La actividad de la telomerasa en tumores cerebrales humanos: astrocitoma y Meningioma

Resumen de las clulas somticas carecen de actividad de la telomerasa pero lneas celulares inmortalizadas yms del 85% de las clulas cancerosas muestran activacin de la telomerasa para evitar que los telmeros de progresivo acortamiento La activacin de esta enzima se ha encontrado en una variedad de tumores humanos y lneas de clulastumor ales, pero solamente pocos estudios sobre la actividad de la telomerasa en tumores cerebrales humano se han divulgado. Aqu, se evalu la actividad de la telomerasa en diferentes grados de tumores de cerebro humanos astrocitomay meningioma. En este estudio, anlisis de actividad de la telomerasa en 50 casos elegibles consisti en 26meningioma, astrocitoma 24 segn los protocolos estndar. En los tejidos del cerebro, la actividad telomerasa fue positiva en 39 (65%) de los 50 pacientes. Una muestra,prueba demostrada que la actividad de la telomerasa en tumores de meningioma, astrocitoma fue significativamente positiva totalmente . (P\\0.001). Tambin, grado I de meningioma y bajos grados deastrocitoma (grados I y II) mostr significativam ente la actividad de la telomerasa. Segn nuestros resultados, sugerimos que la activacin de la telomerasa es un evento que se inicia sobre todoen bajos grados de cerebro incluyendo tumores meningioma y astrocitoma. Tumor de palabras clave telomerasa actividad cerebral Meningioma astrocitoma

Introduccin
Las clulas somticas carecen de actividad de la telomerasa pero lneas celulares inmortalizadas y ms del 85% de las clulas cancerosas muestran la activacin de la telomerasa para evitar que los telmeros deprogresivo acortamiento (Harley 1991). Cuando la longitud de los telmeros alcanza un punto crtico, un mecanismo de retroalimentacin deteccin de longitud llevara a esta activacin (Harley 1991). Telomerasa o telmeros transferasa terminal es una sntesis de novo de Ribonucleoprotena que hacen alargamiento de las repeticiones telomricas en el cromosoma termina utilizando la plantilla de RNA complementaria a las repeticiones de n (TTAGGG) y previene la prdida dependiente de la replicacin de los telmeros y la senescencia celular en clulas altamente proliferativas de la lnea germinal y en la mayora de loscnceres (Blackburn 1991; Feng et al. , 1995; Blasco, 2005). Sin embargo, las clulas somticas humanas notienen normalmente esta activacin de la telomerasa (Kim et al. , 1994). normalmente tiene esta activacin de la telomerasa (Kim et al. , 1994). La falta de actividad de la telomerasa en las clulas somticas humanas normales puede considerarse comoun mecanismo supresor de tumor que impide la expansin clonal ilimitada. Esta idea es apoyada por laEsoms de encontrar que el 90% de los tumores humanos son telomerasa positiva (Falchetti et al. , 2002).

Las clulas con actividad de esta enzima parecen escapar de acortamiento telomrico progresiva y adquirir un potencial de crecimiento indefinido (contador et al. 1992;Al Kimet.1994). La activacin de esta enzima se ha encontrado en una variedad de tumores humanos y lneas de clulas tumorales (contador et al. 1994; Kim et al. ,1994; Panda et al. 1995a; Panda et al. , 1995b; Garcia Aranda et al.2006) pero fewstudies slo en la actividad de la telomerasa el cerebro humano los tumores han sido reportados (Langford et al.1995; Nakatani et al.1997). Actividad de latelomerasa puede detectarse en una muy pequea cantidad de clulas de tejidos tales como recogidas encitologa aspiracin con aguja fina o clulas en los lquidos corporales de pacientes con cncer (Hiyama yHiyama 2002). El convencional basada en la extensin del primer ensayo para la deteccin de actividad de la telomerasa requiere grandes cantidades de clulas o cantidades de muestra de tejido y slo permite la deteccin de la telomerasa con sensibilidad limitada con etiqueta radiactiva. Adems, los productos de amplificacinin especfica se han observado. Estos inconvenientes han sido superados por la telomrica repetir amplificacin protocolo (trampa), en el que el producto de la reaccin de la telomerasa se amplifica por PCR (Kim et al. ,1994). Aqu, se evalu la actividad de la telomerasa en tumores de cerebro humano en diversos grados de astrocitomay tumores de meningioma.

Materiales y mtodos
Pacientes y muestras De los casos en este estudio consisti en 50 pacientes fueron matriculadas en estudioentre abril de 2008 y marzo de 2009. Los pacientes experimentaron la reseccin quirrgica del tumor cerebral (meningioma en 26) y astrocitoma en 24 en la provincia de Shariati hospital de Tehern. El tejido del tumor fue colocado inmediatamente en nitrgeno lquido en el sitio de operacin y almacenar congelada en-80 C. Estas muestras se clasificaron a la clasificacin de la Organizacin Mundial de la salud (OMS) (Kleihues et al. 1993; Ro et al.1995). El estudio se realiz en Tehern Universidad de ciencias mdicas, de acuerdo con las instrucciones del Comit de tica local con el consentimiento informado del paciente.

Anlisis de la actividad de la telomerasa

Ensayos realizados usando Telo TAGGG telomerasa PCR ELISAPLUS Kit (Roche Diagnostics GmbH, Alemania)segn protocolo del fabricante. Cada muestra congelada fue suspendido en un tubo de ensayo estril quecontiene 200 ll reactivo de lisis helada y homogeneizada en hielo hasta alcanzar la consistencia uniforme.Despus de la incubacin en hielo durante 30 minutos, se centrifug el lisado en 16, 0009g por 20 min a 4 C,175 ll del sobrenadante fue retirado y trasladado a otro tubo. Los ensayos se llevaron a cabo en dos pasos. En el primer paso, para cada muestra de tumor y la plantilla de control,25 ll de la mezcla de reaccin y 5 ll del estndar interno (IS) fueron trasladados en un tubo adecuado para la amplificacin por PCR. Actividad de la telomerasa se midi dos veces a travs de un experimento independiente usando 1 Extracto de clulas va por el tubo de la muestra correspondiente a 200 300 ng de la protena total La cantidad de 1 ll del correspondiente extracto celular tratada trmicamente (que corresponde a 200/ 300 ngd e la protena total) fue agregado por cada tubo de control negativo. Transferimos 1 ll de la plantilla de control y 1ll de reactivo de lisis en dos tubos separados. Volumen total de cada tubo ajustado a 50 ll con agua estril. Latrmica ciclismo parmetros fueron un paso de alargamiento de la cartilla de 30 minutos a 25 C por PCRusando Taq polimerasa, los TS de P1, P2 cartillas y nucletidos, seguida por un paso de inactivacin de

latelomerasa de 5 min a 94 C y luego 33 ciclos a 94 C durante 30 s para desnaturalizacin, finalmente, 50 C para30 s para recocido y 72 C por 90 s para polimerizacin en un termociclador de ADN (Corbett CG1-96). En el segundo paso, utilizando el mtodo de ELISA, despus de la inmovilizacin los productos amplificados enplacas de microtitulacin recubiertas de estreptavidina (MP) va la interaccin biotin streptavidin, deteccinpodra ser posible por el anticuerpo anti-digoxigenina (DIG) conjugado con peroxidasa. Luego se agreg elsustrato de la peroxidasa (3,30,5,50tetrametilbenzidina) y la cantidad de productos trampa determinada por lamedida de su absorbancia a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 690 nm. Los resultados seconsideraron como negativo o positivo cuando los valores de OD (densidad ptica) fueron B0. 2 o [0. 2,respectivamente. Adems, para confirmar los resultados de ELISA, productos amplificados fueron funcionadossistmicamente en gel de poliacrilamida no desnaturalizantes de 12%.

Cuantificacin de la actividad de la telomerasa y anlisis estadstico

El nivel de actividad de la telomerasa en una muestra determinada comparando la seal de lamuestra a la seal obtenida usando una cantidad conocida de una plantilla de control que cuentan con laELISAPLUS de PCR de telomerasa TeloTAGGG y est listo para usar soluciones. Todas las pruebasestadsticas fueron dos caras, y B P 0. 05 se consider significativo. Anlisis estadstico se realiz con elpaquete de software SPSS (versin 16).

Resultados
Clinical/pathologic Variables A series de casos estudio incluyeron 50 tumores cerebrales primarios y las variables de clinicalpathologic de los pacientes se enumeran en la tabla 1. Tabla 1 caractersticas de Clinicopathologic de 50 pacientes afectaron con tumor cerebral Meningioma de carcter (no-neuroepiteliales) Astrocitoma (neuroepiteliales) media de edad SD 55. 65 14,5 36,95 15. Sexo 4mujer 5

13

masculino 5 13 21 11 grado I 20 (76. 9%) 2 (8,3%) Grado II 6 (23,1%) 5 (20,0%) Grado III 5 (20,0%) Grado IV 12 (50. 0%) Significa tumores tamao (cm) SD 4. 5 2,3 4. 1 1,82 Total 26 24

Nuestras muestras incluyen meningioma 26 y 24 tumores de astrocitoma. Segn la OMS clasificacin sistema y clasificacin del tumor quirrgico patolgica, 20(76,92%) de 26 muestras tumorales de meningioma tena gradoI y 6 tumores (23,07%) fueron clasificados como grado II. La clasificacin de muestras tumorales de astrocitoma exhibi 2 (8. 3%) como de grado I, 5 (20. 0%) como grado II, 5 (20. 0%) como de grado III y 12 (50.0%) comogrado IV. La talla media de meningioma y astrocitoma tumores fue 4,1 y 4,5 cm, respectivamente.

Anlisis de la actividad de la telomerasa en tumores cerebrales

En tumores cerebrales, actividad de la telomerasa fue positiva en 39 (65%) de los 50 pacientes (figs. 1, 2).Mientras que en tumores de meningioma, 22 (84. 61%) de los 26 pacientes y 17 (70.83%) de los tumores deastrocitoma 24 revel que la actividad de la telomerasa positiva. En grado I de tumores de meningioma, 16 (80%) de 20 muestras mostraron actividad de la telomerasa y en 4 (20%) muestras no podra encontrarse actividad. Adems, 5 de 6 grado II meningioma tumores tenan actividadde la telomerasa, excepto una muestra. En el grado I de tumores de astrocitoma, 1 de 2 muestras exhiben actividad de la telomerasa. Tres (60%) de 5muestras en grado II de astrocitoma tumores tenan actividad telomerasa y otros no mostraron actividadtelomerasa. En el grado III de astrocitomas actividad de la telomerasa se encontr positiva en 4(80%) de 5pacientes con tumor cerebral. En el grado IV de tumores de astrocitoma, 9(80%) de 12 muestras mostraronactividad de la telomerasa, pero en 3 muestras (20%) actividad no poda en contrar. En general, 4(57,1%) de 7Astrocitoma de bajo grado (grados I y II) tena la actividad de la telomerasa, mientras que 13 (76,5%) de 17Astrocitoma de alto grado (grados III y IV) demostr la funcin de la telomerasa. Una muestra t prueba demostrada que la actividad de la telomerasa general fue significativamente positiva (P\\0.001) en tumores de meningioma, astrocitoma. Sin embargo, la actividad de la telomerasa en grado I de tumores de meningioma fue significativamente positiva (P\\0.001). Bajos grados de astrocitoma (grados I y II) mostr significativamente la actividad de la telomerasa (P = 0,03). La actividad de la telomerasa en alto grado de tumores de meningioma fue significativamente positiva (P = 0. 004). Altos grados de tumores de astrocitoma exhibieron una actividad de la telomerasa positiva alta (P\\0. 001) (Fig. 2). Anteriormente habamos medimos la longitud de los telmeros de estas muestras (Kheirollahi et al. , 2011), pero no hubo ninguna correlacin entre la longitud de los telmeros y la actividad de telmeros. Adems, no seobserv ninguna relacin entre la actividad tumoral de tamao y de la telomerasa. No se encontr ninguna correlacin significativa entre la actividad de los telmeros y la edad o el sexo (tabla 2). Comparacin de la actividad de la telomerasa entre tumores astrocitoma y meningioma demostr que bajar losgrados de los astrocitomas (incluyendo grados I y II) tienen una amplia gama de actividad de la telomerasa que grados superiores (grados III y IV), mientras que esta situacin puede verse en mayor grado (grado II) demeningioma (Fig. 3).

Figura 1 ensayo de trampa para la actividad de la telomerasa en especmenes quirrgicos de los tumores cerebrales. Oligonucletidos TS fueron amplificados por PCR, con la cartilla downstream CX [50-(CCCTTA) 3 30CCCTAA] y la cartilla upstream TS, en presencia de patrn interno de ensayo de trampa. Productos de reaccin se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 12%. Los nmeros de lneas tabla segn nmeros de la parte gris en la tabla 2. 12-13, 5-10 Y 1 a 3 lneas son M (meningioma) y las lneas 4, 11, y 14 21son (astrocitoma). Control negativo de N; Plantilla de LC Lowcontrol; Plantilla de alto control HC; Marcador depeso molecular de L (50 bp) (figura de Color en lnea)

Figura 2 comparacin de la actividad de la telomerasa entre tumores cerebrales de alto y bajo lowgrade. un meningioma; Astrocitoma de b. Actividad de la telomerasa de TA, M/I y M/II de grado I y grado II de meningiomas, A/H altos grados (III y IV) de astrocitomas, grados de baja A/L (I y II) de astrocitomas, Negnegativo y positivo de Pos, respectivamente.

(Aqu va la tabla)

Figura 3 el promedio de actividad de la telomerasa (SD) por anlisis de ELISA para cada grupo de tumores y los grados de los tumores. Los valores obtenidos con 1 ll de la ll control plantilla, bajo y 1 de la plantilla decontrol, alta, debe ser entre 0,5 y 2. 0,4. 0, respectivamente, despus de la reaccin de sustrato de 10 minutos.MI y M II de grado I y grado II de meningiomas, A/H altos grados (III y IV) de astrocitomas, grados de baja A/L (Iy II) de astrocitomas, respectivamente

Discusin
El crecimiento y desarrollo de tumores cerebrales varan, pero bajo y alto grado tumores cerebrales son capacesde invadir el tejido cerebral normal. Esto significa que la ciruga es raramente capaz de curar, ya que generalmente no es posible que el cirujano eliminar todas las clulas cancerosas sin quitar un nmero inaceptablemente grande de clulas normales del cerebro as (Lichtenstein et al. , 2009). A diferencia de otros tejidos, las clulas del cerebro tienen un nmero lmite de la divisin celular, y por lo tanto, los estudios de actividad y telmeros longitud de telomerasa en tumores cerebrales son ms atractivos. Los resultados pueden estar reflejando ms visin clara de las clulas cancerosas en el futuro y se consideran como biomarker(s). La actividad enzimtica de la telomerasa se correlaciona con la malignidad del tumor (Langford et al. 1995;DeMasters et al. 1997; Sallinen et al. , 1997; Hiraga et al. , 1998; Kleinschmidt - Demasters et al. 1998; Falchettiet al. , 1999; Weil et al. 1999). Actividad de la telomerasa se observ en los tumores malignos de los tumores no neuroepiteliales, comotumores de clulas germinales, linfomas, adenocarcinomas metastsicos, hemangiopericytomas y unmeningioma anaplsico. Por el contrario, la actividad telomerasa no se encontr en los tumores benignos,incluyendo meningiomas, adenomas pituitarios, hemangioblastomas y schwanomas, excepto unhemangioblastoma que muestran caractersticas malas en la cuarta repeticin (Hiraga et al. , 1998) Finalmente,llegaron a la conclusin que la actividad de la telomerasa puede ser un indicador del potencial maligno omalignidad s mismo en los tumores no-neuroepiteliales cerebrales (Hiraga et al. , 1998). En otro estudio, la actividad telomerasa alta y la expresin del mRNA hTERT detectaron nicamente englioblastoma y meduloblastoma tumores con una tasa alta de proliferacin (Cabuy y Ridder 2001). En nuestro estudio, observamos la actividad de la telomerasa en el 65% de los pacientes. Considerando que, en los tumores de meningioma, 22 (84.61%) de los pacientes revel que la actividad de la telomerasa positiva. En elgrado I de tumores de meningioma, 16 (80%) de las muestras mostraron actividad telomerasa y en 4(20%) delas muestras no se encontr esta actividad. Actividad de la telomerasa era negativa en una nica muestra congrado II de tumor meningioma, y en otros 5, era positivo. Al comparar estos resultados con los que seencuentran en grado I de meningioma,

puede sugerirse que inicio de actividad de la telomerasa en tumores demeningioma se relaciona con tumores de bajo grado. Adems, se demostr ese patrn de actividad de la telomerasa en astrocitomas anaplsicos (que grado III) y glioblastomas (que grado IV), con un alto porcentaje de los glioblastomas (que van de 80 a 100%) revelados a mostrar valores diferentes, que se oponan a los astrocitomas anaplsicos en sos slo un porcentaje menor de muestras (que van de 20 a 30%) expresa la actividad de la telomerasa (Langford et al. 1995; Falchetti et al. 1999). Se trata de un resultado difcil, porque los glioblastomas secundarios se cree que se origin, a travs de la progresin de los astrocitomas preexistentes. Parece que la transformacin de astrocitoma anaplsico y glioblastoma, implica la activacin de la telomerasa, y que los glioblastomas secundarios expresan telomerasa en un mayor porcentaje de casos que hacerglioblasto mas primarios (Falchetti et al. , 2002). Pero segn nuestros resultados, alta frecuencia (4 (57,1%) de7) de bajo grado (grados I y II) astrocitoma tumores demostraron la actividad telomerasa. Adems en nuestro estudio, 1 de 2 muestras fibrilary difusas (grado II) mostraron actividad de la telomerasa.Tambin tuvimos un tumor oligodendroglioma con una actividad de la telomerasa positiva. Por lo tanto,sugerimos que el inicio de la actividad de la telomerasa en astrocytoma podra ser ocurri en tumores de bajo grado as. Acortamiento de la longitud y tumor tamao de telmeros estn correlacionados, probablemente debido a la mayor duracin de la proliferacin en el tumor y la agresividad del tumor. Alower tasa de divisin celular y la presencia de actividad de la telomerasa podran ser razones para caso recurrente (Matsuo et al. , 2007). Engeneral, la actividad de la telomerasa y grado histolgico son demasiado estrechamente correlacionadas (Langford et al 1995; Simon et al. 2000). Datos disponibles sugieren que la telomerasa es un importanteindicador pronstico de supervivencia en pacientes con tumores cerebrales (Kim et al. , 2006). Pero parece que existe una correlacin entre la actividad de la telomerasa y pronstico en los pacientes que tenan actividad de la telomerasa positiva, llevando a un pronstico pobre. El resultado del estudio sobre las muestras del tumor de 41 cerebro ha indicado que la actividad de la telomerasa puede ser un marcador importante de malignidad en el tumor cerebral. Adems, el cambio de actividad negativa a una actividad positiva en los tumores recurrentes pareca ser un prognosticator til para tumor astroctico malo (Nakatani et al. , 1997). Sugerimos que la activacin de la telomerasa es un evento que se inicie en tumores de bajo grado cerebrales incluyendo meningioma y astrocitoma. Adems, nuestra experiencia demuestra que el proceso de acortamiento de telmeros podra ser un acontecimiento temprano en tumores cerebrales humanos (Kheirollahi et al. , 2011). Sin embargo, no se encontr ninguna correlacin entre la actividad telomerasa y longitud de los telmeros. Alparecer, la regulacin de la longitud de actividad y telmeros de telomerasa es un evento complejo y dinmico que est firmemente relacionado con el ciclo celular en clulas madre humanas (Hiyama y Panda 2007) y alargamiento de los telmeros es no slo por la telomerasa y estudios han confirmado un papel para su recombinacin en mantenimiento de telmeros por '' alternativa alargamiento de los telmeros '' (ALT); sin embargo, el mecanismo exacto de esta va es todava ser determinada (Dunham et al. , 2000). Finalmente, apoyndose en la investigacin ms complementaria (Sampl et al. , 2012), entonces la actividad telomerasa puede considerarse como un biomarcador constructivo y combinado con la informacin obtenida dela longitud de los telmeros, puede ser la alteracin de la longitud de los telmeros y la actividad telomerasa en conjunto son marcadores apropiados para un diagnstico preciso de las clulas del tumor de cerebro.

Conflicto de no inters
Los autores divulgan ningn conflicto de inters.