Lucrare de laborator:DIFUZIUNEA I OSMOZA

A. Studiul influenei unor factori fizici asupra ratei difuziunii A.1 Definirea i explicarea fenomenelor de agitaia termic, difuziune i osmoz A.2 Legile osmozei. Soluii false i soluii adevrate A.3 Osmolalitate i osmolaritate. Calculul presiunii osmotice A.4 Aplicaii medicale B. Noiuni generale despre microscopia optic B1. Metode de msurare a dimensiunilor celulare C. Evaluarea cantitativ a fenomenului de osmoz C1. Osmoza la celulele vegetale C2. Osmoza la nivelul hematiei La nivelul membranelor naturale se petrec schimburi de substan fr de care celulele vii nu ar putea supravieui. Acestea implic fenomene de transport ale solventului sau/i ale solvenilor intra i extracelulari. Lucrarea prezentat v permite s punei n eviden fenomenul de transport membranar al solventului, osmoza, n cazul celulelor vegetale i animale. Microscopul optic este utilizat pentru a observa i msura variaiile dimensiunilor celulare

A. Studiul influenei unor factori fizici asupra ratei difuziunii A.1 Definirea i explicarea fenomenelor de agitaia termic, difuziune i osmoz
Definiii: Soluie = Lichid mixt omogen, ce conine dou sau mai multe substane Solvent = Agentul de dizolvare a unei soluii. Apa este cel mai versatil solvent cunoscut. Solvit = Substana ce se dizolv ntr-o soluie

Difuzie:

Datorit energiei lor cinetice, moleculele unui fluid se gsesc intr-o continu micare, numit agitaie termic; aceasta nceteaz doar la temperatura de zero absolut. Difuzia este fenomenul de ptrundere a moleculelor unei substane (lichide sau gazoase) printre moleculele altei substane (lichide, gazoase sau solide). Difuzia se produce ca urmare a tendinei fluidelor de a ocupa ntreg volumul aflat la dispoziie, datorit agitaiei termice. Acest proces conduce la egalizarea diferenelor de concentraie, presiune sau temperatur, fiind o expresie a tendinei naturale a sistemelor de a tinde spre starea de echilibru. Fenomenul de difuzie este caracterizat de dou legi, cunoscute sub numele de legile Fick. n cazul difuziunii, prezena unei membrane prin porii creia s se realizeze fenomenul este facultativ.
Fig 1 Difuzia [www.williamsclass.com/SeventhScienceWork/ImagesCellBricks/Diffusion]

Difuziunea prin intermediul unei membrane este guvernat de prima lege a lui Fick:

Unde

fluxul moleculelor transportate pasiv (moli/s) n sensul gradientului de concentraie

dc/dx, printr-o suprafa S a membranei. Constanta de proporionalitate, D, poart numele de coeficient de difuziune. Semnul minus sugereaz c difuziunea are loc ntotdeauna de la zonele de concentraie mare spre zonele de concentraie mai mic. Coeficientul de difuzie depinde de natura substanei, de temperatur i de forma i dimensiunea particulelor ce difuzeaz. Pentru particule sferice de mici dimensiuni, coeficientul de difuzie se scrie sub forma:
D= kT 6r

unde T este temperatura absolut, k este constanta lui Boltzmann, este vscozitatea i r este raza particulelor. Fenomenul de difuzie st la baza a numeroase schimburi de substan care au loc n natur ntre organisme sau n interiorul unui organism. n toate aceste cazuri ns, substanele care difuzeaz nu sunt n contact direct, ci sunt desprite printr-o membran. Aceast membran poate fi permeabil n mod diferit pentru substane diferite, caz n care se numete selectiv permeabil. Un caz important este acela al membranelor care sunt permeabile pentru solventul unei soluii, dar nu sunt permeabile pentru solvit, numite membrane semipermeabile.

Osmoz: Fenomenul de difuzie selectiv care are loc n cazul a dou soluii de concentraii diferite, desprite printr-o membran semipermeabil, poart numele de osmoz. Efectul osmozei este egalizarea concentraiilor celor dou soluii, atta timp ct osmoza nu este mpiedicat de alte cauze externe. n cazul unei membrane strict semipermeabile, osmoza este singurul fenomen de transport transmembranar.

Fig. 2 Membrana celular [www.philadelphia.edu.jo/courses/biology/ diffusion.ppt]

Pentru o membran permeabil sau selectiv permeabil fenomenele de osmoz i de dializ au loc concomitent, n sensuri opuse. Difuziunea solventului (apa n sistemele vii) are loc din compartimentul n care soluia este mai diluat (numr de molecule ale solventului mare, molecule de solvit puine) nspre compartimentul n care soluia este mai concentrat, are un numr mai mic de molecule ale solventului i un numr mai mare de molecule de solvit, dilund-o. Datorit procesului de egalizare a concentraiei prin difuzia solventului, osmoza red tendina general pe care o are sistemul de a-i mri entropia.

Fig 3.1 Osmoza n cazul unei membrane strict

permeabile. Soluii hipotonice i hipertonice

Mecanismele osmozei Explicarea molecular-cinetic a fenomenului este urmtoarea: trebuie s vedei soluia ca fiind un amestec de dou substane, ap (solvent) i solvit (sau solvii), ambele formate din molecule, dar de dimensiuni diferite; moleculele solventului vor fi ntotdeauna mai mici dect cele ale solvitului. n acest fel va fi mai evident pentru dumneavoastr faptul c ambele specii moleculare se supun acelorai legi, nici una nefiind privilegiat. De exemplu, ntr-o soluie de sare (NaCl) n ap, solventul este reprezentat de moleculele de ap, iar solvitul este reprezentat de particule de i de .

S considerm dou compartimente separate de o membran strict semipermeabil i s ne reprezentm situaia printr-o schem simpl (fig.1). Molecula de solvent, fiind sufucient de mic, poate trece prin membran, pe cnd molecula de solvit nu. Numrul moleculelor de ap ce ajung n unitatea de timp la membrana semipermeabil este mai mic n compartimentul II dect n compartimentul I, ca urmare a concentraiei sczute a apei n II. n intervalul de timp n care din I trec n II trei molecule de ap, din II n I trece doar o molecul de ap.

I F

II
Fig. 3.2 Osmoza

Mb. Semipermeabil

= molecul de ap = molecul de solvit I= compartiment cu solvent pur II= compartiment cu soluie F= flux net de solvent Acest fenomen apare numai n condiiile existenei membranei. Solventul difuzeaz prin membran n cele dou sensuri, dar viteza de trecere a solventului pur spre soluie este mai mare dect trecerea n sens contrar. Aceast diferen de flux este singura responsabil de fenomenul de osmoz. Fluxul net rezultant face ca nivelul lichidului din II s creasc, dezvoltndu-se n acest compartiment o presiune; n momentul n care aceast presiune; va fi echilibrat de presiunea hidrostatic ascensiunea n II se oprete.

Dac s-ar exercita o presiune static asupra soluiei din compartimentul II, numrul moleculelor de solvent care ar ajunge n unitatea de timp la faa membranei dinspre acest vas ar crete. Cnd numrul acestora egaleaz numrul moleculelor de solvent ce ajung n unitatea de timp la membran n vasul I, se stabilete un echilibru dinamic ntre cele dou compartimente. Aceast presiune ar reprezenta presiunea osmotic a soluiei din I. Presiunea osmotic ( ), este presiunea ce ar trebui exercitat asupra soluiei pentru a

aduce n echilibru cu solvent pur, separat de ea printr-o membran semipermeabil, adic pentru a mpiedica orice flux de solvent ntre cele dou compartimente. n exemplul menionat anterior:

Valoarea numeric a presiunii osmotice a unei soluii poate fi msurat experimental prin diverse tehnici. De asemenea, ea poate fi calculat teoretic n cazul soluiilor pentru care poate fi aplicat un model asemntor celui al gazelor ideale.

A.2 Legile osmozei. Soluii false i soluii adevrate Botanistul Pfeffer, cu ajutorul osmometrului care i poart numele a stabilit urmtoarea lege cantitativ a osmozei, pentru soluii diluate:

unde, k= constant C= concentraia ponderal a soluiei (g/l) M= masa molar a solvitului T= temperatura absolut Dac notm cu n numrul de moli dizolvai n volumul de soluie V, vom avea:

m reprezint concentraia molar (numr de moli/ unitate de volum) Dac nlocuim n relaia iniial, obinem: Unde: = presiunea osmotic a soluiei V= volumul soluiei n= numrul de moli de substan dizolvat R= constanta universal a gazelor T= temperatura absolut Ea este, pentru soluiile foarte diluate, identic cu legea gazelor perfecte. Se numete presiune osmotic presiunea care se exercit asupra unei soluii pentru a o menine n echilibru cu solventul, separat de ea printr-o membran semipermeabil. Legile osmozei

 Legea concentraiilor: la temperatur constant, presiunea osmotic este proporional cu concentraia molar a corpului dizolvat: ~C

Legea temperaturii: pentru o soluie dat, presiunea osmotic crete proporional cu coeficientul (1+ valabil pn n ), valoarea lui ): ~ (1+ fiind aceeai ca la gaze, iar t fiind temepratura (lege )

Legea lui Vant Hoff:

este independent de natura solventului i de substana

dizolvant, ea nu depinde dect de numrul particule prezente n volumul ocupat de soluie: * V=n * R* T a unei soluii n care faza dispersat este alctuit din substane

Legea amestecurilor:

diferite este egal cu suma presiunilor osmotice determinat de fiecare substan n parte. Soluii izo-, hipo-, hipertone: Se impun cteva definiii: dou soluii A i B care au aceeai presiune osmotic, deci ntre ele nu ar exista flux de solvent n prezena unei membrane semipermeabile, se numesc izoosmotice (izo=egal). Dac A are mai mare dect B spunem c A este hiperosmotic fa

de B iar B este hipoosmotic fa de A. n mod asemntor, expresia membran semipermeabil se refer la un anumit solvent; dac acesta nu este precizat, se subnelege c este vorba despre ap. Termenii hipoton i hiperton sunt folosii prin raportare la plasma sanguin, la temperatura organismului (izoton =izoosmetic cu plasma, hipoton= hipoosmetic fa de plasm, hiperton= hiperosmotic fa de plasm). Soluii false i soluii adevrate: Legile osmozei nu se aplic riguros la toate categoriile de soluii. Pentru soluiile concentrate presiunea osmotic mai mare dect cea calculat conform legilor osmozei. Aceasta se datoreaz faptului c volumul moleculelor nceteaz de a mai fi neglijabil n raport cu volumul soluiei i distana intermolecular. Ca urmare a fenomenului de disociaie electrolitic srurile, acizii, bazele au n soluii apoase o presiune osmotic superioar celei care ar corespunde numrului de molecule prezente n volumul de soluie dat. De exemplu o soluie de va avea o presiune tripl. va avea o presiune dubl, o soluie de

n cazul soluiilor coloidale, formate din agregate moleculare, presiunea osmotic este mai mic dect cea calculat teoretic, doarece fiecare agregat se comport ca o singur particul. Avnd n vedere consideraiile de mai sus, soluiile se pot clasifica n adevrate i false, dup cum se supun sau nu legilor osmozei. Soluiile adevrate sunt cele cristaloide neelectrolite diluate, la care numrul de particule corespunde exact cu numrul de molecule dizolvate. Soluiile false sunt cele cristaloide i cele coloidale. A.3 Osmolalitate i osmolaritate. Calculul presiunii osmotice S considerm o soluie coninnd: moli de solvent de mas molar moli de solvii de mas molar V= volumul soluiei = volumul molar (al solventului) = volumul molar al solvitului Pentru o soluie electrolitic sau neelectrolitic, se pot defini: a) Concentraia molar (c) (molaritatea sau osmolaritatea). Reprezint numrul de soluie/litru:

Concentraiile molare sunt aditive; ele sunt aplicabile att pentru solvent, ct i pentru solvit. Osmolaritatea se exprim n miliosmoli/ litru de soluie. b) Molalitatea (m) sau osmolalitate. Reprezint numrul de moli de solvit considerat per unitate de mas (n general pe kg) de solvent.

unde, reprezint masa solventului, n grame. Molalitile sunt aditive; ele sunt aplicabile dect solvenilor. n cazul soluiilor apoase foarte diluate, volumul particulelor din soluie este neglijabil n raport cu volumul solventului, iar molaritatea i molalitatea pot fi confundate. n acest caz un litru de ap cntrete aproape 1 kg. Aceast aproximaie nu este corect n cazul plasmei sanguine, deoarece volumul proteinelor nu este neglijabil.

Osmolalitile se exprim n miliosmoli/kg de solvent. c) Concentraia ponderal (p). Reprezint masa de solvit per volul de soluie:

Concentraiile ponderale nu sunt aditive. Relaia ntre concentraia molar (moli/litru) i concentraia ponderal (grame/litru) va fi:

Osmol- explicaie i definiie Deoarece osmoza depinde doar de numrul total de particule de solvit din soluie, indiferent de natura acestora, n scop de uniformizare a termenilor cu referire att la soluiile care conin ioni ct i la cele care conin molecule s-a introdus noiunea de osmol, aceasta reprezentnd o particul oarecare din soluie (Osm)- particul gram cinetic, adic o particul a crei micare liber i dezordonat este asimilabil unei molecule de gaz. Pentru neelectrolii sau electrolii nedisociai, osmolul corespune molului; pentru soluiile de electrolii, osmolul corespunde ionului-gram; pentru ionii monovaleni, osmolul corespunde i echivalentului gram. Osmolaritatea total a unei soluii este, deci, suma numrului de moli nedisociai i a numrului de ioni-gram per litru de soluie. Osmolul fiind o unitate prea mare pentru soluiile biologice, se utilizeaz un submultiplu al acestuia- moliosmolul (mOsm): 1 mOsm= Osm.

Pentru soluiile complexe, osmolalitatea se calculeaz prin sumarea tuturor concentraiilor molare ale constituenilor, innd cont de gradul lor de dizociere. De exemplu, pentru lichidul extracelular, se consider constitueni principali: calcul pentru fiecare lichid n parte. Osmolalitatea plastic se exprim n numr de miliOsmoli/ litru de plasm; se determin prin msurarea punctului crioscopic al unei soluii. , glucoz, uree; exist formule de

A.4 Aplicaii medicale

n organism, sectoarele celulare, interstiiale i intravasculare sunt tot attea compartimente separate prin membrane biologice, cu permeabilitate selectiv, prin care transportul apei se face prin mecanisme total diferite dect n cazul membranelor biologice pot exista proteine cu rol de canale pentru molecule de ap. Fiecare celul sau compartiment subcelular delimitat (nucleu, vacuol, lizozomi etc.) reprezint compartimente microscopice n care intervin fenomenele osmotice. Se poate vorbi, deci, de presiunea osmotic a oricrui compartiment lichidian delimitat de o membran. Osmoza intervine i n realizarea funciei normale a glomerulului renal. Cea mai mare parte a lichidelor din organism sunt soluii complexe. Pentru aceast osmolaritate se calculeaz prin sumarea tuturor concentraiilor molare ale constituenilor, aa cum s-a menionat deja. Att variaiile n plus ct i cele n minus ale osmolaritii diferitelor sectoare lichidiene ale organismului pot amenina nsi existena individului. Exemplu: o deshidratare celular produs ca urmare a unei evaporri masive a apei prin transpiraie abundent. Pierderea unei cantiti mari de ap va fi urmat de creterea presiunii osmotice a lichidelor extracelulare. n aceste condiii apa intracelular se va deplasa extracelular-osmoz la nivelul membranei celulare, selectiv permeabile. Diminuarea volumului lichidian intracelular va altera metabolismul celular. Intensitatea i durata unei astfel de deshidratri condiioneaz reversibilitatea sau ireversibilitatea alterrilor proceselor celulare. Este sugestiv de menionat c la un deficit de peste 15 % ap din greutatea corporal, pentru un interval de timp de 6-7 zile, survine ncetarea funciilor vitale ale organismuluimoartea. Strile hipo- i hiperosmolare, n perioada de reversibilitate, pot fi corectate prin aport sau eliminri lichidiene controlate, dar aceasta necesit n prealabil avaluarea osmolaritii diferitelor comportimente lichidiene.

Strile hipo- i hiperosmolare: Osmolalitatea lichidului intra- i extracelular sunt meninute n echilibru dei compoziia electrolitic este diferit. Variaii mai mari de 2% ale osmalitii plasmatice sunt cunoscute sub numele de stri de hiperosmolare, respectiv hiperoosmolare, n cazul variaiilor sub aceast valoare. Strile hiperosmolare pot fi produse de creterea cantitii unor substane solvite n snge : , glucoz sau ureea i alcoolul care nu au acest efect; n aceste cazuri osmolaritatea

determinat este mai mare dect osmolaritatea total calculat pentru

, glucoz, uree. Strile

hiperosmolare se pot datora: creterii cantitii de solvit; scderii cantitii de solvent; unui aport exogen de solvent i solvit. Tratamentul implic rehidratare prin indigestie sau prin perfuzie cu soluii fiziologice hipotone. Strile hipoosmolare sunt definite de scderea osmolalitii sub 235-300mOsm/kg ap i de scderea , concomitent. Tratamentul implic perfuzii cu soluii hipertone, pn la

revenirea, la osmolaritatea plasmatic normal. Izoosmolaritatea lichidelor biologice: n condiiile normale, lichidele biologice sunt izoosmolare. Meninearea acestei izoosmolariti este asigurat prin schimburi de solvent dar mai ales de solvit. Expresia analitic a osmolaritii unui lichid bilogic, stabilit cu ajutorul dozrilor chimice, consider electroliii ca fiind total disociai, acestea explicnd lipsa unei corespondene riguroase ntre rezultatele obinute prin crioscopie (300 mOsm) i prin calcul. Contribuia diverilor constitueni plasmatici la osmolaritatea total a plasmei este prezentat n tabelul 1. Tabelul 1. Compoziia plasmei n mEq Ioni Cationi 143 5 5 2 Total Anioni : 155 103 27 3 6 16 155 151,7 5,4 5,4 2,2 164,7 109 29 3,2 6,4 17,1 164,7 mEq/l plasm mEq/l ap plasmatic

Fosfai i sulfai Acizi organici proteine Total

Lichidele organismului nu sunt soluii ideale, i dei disocierea electroliilor puternici este complet, numrul particulelor libere care pot s exercite o presiune osmotic este redus, ca urmare a interaciunilor dintre ioni. De aceea efectul osmotic al unui electrolit n soluie depinde de concentraia sa efectiv mai mult dect de numrul de echivaleni. i anionii ce l nsoesc n mod obinuit reprezint 20 mOsm/l. Ceilali cationi i anioni au contribuii mici. Glucoza contribuie cu 5 mOsm/l, deoarece nu disociaz i are greutatea molecular 180. Proteinele, dei se gsesc n concentraie mare, avnd greutatea molecular mare, aduc o contribuie redus la osmolaritatea total a plasmei. S considerm acum o membran poroas care separ dou soluii biologice complexe, coninnd molecule de diferite tipuri i dimensiuni. Datorit faptului c diametrul mediu al porilor membranei are o anumit valoare, moleculele cu diametru mai mic dect acesta vor difuza uor, iar pe msur ce diametrul moleculelor crete, difuzia se va face din ce n ce mai greu. Cnd diametrul moleculei este egal sau mai mare cu cel al porilor, difuzia nu mai are loc. Acest efect de difuziune selectiv poart numele de dializ. Acest fenomen permite purificarea Materiale necesare: sau prepararea soluiilor care conin macromolecule i st la baza funcionrii rinichiului artificial.
3 eprubete cu agar Soluii 5mM de: Metil orange Bicromat de potasiu Sulfat de cupru

PARTEA PRACTIC

Difuziunea poate fi influenat de greutatea molecular i de concentraia moleculelor: a) Efectul greutii moleculare Mod de lucru: 1. Luai trei eprubete coninnd deja o coloan de agar (10 ml gel polizaharidic, n stare semifluid) 2. Adugai 3ml din soluiile de aceeai concentraie a unor compui colorai, cu masa molecular diferit. 3. Notai nivelul la care se gsete limita de separaie a celor dou medii, pentru fiecare eprubet 4. La sfritul orelor de lucrri practice: notai nivelul la care a ajuns soluia colorat i msurai distana pe care a difuzat. Datele se noteaz n tabelul de rezultate

Substana Metil orange Bicromat de potasiu Sulfat de cupru Materiale necesare: 3 eprubete cu agar Soluii de 5 mM de: o Metil orange o Bicromat de potasiu o Sulfat de cupru

Distana (timp: 2 ore)

b) Efectul gradientului de concentraie 1. Luai alte eprubete cu agar. 2. Adugai n fiecare eprubet 3 ml din soluia aceluiai compus (metil orange) dar de concentraii diferite. 3. Realizai aceleai msurtori ca i la puctul a) i notai rezultatele n tabelul de rezultate: Soluie metil orange 1 mmol 5 mmol 10 mmol Materiale necesare: 3 eprubete cu agar Soluii de metil orange de concentraii: 1 mmol, 5 mmol, 10 mmol. Distana (timp:2 ore)

B. Noiuni generale despre microscopia optic B1. Metode de msurare a dimensiunilor celulare

Participarea fenomenului de osmoz la schimbul de substan dintre celul i mediul nconjurtor poate fi observat prin experiene simple, utiliznd microscopul optic. Descrierea microscopului optic Microscopul optic obinuit este un sistem de lentile convergente astfel realizat nct s poat fi folosit pentru observarea unor structuri cu dimensiuni n general de ordinul micrometrilor format din: Partea optic, care se compune dintr-un sistem centrat de iluminare i dou sisteme de lentile convergente: obiectivul cu distan focal de civa milimetri i ocularul, cu distan focal de ordinul centimetrilor. Sistemul obiectiv este alctuit dintr-un sistem centrat de lentile aezate ntr-o anumit ordine ntr-un tub metalic montat direct sau prin intermediul sistemului revolver la partea inferioar a tubului microscopului. Obiectivele au notat puterea mritoare care variaz ntre x10 i x90. Sistemul ocular este alctuit dintr-un sistem de lentile situate la partea superioar a tubului microscopului. Puterea mritoare a ocularelor care variaz ntre x5 i x15. Exist microscoape monoculare i binoculare. Sistemul de iluminare servete pentru a aduce la obiectul examinat lumina de la o surs natural sau artificial. Este situat sub platina microscopului i se compune din surs de lumin, oglind, diafragm i condensor. Unele microscoape au un sistem de iluminare cu bec situat n piciorul microscopului i oglinda detaabil. Partea mecanic servete la susinerea prii optice i a obiectului examinat. Ea se compune din picior, coloan, platin i un dispozitiv de punere la punct format din urubul macrometric i cel micrometric.

Puterea mritoare a microscopului este dat de produsul dintre puterea mritoare a obiectivului i cea a ocularului. Microscoapele optice actuale ating o putere mritoare de x2000.

Fig. 4 Microscop optic [Media/Science/Microscopy /Optical Microscope Diagram freeinfosociety.com]

Principalele mrimi caracteristice unui microscop optic Puterea de rezoluie reprezint calitatea cea mai important a unui microscop. Ea reprezint capacitatea unui sistem optic de a separa dou puncte s fie percepute distinct la nivelul imaginii finale. Prin termenul general de rezoluie se nelege abilitatea unui sistem optic de a detecta detaliile unui obiect. Puterea de rezoluie este invers proporioanal cu sitana minim () ntre dou puncte luminoase ale obiectului, percepute separat. Prin urmare, dac se noteaz puterea de rezoluie cu P( ). Cu ct este mai mic cu att puterea de rezoluie P este mai mare. Distana minim ,

denumit i distana minim rezolutiv sau minimum separabil este dat de formula lui Abbe:

unde: = lungimea de und a luminii utilizate la microscop n= indicele de refracie al mediului prin care trece lumina u= jumtatea unghiului de deschidere a conului luminos ce cade pe obiectiv Se observ c este cu att mai mic cu ct n i u sunt mai mari. Mrimea (n x sinu) se numete apertur numeric i poate fi mrit n dou moduri: 1. Mrind indicele de refracie al mediului existent ntre obiectiv i lama ce conine preparatul: astfel, obiectivele sunt de dou feluri: uscate i umede, dup cum ntre ele i lamel exist aer sau un mediu cu indicele de refracie mai mare dect 1. 2. Mrind unghiul u, prin construcie Puterea separatoare a unui microscop optic este, deci, limitat de lungimea de und a radiaiei utilizate, de indicele de refracie al mediului i de construcia obiectivului, care impune o valoare maxim a unghiului u. Puterea de mrire este mrimea numeric egal cu raportul dintre unghiul u sub care se vede imaginea la microscop i mrimea obiectului AB.

Puterea de mrire se exprim n dioptrii i este invers proporional cu distanele focale ale obiectivului i ocularului.

 Puterea de ptrundere este o calitate ce aparine obiectivelor cu putere de mrire mic. Datorit acestei caliti se poate vedea n profunzime obiectul examinat. Ea variaz n raport invers cu mrimea unghiului de deschidere a obiectivului.

PARTEA PRACTIC Principiul metodei Se suprapune imaginea microscopic a obiectului de msurat peste imaginea unei scri gradate etalonat n prealabil. Se utilizeaz dou tipuri de micrometre: ocular i obiectiv. Micrometrul obiectiv este o lam de sticl pe care sunt marcate diviziuni echidistante cu valoare cunoscut de 10m. El servete la etalonarea micrometrului ocular acesta este un disc de sticl introdus n sistemul ocular i la rndul lui are marcate diviziuni echidistante. Imaginea lui este dat numai de lentila ocular, m timp ce micrometrul obiectiv este mrit de ntreaga putere mritoare a microscopului. A etalona micrometrul ocular inseamn a stabili o coresponden ntre o diviziune ale micrometrului obiectiv. n acest fel, diviziunile micrometrului ocular pot fi exprimate n uniti de lungime. Mod de lucru: 1. Se aeaz pe platina microscopului lama micrometru obiectiv. Aceasta se fixeaz cu ajutorul celor doi cavaleri. 2. Realizai acum imaginea la microscop: se aduce n axul microscopului obiectivul x10 prin rotirea sistemului revolver. Privind din lateral, se rotete viza macrometric spre nainte i se coboar tubul microscopic pn ce obiectivul se apropie de preparat. Viza macrometric se mic foarte ncet. Apoi, privind prin ocular, cu ajutorul aceluiai urub macrometric, rotit n sens invers, se ridic ncet tubul pn ce apare imaginea n cmpul microscopului. n continuare se procedeaz la completarea punerii la punct a imaginii cu ajutorul urubului micrometric care va fi micat n ambele sensuri. 3. Se introduce micrometrul ocular intr-unul dintre ocularele microscopului prin scoaterea acestuia din tub i deurubarea lentilei superioare a ocularului. Sistemul ocular se introduce apoi n tub. Se observ suprapunerea celor dou imagini ale scalelor micrometrice. Notai cte diviziuni ale micrometrului obiectiv corespund laturii unui ptrat al micrometrului ocular. 4. Cunoscnd valoarea unei diviziuni ale micrometrului obiectiv putei uor afla ci mm reprezint latura unui ptrat din reeaua micrometrului ocular. Acum, nlocuind lama micrometru obiectiv cu o lam avnd un preparat, putei msura dimensiunile obiectivelor de pe acestea. 5. Dac se utilizeaz un obiect liniar de lungime d cunoscut (etalon), aezat ntr-un plan bine determinat, perpendicular pe axa optic a microscopului i se msoar

lungimea imaginii reale i=n diviziuni a obiectului cu ajutorul micrometrului ocular pentru un obiectiv dat se poate determina un factor de transformare Mr definit prin relaia: n Mr = d 6. Factorul de transformare Mr este o mrime caracteristic microscopului i poate fi utilizat pentru etalonare astfel nct el s poat fi folosit pentru determinarea lungimii unor obiecte microscopice. Dac n locul obiectului etalon se aeaz preparatul ce conine celule de dimensiuni necunoscute d i se msoar lungimea corespunztoare imaginii n, n conformitate cu relaia anterioar se obine: Mr = Evaluarea cantitativ a fenomenului de osmoz 1. La nivelul celulelor vegetale Celulele vegetale prezint o membran citoplasmatic(care include plasmalema i tonoplastul); la exteriorul membranei citoplasmatice exist o alt membran sau perete celulozic rigid, inextensibil, aflat la o oarecare distan de membrana citoplasmatic. Tonoplastul este considerat o membran semipermeabil, sediul principal al fenomenului de osmoz. Dup pstrarea n mediu izoosmotic celule i conserv volumul, deoarece nu are loc nici un flux rezultant de solvent, spre interiorul sau exteriorul celulei. n mediul hipoosmotic apa intr n celul, traversnd peretele celulozic i membrana citoplasmatic; celula se mrete de volum, dar aceast mrire este limitat prin existena peretului celulozic, rigid. Fenomenul poart numele de turgescen. Turgescena este starea fiziologic normal, de hidratare optim a celulei vegetale. n mediul hiperosmotic, apa celular este extravazat prin membran, n scopul restabilirii izotoniei ntre mediul intra- i extracelular. Celula micoreaz volumul, fenomenul fiind denumit plasmoliz. Membrana citoplasmatic urmrete plasma care se restrnge n volumul celular mic, ndeprtndu-se de peretele celulozic. Plasmoliza are loc n trei faze: 1. Plasmoliza incipient, care const n deprinderea citoplasmei de peretele celulozic numai la colurile acesteia; 2. Plasmoliza concav, care const n desprinderea parial a citoplasmei de perete; 3. Plasmoliza convex, care const n desprinderea total a citoplasmei de perete. Plasmoliza poate fi un fenomen reversibil i apare doar celula viabil, semipermeabilitatea protoplasmei fiind un fenomen caracteristic doar protoplasmei vii; prin moarte celular protoplasma devine permeabil. n' d'

Presiunea osmotic a celulei vegetale este numit i potenial osmotic i este dat de concentraia sucului vacuular n glucide i sruri minerale. 2. La nivelul celulelor animale La celulele animale, lipsa unui perete rigid,care s limiteze mrirea de volum a celulei n mediul hipoton, duce la ruperea membranei celulare. n cazul particular al hematiei fenomenul se numete hemoliz. n mediul hiperosmotic apa iese prin exosmoz din celule, membrana citoplasmaticse retrage mpreun cu coninutul celular spre nucleu, celula micorndu-i volumul; fenomenul este denumit ratatinare. Modificrile de volum ale hematiei depind, deci,de modificrile de presiune osmotic, astfel nct eritrocitul poate fi considerat un veritabil osmometru natural. Presiunea osmotic total n interiorul hematiei depinde, la rndul su, de concentraia ionic i de concentraia glucozei, precum i de coninutul su n hemoglobin. Membrana eritrocitar este permeabil la ap i molecule mici, dar este total impermeabil la hemoglobin, astfel nct determinantul principal al comportamentului de osmometru al hematiei rmne hemoglobina. Eritrocitul reprezinta nsa mecanisme de control ce tind s readuc rapid celula la starea de echilibru iniial. Astfel trecerea masiv de spre exterior poate compensa parial

creterea volumului. Dac nsa gradientul transmembranar de presiune osmotic este prea mare, aceste mecanisme devin insuficiente. n plus hemoglobina care nu poate prsi celula menine o presiune care atrage n continuare volumul iar dac presiunea osmotic a mediului extracelular scade n continuare, la un moment dat, fiind depit rezistena mecanic a membranei, hemoglobina va fi extravazat prin intermediul unor false orificii, fr a se produce o veritabil rupere. Membrana eritrocitar, de aspect modificat, va include un coninut electrolitic, lipsit de hemoglobin, aceast nou structur poart numele de fantoma eritrocitar. n mecanismul hemolizei i n refacerea integritii membranare dup eliminarea hemoglobinei un rol important revine i citoscheletului eritrocitar. Materiale necesare: Dac introducem hematii normale n soluie de NaCl, hemoliza apare la concentraii de Microscop binocular NaCl de 5g/l i este total la o concentraie de 3 g/l. n unele stri patologice hemoliza poate apare chiar i n vivo; i delamele exemplu ntr-o maladie Lame de sticl ereditar, n care hematiile sunt mult mai sensibile la variaii de presiune osmotic.
3 vase Petri Soluii cu osmolariti diferite: NaCl 9g/l (mediu izoton) NaCl 20g/l (mediu hiperton) Ap distilat (mediu hipoton) Pipete Pasteur 3 frunze de Lamele microscopice

PARTE PRACTICA

http://www.linkpublishing.com/video-transport.htm

a. Osmoza la alga .. Utiliznd microscopul optic, vei observa modificrile unor celule vegetale puse n medii izoosmotice, hipoosmotice i hiperosmotice. Cele mai evidente modificri apar n privina volumului i formei celulare. Pentru a le observa avei nevoie de a msura dimensiunile unei celule prin metoda descris anterior, micrometria. Mod de lucru 1. Se pun n cele 3 vase Petri respectiv cca 20 ml mediu hipoton, mediu izoton i mediu hiperton i n fiecare cteva frunzulie de plant. 2. Se las astfel 20 minute dup care se examineaz la microscop cte o frunz din fiecare mediu. Pentru a fi examinat la microscop, frunza, aezat pe lama de sticl, se secioneaz n grosime. Se aeaz fragmentul de frunz pe lama de sticl, apoi se aeaz pe platina microscopului n aa fel nct frunza s se afle n dreptul orificiului central al platinei. Se folosete obiectivul x10. 3. Se rotete dispozitivul revolver i se formeaz imaginea cu obiectivul x20, care a fost folosit i pentru etalonarea micrometrului ocular. 4. Se msoar diametrul longitudinal i transversal pentru un numar de 10 celule; datele se trec n tabel, n care: I= mediu izo-osmotic; II= mediu hipoosmotic; III=mediu hiperosmotic; L=diametru longitudinal; T=diametru transversal;

m=media aritmetic. I L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T L II T L III T

b. Osmoza la hematii Pentru a pune n eviden fenomenul de osmoz la nivelul biomembranelor, se poate realiza un experiment asemntor, dar de data asta utiliznd eritrocitele; acestea reprezinta un model de studiu deosebit de accesibil n raport cu alte celule animale. Protocolul de izolare celulara (pentru obinerea eritrocitelor )consta in centrifugarea sangelui integral urmata de indepartarea plasmei si a stratului superior ( in care se gasesc tromboci tele si leucocitele) . Dupa centrifugarea sangelui , eritrocitele se resuspenda in soluie de mani tol 0,3M si se spal. Spalarea consta dint r -o serie de centrifugri si resuspendri in manitol .Stocarea eritrocitelor s-a facut prin tinerea lor la frigider. ( temperatura fiind cupr insa intre 4-80 C) , in HBSS (HanksBalanced Salt Solution) continand saruri , glucoza, bicarbonat de sodium si fosfati . Mod de lucru Vei observa dimensiunea transversal celulelor. Se va lucra cu 5 recipiente: n A avei o suspensie de eritrocite n mediu izoosmotic lor (NaCl 9g/l); n B i B1 avei soluii hipoosmotice de concentraii diferite (NaCl 3g/l); n C avei soluie izoosmotic (NaCl 9g/l); n D avei soluie hiperosmotic (NaCl 40g/l). 1. Punei cu o pipet Pasteur cte 1 ml suspensie din recipientul A n fiecare dintre recipienetele B, C,D. 2. n continuarea la anumite intervale de timp, vei lua cte o pictur din coninutul recipientelor B, C si D i o vei examina la microscop. Vei remarca c celulele puse n C nu-i modific dimensiunile. Celulele puse n D se ratatineaz. Celulele puse n B1 i scoase dup primul interval de timp sunt turgescente iar cele puse n B sunt parial sau total distruse.

Intervale de timp: Pentru B- 35 minute Pentru B1- 35 minute Pentru C- 20 minute Pentru D- 30 minute

BIBLIOGRAFIE SELECTIV: 1. Lucrri practice Iasi.