Anda di halaman 1dari 45

1

REFERAT

PEMERIKSAAN PENUNJANG PADA PENYAKIT KULIT AKIBAT VIRUS

Dokter Pembimbing: dr. Ismiralda Okke Putranti, SpKK

Disusun oleh: Nisa Hermina Putri Medio Yoga Pratama Rachma Dewi Astari Shella Shalis Jamilah Tiffano Taufan Firdaus G1A211091 G1A211092 G1A212030 G1A212033 1210221033

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN SMF ILMU KESEHATAN KULIT & KELAMIN RSUD PROF. DR. MARGONO SOEKARJO PURWOKERTO 2013

LEMBAR PENGESAHAN

REFERAT

Pemeriksaan Penunjang Pada Penyakit Kulit Akibat Virus

Disusun Oleh: Nisa Hermina Putri Medio Yoga Pratama Rachma Dewi Astari Shella Shalis Jamilah Tiffano Taufan Firdaus G1A211091 G1A211092 G1A212030 G1A212033 1210221033

Telah dipresentasikan dan disetujui. Diajukan untuk memenuhi sebagian syarat kegiatan Kepaniteraan Klinik di bagian Ilmu Penyakit Kulit dan Kelamin RSUD Prof. Dr. Margono Soekardjo Purwokerto

Pada tanggal :

Juli 2013

Mengetahui, Pembimbing

dr. Ismiralda Okke Putranti, SpKK

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas karunia-Nya lah penulis dapat menyelesaikan penulisan dan pelaksanaan penelitian deskriptif yang berjudul Pemeriksaan Penunjang Pada Penyakit Kulit Akibat Virus. Penulisan referat ini merupakan salah satu syarat untuk mengikuti ujian Kepaniteraan Klinik di bagian Ilmu Penyakit Kulit dan Kelamin RSUD Prof. dr. Margono Soekarjo Purwokerto. Penulis berharap referat ini dapat bermanfaat untuk kepentingan pelayanan kesehatan, pendidikan. Dalam kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan ungkapan terima kasih kepada: 1. dr. Ismiralda Okke Putranti, SpKK selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan masukan dalam penyusunan referat ini. 2. Teman-teman FK-Unsoed dan FK-UPN serta semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan referat ini. Penulis sadar sepenuhnya bahwa dalam penyusunan referat ini masih banyak dijumpai kekurangan. Oleh karena itu, segala masukan yang bersifat membangun dari para penelaah sangat diharapkan demi proses penyempurnaan.

Purwokerto, 2 Juli 2013

Penyusun

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar belakang Proses diagnosis merupakan perpaduan antara kegiatan intelektual dan tindakan-tindakan manipulatif sehingga dapat ditentukan adanya suatu penyakit kulit. Diagnosis lesi kulit melibatkan prinsip dan pendekatan yang sama seperti pada gangguan medis lainnya. Dalam menegakkan diagnosis suatu penyakit kulit, diperlukan anamnesis riwayat klinis dan pemeriksaan fisik yang teliti mulai dari pemeriksaan keadaan umum yang berhubungan dengan penyakit kulit sampai penyakit kulit itu sendiri dan terkadang diperlukan juga teknik-teknik dan tes tertentu untuk membantu menunjang suatu diagnosis penyakit kulit (Siregar, 2004). Penyakit kulit dapat disebabkan oleh berbagai macam, salah satunya karena infeksi virus. Ada beberapa penyakit dermatovirologi yang perlu ditegakkan dengan pemeriksaan penunjang untuk membedakan dengan penyakit kulit lain yang disebabkan oleh jamur maupu bakteri. Pemeriksaan penunjang pada penyakit kulit yang disebabkan oleh virus meliputi pemeriksaan histopatologi, tes antibody, tes serologi, pemeriksaan

sitologi/kultur, pewarnaan gram (Siregar, 2004). Indikasi, interpretasi, dan teknik-teknik prosedur diagnosis haruslah dipahami dengan benar untuk memperoleh informasi yang bermanfaat dan reliable agar diagnosis suatu penyakit kulit dapat ditegakkan. Oleh karena itu, kelompok kami tertarik untuk menyusun referat mengenai pemeriksaan penunjang pada penyakit kulit yang disebabkan oleh infeksi virus.

B. Tujuan Tujuan dari pembuatan referat ini yaitu: 1. Mengetahui berbagai pemeriksaan penunjang yang dapat dilakukan pada penyakit kulit akibat virus.

2.

Mengetahui prinsip kerja masing-masing pemeriksaan penunjang untuk penyakit kulit akibat virus

3.

Mengetahui cara penegakan mendiagnosis dengan adanya pemeriksaan penunjang untuk penyakit kulit akbat virus.

C. Manfaat Manfaat dari penulisan refrat ini ialah: 1. Memperoleh informasi mengenai pemeriksaan penunjang untuk penyakit kulit akbat virus 2. Memberikan informasi mengenai pemeriksaan penunjang untuk penyakit kulit akbat virus. 3. Referat ini diharapkan berguna sebagai bahan referensi dan menambah pustaka bagi institusi, masyarakat dan petugas kesehatan.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Pemeriksaan Mikroskopik dengan Pewarnaan 1. Pewarnaan Gram Pengecatan atau pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel tampak). Bakteri gram negatif adalah bakteri yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun terwarnai oleh pewarna tandingan safarin (sel tampak merah) (Djuanda, 2007). Pengecatan gram untuk melihat dan membedakan bakteri gram positif dan gram negatif sehingga juga disebut pewarnaan differensial (Djuanda, 2007). a. Prinsip Kerja 1. Persiapkan Apusan bakteri yang telah dibuat pada tahap sebelumnya; 2. Teteskan 1 tetes Zat Warna I (Gentian Violet) ke atas area apusan, biarkan selama 20 detik; 3. 4. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan 2 detik; Teteskan 1 tetes Larutan Iodine ke atas apusan, biarkan 30 detik s.d. 1 menit; 5. Cuci dengan Alcohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak berwarna (sekitar 10 20 detik); 6. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik;

7.

Teteskan 1 tetes Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin), biarkan selama 20 detik;

8.

Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik;

9.

Keringkan di suhu ruang;

10. Amati di atas mikroskop dengan perbesar 100 x Objektif, dengan bantuan minyak imersi;
b. Interpretasi

Bakteri gram positif adalah bakteri yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel tampak). Bakteri gram negatif adalah bakteri yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun terwarnai oleh pewarna tandingan safarin (sel tampak merah) (Djuanda, 2007). 2. Pewarnaan Tzank Pemeriksaan mikroskopis dari bahan selular dari lesi kulit untuk membantumendiagnosa penyakit vesikuler tertentu. Jaringan ini dikorek dari dasar vesikelsebuah, ditempatkan pada slide, dan diwarnai dengan Wright atau Giemsa'sstain. Sel raksasa multinuklear adalah diagnostik dari virus herpes atau varicella (Djuanda, 2007). Pemeriksaan cairan dari bulla (melepuh) untuk mencari sel Tzanck karakteristik varicella (cacar air), herpes zoster, herpes simpleks, dan pemphigus vulgaris (Djuanda, 2007). a. Prinsip Kerja 1. 2. Pecahkan bulla, lalu dikerok kulit luarnya. Kerokan di fiksasi pada preparat dengan cara dilewatkan di atas api 3x. 3. 4. Rendam di alkohol 96% selama 5 menit, lalu bilas. Tetesi larutan giemsa (1:10) selama 30 menit. Bilas dengan air mengalir, lalu keringkan.

5. b.

Periksa di mikroskop dengan 100x perbesaran.

Interpretasi Hasil (+) jika ditemukan sel datia berinti banyak.

3. Pewarnaan Wright Pewarnaan darah apus merupakan pewaraan yang terwarnai pada preparat darah apus tepi, misalnya dengan menggunakan pewarnaan menurut Romanowsky ada empat macam pewarnaan preparat darah apus yaitu pewarnaan wrights stain, pewarnaan lieshman, pewarnaan may grunwald, pewarnaan giemsa. Pewarnaan wright adalah zat warna yang digunakan dalam metode Romanowsky, merupakan campuran eosin Y, Azure B, metilen blue, dan metil alkohol dalam konsentrasi tinggi (Djuanda, 2007). Pemeriksaan apusan tebal berfungsi sebagai penapisan untuk mencari ada tidaknya infeksi. Pemeriksaan apusan tipis memberi gambaran morfologi eritrosit dan parasite yang lebih jelas yaitu persyaratan yang diperlukan untuk identifikasi akurat parasite darah (Djuanda, 2007). a. Prinsip Kerja 1. 2. Sediaan apus yang telah dikeringkan diudara, tidak perlu mengadakan fiksasi tersendiri, karena telah mengandung metil alcohol dalam konsentrasi tinggi dan di cat wright langsung ditambah penyanggah pH 6,4 sama banyak 3. 4. membiarkan selama 15- 20 menit. Preparat apus yang yang telah selesai dibuat kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x b. Interpretasi Eritrosit normal tampak sebagai sel yang berwarna jambon, tak berinti dengan batas luar yang berbentuk lingkara dan berdiameter antara 6,7 dan 7,7 mikron (rata-rata 7,2 mikron) (Djuanda, 2007).

B. Pemeriksaan Histopatologi. 1. Definisi Histopatologi merupakan cabang biologi yang mempelajari kondisi dan fungsi jaringan dalam hubungannya dengan penyakit. Teknik pemeriksaan histopatologi berguna untuk mendeteksi adanya komponen pathogen yang bersifat infektif melalui pengamatan secara mikroanatomi (Pratama, 2012). 2. Indikasi
a. Untuk menetukan diagnosis (Djuanda, 2005). b. Untuk menentukan prognosis dan keputusan yang efektif dalam

menentukan terapi (Pratama, 2012). 3. Prinsip kerja Pemeriksaan histopatologi dilakukan melalui pemeriksaan terhadap perubahan-perubahan abnormal pada tingkat jaringan. Histopatologi dapat dilakukan dengan mengambil sampel jaringan atau dengan mengamati jaringan setelah kematian terjadi. 4. Cara kerja a. Untuk pemeriksaan ini dibutuhkan potongan jaringan yang didapat dengan cara biopsi dengan pisau atau plong/punch b. Penyertaan kulit normal pada penyakit infeksi seperti infeksi virus tidak perlu diikutsertakan c. Usahakan agar lesi yang akan dibiopsi adalah lesi primer yang belum mengalami garukan atau infeksi sekunder d. Bila ada infeksi sekunder, sebaiknya diobati lebih dahulu e. Pada penyakit yang mempunyai lesi yg beraneka macam/ banyak, lebih baik biopsi lebih dari satu f. Potongan jaringan sebisanya berbentuk elips + diikutsertakan jaringan subkutis g. Jaringan yang telah dipotong dimasukan ke dalam larutan fiksasi, misanya formalin 10% atau formalin buffer, supaya menjadi keras dan sel-selnya mati

10

h. Pewarnaan rutin yang biasa digunakan dalah Hematoksilin-Eosin(HE). Ada pula yang menggunakanperwarnaan oersein dan Giemsa i. Cairan fiksasi sebaiknya tidak kurang dari 20 X volume jaringan j. Agar cairan fiksasi dapat dengan baik masuk ke jaringan hendaknya tebal jaringan kira-kira 1/2 cm, kalau terlalu tebal dibelah dahulu sebelum dimasukkan ke dalam cairan fiksasi 5. Interpretasi Pada penyakit kulit yang disebabkan oleh virus dapat menunjukkan perubahan histopatologik yang berbeda-beda. a. Veruka Vulgaris Pemeriksaan histopatologi pada penyakit ini akan dijumpai gambaran seperti: 1) Hiperkeratosis, yaitu penebalan pada stratum korneum. Bila inti-inti sel masih terlihat pada penebalan stratum korneum disebut parakeratosis, sedangkan bila tidak lagi terlihat ini disebut ortokeratosis. 2) Akantosis, yaitu penebalan pada stratum spinosum. Gambaran ini dapat dijumpai pada penyakit Veruka Vulgaris. 3) Papilomatosis 4) Pelebaran pembuluh darah dan sebukan sel radang kronis pada lapisan dermis. Gambaran histopatologi ini juga menyerupai gambaran histopatologi pada kondiloma akuminata dan kondiloma raksasa. b. Veruka Plana Gambaran histopatologi berupa perubahan pada rete ridge, yaiut adanya gambaran seperti anyaman keranjang pada stratum corneum. c. Moluskum Kontangiosum Akan tampak badan moluskum berupa sel-sel bulat atau lonjong yang mengalami degenerasi keratohialin pada lobuli di stratum spinosum. d. Herpes Simpleks

11

Gambaran histopatologik tampak vesikel intraepidermal, infiltrate leukosit, dan akantolisis akibat degenerasi balon sel-sel epidermis. Dapat terlihat juga badan inklusi asidofilik intranukleus yang dikelilingi halo. 1) Akantolisis, yaitu hilangnya daya kohesi antar sel-sel epidermis sehingga menyebabkan terbentuknya celah, vesikel atau bula didalam epidermis. 2) Degenerasi balon, yaitu edema di dalam sel epidermis sehingga sel menjadi besar dan bulat , disebut juga degenerasi retikuler. Selain pada herpes simplek, gambaran degenerasi balon juga terdapat pada Varisela. e. Herpes Genitalis Pada herpes genitalis, tampak gambaran vesikel-vesikel pada lapisan prickle (stratum spinosum) berisi cairan yang mengandung sel-sel epitel akantolitik, leukosit, sel raksasa, dan fibrin. Vesikel mukosa berbeda dengan vesikel kulit; vesikel mukosa relative tak berisi cairan, jumlah fibrin lebih banyaj serta sel-sel di atas vesikel lebih tebal dan edema. f. Herpes Zooster Pada epidermis, terutama pada lapisan granulosum terkadang subepidermal akan tampak vesikula bersifat uniokular. Khas pada herpes zoster adalah ditemukannya sel balon yaitu sel stratum spinosum yang mengalami degenerasi dan membesar dan badan iklusi (lipschutz) yang tersebar dalam inti sel epidermis, jaringan ikat, dan endotel pembuluh darah. Pada dermis, tampak dilatasi pembuluh darah dan sebukan limfosit. Jika peradangan terdapat pada ganglion gasseri dan degenerasi N. Trigeminus cabang oftalmikus maka dinamakan herpes zooster oftalmikus (Djuanda, 2005; Siregar, 2004).

C. Pemeriksaan Mikroskop Elektron Mikroskop elektron adalah sebuah mikroskop yang mampu untuk melakukan pembesaran objek sampai 2 juta kali, yang menggunakan elektro

12

statik dan elektro magnetik untuk mengontrol pencahayaan dan tampilan gambar serta memiliki kemampuan pembesaran objek serta resolusi yang jauh lebih bagus daripada mikroskop cahaya. Mikroskop elektron ini menggunakan jauh lebih banyak energi dan radiasi elektromagnetik yang lebih pendek dibandingkan mikroskop cahaya. Mikroskopi elektron merupakan teknik pemeriksaan jaringan dengan mikroskop elektron, yang memungkinkan pembesaran yang jauh lebih besar, memungkinkan visualisasi organel dalam sel. Penggunaannya telah banyak digantikan oleh imunohistokimia, tapi sering diumumkan untuk tugas tertentu, termasuk diagnosis penyakit ginjal dan pengenalan sindrom silia imotil di antara lainnya (Invitrogen, 2006). Terdapat beberapa jenis mikroskop electron, yakni : a. Mikroskop transmisi elektron (TEM) Mikroskop transmisi elektron (Transmission electron microscope-TEM) adalah sebuah mikroskop elektron yang cara kerjanya mirip dengan cara kerja proyektor slide, di mana elektron ditembuskan ke dalam obyek pengamatan dan pengamat mengamati hasil tembusannya pada layar (Voyles, 2002). Mikroskop transmisi eletron saat ini telah mengalami peningkatan kinerja hingga mampu menghasilkan resolusi hingga 0,1 nm (atau 1 angstrom) atau sama dengan pembesaran sampai satu juta kali. Meskipun banyak bidang-bidang ilmu pengetahuan yang berkembang pesat dengan bantuan mikroskop transmisi elektron ini (Baratawidjaja, 2006). Adanya persyaratan bahwa "obyek pengamatan harus setipis mungkin" ini kembali membuat sebagian peneliti tidak terpuaskan, terutama yang memiliki obyek yang tidak dapat dengan serta merta dipertipis. Karena itu pengembangan metode baru mikroskop elektron terus dilakukan (Invitrogen, 2006). Agar pengamat dapat mengamati preparat dengan baik, diperlukan persiapan sediaan dengan tahap sebagai berikut : 1. melakukan fiksasi, yang bertujuan untuk mematikan sel tanpa mengubah struktur sel yang akan diamati. fiksasi dapat dilakukan dengan menggunakan senyawa glutaraldehida

13

atau osmium tetroksida. 2. pembuatan sayatan, yang bertujuan untuk memotong sayatan hingga setipis mungkin agar mudah diamati di bawah mikroskop. Preparat dilapisi dengan monomer resin melalui proses pemanasan, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan menggunakan mikrotom. Umumnya mata pisau mikrotom terbuat dari berlian karena berlian tersusun dari atom karbon yang padat. Oleh karena itu, sayatan yang terbentuk lebih rapi. Sayatan yang telah terbentuk diletakkan di atas cincin berpetak untuk diamati. 3. pelapisan/pewarnaan, bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya.

Pelapisan/pewarnaan dapat menggunakan logam berat seperti uranium dan timbal (Voyles, 2002). b. Mikroskop pemindai transmisi elektron (STEM) Mikroskop pemindai transmisi elektron (STEM)adalah merupakan salah satu tipe yang merupakan hasil pengembangan dari mikroskop transmisi elektron (TEM). Pada sistem STEM ini, electron menembus spesimen namun sebagaimana halnya dengan cara kerja SEM, optik elektron terfokus langsung pada sudut yang sempit dengan memindai obyek menggunakan pola pemindaian dimana obyek tersebut dipindai dari satu sisi ke sisi lainnya (raster) yang menghasilkan lajur-lajur titik (dots) yang membentuk gambar seperti yang dihasilkan oleh CRT pada televisi / monitor (Baratawidjaja, 2006). c. Mikroskop pemindai elektron (SEM) Mikroskop pemindai elektron (SEM) yang digunakan untuk studi detail arsitektur permukaan sel (atau struktur jasad renik lainnya), dan obyek diamati secara tiga dimensi. Cara terbentuknya gambar pada SEM berbeda dengan apa yang terjadi pada mikroskop optic dan TEM. Pada SEM, gambar dibuat berdasarkan deteksi elektron baru (elektron sekunder) atau elektron pantul yang muncul dari permukaan sampel ketika permukaan sampel tersebut dipindai dengan sinar elektron. Elektron sekunder atau elektron pantul yang terdeteksi selanjutnya diperkuat sinyalnya, kemudian besar amplitudonya

14

ditampilkan dalam gradasi gelap-terang pada layar monitor CRT (cathode ray tube). Di layar CRT inilah gambar struktur obyek yang sudah diperbesar bisa dilihat. Pada proses operasinya, SEM tidak memerlukan sampel yang ditipiskan, sehingga bisa digunakan untuk melihat obyek dari sudut pandang 3 dimensi (Invitrogen, 2006). Agar pengamat dapat mengamati preparat dengan baik, diperlukan persiapan sediaan dengan tahap sebagai berikut : 1. melakukan fiksasi, yang bertujuan untuk mematikan sel tanpa mengubah struktur sel yang akan diamati. fiksasi dapat dilakukan dengan menggunakan senyawa glutaraldehida atau osmium tetroksida. 2. dehidrasi, yang bertujuan untuk memperendah kadar air dalam sayatan sehingga tidak mengganggu proses pengamatan. 3. pelapisan/pewarnaan, bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya. Pelapisan/pewarnaan dapat menggunakan logam mulia seperti emas dan platina (Voyles, 2002). d. Mikroskop pemindai lingkungan elektron (ESEM) Mikroskop ini adalah merupakan pengembangan dari SEM, yang dalam bahasa Inggrisnya disebut Environmental SEM (ESEM) yang dikembangkan guna mengatasi obyek pengamatan yang tidak memenuhi syarat sebagai obyek TEM maupun SEM. Obyek yang tidak memenuhi syarat seperti ini biasanya adalah bahan alami yang ingin diamati secara detail tanpa merusak atau menambah perlakuan yang tidak perlu terhadap obyek yang apabila menggunakat alat SEM konvensional perlu ditambahkan beberapa trik yang memungkinkan hal tersebut bisa terlaksana (Voyles, 2002). Pertama-tama dilakukan suatu upaya untuk menghilangkan penumpukan elektron (charging) di permukaan obyek, dengan membuat suasana dalam ruang sample tidak vakum tetapi diisi dengan sedikit gas yang akan mengantarkan muatan positif ke permukaan obyek, sehingga penumpukan elektron dapat dihindari. Hal ini menimbulkan masalah karena kolom tempat elektron dipercepat dan ruang filamen di mana elektron yang dihasilkan memerlukan tingkat vakum yang tinggi. Permasalahan ini dapat diselesaikan

15

dengan memisahkan sistem pompa vakum ruang obyek dan ruang kolom serta filamen, dengan menggunakan sistem pompa untuk masing-masing ruang. Di antaranya kemudian dipasang satu atau lebih piringan logam platina yang biasa disebut (aperture) berlubang dengan diameter antara 200 hingga 500 mikrometer yang digunakan hanya untuk melewatkan elektron , sementara tingkat kevakuman yang berbeda dari tiap ruangan tetap terjaga (Invitrogen, 2006). Materi yang akan dijadikan objek pemantauan dengan menggunakan mikroskop elektron ini harus diproses sedemikian rupa sehingga

menghasilkan suatu sampel yang memenuhi syarat untuk dapat digunakan sebagai preparat pada mikroskop elektron. Teknik yang digunakan dalam pembuatan preparat ada berbagai macam tergantung pada spesimen dan penelitian yang dibutuhkan, antara lain :

Kriofiksasi yaitu suatu metode persiapan dengan menggunakan teknik pembekuan spesimen dengan cepat yang menggunakan nitrogen cair ataupun helium cair, dimana air yang ada akan membentuk kristal-kristal yang menyerupai kaca. Suatu bidang ilmu yang disebut mikroskopi cryoelektron (cryo-electron microscopy) telah dikembangkan berdasarkan tehnik ini. Dengan pengembangan dari Mikroskopi cryo-elektron dari potongan menyerupai kaca (vitreous) atau disebut cryo-electron microscopy of vitreous sections (CEMOVIS), maka sekarang telah dimungkinkan untuk melakukan penelitian secara virtual terhadap specimen biologi dalam keadaan aslinya (Invitrogen, 2006).

Fiksasi - yaitu suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik (seperti kenyataannya ) dengan menggunakan glutaraldehid dan osmium tetroksida (Voyles, 2002).

Dehidrasi - yaitu suatu metode persiapan dengan cara menggantikan air dengan bahan pelarut organik seperti misalnya ethanol atau aceton (Baratawidjaja, 2006).

16

Penanaman (Embedding) - yaitu suatu metode persiapan dengan cara menginfiltrasi jaringan dengan resin seperti misalnya araldit atau epoksi untuk pemisahan bagian (Voyles, 2002).

Pembelahan

(Sectioning)-

yaitu

suatu

metode

persiapan

untuk

mendapatkan potongan tipis dari spesimen sehingga menjadikannya semi transparan terhadap elektron. Pemotongan ini bisa dilakukan dengan ultramicrotome dengan menggunakan pisau berlian untuk menghasilkan potongan yang tipis sekali. Pisau kaca juga biasa digunakan oleh karena harganya lebih murah (Voyles, 2002).

Pewarnaan

(Staining)

yaitu

suatu

metode

persiapan

dengan

menggunakan metal berat seperti timah, uranium, atau tungsten untuk menguraikan elektron gambar sehingga menghasilkan kontras antara struktur yang berlainan di mana khususnya materi biologikal banyak yang warnanya nyaris transparan terhadap elektron (objek fase lemah) (Invitrogen, 2006).

Pembekuan fraktur (Freeze-fracture) - yaitu suatu metode persiapan yang biasanya digunakan untuk menguji membran lipid. Jaringan atau sel segar didinginkan dengan cepat (cryofixed) kemudian dipatah-patahkan atau dengan menggunakan microtome sewaktu masih berada dalam keadaan suhu nitrogen ( hingga mencapai -100% Celsius). Patahan beku tersebut lalu diuapi dengan uap platinum atau emas dengan sudut 45 derajat pada sebuah alat evaporator en:evaporator tekanan tinggi (Voyles, 2002).

Ion Beam Milling - yaitu suatu metode mempersiapkan sebuah sampel hingga menjadi transparan terhadap elektron dengan menggunakan cara pembakaran ion( biasanya digunakan argon) pada permukaan dari suatu sudut hingga memercikkan material dari permukaannya. Kategori yang lebih rendah dari metode Ion Beam Milling ini adalah metode berikutnya adalah metode Focused ion beam milling, dimana galium ion digunakan untuk menghasilkan selaput elektron transparan pada suatu bagian spesifik pada sampel (Baratawidjaja, 2006).

17

Pelapisan konduktif (Conductive Coating) - yaitu suatu metode mempersiapkan lapisan ultra tipis dari suatu material electricallyconducting . Ini dilakukan untuk mencegah terjadinya akumulasi dari medan elektrik statis pada spesimen sehubungan dengan elektron irradiasi sewaktu proses penggambaran sampel. Beberapa bahan pelapis termasuk emas, palladium (emas putih), platinum, tungsten, graphite dan lain-lain, secara khusus sangatlah penting bagi penelitian spesimen dengan SEM (Invitrogen, 2006).

D. Pemeriksaan Imunofluoresensi Imunofluoresensi merupakan metode pemeriksaan menggunakan antibody yang telah terkonjugasi dengan molekul fluoresens dan dilihat di bawah mikroskop ultraviolet (UV). Metode tersebut menggunakan antibody yang berikatan kovalen dengan molekul fluoresens. Ikatan antara antibody dan molekul fluoresens tersebut berada pada bagian Fc antibody (Baratawidjaja, 2006). Terdapat 2 jenis metode imunofluoresensi berdasarkan penambahan label fluoresens yang digunakan, yaitu langsung dan tidak langsung. Imunofluoresensi langsung menggunakan antibody yang direaksikan dengan antigen pada jaringan. Antibodi primer yang telah digunakan telah dilabeli oleh fluoresens. Imunofluoresensi tidak langsung menggunakan antibody primer yang tidak dilabeli dan kemudian dideteksi dengan antibody sekunder yang telah dilabeli fluoresens. Metode tersebut lebih sering digunakan dibandingkan dengan imunofluoresensi imunofluoresensi langsung. tidak Hal tersebut lebih disebabkan karena metode metode

langsung

sensitive

dibandingkan

imunofluoresensi langsung. Imunofluoresensi dapat digunakan untuk mendeteksi dan membedakan serotype virus. Pendeteksian dilakukan menggunakan antibody monoclonal yang spesifik terhadap serotype virus tertentu. Antibodi akan berikatan langsung protein virus pada permukaan atau bagian dalam dari sel yang terinfeksi (Voyles, 2002).

18

Pendeteksian virus dengan imunofluoresensi umumnya menggunakan pewarnaan inti sel, yaitu DAPI counter staining. Pewarnaan tersebut akan memberikan warna biru yang kontras jika digabungkan dengan probe warna kuning, hijau atau merah (Invitrogen, 2006).

E. Pemeriksaan Darah Pemeriksaan darah dilakukan untuk menyingkirkan etiologi lain dari penyakit yang sedang diderita. Melalui pemeriksaan darah kita bias melihat ada/tidaknya anemia, leukositosis dan kecenderungan perubahan pada hitung jenis leukosit walaupun indicator-indikator tersebut tidak spesifik untuk penyakit virus. Kita juga dapat melihat laju endap darah yang cenderung meningkat pada infeksi bakteri terutama bakteri spesifik. Berbagai keadaan kimia klinik (seperti tes fungsi hepar dan ginjal) dapat diperiksa untuk melihat status kesehatan pasien secara umum sebagai bahan pertimbangan bias/tidaknya pasien tersebut menerima obat tertentu yang bersifat hepatotoksik atau nefrotoksik. Selain itu, pada pasien dengan keadaan umum yang tidak begitu baik dapat dilakukan pemeriksaan elektrolit. Kadar gula darah pun dapat dilakukan untuk melihat faktor predisposisi penyakit-penyakit infeksi yang muncul (Invitrogen, 2006).

F. Tes Antibodi Tes antibodi dilakukan untuk mendeteksi keberadaan antibodi tertentu yang menyerang sel darah merah. Antibodi adalah protein yang dibuat oleh sistem kekebalan tubuh yang berfungsi untuk melawan zat-zat asing yang masuk ke dalam tubuh dan kemudian memusnahkannya, seperti bakteri dan virus. Beberapa kondisi di bawah ini dapat menyebabkan pembentukkan antibodi dalam tubuh: 1. Reaksi Transfusi : Darah manusia mempunyai tanda sendiri (disebut antigen) pada permukaan sel darah merah. Dalam proses transfusi darah, darah yang ditransfusikan harus cocok dengan tipe darah si penerima. Itu berarti darah yang ditransfusikan harus memiliki antigen yang sama seperti

19

sel darah merah pasien. Jika dilakukan transfusi darah dengan antigen yang berbeda (darah yang tidak cocok), maka sistem kekebalan tubuh akan menghancurkan sel-sel darah yang ditransfusikan. Ini disebut reaksi transfusi dan dapat menyebabkan komplikasi yang serius atau bahkan kematian. Inilah sebabnya mengapa pencocokan golongan darah sangat penting. 2. Rh sensitisasi : Rh adalah antigen. Nama lengkap untuk antigen ini Rhesus faktor. Jika seorang wanita Rh- hamil dengan Rh bayi (janin) positif, sensitisasi Rh mungkin terjadi. Bayi mungkin memiliki darah Rh+ jika ayah memiliki darah Rh+. Sensitisasi Rh terjadi ketika darah bayi bercampur dengan darah ibu selama kehamilan atau proses persalinan. Hal ini menyebabkan sistem kekebalan tubuh ibu membuat antibodi terhadap sel darah merah bayi darah di kehamilan berikutnya. Respon antibodi ini disebut sensitisasi Rh dan bisa menghancurkan sel-sel darah merah bayi sebelum atau setelah lahir. Jika sensitisasi terjadi, janin atau bayi yang baru lahir dapat mengembangkan ringan sampai masalah berat (disebut Rh

disease atau erythroblastosis fetalis). Jika Rh disease ini tidak diobati, akan menyebabkan kematian janin atau bayi yang baru dilahirkan. Seorang wanita dengan Rh- dianjurkan untuk mendapatkan suntikan Immunoglobulin anti RhD untuk mencegah sensitisasi. Masalah sensitisasi Rh (Rh disease) mengalami penurunan drastis dan menjadi sangat langka

setelah Immunoglobulin anti RhD ditemukan. 3. Anemia Hemolitik Autoimun : Anemia hemolitik autoimun atau yang biasa disebut anemia hemolitik adalah penyakit langka yang menyebabkan antibodi dalam tubuh menyerang sel darah merahnya sendiri Pemeriksaan Coombst test adalah pemeriksaan yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibody pada permukaan eritrosit dan anti-ab eritrosit dalam serum. Antibody ini menyelimuti permukaan sel eritrosit yang meyebabkan umur eritrosit menjadi lebih pendek dan sering menyebabkan reaksi inkompetibel pada transfuse darah.

20

Ada 2 jenis Tes Antibodi: 1. Direct Coombs test (langsung) : pemeriksaan dilakukan pada sel darah merah. Direct Coombs Test juga dapat dilakukan pada bayi yang baru lahir dengan darah Rh+ yang ibunya memiliki Rh-. Hasil

pengujianakan menunjukkan apakah darah ibu telah membuat antibodi dan apakah antibodi tersebut telah pindah kepada bayi melalui plasenta. 2. Indirect Coombs test (tidak langsung) : pemeriksaan dilakukan pada serum darah. Indirect Coombs Test umumnya dilakukan sebelum transfusi darah dan dapat juga untuk menentukan titer antibodi Rh+ pada darah seorang wanita Rh-.

TUJUAN PEMERIKSAAN Untuk mendeteksi adanya ab pada permukaan eritrosit dan anti-ab eritrosit pada serum PRINSIP PEMERIKSAAN Eritrosit yang telah dicuci dan yang diselubungi oleh globulin manusia akan diaglutinasi oleh Anti Human Globulin yang ditambahkan ke dalam tabung pemeriksaan REAGENSIA Sel golongan darah O normal 2-5 % Coombs control cell positif (CCCP) Bovin albumin 22% (BA) Coombs Serum ( AHG) yaitu anti human globulin antibody yang dihasilkan oleh binatang yang disuntikkan serum atau protein manusia untuk mendeteksi Ab yang melekat pada permukaan eritrosit dan menyingkirkan Ab lain yang tidak diinginkan. Saline Incubator suhu 37 0 c Centrifuge

PERALATAN

21

Mikroskop Timer Rak tabung Tabung reaksi ukuran 12 x75 mm Pipet tetes Botol semprot Slide test Beaker glass Wadah limbah

CARA KERJA a. Aglutinasi Langsung (direct Coombs test) o o o o o o o o Siapkan alat dan bahan Tambahkan 2 tetes suspense eritrosit 2-5 % ke dalam tabung I dan II Cuci suspense eritrosit 2-5 % 3-4 kali dengan saline Tambahkan kedalam sedimen sel ( tabung I 2 tetes AHG dan tabung II, 2 tetes saline sebagai negative control) Putar 1000 rpm selama 1 menit atau 3500 rpm selam 15 detik Amati ada tidakny aglutina Apabila negative tambahkan 1 tetes cccp dan diputar kembali selama 1 menit kecepatan 1000 rpm Apabila positif berarti pekerjaan benar dan apabila negative pemeriksaan harus diulang kembali. b. Aglutinasi Tidak Langsung o o o o Masukkan 2 tetes serum atau plasma yang akan dipriksa ke dalam tabung reaksi Tambahkan 1 tetes suspense eritrosit 2-5 % kedalam tabung tersebut Inkubasi pada suhu 370 C selam 15-60 menit Tambahkan BA 22% kemudian diputar 1 menit pada 1000 rpm dan baca hasil reaksinya. Setelah itu inkubasi selam 15 menit

22

Cuci suspense eritrosit 2- 5% 3-4 x dengan salin. Salin pencucian terakhir dibuang sebanyak-banyaknya untuk mencegah pengenceran serum coombs

o o o o

Kemudian tambahkan 2 tetes serum coombs dan kemudianputar selam 1 menit 1000 rpm Baca hasil reaksinya Apabila hasil negative tambahkan 1 tetes CCCP dan diputar kembali 1000 rpm selam 1 menit Apabila positif berarti pekerjaan benar dan apabila negative pemeriksaan harus diulang kembali

HASIL a. Normal Tidak ditemukan antibodi (hasil test negatif) Direct Coombs Test negatif berarti tidak ada antibodi dalam sel darah merah Indirect Coombs Test negatif berarti darah pendonor dan darah penerima kompatibel (cocok) Indirect Coombs Test negatif pada wanita Rh- yang hamil berarti tidak ada antibodi anti Rh+ dalam darah dan belum terjadi sensitisasi b. Abnormal Direct Coombs Test positif berarti ada antibodi yang akan melawan dan menghancurkan sel darah merah. Hal ini dapat disebabkan oleh transfusi darah yang tidak cocok atau penyakit anemia hemolitik Indirect Coombs Test positif berarti darah pendonor tidak cocok dengan darah si penerima Indirect Coombs Test positif pada wanita Rh- yang hamil atau berencana untuk hamil berarti dia memiliki antibodi terhadap darah Rh+ (sensitisasi Rh). Saat awal kehamilan jenis darah bayi akan diperiksa, jika darah bayi Rh+ maka ibu harus mendapat pengawasan ketat selama kehamilan untuk

23

mencegah masalah dengan sel darah merah bayi. Jika sensitisasi belum terjadi maka dapat dicegah dengan suntikan Immunoglobulin anti RhD.

Faktor yang mempengaruhi perlekatan Ab pada sdm invitro : 1. Temperatur : Ab yang menyeubungi eritrosit dan serum breaksi oftimal pada suhu 37 0 C. suhu yang terlalu rendah akan mempengaruhi kecepatan asosiasi Ag dan Ab. Sebaliknya suhu yang terlalu tinggi akan merusak eritrosit dan molekul Ab. 2. Ionic Strength. : Eritrosit dapat disuspensikan kedalam berbagai media misal dalam lar saline fisiologis, lar albumin, LISS dan reag additive seperti polyethylene glycol (PEG)/hexadimethrine bromide (polybrene). Dalam cairan isotonik, Na ion dan Cl ion bergerombol sekeliling sel dan sebagian menetralisir muatan yang berseberangan pada Ag dan molekul Ab. Effek penyelubungan ini yang merintangi assosiasi Ab dengan Ag dan dapat dikurangi dengan cara mengurangi ionic strength dari media reaksi. Konsekuensi menurunkan konsentrasi garam dari media

reaksi meningkatkan Ab yang melekat pada eritrosit. Penggunaan albumin kec bila digunakan dibawah kondisi ion yang rendah juga dapat melakukan perlekatan molekul Ab. 3. Proporsi Serum Terhadap Sel : Suspense eritrosit yangterlalu tinggi atau terlalu rendah dapat mempengaruhi drajat Ab yang menyelimuti eritrosit. Dengan meningkatkan ratio serum terhadap sel dapat mendeteksi Ab yang bereaksi lemah yang tidak terdeteksi dibawah suspensi normal eritrosit. 4. WaktuInkubasi : Tehnik albumin waktu inkubasi 15 30 menit suhu 370 C waktu yang adekwat untuk mendeteksi Ab yang menyelimuti sdm yang secara klinis berarti. Ab yang bereaksi lemah, reaksi Ag Ab tidak dapat mencapai keseimbangan dalam waktu inkubasi selama 30 menit dan dengan memperpanjang waktu inkubasi dapat membuktikan keberadaannya.

24

Hasil Negatif Palsu pada Pemeriksaan disebabkan oleh Tidak mencuci sdm dengan bersih dan baik, karena globulin yang bebas yang tidak berikatan dengan sel akan menetralisir AHG. pemeriksaan terganggu atau tertunda. Pelaksanaan proses pencucian harus dilakukan secepat mungkin untuk mengurangi kehilangan Ab yang terlepas dari sel. AHG harus ditambahkan segera setelah proses pencucian selesai karena Ab yang telah mengadakan ikatan akan terlepas kembali. Setelah AHG ditambahkan harus segera diputar dan dibaca, karena reaksi IgG yang menyelimuti sdm akan melemah setelah inkubasi. Reagen kehilangan reaktivitas yang disebabkan oleh penyimpanan yang tidak baik, kontaminasi bakteri / serum manusia. Penyimpanan AHG dianjurkan pada 2 80 C, jangan dibekukan, bila warna berubah tidak digunakan lagi. AHG mengalami netralisasi bila terkontaminasi dengan serum manusia / antiD sera. Hal ini tidak terlihat dengan mata (makroskopis) tetapi terlihat bila diperiksa dengan CCC, hasil reaksi yang seharusnya pos menjadi neg. Tidak ada AHG pada pemeriksaan, atau lupa menambahkan AHG. Hal ini dapat dicegah dengan memakai AHG yang berwarna. Penggunaan centrifugasi yang tidak baik

Centrifugasi yang lambat keadaan menjadi tidak optimal untuk aglutinasi, sebaliknya centrifugasi yang terlalu kuat memadatkan sel, sehingga sel sukar untuk terurai. Jumlah eritrosit yang ada pada pemeriksaan mempengaruhi reaktivitas. Reaksi yang lemah karena terlalu banyak eritrosit, sebaliknya eritrosit yang terlalu sedikit menyulitkan pembacaan aglutinasi dengan baik. Reaksi prozone sebagai kemungkinan penyebab pemeriksaan antiglobulin tidak reaktif.

25

Hasil Positif palsu pada pemeriksaan disebabkan oleh Sdm sudah dicentrifugasi sebelum dilakukan pencucian. Apabila tidak terlihat aglutinasi yang tampak setelah penambahan AHG dapat disalah interpretasikan pembacaannya sebagai akibat perselubungan IgG / komplemen. eritrosit penderita cold react auto Ab yang kuat beraglutinasi pada contoh darah yang disimpan pada suhu kamar atau dibawah suhu kamar. Tabulasi gelas yang tidak bersih terkontaminasi dengan debu, detergent / material lain yang menyebabkan sdm menggumpal / aggregasi. Over centrifugation dapat memadatkan eritrosir yaitu agregasi disalah artikan dengan aglutinasi. Reagen yang dibuat tidak baik dan dapat mengandung Ab yang mengakibatkan aglutinasi pada sel yang tidak diselubungi. Enzyme treated red blood cells dapat meningkatkan reaktivitas dengan antispecies Ab dan dapat bereaksi langsung dengan reag AHG yang mengandung kontaminasi aktivitas.

G. Tes Serologi Pemeriksaan serologis pada virus contohnya pada pemeriksaan

serologis Treponema palidum dibagi menjadi 2, yaitu pemeriksaan non treponema (uji Venereal Disease Research laboratory) dan pemeriksaan treponema (MHA-TP / TPHA) 1. Pemeriksaan Treponema a. b. Metode Tujuan : TPHA Dan Rapid Test : Tes hemaglutinasi untuk menentukan Antibodi

terhadap Treponema pallidum secara kualitatif dan kuantitatif c. PERSIAPAN Persiapan pasien : Persiapan sampel : d. Alat Tidak ada persiapan khusus Serum

26

Mikropipet (25 l, 75 l, 100 l). Rak tabung. Sentrifugasi. Spoid. Sumur TPHA. Tabung K3. Tourniqutte. e. Bahan Kapas alkohol. Rapid test. Reagen TPHA (control cell, test cell, buffer conjugate). Sampel darah(serum atau plasma). CARA KUALITATIF 1. 2. Disiapkan well A, B, dan C Ditambahkan 190 L larutan diluent, dihomogenkan. Lalu ditambahkan 10 L sampel 3. 4. 5. 6. Dipipet kewell B dan C sebanyak 75 L Ditambahkan reagen test diwell B sebanyak 75 L Dan ditambahkan reagen kontrol di well C sebanyak 75 L Dicampur, dihomogenkan dan diinkubasi selama 45-60 menit Dipipet sebanyak 25 L dari sumur B pada uji kualitatif kedalam well A dan B 2. Kemudian dipipet 25 L larutan diluent diwell B dicampur

CARA KUANTITATIF 1.

dihomogenkan, lalu Diambil sebanyak 25l dari lubang B, campur lalu pindahkan ke C sebanyak 25 l, begitu seterusnya hingga ke lubang H dan 25 l terakhir disisihkan. 3. 4. Ditambahkan reagen test pada well B H sebanyak 75 L. Dicampur, dihomogenkan lalu di inkubasi 45-60 menit

27

INTERPRETASI HASIL Hasil Positif : Terjadi Aglutinasi kemudian dilanjutkan untuk tingkatan titer yang lebih besar Hasil Negatif : Tidak terjadi aglutinas

2. Pemeriksaan Non Treponema Tujuan PRINSIP Pada penderita sifilis akan terbentuk antibody yang terjadi sebagai reaksi terhadap bahan-bahan yang dilepaskan karena kerusakan sel-sel antibody tersebut disebut regain. Regain dalam serum penderita akan berflokulasi bila ditambahkan kardiolipin yaitu antigen yang berasal dari ekstraksi hati sapi. ALAT: Objek glass Mikropipet 10 l, 20 l, 40 l Pipet ukur 10 ml Mikroskop Penangas air : Untuk mendeteksi adanya antibody non-treponema (Reagin)

BAHAN Serum darah dan cairan otak Antigen VDRL Larutan garam buffer Larutan garam fisiologis (0,9%)

PROSEDUR PEMERIKSAAN SERUM DARAH 1. Persiapan sampel o Serum yang jernih dipanaskan dulu dalam penangas air pada suhu 56 C selama 30 menit, jangan memakai serum yang keruh atau hemolisis.

28

o o

Pemanasan serum perlu diulang pada 56 C selama 10 menit bila pemeriksaan dilakukan lebih dari 4 jam setelah pemanasan yang pertama. Pemeriksaan dilakukan bila suhu serum sudah sama dengan suhu kamar (23-29 C).

2. Reagen o Antigen harus tidak berwarna merupakan larutan dalam alcohol yang mengandung 0,03% kardiolipin, 0,9% kolesterol dan leucithin murni (0,21%). Antigen harus disimpan dalam ruangan gelap pada suhu 6-8 C. bilamana terjadi presipitat, maka larutan antigen tersebut tidak dapat dipergunakan lagi dan harus dibuang. Suspense antigen baru harus dibandingkan terlebih dahulu terhadap larutan antigen yang reaktivitasnya sudah diketahui sebelum dipergunakan dalam pemeriksaan rutin. o Larutan garam buffer VDRL dengan pH 6,0+0,1 terdapat komersial atau dapat dibuat dengan komposisi sebagai berikut: Formaldehyde netral : 0,5 ml Na2HPO4 KH2PH2PO4 NaCl Aquadest ad : 0,037 gr : 0,170 gr : 10.0 gr : 1000 Ml

Larutan garam fisiologis (0,9 % NaCl) 3. Persiapan Suspensi Antigen o o Terlebih dahulu simpan botol antigen dan larutan garam buffer VDRL pada suhu kamar selama 15 menit. Pipet 400 l larutan garam buffer, masukkan kedalam botol reagen ukuran 30 ml. kemudian ditambahkan 500 l antigen tetes demi tetes langsung diatas larutan garam buffer sambil menggerakkan botol tersebut dengan gerakan memutar pada bidang yang rata. o o o Lanjutkan gerakan memutar botol selama 10 detik. Tambahkan 4100 l larutan garam buffer. Kocok 30 kali dalam 10 detik. Suspense antigen siap untuk dipakai dan hanya tahan selama 1 hari.

29

4. Prosedur pemeriksaan kualitatif o Simpan semua alat pemeriksaan, serum dan suspense antigen pada suhu kamar (23C 29C).pemeriksaan yang dilakukan di bawah suhu kamar memberikan reaktivitas yang lebih rendah, sebaliknya bila di atas suhu kamar reaktivitasnya meningkat. o o o Pipet 50 l serum yang sudah dipanaskan ke atas permukaan slide Pipet 50 l suspense antigen dan teteskan diatas setiap tetes serum dengan posisi vertical. Slide disimpan di atas rotator dan rotator dihidupkan selama 4 menit. Bila pemeriksaan dilakukan pada udara yang kering dan panas. Sebaiknya slide disimpan di dalam kotak yang berisi tissue/kapas basah untuk menghindari adanya penguapan yang berlebihan. o Pembacaan dilakukan segera setelah rotator berhenti dengan

menggunakan mikroskop pembessaran 100x. 5. HASIL Laporan hasil cukup dengan menyebutkan non-reaktif, reaktif lemah atau reaktif o o o o o REAKTIF REAKTIF LEMAH NON REAKTIF : Bila tampak gumpalan sedang atau besar : Bila tampak gumpalan kecil-kecil : Bila tidak tampak flokulasi/gumpalan.

6. Prosedur pemeriksaan kuatitatif Letakkan serum sampel pada baris terdepan rak dan baris kedua berisi tabung dengan 700 l larutan garam fisiologis Buat pengenceran 1:8 dengan menambahkan 100 mikro serum ke dalam 0,7 ml larutan garam fisiologis. Campur hingga homogen. Letakkan 40 mikro. 20 mikro dan 10 mikro serum yang sudah diencerkan pada lingkaran ke 4. 5 dan 6 dari slide keramik. Buang sisa serum yang sudah diencerkan tadi kedalam tabung pengenceran.

30

Dengan menggunakan pipet yang sama, letakkan 40 mikro, 20 mikro dan 10 mikro serum yang tidak diencerkan pada lingkaran pertama, kedua dan ketiga.

o o o

Tambahkan 20 mikro larutan garam fisiologis pada lingkaran ke 2 dan 5. Tambahkan 30 mikro larutan garam fisiologis pada lingkaran ke 3 dan 6 Slide digoyang perlahan-lahan dengan menggunakan kedua belah tangan selama kurang lebih 15 detik untuk memperoleh campuran yang homogen.

o o o

Tambahkan 10 mikro suspense antigen pada tiap lingkaran. Tahap selanjutnya dilakukan seperti pemeriksaan VDRL kualitatif. Hasil dilaporkan dengan menyebutkan pengenceran serum tertinggi yang masih memberikan hasil reaktif.

PEMERIKSAAN VDRL PADA CAIRAN OTAK 1. Persiapan Sampel Cairan otak disentrfifus dengan kecepatan 300-500 g selama 10 menit kemudian dituangkan kedalam tabung yang bersih. Cairan tersebut siap untuk diperiksa dan tidak perlu pemanasan terlebih dahulu. Cairan otak yang jelas terkontaminasi atau banyak mengandung eritrosit memberikan hasil yang tidak memuaskan. 2. Persiapan Reagen Antigen, larutan buffer VDRL dan larutan garam fisiologis seperti yag disebutkan pada pemeriksaan VDRL serum. Larutan NaCl 10% 3. Persiapan Antigen o Buat suspense antigen VDRL seperti yang dilakukan pada pemeriksaan serum o Tambahkan 1 bagian dari 10% larutan NaCl pada 1 bagian suspense antigen VDRL.

31

o Campur hingga homogen dengan gerakan memutar dan diamkan selama 5 menit. Suspense ini harus segar dan tidak boleh dipakai lebih dari 2 jam sejak penambahan larutan NaCl. 4. Pemeriksaan Kualitatif o Pipet 50 mikron cairan otak ke dalam bagian cekung dari slide o Tambahkan 10 mikro suspense antigenpada tiap sampel cairan otak dengan menggunakan pipet mikro. o Slide disimpan di atas rotator dan putar selama 8 menit. o Pembacaan dan pelaporan hasil seperti pada pemeriksaan serum kualitatif. 5. Pemeriksaan Kuantitatif o Pemeriksaan VDRL kuantitatif pada cairan otak dilakukan bila pada pemeriksaan VDRL kualitatif menunjukkan hasil reaktif o Lakukan pengenceran cairan otak sebagai berikut: pipet 200 mikro larutan garam fisiologis (0,9%) ke dalam 5 buah tabung atau lebih Tambahkan 200 mikro cairan otak ke dalam tabung yang pertama. Campur hingga homogeny dan pindahkan 200 mikro ke dalam tabung nomor 2. campur hingga homogeny. Kemudian pindahkan 200 mikro cairan dari tabung nomor 2 ke dalam tabung no 3 dan seterusnya, pada tabung terakhir campuran dibuang sebanyak 200 mikro. Sehingga diperoleh pengenceran 1:2. 1:4. 1:8. 1:16 dan seterusnya. o tabung selanjutnya dilakukan seperti pemeriksaan VDRL cairan otak kualitatif tahap 1 sampai dengan 3 o Pembacaan dan pelaporan hasil dilakukan seperti pemeriksaan serum kuantitatif.

32

H. Kultur Banyak virus yang telah dapat dibiakkan dalam biakan jaringan atau dalam telur berembrio dengan keadaan lingkungan yang dapat dikendalikan secara ketat.walaupun demikian pertumbuhan virus pada hewan percobaan masih tetap digunakan untuk isolasi primer virus tertentu dan untuk penelitian patogenitas virus dan onkogenesis virus. Jadi ada tiga jenis biakan untuk virus yaitu :\ 1. Hewan Percobaan Jenis hewan percobaan,umur,jenis kelamin serta cara penyuntikannya berbeda-beda tergantung dari jenis virus. Contohnya : Untuk virus polio maka hewan percobaan yang digunakan adalah kera. Cara penyuntikan adalah sbb : secara intra cerebral (ke dalam otak) secara intra spinal (ke dalam sus-sum tulang belakang) secara intra nasal (diteteskan ke dalam hidung) intra musculair (disuntikan ke dalam otat paha)

secara

Dalam waktu 2 minggu setelah penyuntikan,maka kera akan lumpuh. Ini dibuktikan bahwa tinja penderita mengandung virus polio. 2. Telur Berembrio. Telur berembrio yang biasanya digunakan adalah telur ayam negeri,telur ayam kampung, atau telur bebek. Umur dari telur,cara penyuntikan,suhu pengaraman dan lamanya pengeraman tergantung dari jenis virus yang akan disuntikkan. 3. Biakan Jaringan (Tissue Culture) 3 tipe dasar biakan jaringan,yaitu: a. biakan jaringan primer,dibuat dengan cara menyebarkan sel (dengan tripsin) dari jaringan tuan rumah.umumnya sel ini tidak sanggup tumbuh lebih dari beberapa kali pemindahbiakan,sebagai biakan skunder

33

b.

strain sel diploid,adalah biakan skunder yang telah mengalami perubahan yang memungkinkan sel-sel tersebut dibiak terbatas (sampai 50 kali pemind biakan)tetapi tetap memiliki pola kromosom normal.

c.

Garis sel berkesinambungan,adalah biakan sel yang sanggup untuk tumbuh lebih lama dan berasal dari strain sel atau jaringan ganas.biakan sel ini selalu memiliki jumlah kromosom yang sudah berubah dan tidak teratur (1 : 16-23)

CARA PENGAMBILAN DAN PENANGANAN SPECIMEN Tujuan Prinsip : mengetahui cara pengambilan dan penanganan sampel virologi : Pengambilan sampel dilakukan secara aseptis dan dimasukan dalam

larutan antibiotik dan anti jamur. Penanganan sampel : Sampel dimasukkan dalam media transport dan

dimasukkan dalam bok pendingin Alat : Cotton bud steril. Botol steril / tabung bertutup steril. Bahan : Media transport (PBS antibiotik) Larutan antibiotic Larutan antijamur Bahan pemeriksaan : Organ tersangka Susu Sperma Swab anus Swab trachea

34

Prosedur kerja : 1. Sampel Organ

organ yang dicurigai terinfeksi virus diambil secara aseptis dan dimasukan ke dalam container organ digerus ditambah media PBS,larutan antibiotik dan antijamur untuk mencegah pertumbuhan kontaminan jamur dan bakteri. Disentrifuge 1000 rpm selama 10 menit Diambil supernatan dan ditambah antibiotic Diinkubasi 30 menit 37oC Diinokulasikan dalam telurr atau media sel.

2. Sampel Swab Swab steril dimasukan ke dalam pharing/anus dan digosokkan ke sekeliling organ (untuk pharing). Swab dikeluarkandan dimasukkan ke dalam tabung berisi media transport dan dimasukkan bok pendingin untuk dibawa ke laboratorium. Sampel swab divortex dan disentrifuge 1000 rpm 10 menit Diambil supernatannya dan diinokulasikan dalam telur berembrio atau media sel. ISOLASI VIRUS PADA TELUR BEREMBRIO Isolasi virus secara invivo paling banyak dilakukan pada telur ayam berembrio karena lebih praktis dan relatif murah. Keberhasilan atau kegagalan menggunakan telur berembrio ini tergantung dari : rute inokulasiumur embrio,suhu inkubasi,lama inkubasi,volume dan pengenceran inokulum,status imun dari flok Penyuntikan pada telur berembrio dapat dilakukan melalui 6 cara : 1. 2. 3. intra allantois selaput korio alantois (CAM) intra kuning telur (yolk sac)

35

4. 5.

intra amnionik intra venous Virus yang tumbuh pada telur berembrio biasanya ditandai dengan

kematian embrio,embrio menjadi kerdil,perdarahan di bawah kulit,pertumbuhan abnormal otot dan bulu serta organ visceral seperti hati dan limfanya membengkak,warnanya pucat dan kehijauna,ada nekrotik,fokal di hati dan jantung dan endapan asam urat di ginjal,selaput corio alantois (CAM)menebal karena edemaa dan terdapat bintik putih (pock)atau plak. Berbagai metode dapat dipakai untuk identifikasi dan klkasifikasi virus yaitu berdasarkan : 1. 2. 3. 4. 5. tipe asam inti (DNA atau RNA) diameter virion . bentuk nukleokapsid (kubus atau helical) sifat kimiawi virus,kepekaan terhadap pelarut lemak yaitu lipoprotein sifat fisika (thermo stabilitas)yaitu kepekaan virus terhadap pemanasan pada suhu 56C,proses cair beku,ultra sonikasi 6. sifat biologis yaitu kemampuan mengaaglutinasi darah ,merah unggas dan mamalia,elusi dan patogenitas (2 : 3-6) Tujuan : Mengisolasi virus yang dicurigai dalam telur berembrio Alat : Alat peneropong posisi embrio Pencil Bor telur Spuit steril 1 ml Selotip/kutek/lilin Inkubator Reagen : Desinfektan ( Alkohol 70% atau yodium)

Bahan : Telur berembrio Metode : Penyuntikan Intra allantois Prosedur kerja : a. Intra Selaput allantois

36

Digunakan embrio umur 8-11 hari. Dekat dengan rongga udara di desinfektan dan dilubangi dengan bor telur. Menggunakan tuberculin syring dengan jarum berukuran 25 gauge (16 mm),inokulum sebanyak 0,1 0,2 ml pertelur.disuntik dengan hati-hati langsung ke dalam selaput alantois. Jarum tidak boleh digerak-gerakkan ke samping untuk menghindari sobeknya selaput korio alantois dan matinya alantois.

Lubang bekas suntikan ditutup dengan kutek atau lilin dan telur diinkubasi di dalam inkubator suhu 37C selama 3 7 hari

Telur diperiksa setiap hari untuk melihat apakah ada embrio yang mati.jika ada embrio yang mati atau embrio yang masih hidup setelah periode inkubasi dikeluarkan dari inkubator dan didinginkan dalam kulkas selama 1 jam

Telur didesinfeksi,kulit telur dipotong di atas batas rongga udara kemudian cairan alanto amnionik dipanen menggunakan pipet pasteur dan ditampung dalam botol atau beaker steril.

Embrio dikeluarkan dan diletakkan di dalam petri disk Perubahan diamati seperti perdarahan di bawah kulit,udema,dan kerdil

b. Intra Korio-alantois Digunakan embrio umur 10 - 11 hari. Kulit telur dekat rongga udara dan sebelah samping didesinfeksi Kulit telur dibor,pengeboranharus hati-hati jangan sampai menembus selaput korio alantois atau mengenai pembuluh darah Telur ditempatkan dengan poisisi horisontal,kemudian dibuat rongga udara tiruan disamping dengan cara menyedot udara melaui lubang rongga udara Setelah lubang udara berpindah ke samping,lubang udara semula pada rongga udara ditutup dengan kutek atau lilin Inokulum sebanyak 0,1-0,2 ml,dimasukkan vertikal masuk di atas selaput korio alantois.lubang ditutup dengan kutek atau lilin

37

Telur diinkubasi 37C selama 5607 hari dan diperiksa setiap hari untuk melihat apakah ada embrio yang mati.jika ada embrio yang mati atau embrio yang masih hidup setelah periode inkubasi dikeluarkan dari inkubator dan didinginkan dalam kulkas selama 1 jam

Telur didesinfeksi,kulit telur dipotong dekat rongga udara kemudian cairan alanto amnionik dipanen menggunakan pipet pasteur dan ditampung dalam botol atau beaker steril.

Embrio dikeluarkan dan diletakkan di dalam petri disk Selaput korio alantois diambil dan diperiksa perubahan seperti udema,penebalan dan bintik atau bercak putih (pock atau plak)

Selaput korio alantois ini ditampung dengan cairan alanto amnionik tadi

c. Intra kuning telur Digunakan telur berembrio umur 6-8 hari Telur diletakkan posisi tegak,kulit telur di atas rongga udara didesinfektan kemudian dibor Menggunakan spuit 1 ml dan jarum 25 mm, telur diinokulum dengan suntikan tegak lurus masuk ke selaput kuning telur.disedot sedikit untuk memastikan jarum telah masuk kuning telur Lubang telur ditutup dengan kutek atau lilin dan diinkubasi 37C selama 3-10 hari atau sampai embrio menetas Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas d. Intra amnionik Digunakan embrio telur umur 10-11 hari. Posisi telut ditentukan dan diberi tanda dengan pencil Kulit telur di atas rongga udara didesinfeksi kemudian kulit telur dibor Menggunakan spuit 1 ml dengan jarum 22 gauge sebanyak 0,1-0,2 ml inokulum disuntikan langsung menembus selaput amnionik. Jika jarum

38

tepat masuk selaput tersebut maka akan ada gerakan embrio menyentuh ujung jarum Lubang telur ditutup dengan kutek atau lilin dan diinkubasi 37C selama 2-4 hari Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas 1 jam e. Intra venous Digunakan telur berembrio umur 10-12 hari tentukan posisi pembuluh darah di bawah batas rongga udara kulit telur didesinfektan kemudian kulit telur dibor bentuk segitiga tepatdi lokasi pembuluh darah. Hati-hati jangan sampai menembus selaput korio allantois supaya pembuluh darah jelas terlihat,kulit telur diusap dengan aseton sedikit. Menggunakan spuit 1 ml dan jarum 16 mm (25 gauge) inokulum dimasukkan melalui pembuluh darah dengan arah ke rongga udara kulit telur ditutup kembali dengan potongan kulit telur semula kemudian ditutup dengan selotip dan diinkubasi 37C selama 7 hari Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas. Memanen specimen dari telur terinfeksi: 1) Kulit telur didesinfeksi 2) Kulit telur dipotong tepat di atas batas rongga udara 3) Cairan alantois,amnionik,selaput korio alantois,selaput kuning telur dan embrio di panen
4)

Perubahan pada selaput korio alantois diamati penebalan,bercak-bercak putih,perdarahan di bawah kulit embrio dan kekerdilan.

39

PEMBUATAN KULTURE JARINGAN Kulture sel adalah memelihara suatu jenis sel tertentu dalam suatu wadah dengan media yang sesuai. Untuk mendapatkan kulture sel harus diisolasi dari jaringan donor atau organ. Agar sel yang kita peroleh berupa satu sel maka sel tersebut berasal dari satu sel yang dipelihara atau dengan memurnikan sel sebelum dipelihara. Sel primer adalah biakan sel yang baru pertama kali diisolasi dari donor,untuk mendapatkannya bisa diperoleh dari Sel Mesenchymal Sel adiphose,chondrocyt,endhotelial.fibroblast,myocyte,osteoblast,dental Sel epithelial Sell turunan sumsum tulang Sel epithelial respiratory,mucosa oral,keratnocyt,hepatocyt,kidney Sel bone marrow stromal,peripheral blood mononuclear (2: 7)

1. Pembuatan Kulture Jaringan Chicken Embrio Fibroblast (CEF) Tujuan : Mengetahui cara pembuatan kulture jaringan CEF Alat : Pinset steril Gunting steril Petri disk Safety cabinet Sentrifuge Mikroskop Beaker glass Kasa Spuit 5 ml,10 ml Tabung Sentrifuge Flash Bahan : Telur ayam berembrio 9-11 hari Media MEM 5-10 % Serum Sapi PBS AB Alkohol 70 % Trypsin 0,25 %

40

Prosedur kerja : 1) Cara Tanpa Pemanasan : a. Tangan, sarung tangan, gunting, pinset, telur disterilkan dengan alkohol 70 %. b. Telur dibuka tepat di atas rongga udara dengan menggunakan gunting, kemudian diambil di bagian leher dengan menggunakan pinset, ambil embrio (dikerjakan di ruang steril/safety kabinet) c. Masukkan embrio ayam ke dalam cawan petri, kemudian dipisahkan dengan memotong bagian kepala, sayap, kaki, dan viscera /isi perut embrio (bagian yang dipotong ini dibuang). d. Bagian tubuh embrio dicuci dengan larutan PBS AB beberapa kali (23 kali) untuk menghilangkan sel darah merah, dipindahkan ke cawan petri yang lain. e. Bagian tubuh digunting kecil-kecil, kemudian dituangi dengan larutan tripsin 0,25 %. Digoyang dan dimasukkan larutan ini ke dalam tabung sentrifuge dengan memipetnya dengan pipet steril. f. Diputar dalam sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. g. dibuang bagian yang jernih, bagian yang keruh di tambahkan lagi dengan larutan tripsin, lalu di sentrifuge kembali selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm, ulangi pengerjaan ini sampai 3 kali. h. Hasil sentrifuge yang terakhir diambil bagian yang jernihnya, kemudian dipindahkan kedalam flask. i. Ditambah larutan MEM 1-2 ml, kocok, disaring dengan kasa steril, filtrat ditambah dengan larutan MEM 5ml, kocok, ditambah serum sapi 2ml, goyang. j. Diamati dibawah mikroskop, tampak sel-sel yang terpisah merata dan transparan.

41

k. Disimpan di dalam inkubator 37C 5% CO2, dilihat pertumbuhan selnya tiap hari dengan mikroskop. 2) Dengan pemanasan : Pengerjaan seperti cara di atas (a, b, c, d, e) cairan tadi dimasukkan ke dalam flask dengan pipet steril kemudian di putar dengan magnetik stirer diatas hot plate. (jangan terlalu panas).

2. Pembuatan Kultur Jaringan (Tissue Culture) Dari Sel Hati Dan Ginjal Anak Ayam Tujuan : Mengetahui cara kulture jaringan sel hati dan ginjal anak ayam Alat : Petridisk Sentriufuge Tabung sentrifuge Beaker glass Pipet tetes Mikroskop Pinset steril Spuit Botol/flaskk Prosedur kerja Anak ayam yang sudah disembelih disemprot/disterilkan dengan alkohol 70%. Kemudian di bedah, bagian ginjal diambil dan dipindahkan ke petridisk. Dicuci dengan larutan PBS AB sebanyak 2-3 kali. Ginjal digunting kecil-kecil dalam media PBS AB tadi, kemudian ditambah larutan tripsin. Dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge, dan di putar dalam sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Bahan : Anak ayam umur 2-3 hari PBS AB MEM Serum sapi Alkohol 70% Larutan Tripsin

42

Cairan atas dibuang dan endapan diambil. Ditambah larutan tripsin, lalu diputar lagi (ulangi pengerjaan ini sebanyak 2-3 kali).

Cairan atas dibuang dan endapan dicuci dengan PBS AB. Dipindahkan ke dalam flask, ditambahkan larutan MEM sebanyak 1-2 ml, kocok, disaring dengan kasa steril, lalu ditambah larutan MEM lagi sebanyak 5 ml dan serum sapi 2ml, goyang.

Diamati di bawah mikroskop, akan tampak sel-sel transparan dan terpisah merata.

Disimpan dalam inkubator 37OC dan setiap hari dilihat perkembangan selnya di bawah mikroskop.

Cara Inokulasi sel : a. b. Setelah terbentuk satu lapis sel(monolayer) maka sel dicuci dengan PBS Sampel dimasukkan dalam media dan biarkan 30 menit untuk terjadinya absorbsi. c. Sel ditambah dengan media dan diinkubasikan 2 atau 3 hari dengan diamati sitopatologi efek (CPE) d. e. Hasil : Positif akan ditemukan negri bodies intra sitoplasma yang berwarna merah muda Pada sampel yang positif akan ditemukan Matinya sel,giant,sel,atau negri bodies

43

BAB III KESIMPULAN

1.

Pemeriksaan penunjang pada penyakit kulit akibat virus dapat dilakukan dengan banyak cara yaitu: a. b. c. d. e. f. g. h. Pemeriksaan Mikroskopis dengan pewarnaan Pemeriksaan histopatologi Pemeriksaan Mikroskop elektron Pemeriksaan imunofloresensi Pemeriksaan darah Tes antibodi Tes serologis kultur

2.

Pada pemeriksaan mikroskopis dengan pewarnaan yang dilakukan pada penyakit kulit akibat virus ialah pewarnaan Tzank. Prinsip pemeriksaan ini ialan mengambil Jaringan dari dasar vesikel, ditempatkan pada slide, dan diwarnai dengan Wright atau cat Giemsa's. Sel raksasa multinuklear adalah diagnostik dari virus herpes atau varicella.

3.

Pemeriksaan Histopatologis dilakukan melalui pemeriksaan terhadap perubahanperubahan abnormal pada tingkat jaringan. Histopatologi dapat dilakukan dengan mengambil sampel jaringan atau dengan mengamati jaringan setelah kematian terjadi. Interpretasi pada peeriksaan ini juga berbeda-beda menurut jenis virus.

4.

Mikroskopi elektron merupakan teknik pemeriksaan jaringan dengan mikroskop elektron, yang memungkinkan pembesaran yang jauh lebih besar,

memungkinkan visualisasi organel dalam sel. 5. Imunofluoresensi merupakan metode pemeriksaan menggunakan antibody yang telah terkonjugasi dengan molekul fluoresens dan dilihat di bawah mikroskop ultraviolet (UV). Metode tersebut menggunakan antibody yang berikatan kovalen dengan molekul fluoresens. Ikatan antara antibody dan molekul fluoresens tersebut berada pada bagian Fc antibody.

44

6.

Pendeteksian virus dengan imunofluoresensi umumnya menggunakan pewarnaan inti sel, yaitu DAPI counter staining. Pewarnaan tersebut akan memberikan warna biru yang kontras jika digabungkan dengan probe warna kuning, hijau atau merah.

7.

Pemeriksaan darah dilakukan untuk menyingkirkan etiologi lain dari penyakit yang sedang diderita.

8.

Tes antibodi dilakukan untuk mendeteksi keberadaan antibodi tertentu yang menyerang sel darah merah. Prinsip kerja pemeriksaan ini ialah untuk mendeteksi adanya antibody pada permukaan eritrosit dan anti-ab eritrosit dalam serum. Antibody ini menyelimuti permukaan sel eritrosit yang meyebabkan umur eritrosit menjadi lebih pendek dan sering menyebabkan reaksi inkompetibel.

9.

Kulture sel adalah memelihara suatu jenis sel tertentu dalam suatu wadah dengan media yang sesuai. Untuk mendapatkan kulture sel harus diisolasi dari jaringan donor atau organ.

10. Banyak virus yang telah dapat dibiakkan dalam biakan jaringan atau dalam telur berembrio dengan keadaan lingkungan yang dapat dikendalikan secara ketat.walaupun demikian pertumbuhan virus pada hewan percobaan masih tetap digunakan untuk isolasi primer virus tertentu dan untuk penelitian patogenitas virus dan onkogenesis virus. 11. Jadi ada tiga jenis biakan untuk virus yaitu :\ a. b. c. Hewan Percobaan Telur Berembrio. Biakan Jaringan (Tissue Culture)

45

Daftar Pustaka

Adam,M. 2000. Mikro Biologi Dasar. Jakarta : Erlangga Baratawidjaja, K. G. 2006. Imunologi Dasar. Ed ke-7. Balai Penerbit FK UI, Jakarta: xxxviii + 559 hlm. Djuanda A, Hamzah M, Aisah S, Editor. Ilmu Penyakit Kulit dan Kelamin. Edisi 5. Cetakan 2. Jakarta: Balai Penerbit FKUI, 2007. Invitrogen. 2006. DAPI nucleic acid stain. Molecular Probes, Inc, Paisley: 5 hlm. Pratama, AD. 2012. Biopsi dan Pemeriksaan Histopatologi. Diunduh dari: http://www.scribd.com/doc/104762326/Biopsi-Dan-PemeriksaanHistopatologi#download pada tanggal 3 Juli 2013 Rusdimin.2008. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Pt Gramedia Setiawan, I Made. 2007. Pemeriksaan serologis treponema untuk diagnosis sifilis. Jakarta Siregar R. Atlas Berwarna Saripati Penyakit Kulit. Edisi 2. Cetakan 1. Jakarta: EGC, 2005 Voyles, B. A. 2002. The Biology of viruses. 2nd ed. McGraw-Hill Companies, Inc., New York: xv+480 hlm.

Anda mungkin juga menyukai