PEMBAHASAN

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985): 1. 2. 3. 4. Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang

ada akan dapat diketahui. Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985). Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berfungsi untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakteri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo , 1991).

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet , yodium , alkohol dan safranin. Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah : 1. Crystal Violet Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam , dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu). 2. Yodium Merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. 3. Alkohol Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan : a. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu b. Bakteri menjadi tidak berwarna 4. Safranin Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non target (Wahyuningsih , 2008). Berikut ini adalah macam - macam pewarnaan bakteri untuk melihat atau mengidentifikasi bakteri secara mikroskopis. Sebenarnya yang sering digunakan adalah pengecatan gram namun tidak ada salahnya jika mempelajari pewarnan lainnya agar lebih spesifik jika ingin meng indentifikasi bakteri semoga bermanfaat.

Pewarnaan Gram

Tujuan : Mempelajari prosedur pewarnaan Gram,memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur tsb,dan secara umum memahami reaksi reaksi kimiawi yang terlibat di dalam proses tersebut. Prinsip : Bakteri dengan pewrna utama (Primary stain) yaitu dengan kristal violet atau Gentian violet akan berwarna ungu,melalui fiksasi warna dengan lugol akan menguatkan pelekatan warna utama,penambahan alcohol akan melunturkan atau memucatkan zat warna utama sehingga pada sel Gram negatif sel menjadi tidak berwarna tetapi pada sel Gram positif tidak mengalami pelunturan sehingga tetap berwarna ungu.pada pemberian pewarna tandingan (counterstain) yang berbeda dengan pewarna utama yaitu safranin menyebabkan bakteri gram negatif akan menyerap warna tsb menjadi merah. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994). Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008). Jika teknik pewarnaan tepat, Gram positif bakteri akan tampak ungu dan Gram negatif bakteri akan merah muda. Jika spesies gram terlalu pucat untuk dilihat maka disesuaikan dengan diafragma, kemudian dapat melakukan pewarnaan kedua tetapi berhenti setelah dicuci dengan air iodine. Pada bakteri gram warna ungu lebih mudah untuk mengamati. Untuk motilitas pengamatan segar akan menghasilkan jumlah bakteri yang sama dalam setetes air bawah coverslip (tidak panas, tidak ada noda) (Koning, 1994). Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994)

Kristal violet dipakai sebagai zat warna primer dikarenakan Kristal violet mampu melekatkan bakteri pada kaca mencegah autolisis pada sel, membuat sel-sel lebih kuat atau keras, mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel, mempertinggi sifat reaktif

gugusan-gugusan, membunuh bakteri secara cepat dengan tidak mengubah bentuk dan strukturnya, dan mengubah afinitas cat.

Kendala yang sering dihadapi dalam proses pewarnaan biasanya adalah kesalahan praktikan dalam membuat pewarnaan sehingga hasil pewarnaan terlalau tebal dan sulit diamati.