucin proteica modifica la constante dielctrica del solvente, permitiendo una mayor solubilidad de la protena. Sin embargo, cuando se aade exceso de una sal se neutralizan las cargas de la protena y esta tiende a precipitar. Este mismo efecto ocurre al aadir sales metlicas cargadas electropositivamente. Existe variante entre diferentes sales metlicas de la misma valencia, a la misma concentracin, y de masa atmica diferente. Tambin se demostrara, la diferencia existente tratndose con diferentes tipos de protenas. Prepara tres series de tubos como se indica. REACTIVO Testigo H2O ZnSO4 2 % Albmina 1% (1ml) 0.5 ml 0.5 ml Gelatina 1% (1ml) 0.5 ml 0.5 ml Peptona 1% (1ml) 0.5 ml 0.5 ml

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CuSO4 2% C2H3O2 Co 2% C2H3O2 Co 1% NaCl 1% NaCl 20%

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Agitar bien los tubos y comparar los cambios en la solubilidad de la protena, comparndolos con un tubo testigo adicionando agua destilada. Nota. Si lo requiere, dejar reposar por 20 min.*(o lo que considere), y hacer las observaciones. Experimento No. 2 Determinacin del punto Isoelctrico de la Albmina por adicin de un cido. Fundamento Qumico: Con la adicin de un cido o una base a una solucin protica se alcanza un estado en que hay el mismo nmero de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la protena y tiende a precipitar. El pH que determina el nmero igual de cargas de signos opuestos se denomina punto isoelctrico. Preparar una serie de tubos como se indica a continuacin: Ac. Acetico Ac. Acetico Albuminato de Tubo pH Agua destilada Ac. Acetico 0.1 0.01N 1.0N Sodio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 8.38 7.75 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4 5.8 0.62 1.25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.6 3.2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

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Mezclar bien y observar los cambios que presente la solubilidad de la casena en cada tubo. Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de Hendersosn-Hasselbach. RESULTADOS: Experimento No.1 Efecto en la solubilidad de las protenas por adicin de sales. Sal utilizada Solubilidad de la Albumina Solubilidad de la Peptona Solubilidad de la Gelatina

Acetato de Cobalto Cloruro de sodio 1.0% Cloruro de Sodio 20.0% Sulfato de Zinc 5.0% Sulfato de zinc al 20 %

Experimento No. 2 Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cul es el punto isoelctrico de la protena ? 28 pH Solubilidad

DISCUSION: 1.-Cual es el efecto de la adicin de un sal metlica a una solucin protenica. 2.-De que factores depende la solubilidad de una protena en el agua. 3.-Explique en trminos fisicoqumicos el efecto que provoca la adicin de un cido o una base fuerte. 4.-Explique como afecta un cambio en la constante dielctrica del agua a la solubilidad de una protena. 5.-Qu es el Salting in y que tipo de compuestos pueden promoverlo. 6.-Qu es el Salting out y que tipo de compuestos pueden promoverlo. 7.-Qu relacin existe entre el punto isolelectrico y la solubilidad de una protena. 8.-Qu es la ecuacin de Henderson-Hasselbach y en que casos est indicado utilizarse. 9.-Diga si es posible tener dos protenas con puntos isoelctricos muy alejados solubles en un mismo solvente. Porqu? CUESTIONARIO: 1.- Las protenas Bence Jones precipitan a una temperatura mayor de 60C. Las Crioglobulinas precipitan a una temperatura de 4C. La albmina de huevo precipita a una temperatura mayor de 90C y tambien precipita a un pH menor de 4.5. Explique el comportamiento de cada una de estas protenas tomando en cuenta los siguientes parmetros: Fuerza inica del solvente, interacciones electrostticas solutosolvente, agentes desacoplantes de la interaccin soluto-solvente. 2.- Mencione que propiedades fisicoqumicas de la albmina le permiten interaccionar y transportar cualquier compuesto incluyendo hidrofbicos a travs de un medio acuoso. 3.- El punto Isoelctrico de la Gelatina es de 4.7 y el de la colgena es de 8.4. Se sabe que la colgena es una protena fibrilar precursora de la gelatina. Explique porque hay una diferencia tan grande entre los puntos isoelctricos de ambas. 4.- El Ac. tricloroactico, el Ac. sulfosaliclico y el Ac. fosfotngstico tienen la propiedad de precipitar protenas. Cul es el mecanismo fisicoqumico que ocurre en esta precipitacin. 5.- Especifique cual es el efecto del plomo sobre las propiedades electroqumicas de las protenas de la sangre. 6.- Determine el efecto del litio cuando se encuentra en altas concentraciones sobre las protenas de las clulas nerviosas.

PRCTICA #. 9 FOTOCOLORIMETRIA
OBJETIVO 29

a) Determinar los espectros de absorcin de 2 sustancias coloridas. b) Determinar la longitud de onda ptima para la cuantificacin de cada sustancia (mxima absorbancia). c) Desarrollar curvas de calibracin para cada una de las sustancias. d) Comprobar si se sigue la Ley de Lambert-Beer para cada una de las sustancias y cuales sern los lmites. PRERREQUISITOS 1.- Definicin de los siguientes trminos: a) Longitud de onda b) espectro de absorcin c) absorbancia d) transmitancia. 2.- Longitud de onda del espectro visible, ultravioleta e infrarrojo. INTRODUCCION La utilizacin de fotocolormetros y espectrofotmetros se basa en la determinacin de un parmetro, esto es, medir la luz absorbida por una sustancia que se encuentra en el seno de un lquido y esto se relaciona directamente con la concentracin de la sustancia en el lquido. Estos instrumentos que sirven para medir la intensidad de la luz transmitida o absorbida por una solucin, consisten prcticamente de una fuente de luz, filtros (fotocolormetros) o un monocromador (espectrofotmetro ), una hendidura de salida de luz seleccionada, un receptculo para la muestra ( celdilla ), fotocelda y galvanmetro ( figura 1 ). Lmpara ------> Filtro ------> Celdilla ---> Fotocelda ------> Galvanmetro Figura No. 1.- Diagrama de flujo de luz en un fotocolormetro o espectrofotmetro. La diferencia entre un fotocolormetro y un espectrofotmetro es a nivel del separador de las diferentes longitudes de onda que componen la luz, siendo ms sensible el monocromador del espectrofotmetro, ya que los lmites son ms estrechos, que los filtros del fotocolormetro en cul los lmites estn ms separados. Las medidas fotocolorimtricas estn basadas en 2 leyes: a) La Ley de Lambert b) La Ley de Beer

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La Ley de Lambert nos indica que la proporcin de luz incidente absorbida por un medio es independiente de su intensidad, pero no del espesor de la capa lquida ni de las caractersticas del medio. La Ley de Beer nos indica que la intensidad de la luz que pasa a travs de una solucin a una concentracin c y un grosor l es la misma cuando la concentracin es 2c y el grosor l/2 o cuando la concentracin es c/2 y el grosor 2l, de tal manera que la absorcin de luz es proporcional al nmero de molculas del material absorbente a travs de las cules pasa la luz. As, si la sustancia absorbente est disuelta en un solvente transparente, la absorcin de la solucin es proporcional a la concentracin molar.(1) Matemticamente la ley de Lambert-Beer se expresa como sigue:

Los materiales que cumplen con la ley de Lambert-Beer, o sea donde hay proporcionalidad entre la Absorbancia (As) y la concentracin dentro de ciertos lmites de concentracin, pueden ser estudiados por este mtodo, trabajando una curva de calibracin que permita la interpolacin dentro del margen de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer o utilizando un estndar. MATERIAL Solucin de H2SO4 0.5 M. Solucin de KMnO4 0.0004 M. Solucin de K2Cr2O7 0.0016 M. 11 Tubos de ensaye de 15x160 mm 2 Pipetas de 10 ml. 2 Pipetas de 5 ml. 2 Celdillas para Fotocolormetro. 1 Gradilla. Fotocolormetro

METODOLOGIA.Experimento No. 1 DETERMINACION DE LOS ESPECTROS DE ABSORCION. 1. Determinar los espectros de absorcin de cada una de las soluciones tipo, leyendo las absorbancias (As) a cada una de las longitudes de onda (nanmetros, nm) del Fotocolormetro; calibrando a cero con la solucin de H2SO4 0.05 M.

2. Seleccionar las longitudes de onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones tipo. 3. En el reporte incluir una tabla con las absorbancias de cada sustancia tipo y la longitud de onda utilizada. Con estos datos construir una grfica para cada espectro de absorcin, colocando en las ordenadas las absorbancias y en las abcisas las longitudes de onda. Debe indicar cual es la longitud de onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones tipo. Comparar los espectros de absorcin de cada solucin tipo y discutir porque tienen diferentes espectros de absorcin. Experimento No. 2 31

PREPARACION DE CURVA DE CALIBRACION PARA UNA SOLUCION TIPO. 1. Preparar 4 diluciones (1:2, 1:4, 1:8, 1:16) para una de las soluciones tipo, utilizando la solucin de H2SO4 como diluyente. 2. Leer la absorbancia de cada dilucin a la longitud de onda seleccionada en el inciso anterior. 3. En el reporte incluir las curvas de calibracin para la solucion tipo, graficando absorbancia vs. concentracin molar. Definir la relacin que existe entre la concentracin y la absorbancia obtenida.

Experimento No. 3 DETERMINACION DE LAS CONCENTRACIONES MOLARES DE LOS COMPONENTES EN UNA MEZCLA. 1.- Preparar las siguientes mezclas: Tubo 1 2 3 K2CRsO7 5.0 2.5 1.0 KMnO4 1.0 2.5 5.0 H2SO4 0.2 0.2 0.2 H2O 3.8 3.8 3.8

2.- Medir las absorbancias de cada mezcla a las longitudes de onda seleccionadas en el experimento No. 1. Utilice la misma solucin tipo del experimento 2. Determinar la concentracin del analito deseado. 3.- Medir un tubo problema a la misma longitud de onda para determinacin de la concentracin desconocida, en base a una lectura patrn de la solucin tipo. RESULTADOS: EXPERIMENTO No. 1 1.- Llenar la siguiente tabla: Longitud de onda 415 445 460 490 520 535 32 Abs K2CRsO7 Abs KMnO4

550 580 610 640

En el reporte incluir una tabla con las absorbancias de cada sustancia tipo y la longitud de onda utilizada. Con estos datos construir una grfica para cada espectro de absorcin, colocando en las ordenadas las absorbancias y en las abcisas las longitudes de onda. Debe indicar cual es la longitud de onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones tipo. EXPERIMENTO No. 2 Longitud de onda seleccionada para el K2Cr2O7 = __________ =As1 Longitud de onda seleccionada para el KMnO4 = __________ =As2 K2Cr2O7 KMnO4 Dilucin 1:2 1:4 1:8 1 : 16 Absorbancia Concentracin

En el reporte incluir la curva de calibracin para la solucion tipo, graficando absorbancia vs. concentracin molar. EXPERIMENTO No. 3 Llenar la siguiente tabla: Determina la concentracin de K2Cr2O7 KMnO4 en las mezclas y en el tubo problema utilizando un tubo patrn de solucin tipo. Mezcla 1 2 Absorbancia Conc. Practica

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3 Problema

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PRCTICA #. 10 ANALISIS ENZIMATICO CUALITATIVO

OBJETIVO: Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de definir el efecto fisicoqumico que generan las enzimas sobre diferentes sustratos. Indicando adems, las propiedades qumicas que permiten que un enzima, catalize la modificacin de un sustrato PREREQUISITOS: 1. Definicin de enzima, substrato, apoenzima, holoenzima, proenzima, zimgeno, coenzima, cofactor. 2. Determine lo que significa: especifidad enzimtica y alosterismo. 3. Defina el efecto de una hidrolasa, oxidoreductasa, transferasa, liasa, ligasa e isomerasa. INTRODUCCION: Todos los organismos vivos pueden obtener y gastar la energa muy rpidamente, debido a la presencia de catalizadores biolgicos llamadas enzimas. Al igual que los catalizadores inorgnicos; las enzimas modifican la velocidad de una reaccin qumica sin afectar el equilibrio final y slo se requieren pequeas cantidades para efectuar la transformacin de un gran nmero de molculas de sustrato. Sin embargo, a diferencia de la mayora de los catalizadores inorgnicos las enzimas son bastante especficas ya que catalizan un nmero comparativamente pequeo de reacciones; en algunos casos, tan solo una reaccin , as mismo las enzimas funcionan solo bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentracin de sustrato, coenzimas etc. Estas condiciones se ilustran en algunos de los experimentos que se tienen determinados en este tema. Las enzimas se designan y se clasifican de acuerdo con el tipo de reaccin que catalizan; los 6 grupos principales de enzimas son: Oxidoreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, Ligasas o Sintetasas. MATERIAL: 1.- 6 tubos de ensaye 2.- 3 pipetas de 1.0 ml 3.- 2 pipetas de 5.0 ml 4.- 2 pipetas Pasteur 5.- 2 gradillas 6.- Tapones de algodon METODOLOGIA.Experimento No. 1 EFECTO DEL CALOR SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS. "ACTIVIDAD DE LA UREASA" Tubo Semilla de Vegetal 1 pizca 2 pizca 3 pizca 35

Agua 0 5.0 5.0 Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sandia y enseguida coloque un tapn de algodn a los tubos 1 y 2 y colquelos en bao a ebullicin durante 20 minutos. (cuidar que no se acabe el agua del bao,) Agua 5.0 0 Azul de Bromotimol 2 Gotas 2 Gotas Aadir cido dbil (GOTAS) en caso de que la solucin tenga un color azul. 0 2 Gotas

Urea 5.0 5.0 5.0 Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire de color amarillo a azul en cada uno de los tubos. Experimento No. 2 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE RENINA. Tubo 1 2 3

Leche 3.0 3.0 3.0 Oxalato de Amonio 0 0.5 0.5 Solucin renina 3 Gotas 3 Gotas 3 Gotas Mezclar e incubar a 37C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada uno de los tubos. Calentar el tubo No. 2 a ebullicin y enfriar. Cloruro de Calcio 0 10 Gotas Mezclar y comparar los cambios observados en los tubos No 2 y 3 con el 1. CUESTIONARIO: 1.- Deacuerdo a la clasificacin enzimtica a que clase pertenecen las enzimas utilizadas (renina y ureasa) y porqu? 2.- Mencione 3 bacterias que contengan la enzima ureasa: 3.- Qu grupos qumicos participan en el sitio activo de las enzimas ? 4.- Las enzimas cambian la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan ? si, no ; porqu? 5.- Porqu algunas protenas actan como catalizadores (enzimas) de reacciones con alta especificidad, mientras que otras protenas que tambin contienen aminocidos en su estructura no lo hacen? 10 Gotas

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PRCTICA #. 11 CINETICA ENZIMATICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
OBJETIVOS: El alumno observar el comportamiento de la actividad enzimtica de acuerdo a los parmetros de concentracin tanto del sustrato determinando los valores de: a) b) c) d) Vmax ( velocidad mxima de la reaccin ). 1/2 Vmax Km ( constante de Michaelis ). [S] ptima ( concentracin ptima de sustrato ).

PRE-RREQUISITOS: 1. Describir el mecanismo de accin de las enzimas en las reacciones qumicas. 2. Cul es la relacin que existe entre la velocidad de una reaccin catalizada y la concentracin de enzima. 3. Definir la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin enzimtica. 4. Interpretar la cintica de Michaelis-Menten y la de Lineweaver-Burk. INTRODUCCION: La cintica qumica es el estudio de la velocidad de cambio que existe entre el estado inicial de reactantes y productos y el estado final. La velocidad es expresada en trminos de cambios de concentracin de sustrato o producto por unidad de tiempo, esto se puede seguir, determinando la desaparicin de reactantes o aparicin de productos en funcin del tiempo. Es particularmente importante hacer notar que constantemente hay cambios en la velocidad de reaccin conforme procede la reaccin hasta llegar al equilibrio, una vez alcanzado ste, los cambios de velocidad son iguales a cero. El determinar la velocidad de una reaccin no revela nada acerca de la estequiometra de los reactantes y productos ni del mecanismo de la reaccin. En la mayora de las reacciones enzimticas al seguir su comportamiento cintico se pueden obtener generalmente varios rdenes de reaccin; al examinar la curva de velocidad respecto a la concentracin de sustrato, se encuentran tres regiones distintas donde la velocidad responde en forma caracterstica a los aumentos de concentracin de sustrato: a) A muy bajas concentraciones de sustrato el comportamiento de velocidad con respecto a la concentracin de sustrato es esencialmente lineal, esto es, la velocidad es directamente proporcional a la concentracin de sustrato y en esta regin se presenta la cintica de primer orden. b) En la etapa final de la curva observamos que la velocidad es esencialmente independiente de la concentracin de sustrato, aqu la cintica es de orden cero.

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c) En la parte intermedia de la curva se presenta una mezcla de rdenes de reaccin, ya que se observan cambios en la velocidad de reaccin pero no siguen una constante de proporcionalidad. Este tipo de estudio cintico fue desarrollado por primera vez por Michaelis-Menten y formularon la siguiente ecuacin: V =Vmax [S] Km + [S] donde las constantes Vmx y Km son caractersticas para cada enzima bajo ciertas condiciones. En forma prctica es difcil determinar el valor de Km de una curva de saturacin de sustrato, pero se puede recurrir a la grfica de Lineweaver-Burk que utiliza los recprocos de velocidad y sustrato, sta tiene la ventaja de dar valores de Km y Vmx estadsticamente ms significativos con tan slo 6 a 8 datos experimentales. En los experimentos a realizar se van a observar los efectos de la concentracin de sustrato y concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica en una reaccin. MATERIAL 1.- 8 Tubos de ensaye 2.- 1 Gradilla 3.- 3 Pipetas de 1.0 ml 4.- 2 Pipetas de 5.0 ml 5.- 1 Bao de agua a 37C 6.- 1 Bao de agua en ebullicin METODOGIA: La invertasa es una enzima hidroltica que acta sobre sacarosa ( un disacrido ) liberando glucosa y fructosa. La actividad de la enzima se detiene al aadir una solucin alcalina y el poder reductor de los productos se mide hacindolos reaccionar con el reactivo de 3,5-dinitrosalicilato. Tubo 1 2 3 1.0 0.5 0 0 1.0 0 0 0 4 1.0 0.5 0 0 0 1.0 0 0 5 1.0 0.5 0 0 0 0 1.0 0 6 1.0 0.5 0 0 0 0 0 1.0

Invertasa 1.0 1.0 Amortiguador 0.5 0.5 Sacarosa 0.02 M 1.0 0 Sacarosa 0.03 M 0 1.0 Sacarosa 0.05 M 0 0 Sacarosa 0.10 M 0 0 Sacarosa 0.30 0 0 Agua 0 0 Mezclar e incubar a 35 C durante 20 min.

Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos. 38

Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero con el tubo No. 6 RESULTADOS: 1.- Graficar los valores de As vs. [S] 2.- Graficar los valores de 1/As vs. 1/[S] 3.- Determinar los valores de: Grfica de M-M Vmx Km Vmx [ S ] ptimo CUESTIONARIO: 1.- La velocidad inicial de una reaccin enzimtica es dependiente exclusivamente de la cantidad de sustrato presente? si, no por qu? 2.- Cual es la diferencia entre los cambios de energa libre que existen entre un proceso catalizado por una enzima y el mismo proceso no catalizado. 3.- Por qu a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km la velocidad de la reaccin es independiente de la concentracin de sustrato? 4.- La Km de una enzima vara con la concentracin de enzima? si, no, por qu? Grfica de L-B

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PRCTICA #. 12 CINETICA ENZIMATICA 2: EFECTO DEL INHIBIDOR SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

OBJETIVO El alumno observar el comportamiento de la inhibicin de la actividad enzimtica de acuerdo a los parmetros de concentracin tanto del sustrato como de inhibidor determinando los valores de: a) Vmax ( velocidad mxima de la reaccin ). b) 1/2 Vmax c) Km ( constante de Michaelis ). INTRODUCCIN Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un organismo patgeno o corregir un desequilibrio metablico, muchos medicamentos actan como inhibidores enzimticos. Tambin son usados como herbicidas y pesticidas. Sin embargo, no todas las molculas que se unen a las enzimas son inhibidores; los activadores enzimticos se unen a las enzimas e incrementan su actividad. La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reaccin correspondiente. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y modifican su estructura qumica a nivel de residuos esenciales de los aminocidos necesarios para la actividad enzimtica. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a ambos. Los inhibidores reversibles se unen a las enzimas mediante interacciones no covalentes tales como los puentes de hidrgeno, las interacciones hidrofbicas y los enlaces inicos. Los enlaces dbiles mltiples entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir una unin fuerte y especfica. Al contrario de lo que ocurre con el sustrato y los inhibidores irreversibles, los inhibidores reversibles generalmente no experimentan reacciones qumicas cuando se unen a la enzima y pueden ser eliminados fcilmente por dilucin o por dilisis. Existen tres tipos de inhibidores reversibles. Se clasifican en base al efecto producido por la variacin de la concentracin del sustrato de la enzima en el inhibidor. En la inhibicin competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el que tambin se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compite para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibicin se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competicin al inhibidor. Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato verdadero (ver ejemplos expuestos ms abajo).

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En la inhibicin mixta, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que el sustrato. Sin embargo, la unin del inhibidor afecta la unin del sustrato, y viceversa. Este tipo de inhibicin se puede reducir, pero no superar al aumentar las concentraciones del sustrato. Aunque es posible que los inhibidores de tipo mixto se unan en el sitio activo, este tipo de inhibicin resulta generalmente de un efecto alostrico donde el inhibidor se une a otro sitio que no es el sitio activo de la enzima. La unin del inhibidor con el sitio alostrico cambia la conformacin (es decir, la estructura terciaria o la forma tridimensional) de la enzima de modo que la afinidad del sustrato por el sitio activo se reduce. La inhibicin no competitiva es una forma de inhibicin mixta donde la unin del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unin con el sustrato. Como resultado, el grado de inhibicin depende solamente de la concentracin de inhibidor MATERIALES

METODOLOGA

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PRCTICA #. 13 CINETICA ENZIMATICA 3: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA

OBJETIVOS: El alumno analizar el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica en una reaccin. Basado en: a. Discutir el efecto sobre el comportamiento cataltico de una enzima al variar el pH de la mezcla de reaccin. b. Discutir los cambios que se presentan en la cintica enzimtica al variar la temperatura de reaccin. c. Determinar las condiciones ptimas de reaccin en funcin de estos dos factores ( pH, temperatura). PRE-RREQUISITOS: 1. 2. 3. 4. 5. Describir el efecto del pH sobre la estabilidad y actividad de una enzima. Describir el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad de una enzima. Describir el sitio activo y sitio de enlace de una enzima. Describir los agentes desnaturalizantes y su mecanismo de accin sobre una enzima. Explicar los conceptos de pH y temperatura ptimos de una enzima en una reaccin catalizada.

INTRODUCCION: Es lgico pensar que el pH de una solucin influye sobre la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas. El sitio activo y el sitio de enlace de una enzima generalmente estn compuestos por grupos ionizables que deben presentarse con una forma inica apropiada o especfica, de tal manera, que se pueda mantener la conformacin adecuada de estos sitios en la enzima y pueda llevarse a cabo la unin del sustrato y su transformacin hacia productos. Igualmente puede existir un sustrato con grupos ionizables y debe contener una forma inica especfica para que pueda unirse a la enzima y posteriormente se realize la catlisis. Los efectos de pH sobre la estabilidad de una enzima se debe tomar en cuenta en cualquier estudio de efecto de pH sobre la catlisis de sustrato. Se observa que el pH ptimo de la reaccin enzima -sustrato es a 6.8 segn la grfica de la curva A, sin embargo, no nos indica porque declina la velocidad por arriba y abajo de este valor. En la curva B se observa que la preincubacin de la enzima entre pH de 5.0 - 8.0 no tiene efecto sobre la actividad medida a pH 6.8. Por lo tanto, la interpretacin de las 2 grficas nos indica que la cada en la actividad entre 6.8 - 8.0 y entre 6.8 - 5.0 es el resultado de la formacin de una estructura inica impropia de la enzima y/o sustrato o los dos. Cuando la enzima es preincubada a pH entre 5.0 - 8.0, se mantiene la actividad completa de la enzima a 6.8. Por arriba o abajo de este valor de pH resulta en inactivacin de la enzima. La estabilidad de la enzima depende de varios factores, por ejemplo, temperatura, fuerza inica, naturaleza del amortiguador, concentracin de iones metlicos, concentracin de sustratos o cofactores y concentracin de enzima. 42

El ltimo factor es muy importante ya que existen algunas enzimas que a bajas concentaciones se disocian en monmeros y que son menos estables. Otro de los factores que afectan la velocidad de una reaccin es la temperatura, de tal suerte que un incremento de temperatura proporciona mayor energa cintica a las molculas reactantes, dando como resultado choques ms productivos por unidad de tiempo. La actividad cataltica de las enzimas resulta de una estructura altamente ordenada. Si la molcula absorbe mucha energa, la estructura se rompe y la enzima se desnaturaliza y por lo tanto pierde su actividad cataltica. Si se grafica velocidad vs. temperatura se obtiene una curva en forma de campana, en el cual el pico se conoce como temperatura ptima. La estabilidad a la temperatura, de una enzima depende del pH, fuerza inica del medio, as como de la presencia o ausencia de metales. La mayora de los sustratos ejercen un efecto de proteccin a la enzima contra la desnaturalizacin por temperatura. Las enzimas de bajo PM compuestas de cadenas sencillas y que poseen enlaces disulfuro son ms estables al calor que las de alto PM. Las enzimas obtenidas de un extracto crudo libre de clulas son ms estables al calor por la alta concentracin de otras protenas (efecto protector). MATERIAL : 1.- 14 tubos de ensaye 2.- 1 gradilla 3.- Celdas de fotocolormetro 4.- Fotocolormetro 5.- Baos de agua de temperatura controlada 6.- 3 Pipetas de 1.0 ml 7.- 2 pipetas de 5.0 ml METODOLOGIA : Efecto del pH Tubo 1 2 1.0 0 0.5 0 0 0 0 0 0 3 1.0 0 0 0.5 0 0 0 0 0 4 1.0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 5 1.0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 6 1.0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 7 1.0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 8 1.0 0 0 0 0 0 0 0 1.0

Sacarosa 0.3 M 1.0 Amortiguador pH = 2.5 0.5 Amortiguador pH = 2.5 0 Amortiguador pH = 3.5 0 Amortiguador pH = 4.5 0 Amortiguador pH = 5.5 0 Amortiguador pH = 6.5 0 Amortiguador pH = 7.5 0 Agua 0 Mezclar e incubar a 37 C durante 2 min.

Agregar 0.5 mL de Enzima (Invertasa) a todos los tubos. Mezclar e incubar a 25C durante 20 min. Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos. 43

Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero con el tubo No. 8 Efecto de la Temperatura Tubo 1 2 3 4 1.0 0.5 1.0 0 45 5 1.0 0.5 1.0 0 60 6 1.0 0.5 1.0 0 100 7 1.0 0.5 0 1.0 25

Sacarosa 0.3 M 1.0 1.0 1.0 Amortiguaor pH = 4.7 0.5 0.5 0.5 Invertasa 1.0 1.0 1.0 Agua 0 0 0 Temperatura C 4 26 37 Mezclar e incubar 5 min a la temperatura indicada. Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.

Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero con el tubo No. 7 RESULTADOS : 1.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs pH. 2.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs temperatura. 3.- Indique cuales son los valores de pH y temperatura ptimos obtenidos. CUESTIONARIO : 1.- La pepsina presenta su mxima actividad a un pH 1. Mencione cules podran ser los grupos funcionales presentes en el sitio activo y sobre cuales residuos de aminocidos rompe los enlaces peptdicos. 2.- Si la concentracin de sustrato en una reaccin enzimtica es igual a un 1/3 de Km. Cul ser la velocidad inicial de la reaccin. 3.- De acuerdo a la clasificacin de las enzimas a que clase pertenece una enzima que participa en la conversin de un azcar de tipo aldosa a un azcar de tipo cetosa. 4.- En esta prctica se ha observado como influye el pH en la actividad de invertasa, a una concentracin de sacarosa dada. La estaquiosa es un tetrasacrido y es un sustrato para esta enzima y se ha observado que es hidrolizado a una velocidad igual al 5% de la sacarosa, bajo las mismas condiciones de concentracin y pH. Cmo explicara esta velocidad mxima tan baja en relacin al pH de la reaccin. ( aGal-a-Gal-a-Glu--Fru ). 5.- Cuando las soluciones enzimticas son calentadas, hay una prdida progresiva de la actividad cataltica con el tiempo. As, una solucin de hexocinasa incubada a 45C durante 12 minutos pierde el 50% de su actividad; pero cuando la hexocinasa se incuba a 45C, en presencia de altas concentraciones de glucosa durante el mismo tiempo, solamente se pierde un 3% de su actividad. Explique el porque de 44

la variacin desnaturalizante de la hexocinasa por efecto de la temperatura en ausencia y presencia del sustrato.

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PRCTICA #. 14 CUANTIFICACION DE COLESTEROL SERICO

OBJETIVO: Determinar la concentracin de colesterol srico y analizar las implicaciones clnicas de niveles anormales de colesterol. PRE-REQUISITOS. 1. 2. 3. 4. Estructura, funcin y tipos de colesterol Relacin metablica entre el colesterol y las lipoprotenas Anlisis de la digestin del colesterol esterificada y no esterificado Relacin de las Lipoprotenas plasmticas con la Aterognesis.

INTRODUCCION. El colesterol es uno de los lpidos que se encuentran en mayor concentracin en la sangre, se puede afirmar que la fraccin lipdica del colesterol, es la segunda en cuanto a concentracin y sta se localiza principalmente formando parte de las lipoprotenas. Qumicamente el colesterol es un compuesto cclico con estructura bsica de perhidrofenantreno con un total de 27 carbones, un radical OH en el carbono 3 y un doble enlace entre los carbonos 5 y 6. El colesterol existe en dos formas: como colesterol libre en muy pequeas cantidades y como colesterol esterificado mediante la unin de un cido graso no saturado de cadena media al carbono 3. Este tipo de colesterol es el ms frecuente tanto en sangre como en tejidos. La mayor parte de colesterol que existe en el organismo es sintetizado en el hgado, sto implica que el colesterol exgeno tenga menor importancia metablica. La sntesis de colesterol endgeno es activada en primera instancia ante el excedente de Acetil-S-CoA que haya en el hepatocito, ya que ste funciona como metabolito precursor y en segunda instancia ante la presencia de efectores hipercolesterolmicos que aumentan la sntesis de colesterol o bin disminuyen el catabolismo del colesterol ya formado. El colesterol exgeno se reduce en el intestino por medio de enzimas bacterianas para dar lugar al colestanol y as entra a la sangre en pequeas concentraciones, otra parte del colesterol exgeno se convierte en un producto de excresin llamado coprostano que se libera con las heces. El colesterol endgeno con frecuencia se cataboliza en el hgado y en otros rganos. El 7dihidrocolesterol se obtiene por oxidacin del colesterol; ste compuesto predomina en la piel y en presencia de radiacin ultravioleta se convierte en colecalciferol que es una de las formas de vitamina D. Otros productos del catabolismo del colesterol son los cidos biliares que en general se deben a una carboxilacin de la cadena lateral del colesterol y sta reaccin sucede en el hgado. Entre los cidos biliares ms comunes est el cido clico, el cido desoxiclico, cido quenodesoxiclico y el cido litoclico. Por ltimo, otros metabolitos son la progesterona y los esteroides corticales, as como hormonas andrognicas y estrognicas.

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METODOLOGIA Fundamento qumico : Esta tcnica se basa en utilizar los derivados polienos del colesterol como elementos cromforos( que dan reaccin de color). En presencia de cido sulfrico concentrado y anhdrido actico ( reactivo de colesterol) se producen diferentes tonalidades de color verde cuya tonalidad es proporcional a la cantidad de colesterol presente en la muestra. Los polienos son estructuras cclicas que resultan de la oxidacin del colesterol. La cuantificacin de HDL colesterol se determina por mtodos de precipitacin en los cuales la formacin de complejos insolubles se debe a interacciones entre los grupos cargados negativamente de los polianiones y los grupos positivos de las subunidades proteicas de las lipoprotenas TECNICA: preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro. REACTIVOS SUERO SOL. PATRON AGUA SOBRENADANTE* REACTIVO DE COLESTEROL Colesterol 0.05 ml. ---2.0 ml. HDL ---0.05 ml 2.O ml Patron o Estandar -0.05 ml. --2.0 ml. Blanco --0.05 mL -2.0 ml

*NOTA: Para adquirir sobrenadante: A 0.5 ml de suero, agregar 0.05 ml de Reactivo precipitante de HDL-COLESTEROL, mezclar, reposar 5 minutos y centrifugar 5 min a 3000 rpm. Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reaccin durante 20 minutos a temperatura ambiente y aadir en forma directa sobre la superficie del lquido 0.20 ml. de Acido sulfrico concentrado. Colocar los tubos por separado inmediatamente despues de la adicin del cido sulfrico en un bao de agua a temperatura ambiente y agitar suavemente. Se deben mantener los tubos en bao de agua mnimo 5.0 minutos. Leer la absorbancia del problema y el patrn ajustando a cero con el tubo blanco a una longitud de onda de 640nm. CALCULOS: [Colesterol Total] = Abs. problema / Abs. del Patrn X [ conc. patrn mg/dl ] [ HDL-COLESTEROL ] = Abs problema / abs patrn x [ conc. Patrn]

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PRCTICA #. 15 EXTRACCIN DE GLUCOGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO. a) Desarrollar una tcnica de extraccin de glucgeno a partir de tejido heptico de conejo o rata y determinar la calidad del glucgeno obtenido por medio de reacciones cualitativas de caracterizacin. b) Conocer las tcnicas de anlisis cualitativo que permiten identificar carbohidratos y su utilizacin como herramienta de trabajo en ciertos experimentos. PREREQUISITOS. 1. Identificar la composicin del glucgeno y sus diferencias estructurales y funcionales con el almidn. 2. Diferenciar los efectos sobre el metabolismo del glucgeno de las siguientes hormonas : Insulina, Glucagn y Adrenalina 3. Identificar las caractersticas de por lo menos tres enfermedades por almacenamiento de glucgeno. 4. Definir el trmino carbohidrato. 5. Diferenciar los tipos de carbohidratos y mencionar ejemplos. 6. Identificar las propiedades qumicas de los carbohidratos. INTRODUCCIN. Los carbohidratos son derivados aldehdicos o cetnicos de alcoholes superiores polivalentes ( ms de un OH). se clasifican en base al nmero de molculas que los componen. Monosacridos (azcares simples) no se pueden hidrolizar en molculas ms sencillas, pueden subdividirse en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas etc. segn el nmero de tomos de carbono que tengan. Las siguientes reaccines permiten identificar de manera cualitativa la presencia de cierto tipo de azucares en una muestra problema y se utilizan en la prctica tanto clnica como vegetal. Muchas de las pruebas que se estudiarn en el laboratorio requieren tiempo para que aparezca un precipitado o se desarrolle un color. La mayara de las reacciones son muy sensibles, por lo que el uso de reactivos en cantidades mayores pueden conducir a interpretaciones errneas. El glucgeno es un polisacrido ramificado constitudo de molculas de alfa d-glucosa unidas por enlaces glucosdicos. Es el nico polisacrido que se produce y se almacena en el humano, siendo el hgado el principal promotor de la glucognesis que es la va metablica de dicho polisacrido. Todas las clulas del organismo son capaces de producir glucgeno y la capacidad de sntesis de cada clula estar dada por la cantidad de enzima glucgeno sintetasa que presenta. El hepatocito, por lo tanto, es la clula que mayor cantidad de glucgeno sintetasa presenta. Desde el punto de vista energtico, ste polisacrido es importante ya que por ser una fuente almacenadora de glucosa es factible que se pueda utilizar cuando el organismo as lo requiera mediante una va de hidrlisis del glucgeno que se conoce como glucogenolisis.

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Tanto en la glucognesis como la glucogenolisis son vas reguladas hormonal y alostricamente. La insulina promueve la actividad de la glucognesis y en forma directa sobre la glucgeno sintetasa y la adrenalina activa en forma indirecta a la glucogenlisis e inhibe de la misma forma a la glucogenesis esto es , induce la formacin de AMP-Cclico para que este a su vez active a la glucogeno-fosforilasa e inhiba a la glucgeno sintetasa. El mecanismo de regulacin es complejo y algunas veces puede fallar a tal grado que altera el almacenamiento de glucgeno y generar estados patolgicos llamados glucognosis, algunos de los cuales pueden llegar a ser fatales tales como las enferedades de Von-Gierke, Andersen, de Pompe, Mc. Ardle, Hers, etc. Estas enfermedades se caracterizan por presentarse debido a una deficiencia congnita de algunas de las enzimas arriba mencionadas y otras relacionadas con ellas. MATERIAL. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 6 Tubos de ensaye 15 X 150 mm 1 Mortero con pistilo 2 Pipetas de 1.0 ml. 1 Pipeta de 5.0 ml. 1 vaso de precipitados Gradilla. Vidrio de reloj 8. Balanza granataria 9. Probeta de 100 ml. 10.- Bao de agua a ebullicin 11 Tubos de ensaye 12.- 2 Pipetas de 1.0 ml 13.- Pipeta de 5.0 ml 14.- Gradilla

METODOLOGIA: Extraccin de Glucgeno 1. Pesar 5g de hgado y cortarlo en trozos pequeos (utilizar el vidrio de reloj). 2. Colocar unos trozos en un mortero fro al cual se le aade TCA al 10 % en proporcin de 1.0 ml por cada gramo de tejido y una pizca de arena lavada. 3. Centrifugar 5 min. a 2000 r.p.m. 4. Recuperar el sobrenadante en un tubo de ensaye grande y medir el volmen. 5. Aadir 2 volmenes de alcohol al 95 % por volmen de sobrenadante agitando lentamente hasta que el glucgeno flocule. 6. Centrifugar a 2 000 r.p.m. 5 Min. 7. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 4.0 ml. de agua destilada. 8. Utilizado la suspensin de glucgeno como muestra problema, desarrolle las tcnicas de Fehling ,Lugol y Molish al mismo tiempo que los carbohidratos provedos por el profesor.

EXPERIMENTO # 1 REACCION DE FEHLING (IDENTIFICACION DE COMPUESTOS REDUCTORES ) Esta reaccin nos identifica carbohidratos con capacidad reductora, se basa en que algunos azcares en un medio fuertemente alcalino y en presencia de oxgeno o de diversos agentes oxidantes ej. Cu, Ag dan las reacciones de reduccin que dependen de la existencia de un grupo carbonilo libre como en la glucosa, galactosa, fructosa, maltosa y lactosa. Si la prueba se efecta con una solucin que contenga cloroformo como conservador, puede obtenerse un resultado positivo, sin que exista azcar, las sales de amonio tambin interfieren en la reaccin. Si la solucin problema es cida debe neutralizarse antes de efectuar la prueba. 49

Fundamento: si calentamos una solucin de Cu(OH)2 en un medio alcalino formamos oxido cprico (negro) CuO y en presencia de sustancias reductoras se precipita como oxido cuproso Cu2O de color caf rojizo pardo . Solucion A contiene sulfato de cobre . Solucion B contiene tartrato de sodio y potasio e Hidroxido de potasio . METODO MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno) 1.0 ml. SOL. DE FEHLING A 0.5 ml SOL. DE FEHLING B 0.5 ml. MEZCLAR Y CALENTAR A BANO DE EBULLICION 5 MIN. COLOR ROJO ES POSITIVO. EXPERIMENTO # 2 REACCION DE MOLISH-UDRANSKY. Esta prueba es positiva con aldehidos y algunos cidos como el frmico, oxlico, lctico, ctrico, etc. Esta reaccin es muy sensible , dicha sensibilidad para la glucosa es de hasta 0.001% y para sacarosa de 0.0001%. METODO MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno) Reactivo de Molish 3 GOTAS 1.0 ml

Mezclar y aadir 0.5 ml de cido sulfrico concentrado ( resbalando por la pared del tubo ) NO mezclar. La aparicin en la interfase de un anillo violceo es indicativo de que la prueba result positiva. EXPERIMENTO # 3 REACCION DE SELIWANOFF Est reaccin permite diferenciar Aldosas de Cetosas. Anote el tiempo en el cual aparece el color en cada uno de los tubos. Una reaccin positiva est dada por la aparicin de un color rojo. Es utilizada para diferenciar Cetosas de Aldosas ( Reaccin de Seliwanoff ) METODO MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno) REACTIVO DE SELIWANOFF 5.0 ml 1.0 ml

Mezclar y calentar en bao de ebullicin durante 1 minuto, anote el resultado. Las cetosas dan un color rojo y las aldosas dan la prueba dbil y lentamente. EXPERIMENTO # 4 REACCION DEL YODO O LUGOL 50

Esta reaccin identifica los polisacridos como Amilosa, Amilopectina, Glucogeno, Almidon formando un complejo adsortivo entre el Iodo y las cadenas helicoidales del polisacrido (enlaces alfa 1,4 glucosdicos y enlaces alfa 1,6 glucosdicos de por lo menos 8 residuos de glucosas ) . METODO. MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno) 1.0 ml. LUGOL 3 GOTAS Mezclar y si es necesario calentar 2 segundos en bao de ebullicin. La aparicin de un color azul o violeta indica la presencia de un polisacarido. RESULTADOS FEHLING MUESTRA GLUCGENO AGUA CUESTIONARIO 1. Mencione las diferencias en las propiedades qumicas de los monosacridos con los aminocidos y los lpidos. 2. Mencione 3 funciones fundamentales de los carbohidratos en la clula, ejemplificando en cada caso. 3. Mencione 2 homopolisacaridos y 3 heteropolisacaridos y su composicin, indicando tambin los tipos de enlaces que presentan. 4. Defina y ejemplifique con carbohidratos los siguientes conceptos: Isomera ptica, Anomerismo, Epimerismo. 5. Explique el mecanismo de accin de los segundos mensajeros en la regulacin hormonal y enzimtica del metabolismo del glucgeno. 6. Describa las implicaciones bioqumicas que se presentan en la enfermedad de Von Gierke 7. Describa dos eventos bajo los cuales se puede activar la va de la glucogenolisis. LUGOL MOLISH

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PRCTICA #. 16 EFECTO DE LAS COENZIMAS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

OBJETIVO: Determinar cualitativamente, mediante la observacin de los grados de decoloracin; las relaciones existentes entre la actividad de la deshidrogenasa lctica (LDH) y la presencia de nicotinamida adenin dinucletido (NAD), en funcin de los siguientes aspectos: a) Determinar si la actividad de LDH depende de la presencia de NAD. b) Especificar la actividad de indicador redox del azul de metileno. c) Aportar pruebas experimentales que demuestren que la coenzima no se modifica estructuralmente durante la actividad de la enzima. PRERREQUISITOS: 1.- Definir los trminos: cofactor, coenzima y metaloenzima. 2.- Mencionar las coenzimas que actan en oxidorreducciones. 3.- Explicar como afectan las coenzimas a la cintica enzimtica. INTRODUCCION: La mayora de las manifestaciones metablicas de un organismo, se relacionan con cambios de energa, la cual se obtiene por la oxidacin sistemtica de los nutrientes y esto es debido a que en los procesos de oxidorreduccin hay transferencias de energa generadas por diferencias en el potencial elecroqumico. Un sistema de potencial elevado, oxida al de ms bajo potencial con la consiguiente liberacin de energa para las necesidades vitales. En todas las reacciones de oxidorreduccin, existe transferencia de electrones. La oxidacin se define como: la prdida de electrones por parte de un compuesto, mientras que la reduccin es la ganancia de dichos electrones por otro compuesto. Por lo tanto, la oxidacin y la reduccin son fenmenos que se realizan en forma simultnea. La oxidacin biolgica implica transferencia de hidrgenos y electrones a travs de una serie de sistemas enzimticos que actan como intermediarios, para llegar al aceptor final que es el oxgeno. El proceso oxidativo se inicia por la oxidacin de una deshidrogenasa especfica que no reacciona directamente con el oxgeno, sino que requiere intermediarios como el NAD, las flavoprotenas y los citocrmos.

Piruvato

Lactato

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En el presente experimento, se pretende realizar un estudio cualitativo, donde se utilizar la deshidrogenasa lctica de msculo de rata; que slo es activa en estado de anaerobiosis y requiere NAD como intermediario para completar su actividad, la cual se manifiesta en la siguiente reaccin: Con este experimento se pretende demostrar que: Si la LDH es una enzima que funciona normalmente, en base a la concentracin de NAD y anerobiosis promoviendo la reduccin del piruvato en presencia de NADH + H+; entonces, aumentando la concentracin de NAD+ podemos revertir la reaccin para oxidar al lactato y generar NADH + H+ el cual reccionar con el azul de metileno y provocar su decoloracin. Si esta premisa se cumple se habr demostrado que la concentracin de la coenzima puede regular la direccin de la actividad de una enzima reversible. MATERIAL : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 4 tubos de ensayo de 20 x 150 mm. 3 pipetas de 5.0 ml. 1 pipeta de 2.0 ml. 1 pipeta de 1.0 ml. 2 vasos de precipitado de 150 ml. 1 matraz erlenmeyer de 125 ml. 1 mortero con pistilo. 1 bao Mara ajustado a 37C. Arena lavada. (agente triturante). NaCl al 0.9% (solucin isotnica para suspender clulas) KCN al 0.5% (inhibidor de las deshirogenasas mitocondriales). Lactato de sodio al 1.0%.(substrato de la LDH). Azul de metileno 0.002 M.(indicador redox que reacciona con NAD). Aceite mineral. (compuesto que al sellar los tubos promueve la anaerobiosis).

METODOLOGIA : Preparacin de la enzima LDH: 1. Colocar 5 gr de msculo de res en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al 0.9% (10 ml. por gramo de tejido) y agregar un poco de arena. Triturar perfectamente. 2. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 minutos. 3. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y recuperar el sobrenadante etiquetndolo como LDH. Preparacin de la coenzima NAD: 1. Obtener otros 3 gr. de tejido muscular. 2. Cortar el msculo en fragmentos ms pequeos y ponerlo en agua a ebullicin por 5 minutos en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. en una proporcin de 8 ml. de agua por gramo de msculo. 3. Pasar la preparacin a un mortero con un poco de arena y triturar perfectamente. 4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como NAD. Preparacin de la enzima DSC a partir de msculo cardico 1. Tomar de 2 a 3 g de msculo de corazn cortarlo en fragmentos pequeos. 2. Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al 0.9% en una proporcin de 10 ml. por gramo de msculo, agregar un poco de arena lavada y triturar perfectamente. 53

3. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 min. 4. Centrifugar el homogeneizado a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como DSC.

Deteccin de la actividad enzimtica de LDH: Preparar una serie de cuatro tubos de ensayo como se indica a continuacin: NOTA: se debe tener precaucin al utilizar el KCN ya que es altamente txico. utilice bureta. TUBO KCN 0.5% Lactato de Sodio al 1.0% Azul de metileno 0.002 M Agua destilada Coenzima ( NAD ) Enzima ( LDH ) 1 1.0 ml 1.0 ml 2 1.0 ml 1.0 ml 3 1.0 ml --------4 1.0 ml 1.0 ml

0.3 ml

0.3 ml

0.3 ml

0.3 ml

1.0 ml -------1.0 ml

---------1.0 ml 1.0 ml

1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

1.0 ml 1.0 ml ---------

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar 1.0 ml. de aceite mineral, evitando mezclarlos. Incubar en bao de agua a 37C los tubos MANTENIENDOLOS INMOVILES y observar los grados de decoloracin de cada solucin. Hacer estas observaciones en intervalos de 15 minutos durante 45 minutos.

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RESULTADOS : TUBO 15 min 30 min 45 min 1 2 3 4

DISCUSION: 1.- Relacione el efecto de cada reactivo con los resultados obtenidos. 2.- Determine si los resultados que obtiene son acordes con los esperados. 3.- Explique el fundamento qumico de la reaccin entre el azul de metileno y el NAD. 4.- Mencione los errores, si es el caso, en el planteamiento o en el manejo del experimento que pudieran modificar los resultados. CUESTIONARIO: 1.- Mencione las diferencias entre una enzima y un cofactor. 2.- Explique cual es el efecto del oxgeno en la actividad de las oxidasas. 3.- Mencione cinco coenzimas que acten con transferasas. 4.- Explique la relacin que existe entre algunas coenzimas y las vitaminas del complejo B. 5.- Describa la funcin del fosfato de piridoxal en la reaccin que cataliza la enzima transaminasa glutmico oxaloactica (GOT).

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PRCTICA #. 17 EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

OBJETIVO: Analizar el efecto inhibitorio de los compuestos qumicos malonato de sodio y oxalato de sodio, sobre la actividad enzimtica de lactato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa, en base al tipo de inhibicin que generan. PRERREQUISITOS: 1. 2. 3. 4. 5. Explicar el trmino actividad enzimtica. Describir el fenmeno de inhibicin competitiva. Describir el fenmeno de inhibicin no competitiva. Enumerar al menos cinco inhibidores que acten en cada tipo deinhibicin. Explicar el comportamiento cintico de una enzima cuando esta bajo el efecto de ambos tipos de inhibicin.

INTRODUCCION: Algunos compuestos reaccionan con las enzimas disminuyendo su actividad cataltica. Este efecto se utiliza para preparar drogas o insecticidas que inhiben selectivamente ciertas enzimas en la bacteria o insecto infectante y que no afecte al hospedero. La inhibicin es una de las formas ms tiles para regular la actividad de una enzima. Los estudios logrados en base a inhibidores, han contribuido a la informacin actual sobre cintica enzimtica y mecanismos tanto metablicos como clnicos. Los dos tipos principales de inhibicin son: La inhibicin competitiva: donde el compuesto inhibidor interacciona con el sitio cataltico, compitiendo con el sustrato por la unin con dicho sitio. En este caso el grado de inhibicin depende directamente de la concentracin del inhibidor, con respecto al sustrato especfico, por lo tanto, si la concentracin de sustrato es mayor que la del inhibidor, no se presentar el efecto inhibitorio. Ms an, si a una enzima bajo el efecto de un inhibidor competitivo se le adiciona mayor cantidad de sustrato, casi siempre desaparecer el efecto inhibitorio. La mayora de los inhibidores competitivos tienen una estructura qumica semejante a la del sustrato natural por lo tanto son muy especficos. Como el inhibidor competitivo se une al sitio cataltico, la enzima pierde afinidad con el sustrato original y esto modifica la constante de Michaelis (Km). La inhibicin no competitiva es aquella, donde el inhibidor se combina con la enzima, pero no con el sitio cataltico de manera que la enzima puede unirse al sustrato y al inhibidor simultneamente. La inhibicin ocurre porque al unirse el inhibidor provoca cambios moleculares en la enzima que disminuyen su actividad cataltica. El aumento de la concentracin de sustrato no tiene efecto sobre el inhibidor. Los inhibidores no competitivos son inespecficos o sea que un mismo inhibidor puede afectar a varias enzimas a la vez. Existen inhibidores muy complejos como el pentacloruro de mercurio, el benzoato de 56

sodio o muy simples como los iones metlicos plata, cobre, plomo y cianuro. La inhibicin no competitiva no afecta la afinidad de la enzima por el sustrato por los que la Km se mantiene intacta. En este caso, el complejo enzima-sustrato-inhibidor no puede disociarse y ocurre una disminucin en la cantidad de enzima activa disponible. MATERIAL : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 14 tubos de ensayo de 20 X 150 mm. Cuatro pipetas de 1.0 ml. Dos pipetas de .0 ml. Dos pipetas Pasteur. Una gradilla. Solucin de succinato de sodio 0.1 M. Solucin de malonato de sodio 0.1 M. Solucin de azul de metileno 0.002 M. Preparacin de la enzima deshidrogenasa succinica (DSC). Solucin de cloruro de sodio al 0.9%.

METODOLOGIA: En este experimento se probar el efecto inhibitorio del malonato de sodio mediante un diseo en donde, se aumenta gradualmente la concentracin de inhibidor con respecto al sustrato, manteniendo constante la concentracin de la enzima. La verificacin de la actividad se determinar, en referencia a la actividad de un redox biolgico (azul de metileno) ya que las enzimas que utiliza el diseo son oxidorreductasas.

Preparacin de DSC a partir de msculo cardico de rata. 1.- Tomar de 2 a 3 g de msculo de corazn cortarlo en fragmentos pequeos. 2.- Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al 0.9% en una proporcin de 10 ml. por gramo de msculo, agregar un poco de arena lavada y triturar perfectamente. 3.- Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 min. 4.- Centrifugar el homogeneizado a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como DSC. Efecto del malonato de sodio sobre la actividad de DSC: Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro: TUBO 1 2 3 4 5 6 7

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Succinato de Sodio 0.1M Azul de metileno 0.002M Malonato de sodio 0.1M Agua destilada Enzima DSC

0.5 0.3 -----1.0 2.0

------0.3 ----1.5 2.0

0.5 0.3 ----3.0 ----

0.5 0.3 1.5 ----2.0

0.5 0.3 0.5 0.5 2.0

0.5 0.3 0.25 0.75 2.0

1.0 0.3 0.25 0.25 2.0

Mezclar bien el contenido de cada tubo. Incubar en bao de agua a 37 C y observar los grados de decoloracin que genera cada tubo a los 15, 30, 45 y 60 min de incubacin.

RESULTADOS

TUBO 15 min 30 min 45 min 60 min

DISCUSION: 1.-Discuta el tipo de inhibicin que genera el malonato de sodio. 2.-Determine si el diseo experimental que se plantea en esta practica es el adecuado para la diferenciacin de una inhibicin competitiva y no competitiva. 3.-Explique los cambios moleculares que genera el inhibidor no competitivo sobre la estructura de la enzima. CUESTIONARIO: 1.- Describa el comportamiento cintico de una enzima bajo el efecto de un inhibidor competitivo. 2.- Haga la misma descripcin para una inhibicin no competitiva. 3.- Analice las diferencias entre un inhibidor y un efector alostrico negativo. 4.- Qu tipo reacciones especficas inhiben los siguientes compuestos: 58

a.- Yodoacetato b.- Cianuro c.- Alopurinol d.- Tioguanina e.- Fluoruros f.- 2,4-dinitrofenol g.- Metotrexato

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PRCTICA #. 18 DETERMINACION DE UREA Y CREATININA SERICA

OBJETIVO: Al finalizar esta prctica, el alumno deber tener los fundamentos para poder interpretar desde el punto de vista clnico, los resultados obtenidos de la cuantificacin de urea y creatinina de una muestra de suero de un paciente. PREREQUISITOS: 1.- Describir los puntos principales del ciclo de la urea. 2.- Describir los mecanismos de produccin de la cretinina. 3.- Identificar los principales tejidos productores de urea y creatinina. 4.- Interpretacin de aumento y disminucines de los analitos anteriormente INTRODUCCION: La urea es el principal producto de excrecin, proveniente del catabolismo de las protenas, el cual se origina a partir de los grupos amino de los aminocidos. Esta va, es el principal medio de excrecin de nitrgeno por el organismo. La urea es sintetizada en el hgado por medio del ciclo de la urea (descrito en 1932 por Sir Hans Krebs y Kurt Henseleit) tambin llamado ciclo de la ornitina, cuya funcin fundamental es convertir el amonico y el bixido de carbono en urea. Fig. 1 La urea es el producto final del metabolismo protico; sintetizada por el hgado, transferida al torrente circulatorio y excretada por el rion. La urea contiene en su estructura dos nitrgenos cuyo peso atmico es 28, los cuales relacionados con el peso molecular de la urea que es 60 se obtiene una constante de 2.14 que es utilizado para convertir en valores de nitrgeno ureico y viceversa. Los aumentos del BUN estn relacionados con los siguientes trastornos tales como: PREREANAL en los que se encuentra un flujo sanguneo reducido como en la insuficiencia cardaca congestiva, shock, deplecin de agua y sal as como tambien vmito, diarrea, diuresis, sudoracin etc. En trastornos POSTRENALES como obstrucciones del tracto urinario, hemorragia digestiva, infarto al miocardio, stress etc. Y clsicamente en insuficiencia renal y otras entidades tales como dieta alta en protenas y pancreatitis. El nitrgeno urico sanguneo (BUN) esta elevado en toda lesin renal, que perturbe su funcin excretora. La urea tambin se eleva en casos de azoemia prerrenal (elevacin de los productos nitrogenados del metabolismo orgnico POR CAUSAS NO RENALES), que depende un bajo volumen plasmtico circulante, como ocurre en la hemorragia masiva, deshidratacin. Est tambin elevada en los casos que cursen con catabolia protenica elevada, acompaada de baja eliminacin renal.

analizados.

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Cuando los niveles de urea pasan de 214 mg/100 ml, aparece depresin mental, somnolencia y desequilibrio hidroelectroltico, y si los niveles siguen aumentando, aparece el coma urmico.

La creatinina se forma en los msculos a partir del fosfato de creatina. Un 2% de esta sustancia se convierte diariamente en esta sustancia. Es excretada por los riones, y en pequea cantidad por las heces. La creatinina libre que aparece en la sangre y orina no vuelve a ser utilizada. Esta se excreta en la orina de manera constante. En condiciones fisiolgicas normales la creatinina urinaria representa la filtracin glomerular y la excrecin tubular activa, formndose a partir de la creatina en cantidades constantes. La creatinina normal del suero no se modifica ni con la dieta, edad, sexo, catablia protenica ni ejercicio. Sin embargo, con una ingesta proteca sustancial, que incluye una cantidad considerable de carne y con ejercicios intensos durante largos perodos, se han observado en sujetos jvenes sanos, excreciones urinarias de creatinina del orden del 2.5 a 2.7 g/24 hrs., pero con niveles sanguneos normales; por lo tanto, se deduce que los niveles sanguneos de creatinina en los sujetos normales son ms constantes que los niveles en la orina. La cifra normal dependiendo de la tcnica esta comprendida entre 0.5 y 1.6 mg/100 ml de suero o plasma, y es proporcional a la masa muscular. Sus aumentos generalmente van parejos con los de la urea, aunque la creatinina tarda ms en aumentar. Se presentan aumentos:

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1.BUN/Creatinina Mayor 10:1 en aporte excesivo de protenas, excesivo catabolismo tisular (quemaduras, fiebre, tratamiento con corticosteroides), obstruccin postrenal, shock hipovolmico y en la insuficiencia renal aguda y crnica. 2. BUN/Creatinina Menor 10:1 Escaso aporte de protenas, dialisis, deshidratacin (diarrea, vmito), insuficiencia heptica. MATERIAL: 1.- Fotocolormetro 2.- Bao de agua a ebullicin 3.- 2 Pipetas 5.0 ml 4.- 2 Pipetas 1.0 ml 5.- 2 Pipetas 0.1 ml 6.- 3 Tubos de ensaye 13 X 150 mm 7.- 2 Tubos de ensaye 10 X 100 mm 8.- 2 celdas de fotocolormetro METODOLOGIA : Tomar una muestra de sangre pos puncin venosa (3.0 ml aproximadamente) de uno de sus compaeros, (revisar el Apndice I) con o sin anticoagulante, centrigugar la muestra ysepare el suero o plasma segn sea el caso. Experimento No. 1 Cuantificacin de urea srica. Reactivos Diacetilmonoxima Agua Sol. patrn o std. Suero o plasma Reactivo cido Blanco 3 ml. 0.05 ml --------3 ml. Patron 3 ml. ----0.05 ml. ----3 ml. Problema 3 ml. ----------0.05 ml 3 ml

Mezclar y calentar en bao a ebullicin durante 10 minutos. Enfriar al chorro de agua y leer las absorbancias ajustando con el blanco a cero a una longitud de onda de 520 nm. CALCULOS ( )

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Experimento No. 2 Cuantificacin de creatinina srica

REACTIVOS Agua Tungstato de sodio 10% Acido sulfrico Suero o plasma (ml.) Sol. Patrn o estandar (ml.)

PATRON 3.5 0.5 0.5 --0.5

PROBLEMA 3.5 0.5 0.5 0.5 ---

BLANCO 4.0 0.5 0.5 0.5 ---

Centrifugar los tubos Patron y Problema a 2,500 rpm por 5 min Tomar sobrenadante y realizar lo siguiente: REACTIVOS Sobrenadante NaOH 0.75 N Acido Picrico PATRON 3.0 1.0 1.0 PROBLEMA 3.0 1.0 1.0 BLANCO 3.0 1.0 1.0

Reposar por 15 min a temperatura ambiente y leer absorbancia a 490 nm del tubo patrn y problema, ajustando a cero de absorbancia con el tubo blanco. CALCULOS ( )

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