LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM TEKNIK BIOPROSES IDENTIFIKASI PRAKTIKAN NAMA NIM KELOMPOK I. II.

JUDUL PERCOBAAN TUJUAN PERCOBAAN 1) 2) 3) : MEYTA RAHMA : 03101403036 : 2 (Dua) : MEDIUM :

Dapat membuat media untuk menumbuhkan dan mengembangbiakan mikroba. Mengetahui pengaruh pembuatan media terhadap perkembangan mikroba. Mengetahui teknik sterilisasi dengan autoklaf.

III. DASAR TEORI Dalam melakukan diagnosa mikrobiologi sterilisasi sangat diutamakan baik alat maupun medianya. Suatu alat dikatakan steril apabila alat atau bahan bebas dari mikroba baik bentuk vegetative maupun spora. Untuk itu sebagai pemula dalam mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman. Secara umum sterilisasi merupakan proses pemusnahan kehidupan khususnya mikrobia dalam suatu wadah ataupun peralatan laboratorium. Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua mikroorgansime yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Apabila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi basah, bila tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi kering. Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu

medium atau bahan yang akan digunakan. Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme. Sebelum menumbuhkan mikroorganisme, pertama-tama kita harus memahami kebutuhan dasarnya lalu mencoba memformulasikan suatu medium yang memberikan hasil baik. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan percobaan untuk menambah pengetahuan tentang cara pembuatan medium dan juga cara menstrilisasikan medium. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium sebaiknya menggunakan air suling. Air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat (Hadioetomo, 1993). Pembuatan medium agar padat, digunakan agar-agar, gelatin atau gel silika. Bahan agar yang utama adalah galaktan (komplek karbohidrat yang diekstrak dari alga genus Gelidium). Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100 oC dan akan cair apabila kurang lebih 43oC (Hadioetomo, 1993). Menurut Schlegel (1993) agar merupakan media tumbuh yang ideal yang diperkenalkan melalui metode bacteriaological. Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Subtansi kimia organik dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrien diambil dari likungan kemudian ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler (Lim, 1998). Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk dinding sel baru (Volk,

1993). Menurut (Suriawati, 2005), Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa : 1. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba). 2. 3. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin). Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat bejana/ruang panas (oven dengan temperatur 170OC 180oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas). Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-40oC (Volk, 1993). PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan (Dwidjoseputro, 1994). Autoklaf digunakan sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan tinggi. Penggunaan autoklaf untuk sterilisasi, tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0 serta dilakukan

pendinginan sedikit demi sedikit. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994) 3. 1 1) Macam-macam Pertumbuhan Medium Medium dasar/ basal mineral Medium dasar adalah medium yang mengandung campuran senyawa anorganik. Medium dasar ini selanjutnya ditambah zat lain apabila diperlukan, misalnya sumber karbon, sumber energi, sumber nitrogen, faktor tumbuh, dan faktor lingkungan yang penting seperti pH dan oksigen serta tekanan osmosis. 2) Medium sintetik Medium sintetik adalah medium yang seluruh susunan kimia dan kadarnya telah diketahui dengan pasti. Sebagai contoh adalah medium dasar yang ditambah NH4Cl (medium 1) dengan sumber karbon berupa gas CO2, apabila diinkubasikan dalam keadaan gelap dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri nitrifikasi khemoototrof, misalnya bakteri Nitrosomonas. Bakteri ini memperoleh energi dari oksidasi amonium, selain itu amonium juga berfungsi sebagai sumber nitrogen. Contoh lain adalah medium dengan susunan sama dengan medium 1 tetapi ditambah glukosa (medium 2). Dalam keadaan aerob merupakan medium untuk perbanyakan jamur dan bakteri yang bersifat heterotrof. Glukosa berfungsi sebagai sumber karbon dan sumber energi. Dalam keadaan anaerob, medium ini dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri fakultatif anaerob maupun anaerob obligat. Energi diperoleh dari hasil fermentasi glukosa. Untuk menumbuhkan mikroba yang memerlukan faktor tumbuh dapat menggunakan medium yang komposisinya sama dengan medium 2 tetapi ditambah asam nikotinat (vitamin) sebagai faktor tumbuh (medium 3). 3) Medium kompleks Medium kompleks adalah medium yang susunan kimianya belum diketahui dengan pasti. Sebagai contoh medium ini adalah medium dasar yang

ditambah glukosa dan ekstrak khamir (medium 4). Susunan kimia ekstrak khamir tidak diketahui secara pasti, tetapi mengandung berbagai faktor tumbuh yang sering diperlukan oleh mikroba. Medium ini dapat untuk menumbuhkan mikroba khemoheterotrof aerob maupun anaerob baik yang memerlukan maupun yang tidak memerlukan faktor tumbuh. Medium yang juga termasuk medium kompleks adalah yang mengandung ekstrak tanah. 4) Medium diperkaya Medium Medium diperkaya adalah medium yang ditambah zat tertentu yang merupakan nutrisi spesifik untuk jenis mikroba tertentu. Medium ini digunakan untuk membuat kultur diperkaya (enrichment culture) dan untuk mengisolasi mikroba spesifik, dengan cara mengatur faktor lingkungan (suhu, pH, cahaya), kebutuhan nutrisi spesifik dan sifat fisiologinya. Dengan demikian dapat disusun medium diperkaya untuk bakteri yang bersifat khemoheterotrof, khemoototrof, fotosintetik, dan untuk mikroba lain yang bersifat spesifik. 3.2 Syarat-syarat Suatu Medium Supaya mikroorganisme dapat tumbuh baik, maka medium harus memenuhi syarat, sebagai berikut : 1. Harus steril, 2. Harus tidak mengandung toksin, 3. Harus mengandung nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroorganisme, 4. Harus mempunyai tekanan osmose, tegangan permukaan dan pH yang steril. 3.3 a) Penggolongan Medium Berdasarkan bahan yang digunakan : 1. Medium Alamiah atau Substrat . Medium alamiah atau substrat ini terdiri atau terbuat dari bahan-bahan dari alam., beriku contoh bahanbahan yang berasal dari alam : Sari buah, Wortel, Nasi, Jagung, Kentang, Darah, Susu, Daging, dan bahan alami lainnya.

2. Medium Semi Alamiah. Medium ini terdiri atas bahan alami tetapi ditambah dengan senyawa kimia. Misalnya, Potato Dextrose Agar (PDA), Taoge Ekstrak Agar (TEA), Malt Ekstrak Agar (MEA). 3. Medium Buatan atau Sintetik. Medium ini terdiri atas senyawasenyawa kimia yang komposisinya dan jumlahnya sudah ditentukan. Misalnya, Czapeks Dox Agar (CDA), Sabouraud Dextose Agar (SDA). b) Berdasarkan kegunaanya : 1. Medium Umum Medium ini ditumbuhi oleh mikoorganisme secara umum, yaitu banyak jenis mikrooragnisme yang dapat tumbuh pada media ini. Misalnya, Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), Taoge Ekstrak Agar (TEA). 2. Medium Selektif Medium ini komposisinya sedikit sulit, sehingga hanya jenis-jenis mikroorganisme tertentu yang dapat hidup. Misalnya, Salmonella Shigella Agar (SSA), Brilliant Green Lactose Broth (BGLB). 3. Medium Differensial Medium ini digunakan untuk membedakan jenis mikroorganisme satu dengan mikrooragnisme yang lain. Hal ini disebabkan karena adanya suatu reaksi atau ciri khas. Reaksi ini terjadi karena mikroorganisme mampu mengurai salah satu bahan dalam medium. Misalnya, Eosin Methylen Blue Agar (EMBA), Blood Agar (BA). 4. Medium Perkayaan Medium ini dipakai untuk menumbuhkan mikroorganisme tertentu, sebelum dipakai dalam suatu proses fermentasi. Tujuannya adalah untuk mengaktifkan mikroorganisme. Misalnya, medium MEA untuk khamir. 5. Medium Penguji Medium yang susunannya tertentu digunakan untuk pengujian vitamin, asam amino, dan antibiotic. Misalnya, Phenyl Alanin Agar (PAA). 6. Medium Khusus

Medium untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroorganisme dan kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu. c) Berdasarkan fisiknya : 1. Medium Padat (Agar) Medium ini diberi agar sehingga pada suhu kamar medium akan mengeras. Contoh, Nutrient Agar (NA). 2. Medium Cair (Broth) Medium ini tidak diberi agar sehingga bentuknya encer seperti cairan. Contoh, Nutrient Broth. 3.4 Media Tumbuh Mikroorganisme Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Berikut ini beberapa media yang sering digunakan secara umum dalam mikrobiologi. 1. Lactose Broth Lactose Broth digunakan sebagai media untuk mendteksi kehadiran koliform dalam air, makanan dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (Pre-enrichment Broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri. Laktosa menyediakan nutrient esensial untik metabolisme bakteri. 2. Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) Media EMBA mempunyai keistimewaan mengadung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan seperti S. Aureus, P. Aerugenosa dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam, sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan methylen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. 3. Nutrient Agar

Nutrient agar dalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak efektif, dalam arti mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton dan agar. NA merupakan salah satu media yang umu digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk petumbuhan sampel pada uji bakteri dan untuk mengisolasi organism dalam kultur murni. 4. Nutrient Broth Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. 5. deMann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) MRSA adalah media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa dan Sharpe (1960) untuk memperkaya< menumbuhkan dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh bahan. MRSA juga mengandung polysorbat, asetat, magnesium dan mangan yang diketahui untuk beraksi sebagai pertumbuhan bagi Lactobcillus. 6. Tryticase Soy Broth (TSB) TSB adalah media cair diprkaya untuk tujuan isolasi dan penumbuhan berbagai macam mikroorganisme. Media ini digunakan untuk mengisolasi bakteri dari specimen laboratorium dan membantu pertumbuhan bakteri Patogen. Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk mikroorganisme. 7. Plate Count Agar (PCA) PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobic dengan inokulasi diatas permukaan. PCA baik untuk pertumbuhan semua jenis mikroba karena didalamnya mengandung komposisi casein enymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan ekstrak yeast yang mensuplai viamin B. 8. APDA Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan danmenghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan

tumbuh secara optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. 9. Violet Red Bile Agar (VRBA) VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri Entobactericeae. Median VRBA mengandung Kristal violet yang bersifat basa, sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati. Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri positif. Ekstrak yeast menyediakan vitamin B komplek yang mendukung pertumbuhan bakteri. 10. Media PGYA Media PGYA ini berfungsi untuk isolasi enumerasi dan menumbuhkan sel khamir. Dengan adanya dektrosa yang terkandung dalam media ini dapat digunakan untuk salah satu yang banyak digunakan untuk membiakan suatu mikroorganisme baik itu berupa cendawan atau fungi, bakteri, maupun sel makhluk hidup lainnya. PDA merupakan paduan yang sangat sesuai untuk membiakan mikroba. Karena ekstrak kentang adalah sumber karbohidrat, dextrose yang berupa gugusan gula sebagai tambahan nutrisi. Penggunan dari media ini juga bertujuan, antara lain : a) Mempelajari pengaruh mikroba terhadap suatu zat didalam media atau sebaliknya, b) Menumbuhkan dan memelihara suatu biakan mikroba, dan c) Mendapatkan zat-zat yang dihasilkan pada biakan mikroba.

IV.

ALAT DAN BAHAN IV.1 ALAT 1) Tabung reaksi 2) Pipet tetes 3) Kompor Listrik 4) Autoklaf 5) Spatula IV.2 BAHAN 1) Kentang yang bagus 2) Agar-agar 3) Dekstrose 4) Air suling

V.

PROSEDUR PERCOBAAN 1. Agar Kentang Dekstrosa (AKD) / Potato Dekstrose Agar (PDA) untuk menumbuhkan jamur. a) Cucilah kentang kemudian dipotong-potong kecil dan masak selama 1 jam. Volume air dijaga supaya tetap dengan menambahkan air suling. b) Saringlah kentang yang telah dimasak tadi dan masukan dekstrose ke dalam filtrat kentang serta agar-agar sampai larut dengan baik. c) Tuangkan ke dalam tabung sesuai dengan kebutuhan, sumbatkah dengan kapas. d) Sterilkan dalam autoklaf (121C/15 lbs) selama 15 menit.

2. Sterilisasi dengan Autoklaf a) Isi autoklaf dengan air suling sebanyak 3 5 liter, panaskan sampai semua udara keluar dari autoklaf. b) Siapkan alat/bahan yang akan disterilkan dan letakan pada rak dari autoklaf. Masukan rak tersebut ke dalam autoklaf, tutup rapat kecuali klep udara supaya udara yang mungkin masih ada dalam autoklaf dapat keluar, karena jika dalam autoklaf masih ada udara sedangkan klep sudah ditutup rapat, maka sterilisasi tidak dapat mencapai suhu dan tekanan yang diharuskan (121C/15 lbs).