Prctica N7: Hemoglobina y Hematocrito

Objetivos: a) Conocer la concentracin de hemoglobina y hematocrito en eritrocitos de individuos que viven a nivel del mar y que viajan a 3000 4000 m.s.n.m. Teora: La hemoglobina es una protena normalmente presente slo en los eritrocitos. Est constituida por cuatro grupos heme (porfirinas), unidos a una cadena polipeptdica. Los grupos heme son capaces de ligar reversiblemente oxgeno o dixido de carbono. La hemoglobina transporta el oxgeno desde los pulmones a los diferentes tejidos corporales, donde es utilizado en el metabolismo energtico y retira de ellos el dixido de carbono producido por dicho metabolismo. La cuantificacin de hemoglobina, es de utilidad para diagnstico de varias patologas que alteran su concentracin. El cuadro ms comnmente relacionado con la disminucin de hemoglobina srica es la anemia. En la mayora de los casos la anemia ocurre como signo o complicacin de otra enfermedad, a veces no relaciona directamente con trastornos en el sistema sanguneo, como alteraciones hepticas o renales, infecciones, etc. Por el contrario existen situaciones en las que, la concentracin de hemoglobina se encuentra anormalmente elevada debida a una superproduccin de glbulos rojos (policitemia, tumores renales u ovarios, hepatomas, hidronefrosis). La nica condicin natural y fisiolgica que afecta los niveles de hemoglobina es la altitud, puesto que frente a bajas presiones de oxgeno atmosfrico se produce una compensacin mediante el incremento en el nmero de glbulos rojos y, por ende, en la concentracin de hemoglobina circulante. El Hematocrito es definido como un instrumento para determinar la cantidad relativa de plasma y corpsculos en sangre. Es el volumen del paquete eritrocitario o ms correctamente, el volumen del paquete eritrocitario por 100 ml. de sangre. Se emplea para medir el volumen celular despus de centrifugar la sangre; da estimaciones exactas de la hemoglobina y del recuento de eritrocitos. Fundamento del Mtodo de Hemoglobina. El reactivo de hemoglobina se basa en el mtodo de la cianometahemoglobina. Los eritrocitos son lisados por accin de un agente tensiactivo presente en el reactivo, liberando su contenido de hemoglobina en la solucin. La hemoglobina liberada es oxidada a metahemoglobina por el ferricianuro, siendo esta ltima convertida en cianometahemoglobina por la presencia de cianuro. La absorbancia de la cianometahemoglobina es medida a 540 nm, siendo la intensidad de color obtenida, directamente proporcional a la concentracin de hemoglobina en la muestra.
Material y Reactivos:

Reactivo de Hemoglobina: Ferricianuro de potasio [K3Fe2(CN)6] 0,6mM; Cianuro de potasio (KCN) 0,7mM; Sterox-Se 1mL/L; Buffer y estabilizantes no reactivos c.s. Estndar de Hemoglobina: Metahemoglobina disuelta en reactivo de hemoglobina equivalente a 18 g/dL de hemoglobina. Muestra: Sangre total obtenida utilizando EDTA, citrato, oxalato o heparina como anticoagulante. Espectrofotmetro, Centrifuga de hematocrito Tubos de hematocrito con heparina al 1/1000, Tubos, pipetas
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Mg. Ana Gutirrez Romn (anaisabelflor@gmail.com)

A. Procedimiento para Hemoglobina: Prepara el reactivo de trabajo diluyendo el reactivo 1:10 con agua destilada, antes de usar. La solucin estndar se provee lista para su uso, medir su absorbancia directamente contra el blanco de reactivo.

Blanco

Muestra

Muestra (ml) --------0,01 Reactivo de trabajo (ml) 2,50 2,50 Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (sobre 20C), o 10 min. si la temperatura ambiental es muy baja. Leer las absorbancias a 540 nm llevando a cero el equipo con el blanco de reactivo. El color obtenido es estable ms o menos 1 hora. Clculos para la Hemoglobina Factor = 18/ absorbancia estndar. Rangos de Referencia: Hombres Mujeres Nota.

Hb (g/dL) = Factor x Absorbancia de Muestra.

14,0 a 18,0 g/dl 12,0 a 16,0 g/dl.

Se puede utilizar el reactivo de Drabkin que se prepara de la siguiente forma: Disolver 1 g de bicarbonato de sodio, 50 mg. de cianuro de potasio y 200 mg de ferricianuro de potasio en agua destilada, hasta completar a un litro. Guardar en frasco oscuro a temperatura ambiente. Estable un mes. Patrn de cianuro de Hemoglobina (CNHi) de 180 g/dL. Hacer curva estndar con 20, 40 y 60 mg, cuyas concentraciones de Hb corresponden a: 5, 10 y 15 g/100 mL de hemoglobina, respectivamente.

B. Procedimiento para el Hematocrito: Se puede utilizar sangre venosa o capilar. Llenar los tubos de hematocrito hasta 1 cm de su extremo y se taponar con plastilina. Se centrifuga a altas velocidades en centrifuga para hematocrito a velocidades de 5 000 a 10 000 r.p.m. durante 5 a 10 minutos. Despus se lee la proporcin del volumen ocupado por los hemates con una regla milimetrada.

Rangos de Referencia: 36 Hco = 12,2 g/ dl Hb 39 Hco = 13,27 g/ dl Hb Cuestionario:

42 Hco = 14,2 g/ dl Hb 44 Hco = 15 g/dl Hb

1. Que relacin tiene la afinidad de la hemoglobina por el oxigeno en la presin parcial de oxigeno en la sangre de un mamfero? 2. Que modificaciones respiratorias y metabolicas se presentan en respuesta a una hipoxia por altitud? Literatura complementaria: Gustavo F. Gonzales y Vilma Tapia 2007. Hemoglobina, hematocrito y adaptacin a la altura: su relacin con los cambios hormonales y el periodo de residencia multigeneracional. Revista med 15 (1): 80 -93
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