Efectividad y modo de accin de nisina sobre Lactobacillus fructivorans

Nuez, Griselda A. - Cayr, Mara. E. - Castro, Marcela P. - Garro, Oscar A. Ctedra Microbiologa de Alimentos - Facultad de Agroindustrias - UNNE. Comandante Fernndez 755 - (3700) Pcia. Roque Senz Pea - Chaco - Argentina. Tel./Fax: +54 (03732) 420137 E-mail: ganunez@fai.unne.edu.ar
ANTECEDENTES

Determinadas cepas bacterianas generan pequeas protenas conocidas como bacteriocinas. Estos biocompuestos funcionan como antibiticos de reducido espectro ya que tienden a daar solo a aquellos microorganismos similares a las bacterias que los producen. La nisina es uno de estos compuestos. Aislada en 1928, comenz a utilizarse como antimicrobiano en algunos alimentos en la dcada del '50 y actualmente reviste la categora de GRAS ("Generally Recognized As Safe": reconocido generalmente como seguro) por la FDA (Food and Drug Administration, USA). La nisina es una sustancia polipeptdica producida por Lactococcus lactis a partir de una fermentacin en medio lcteo modificado. Presenta actividad antimicrobiana contra un rango limitado de bacterias Gram-positivas, particularmente sobre aquellas formadoras de esporas. La molcula es acdica y por tanto exhibe su mayor estabilidad bajo condiciones cidas (Delves-Broughton, 1990). Es tambin ms soluble a pH bajo (Hurst, 1981). El uso propuesto de las bacteriocinas como preservadores potenciales de alimentos no se entiende como un medio primario de preservacin. La mayora de los investigadores consideran que las bacteriocinas contribuyen a la tecnologa de "obstculos" ("hurdle approach") para la seguridad y preservacin de los alimentos. Esta tecnologa se basa en el uso de un nmero de factores intrnsecos (e.g., tratamiento trmico, pH, sales, otros preservadores) y extrnsecos (e.g., temperatura de almacenamiento, atmsfera del empaque) que actan como "barreras u obstculos" frente al crecimiento o supervivencia de microorganismos patgenos o causantes de deterioro del alimento. A mayor cantidad de barreras, mayor es la dificultad del microorganismo a crecer o sobrevivir (Leistner, 1994). Contrariamente a las barreras biostticas, las cuales slo inhiben el crecimiento de los microorganismos contaminantes, las bacteriocinas pueden servir como barreras bactericidas y ayudar a reducir el espectro de microorganismos que pudieran desarrollarse en el alimento (Muriana, 1996). El efecto de distintos factores fsico-qumicos sobre la actividad de una bacteriocina no slo tiene el fin de caracterizarla, sino tambin sirve para inferir su posible aplicacin industrial, ya que las altas temperaturas y las amplias variaciones de pH son, entre otras, algunas de las condiciones que debe resistir una bacteriocina para ser til como potencial agente inhibidor de microorganismos no deseados en procesos alimenticios (fermentaciones de leche, maduracin de quesos, curado de encurtidos, etc.) (Faras, 1996). El microorganismo Lactobacillus fructivorans se halla dentro de la microflora alterante de salsas y aderezos. La acidez de estos productos oscila entre 2,9 y 4,4 unidades de pH (Smittle, 1982). Si bien se halla aprobado el uso de nisina como preservador para este tipo de alimentos, no se ha reportado en la bibliografa el modo de accin y la efectividad de esta bacteriocina sobre L. fructivorans. El objetivo de este trabajo fue determinar la efectividad de nisina sobre L. fructivorans a valores de pH cercano a la neutralidad y cido (3,5), as como tambin establecer el modo de accin de esta bacteriocina sobre dicho microorganismo en esas condiciones.
MATERIALES Y METODOS

Preparacin del inculo L. fructivorans CRL 941 conservado en lquido crioprotector fue suspendido en medio nutritivo lquido MRS (Biokar Diagnostics, Beauvais, France) e incubado durante 24 h a 30C. Seguidamente se realizaron dos repiques adicionales de la cepa antes de ser inoculada a los sistemas en estudio. En cada caso, estos repiques se realizaron en medio lquido nutritivo ajustado al valor de pH correspondiente con una solucin 500 g/l de cido ctrico. Las lecturas de pH se realizaron con un medidor con electrodo de vidrio (Accumet, Fischer, USA). Preparacin de la solucin de bacteriocina Se utiliz una solucin concentrada de nisina de 10000 ppm. El diluyente se prepar con 0,83 ml de HCl 12,1N y 3,75 g de NaCl suspendidos en agua destilada c.s.p. 500ml. En estas condiciones el pH es lo suficientemente bajo para asegurar la estabilidad de la bacteriocina durante la esterilizacin a 115,6C (Tramer, 1964) Determinacin de la efectividad y modo de accin de la nisina El monitoreo de la evolucin del microorganismo en los sistemas ensayados se realiz mediante mediciones de densidad ptica (DO) a 580 nm, contra blanco de medio de cultivo sin inocular, y recuento en placa sobre agar MRS

(Biokar Diagnostics, Beauvais, France), durante 53 h. El inculo inicial agregado fue el necesario para alcanzar un recuento de 105 UFC/ml. Este nmero de clulas se corresponde con una lectura de DO al inicio del rango de deteccin. Se prepararon dos sistemas modelo a distintos valores de pH: 3,5 y 6,5. Las corridas se realizaron por cuadruplicado con sistemas testigo, a los cuales no fue agregado el biopreservador. El agregado de la solucin de nisina se realiz durante la fase exponencial de crecimiento del microorganismo en c.s.p. alcanzar una concentracin final en los sistemas modelo de 2000 ppm. El modo de accin de una sustancia inhibidora frente a una clula sensible puede ser bacterioltico, bacteriosttico o bactericida. El primero implica muerte celular seguida de lisis, con la concomitante disminucin de la DO. El modo de accin bactericida produce tambin muerte celular que se manifiesta en la disminucin en el conteo de colonias pero sin lisis y por consiguiente la DO se mantiene constante. El modo de accin bacteriosttico no produce muerte celular pero detiene el crecimiento, por lo cual, sin muerte celular, el conteo de colonias y la DO se mantienen constantes.
RESULTADOS Y DISCUSION

En la Figura 1 puede observarse el efecto producido por el agregado de nisina en ambos sistemas. La figura 1(a) exhibe el modo de accin de la bacteriocina a pH 6.5, donde claramente se visualiza la disminucin de la DO posterior al agregado de la misma. En dicho momento, los recuentos obtenidos fueron de 1,7x108 UFC/ml. A las 24 horas de la adicin de nisina, el nmero de microorganismos presentes fue menor a 103 UFC/ml. De lo expuesto precedentemente se infiere que el modo de accin de nisina sobre L. fructivorans a pH cercano a la neutralidad es bacterioltico. La figura 1(b) muestra cmo el agregado de la bacteriocina provoca que las lecturas de DO se mantengan constantes en el tiempo de experimentacin. Del recuento en placa surge que el modo de accin de nisina sobre L. fructivorans a pH 3,5 es bactericida ya que el nmero de microorganismos disminuy con el transcurso del tiempo.

(a)
ABS 580 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 5 Tiempo (horas) 10 15
Agregado de Nisina

1 ABS 580 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

(b)

Agregado de Nisina

20

40 T iempo (horas)

60

Figura 1. Crecimiento de Lactobacillus fructivorans a pH 6,5 (a) y 3,5 (b) sin el biopreservador (o) y en presencia de 2000 ppm de nisina ().

Basados en las caractersticas catinicas e hidroflicas de la nisina, dos son los mecanismos que explican el modo de accin de la nisina sobre la permeabilizacin de la membrana celular: 1) las bacteriocinas actan como un complejo de poracin en el cual los monmeros de la misma se unen, insertan y oligomerizan en la membrana citoplasmtica para formar un poro y 2) las bacteriocinas desestabilizan la membrana a modo de un detergente (Abee y col., 1995; Muriana, 1996). Los resultados de muchos estudios tienden a apoyar el modelo de la formacin de poros sobre el que propone una accin tipo detergente. Un esquema del modelo de poracin se presenta en la fig. 2. Los monmeros de nisina se unen a la membrana citoplasmtica a travs de uniones electrostticas con los fosfolpidos cargados negativamente, luego se insertan en la membrana con una reorientacin que depende del potencial de membrana. Este potencial podra estar influenciado por el pH y la composicin fosfolipdica. Los monmeros se agregan resultando en la formacin de un poro en la membrana, hacia adentro de la regin de fosfolpidos se ubican los residuos hidroflicos y hacia fuera los hidrofbicos, con la consecuente salida de iones y la prdida de la fuerza protn motriz (FPM) a la que le sigue la muerte celular.

Figura 2. Interaccin de los monmeros de bacteriocina con la membrana citoplasmtica: modelo de complejo de poracin. (Faras, 1996).

Por otro lado, estudios realizados con espectroscopa de fluorescencia sobre la interaccin de nisina con la bicapa lipdica demostraron que la concentracin de bacteriocina por molcula de lpido determina el grado de eflujo de ATP intracelualar que lleva a la muerte celular y que a pH neutro se requieren menos molculas de bacteriocinas (Gao y col. 1991, Garcer y col., 1993). En base a lo citado podra entenderse el efecto bacterioltico ejercido por nisina a pH 6,5 sobre Lactobacillus fructivorans como resultado de una masiva poracin de la membrana ya que, en estas condiciones, la adsorcin de nisina a la bicapa se vera favorecida. A pH 3,5 las interacciones electrostticas que se establecen entre el biopreservador y la membrana celular se afectaran de modo que la concentracin de nisina usada, si bien causa la muerte bacteriana, no sera suficiente para promover la lisis celular.
CONCLUSIONES

Los resultados expuestos muestran que 2000 ppm de nisina comercial tienen efecto bacterioltico sobre L. fructivorans a pH 6,5, mientras que a pH 3,5 presenta un modo de accin bactericida. Los estudios realizados sobre la efectividad del biopreservador se complementarn con ensayos a distintos valores de pH y concentracin de nisina a fin de proponer un modelo integral sobre sus mecanismos de accin. El estudio de las propiedades fsicas y qumicas, modos de accin y relaciones entre estructura y funcin de las bacteriocinas es necesario a fin de evaluar sus potenciales aplicaciones en alimentos (Abee y col., 1995).
REFERENCIAS

Abee T., Krockel L., Hill C. 1995. Bacteriocins: modes of action and potentials in food preservation and control of food poisoning. Int. J. Food Microbiol. 28, 169-185. Delves-Broughton, J. 1990. Nisin and its uses as a food preservative. J. Food Technol., 100-117. Faras, M.E. 1996. Estudios bioqumicos y genticos de bacteriocinas producidas por bacterias lcticas. Tesis doctoral. Univ. Nacional de Tucumn. FDA. 1988. Nisin preparation: Affirmation of GRAS status as a direct human food ingredient. Food and Drug Admin., Fed. Reg. 53: 11247.

FDA. 1989. Food and Drug Admin., Fed. Reg. 54: 6120. Gao, F.H., Abee T.L. y Koonings W.N. 1991. Mechanism of action of the peptide antibiotic nisin in liposome and cytochrome C oxidase containing proteoliposomes. Appl. Environ. Microbiol., 57: 2164-2170. Garcer, M.J., Elfernik, M.L., Driessen, A.J. and Koonings, W.N. 1993. In vitro pore forming ability of lantibiotic nisin role of proton motive force and lipid composition. Eur. J. Biochem., 212: 417-422. Hurst, A. 1981. Nisin. Adv. Appl. Microbiol. 27: 85. Leistner, L. 1994. Further developments in the utilization of hurdle technology for food preservation. J. Food eng. 22: 421-432. Muriana, P.M. 1996.Bacteriocins for control of Listeria spp. in food. J. Food Protection, suppl.: 54-63. Smittle, R.B. y Flowers, R.S. 1982. Acid tolerant microorganisms involved in the spoilage of salad dressings. J. Food Protection, 45, 10, 997-983. Tramer, J.(1964) The inhibitory action of nisin on Bacillus stearothermophilus. In Microbial Inhibitions in Foods, ed. N. Molin, p. 25. Almqvist and Wiksell, Stockholm, Sweden.