ISOLASI DNA KROMOSOM I.

TUJUAN

Memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri gram negatif menggunakan Gene JETTM Genomic DNA Purification Kit.

II.

PRINSIP

Sel bakteri gram negatif dipecahkan menggunakan Proteinase K solution dan Digestion Solution atau Lysis Solution. RNA dihilangkan dengan penambahan RNAse A. Lisat dicampurkan dengan etanol, lalu dituangkan ke dalam kolom purifikasi, sehingga molekul DNA terikat pada membran silika. Kolom dicuci dengan Wash Buffer untuk membuang kontaminan. DNA kromosom dielusi dari membran silika pada kondisi kekuatan ionik yang rendah menggunakan Elution Buffer.

III.

TEORI Asam nukleat dan protein merupakan senyawa polimer utama yang terdapat pada

sel. Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan informasi genetic dalam sel (Gaffar, 2007). Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya (Fessenden, 1990). DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3 suatu mononukleotida dan posisi 5 pada mononukleotida lainnya (Harper, 1980). DNA terdiri dari molekul yang disebut nukleotida. Setiap nukleotida mengandung gugus fosfat, kelompok gula dan basa nitrogen. Empat jenis basa nitrogen adenin (A),

timin (T), guanin (G) dan sitosin (C). Urutan dasar tersebut adalah apa yang menentukan instruksi DNA, atau kode genetik. Mirip dengan cara urutan huruf dalam alfabet dapat digunakan untuk membentuk suatu kata, urutan basa nitrogen dalam urutan DNA membentuk gen, yang dalam bahasa sel, memberitahu sel bagaimana membuat protein. Tipe lain dari asam nukleat, asam ribonukleat, atau RNA, mentransmisikan informasi genetik dari DNA menjadi protein. Molekul DNA yang panjang, pada kenyataannya mereka tidak dapat masuk ke dalam sel tanpa kemasan yang tepat. Untuk muat di dalam sel, DNA melingkar erat untuk membentuk struktur yang kita sebut kromosom. Setiap kromosom mengandung molekul DNA tunggal. Manusia memiliki 23 pasang kromosom, yang ditemukan di dalam inti sel (Rettner, 2013). Plasmid merupakan molekul DNA sirkular kecil yang dapat masuk ke dalam bakteri dan bereplikasi sendiri, terpisah dari genom inang. Kebalikan dari virus, plasmid tidak bersifat menginfeksi, plasmid tidak merubah sel inang menjadi pabrik untuk memproduksi plasmid. Plasmid biasanya mengode gen yang memberikan sifat tertentu pada bakteri, misalnya gen pengode resistan antibiotik. Ahli rekayasa genetika menggunakan plasmid sebagai alat untuk mentransfer gen asing ke dalam bakteri karena sepotong DNA dengan cepat bergabung dengan DNA plasmid (Gaffar, 2007). DNA memiliki fungsi sebagai berikut; a. sebagai pembawa materi genetika dari generasi ke generasi berikutnya. b. mengontrol aktivitas hidup secara langsung maupun tidak langsung. c. melakukan sintesis protein. d. sebagai autokatalis, yaitu kemampuan DNA untuk menggandakan diri (replikasi). e. sebagai heterokatalis, yaitu kemampuan DNA untuk dapat mensintesis senyawa lain (Black, 2013). Sel prokariot seperti bakteri mengandung lebih banyak DNA dibanding virus. Misalnya saja bakteri E.Coli. Escherichia coli adalah bakteri gram negatif berbentuk batang dalam sel tunggal atau berpasangan, merupakan anggota family

Enterobacteriacea dan flora normal intestinal yang mempunyai kontribusi pada fungsi normal intestine dan nutrisi tetapi bakteri ini akan menjadi pathogen bila mencapai jaringan di luar jaringan intestinal. Spesies E.coli bersifat motil dengan flagel peritrik yang dimilikinya, tetapi beberapa ada yang nonmotil (Noviana, 2004).

Kromosom E. Coli merupakan molekul DNA sirkular rantai ganda. Disamping DNA kromosom, beberapa bakteri juga mengandung DNA ekstrakromosom yang disebut DNA plasmid. DNA plasmid juga berbentuk sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding DNA kromosom. Beberapa plasmid dapat bergabung dengan DNA kromosom dan kemudian dapat dipotong lagi dengan tepat pada peristiwa rekombinasi. DNA plasmid hanya berukuran 1.000-100.000 pasang basa. Plasmid membawa informasi genetik dan mengalami replikasi untuk menghasilkan plasmid yang identik dan diturunkan selama pembelahan sel. Beberapa plasmid tidak memberikan manfaat pada inangnya, namun beberapa plasmid yang lain membawa gen yang mengakibatkan bakteri resistan terhadap antibiotik. Sebagai contoh plasmid yang membawa gen pengkode enzim -laktamase, menyebabkan bakteri resistan terhadap antibiotik yang mengandung cincin -laktam, seperti penisilin dan amoxicillin (Gaffar, 2007). Prinsip isolasi DNA kromosom adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Albert, 1994). Isolasi DNA kromosom bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan dan pembuangan dinding sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingakt kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi (Albert, 1994).

IV.

ALAT DAN BAHAN

A. Alat 1. Beaker glass. 2. Freezer atau wadah berisi balokbalok es

3. GeneJETTM Genomic DNA Purification Column

4. Inkubator

5. Mikropipet ukuran 220 L, 10100 L, 1001000 L

6. Pembakar spiritus

7. Sarung tangan dan masker

8. Sentrifugator

9. Tabung eppendorf

10. Tabung reaksi

11. Tip mikropipet biru dan kuning.

12. Vortex

B. Bahan 1. Ampicillin 2. Aqua bidestilata steril 3. Biakan bakteri Escherichia coli 4. Etanol 50% 5. GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit: Proteinase K solution, Rnase A solution, Digestion solution, Lysis Solution, Wash Buffer I,Wash Buffer II, Elution Buffer (10mM TrisCl, pH 9 0,5 mM, EDTA), GeneJETTM Genomic DNA Purification Column, tabung kolektor 2 mL. 6. Media Lurea Bertani (LB) cair.

V.

PROSEDUR Semua alat dan bahan disiapkan meliputi tip mikropipet, mikropipet, bunsen,

eppendorf, vortex, kolom, mikrosentrifuga, waterbath, lemari pendingin, biakan bakteri Escherichia colli T 10, ddH2O, digestion solution, proteinase K, RNAse, etanol 50%, wash buffer I dan II, elution buffer. Bakteri dari media diremajakan pada media LB baru dengan cara 1 koloni bakteri dari plate biakan berumur 18-24 jam diinokulasikan dalam 5 ml media LB yang telah ditambahkan kloramfenikol 100g/ml (dilakukan oleh selain praktikan). Langkah berikutnya yaitu panensel. Suspensi bakteri dipindahkan pada eppendorf 1.5 ml dan dilakukan sentrifugasi pada 5000g selama 5 menit, pengerjaan dilakukan sampai suspensi habis disentrifugasi semuanya. Supernatan yang dihasilkan kemudian dibuang dan pelet disatukan dalam satu eppendorf dengan cara menambahkan larutan 500l ddH20 sehingga pelet mudah dipindahan. Kumpulan pelet setelah panen sel disatukan dalam satu eppendorf lalu disentrifugasi lagi pada 5000g selama 5 menit.

Supernatan yang dihasilkan kemudian dibunang. Pelet yang tersisa ditambahkan lagi 500l ddH2O lalu diresuspensi dengan cara pipeting sampai pelet tersuspensikan dalam ddH2O. Setelah homogen tambahkan 45l digestion solution lalu lakukan resuspensi ulang kemudian tambahkan 5l proteinase K setelah itu tabung tersebut divortex hingga homogen. Hasil dari perlakuan tersebut adalah suspensi sel yang telah pecah. Perlakuan selanjutnya yaitu proses ekstrasi dengan cara suspensi tersebut diinkubasi pada suhu 56oC selama 30 menit. Hasil ekstrasi kemudian ditambahkan 5l RNAse lalu dvortex hingga homogen selama 10 detik. Setela itu ditambahkan lagi 50l lisis solution dan dihomogenkan kembali dengan cara di vortex selama 15 detik. Ekstrak lalu ditambahkan etanol 50% kemudian di vortex lagi. Ekstrak dalam eppendorf lalu dituangkan kedalam kolom yang sudah terpasang dengan tabung kolektor. Kemudian kolom disentrifugasi selama 1 menit pada 6000G. Supernatan yang dihasilkandalam tabung kolektor

kemudian dibunang. Kolom dimasukan kembali ke dalam tabung kolektor yang sama. Setela itu ditambahkan 250l Wash Buffer I ke dalam kolom. Lalu disentrifugasi selama 1 menit pada 8000g. Supernatan yang dihasilkan didalam tabung kolektor dibuang, lalu kolom purifikasi ditempatkan kembali dalam tabung kolektor yang sama. Sebanyak 250l Wash buffer II (dengan penambahan etanol) ditambahkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 3 menit pada 12000g. jika larutan residu masih ada dalam kolom, maka tabung kolektor dikosongkan dan disentrifugasi kembali pada 12000g selama 1 menit. Supernatant pada tabung kolektor dibuang dan kolom dipindahkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 mL baru. Sebanyak 50l Elution Buffer ditambahkan ke dalam bagian tengah membran kolom plasmid (tip mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom) untuk mengelusi DNA kromosom. Kemudian kolom diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang, lalu disentrifugasi pada 8000g selama 1 menit dilakukan sebanyak 2 kali. Kolom purifikasi dilepaskan dari tabung eppendorf, tabung eppendorf diberi simbol 1 fraksi A, DNA murn disimpan pada suhu -20oC. Kemudian kolom dipasang ke dalam eppendorf 1,5 mL baru, lalu lakukan teknik yang sama seperti diatas, setelah selesai lepas kolom dan eppendorf diberi simbol 2 fraksi B, DNA murni disimpan pada suhu 20oC.

VI. No

DATA PENGAMATAN Hasil

Perlakuan

1.

Dibiakan bakteri E. coli top 10 dalam 5 ml LB cair steril ditambah ampicilin/kloramfenikol sebanyak 5 ml. Diinkubasi pada suhu 37 o selama 12-16 jam

Diperoleh suspensi bakteri E. coli

2.

Larutan biakan suspensi E. coli diambil masing-masing 1 ml dipindahkan pada 2 tabung eppendrof 1,5 ml. Disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm (5000 x g) selama 5 menit. Lakukan sampai larutan suspensi habis.

Diperoleh pelet dan supernatan (dibuang).

3.

Pelet ditambahkan 500 l ddH2O kepada salah satu tabung diresuspensi. Kemudian dipindahkan pada tabung eppendrof lainnya.

Pelet dan ddH2O bercampur homogen. Diperoleh 1 tabung eppendrof.

4.

Tabubng eppendrof di sentrifugasi kecepatan 6000 rpm (5000 x g) selama 5 menit

Diperoleh pelet dan supernatan ( dibuang).

5.

Ditambahkan 45 l digest solution, kemudian dipipeting, ditambah 5 l proteinase K, di vortex

Larutan tercampur homogen. Suspensi sel yang pecah

6.

Dipanaskan diatas penangas air 56 0 C selama 30 menit.

diperoleh Ekstrak sel , suspensi menjadi panas Ekstrak sel

7.

Ditambahkan 5 l RNAse A, divortex, disimpan pada suhu ruangan

8. 9.

Ditambahkan 50 l lisis solution, divorteks Ditambahkan 100 l etanol 50 % dan di vortex

Suspensi menjadi homogen Suspensi menjadi homogen

10. Dipindahkan pada GeneJETTM Genomic DNA Purification Column dalam tabung kolektor. Disentrifugasi pada 6000 g selama

Supernatan dalam tabung kolektor dibuang.

1 menit. 11. Ditambahkan 250 l wash buffer I ke dalam kolom. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 g dalam 1 menit. 12. Ditambahkan 250 l wash buffer II ke dalam Supernatan dalam tabung kolektor kolom. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1200 g dalam 3 menit. 13. Kolom dipindahkan pada tabung eppendorf baru. 14. Ditambahkan 50 l elution buffer, diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit . kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 g selama 1 menit dilakukan dua kali sentrifugasi. Kolom dilepas, supernatan pada tabung eppendorf diambil dan disimpan pada suhu -200 C. dibuang. Supernatan dalam tabung kolektor dibuang.

VII.

PEMBAHASAN Praktikum kali ini adalah isolasi DNA Kromosom. Tujuannya adalah untuk

memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri Gram negatif menggunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Pada prinsipnya bakteri gram negatif dipecahkan menggunakan Proteinase K dan Digestion Solution atau Lysis Solution. RNA dihilangkan dengan penambahan RNase A. Lisat dicampurkan dengan etanol, lalu dituangkan ke dalam kolom purifikasi, sehingga molekul DNA terikat pada membran silika. Kolom dicuci dengan Wash Buffer untuk membuang kontaminan. DNA kromosom dielusi dari membran silika pada kondisi kekuatan ionik rendah menggunakan Elution Buffer. Ada lima tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu : isolasi sel, pelisisan dinding sel dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan. Pada praktikum kali ini sudah disediakan Escherichia coli top 10 yang diambil dari pelet

biakan berumur 18-24 jam, lalu diinokulasikan ke dalam medium LB (Lurea Bertani) yang telah ditambahkan antibiotik kloramfenikol 100 g/ml. Biakan di inkubasi selama 12-16 jam pada suhu 37oC dengan pengocokan 200-250 rpm. Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung Eppendrof 1,5 ml. Tabung Eppendrof adalah mikrotabung sentrifuga yang berfungsi untuk sentrifugasi sampel dalam ukuran mikroliter. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm (5000 x g) selama 5 menit. Sentrifugasi adalah suatu teknik atau metode pemisahan melalui proses pengendapan dengan memberikan gaya sentrifuga atau kecepatan sentrifuga pada partikel-partikelnya. Campuran heterogen yang terdapat dalam sampel dengan berat jenis berdekatan akan sangat sulit untuk dipisahkan sehingga dilakuakn metode sentrifugasi untuk memisahkan bakteri dari media dan pengotornya, atau disebut panen sel. Membiarkan senyawa tersebut terendapkan karena adanya gravitasi yang berjalan sangat lambat. Setelah dilakukan sentrifugasi selama 5 menit, supernatannya dibuang. Supernatan adalah bagian dari cairan yang berada diatas fase endapan, biasanya berisi pengotor dan dibuang karena yang dibutuhkan adalah bakteri yang mengendap pada dasar tabung Eppendorf. Langkah diatas dilakukan sampai biakan bakteri yang berada dalam tabung habis sehingga didapat endapan atau pelet sel bakteri dari semua biakan. Kemudian pelet bakteri ditambahkan 1,0 ml aquabidest. Aquabidest adalah air yang telah melaui proses destilasi sebanyak dua kali sehingga steril. Aquabidest ini ditambahkan untuk pencucian. Setelah aquabidest dimasukkan, dilakukan pipeting dengan menggunakan mikropipet, dengan cara dipipet dan dibuang pada tabung tersebut sehingga aquabidest dengan pelet menjadi suspensi. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm (5000 x g) agar pelet kembali terbentuk. Kemudian supernatannya dibuang. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak dua kali. Setelah selesai dengan pencucian, pelet ditambahkan 45 l Digest Solution. Kemudian dilakuakn pipeting sehingga digest solution mengenai smeua pelet sel dan sel akan lisis. Digest Solution adalah larutan yang berfungsi untuk melisis sel sehingga komponen-komponennya akan lisis. Digest solution ini bersifat merusak dinding dan membran sel bakteri dan menghasilkan komponen-komponen sel, seperti DNA, RNA, protein dan lain-lain. Kemudian untuk menghilangkan protein dari hasil lisis sel

ditambahkan Proteinase. Proteinase merupakan enzim yang mendenaturasi protein atau bersifat merusak protein dengan cara mengubah proteosa, pepton dan polipeptida menjadi asam amino. Setelah dimasukan proteinase, dugunakan alat vortex yang berfungsi untuk menggetarkan bagian bawah tabung eppendorf sehingga pelet yang menempel dan tidak terangkat pada proses pipeting akan terangkat dan bergabung menjadi suspensi. Vortex digunakan hanya beberapa detik karena getarannya sudah cukup mencampurkan pelet menjadi suspensi sel yang pecah. Suspensi sel yang pecah diinkubasi pada suhu 56oC selama 30 menit untuk mendapat ekstrak sel. Setelah itu, suspensi sel yang telah pecah di inkubasi pada suhu 56o C selama 30 menit untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh suhu. Kemudian, ekstrak sel yang diperoleh ditambahkan 5 l RNase A untuk menghancurkan RNA sehingga yang tertinggal dalam ekstrak hanya DNA dan hasil yang diisolasi berupa DNA murni. Lalu, ekstrak tersebut dikocok menggunakan vortex agar larutannya homogen. Selanjutnya, campuran tersebut diisolasi selama 10 menit pada suhu ruangan untuk menginaktivasi enzim yang mendegradasi DNA (DNAase). Kemudian 50 l Lysis Solution ditambahkan ke dalam campuran untuk melisis dinding dan membran sel bakteri. Lalu, campuran ini dihomogenkan dengan pengocokan menggunakan vortex selama 15 detik. Ekstrak tersebut kemudian ditambahkan dengan 100 l etanol 50 % untuk membantu presipitasi DNA karena adanya perbedaan polaritas. Lalu, laurtan dihomogenkan lagi dengan vortex. Kemudian larutan dipipet ke kolom dalam tabung kolektor dengan menggunakan mikropipet. Pemipetan ini dilakukan tegak lurus dan hati-hati agar tidak meusak kolom. Lalu kolom disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 6.000 x g. Hal ini bertujuan untuk memisahkan kontaminan yang mungkin masih terdapat pada supernatan. Kemudian supernatan dalam tabung kolektor dibuang. Dan kolom dimasukkan kembali ke dalam tabung kolektor yang sama. Kemudian sebanyak 250 l Wash buffer I dimasukkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 9400 rpm ( 8000 x g ) . Teknologi Wash Buffer adalah sebuah formulasi optimal buffer dan garam yang memaksimalkan penyerapan antibodi dan antigen ke piring plastik. Selama proses adsorpsi, kinerjanya untuk menstabilkan protein yang terlapisi, memungkinkan untuk mengikat reaktivitas yang lebih besar dengan molekul deteksi, sehingga meningkatkan sinyal tertentu. Dengan menghasilkan sinyal tertentu yang lebih tinggi, konsentrasi yang lebih rendah dari protein mantel mungkin diperlukan ketika buffer ini digunakan, sehingga menghemat

reagen. Tujuan dari sentrifugasi ini adalah untuk mendapatkan pellet yang akan mengendap di dasar kolom. pada saat kontak langsung dengan wash buffer , diharapkan berhati hati , karena zat ini dapat menimbulkan iritasi terhadap kulit. Setelah itu, supernatan dalam tabung kolektor dibuang. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jerbih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisinya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh. Lalu, kolom purifikasi ditempatkan kembali dalam tabung kolektor yang sama. Langkah selanjutnya adalah sebanyak 250 L Wash Buffer II (dengan penambahan etanol) ditambahkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 14.000 rpm (12.000 x g). Supernatan pada tabung kolektor dibuang dan kolom dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 mL baru. Tabung Eppendorf ini berguna untuk mengisolasi DNA kromosom yang dilakukan. Kemudian sebanyak 250 L Elution Buffer ditambahkan ke bagian tengah membran kolom plasmid untuk mengelusi DNA kromosom, tip mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom karena akan menimbulkan kontaminasi. Kolom diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang, lalu disentrifugasi pada kecepatan 9.400 rpm (8000 x g) selama 1 menit, tahap ini dilakukan 2 kali agar mendapatkan kemurnian yang baik. Kolom purifikasi dilepaskan dari tabung Eppendorf. DNA murni disimpan pada suhu 20 C.

VIII. KESIMPULAN Telah dipahami prinsip isolasi DNA kromosom dan telah dilakukan metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri gram negatif menggunakan Gene JETTM Genomic DNA Purification Kit.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, Brush. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Jakarta: Gramedia. Black, Rahmatdi. 2013. Fungsi serta Peranan DNA. Tersedia di http://www.csbioinformatika.us/2013/07/fungsi-serta-peranan-dna.html [Diakses tanggal 25 September 2013]. Fessenden, Ralph J. 1990. Kimia Organik Jilid I. Jakarta: Erlangga. Gaffar, Shabarin. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: Universitas Padjadjaran. Harper, et al. 1980. Biokimia Review of Physiological Chemistry Edisi 17. Jakarta: EGC. Noviana, Hera. 2004. Pola Kepekaan Antibiotik E.Coli yang diisolasi dari Berbaga Spesimen Klinis. Tersedia di http://www.univmed.org/wpcontent/uploads/2011/02/Hera.pdf [Diakses taggal 25 September 2013]. Rettner, Rachael. 2013. DNA: Definition, Structure and Discovery. Available online at http://www.livescience.com/37247-dna.html [Diakses tanggal 25 September 2013].