FACULTAD DE OCEANOGRAFA, PESQUERA, CIENCIAS ALIMENTARIAS Y ACUICULTURA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA ALIMENTARIA

ASIGNATURA: TEMA: DOCENTE: AO: ALUMNO:

MICROBIOLOGA GENERAL Y DE ALIMENTOS DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES. DRA. MARA TERESA FLORES CRDOVA TERCERO B

SOTO ZAMORA, Jean Carlos

MIRAFLORES 15 DE AGOSTO DEL 2013

I.

OBJETIVOS Evaluar la calidad sanitaria en alimentos mediante la bsqueda de microrganismos coliformes totales. Aprender el mtodo de recuento del nmero ms probable (NMP). Determinar si la muestra analizada es apta para el consumo humano. MARCO TERICO Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecaloral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extra intestinalmente. La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos. Coliforme significa con forma de coli, refirindose a la bacteria principal del grupo. El grupo contempla a todas las bacterias entricas que se caracterizan por tener las siguientes propiedades bioqumicas: 1. ser aerobias o anaerobias facultativas, 2. ser bacilos Gram negativos, 3. no ser esporgenas, 4. fermentar la lactosa a 37 C en 48 horas, produciendo cido lctico y gas. Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminacin fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano en razn de que, en los medios acuticos, los coliformes son ms resistentes que las bacterias patgenas intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriolgicamente segura. Asimismo, su nmero en el agua es proporcional al grado de contaminacin fecal; mientras ms coliformes se aslan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces. Coliformes fecales Los coliformes fecales son microorganismos con una estructura parecida a la de una bacteria comn que se llama Escherichia coli y se transmiten por medio de los excrementos. La Escherichia es una bacteria que se encuentra normalmente en el intestino del hombre y en el de otros animales. Hay diversos tipos de Escherichia; algunos no causan dao en condiciones normales y otros pueden

II.

incluso ocasionar la muerte. Formas patgenas de Escherichia y de otras bacterias (que por tener forma similar se denominan genricamente coliformes fecales) se transmiten, entre otras vas, a travs de las excretas y comnmente por la ingestin o el contacto con agua contaminada. Mtodo del nmero ms probable
El mtodo se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos especficos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una nica clula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El mtodo requiere la realizacin de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o ms clulas microbianas procedentes de la muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna clula permanecern transparentes. Al aumentar el factor de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrn tan slo un microorganismo y otros tubos no contendrn ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna clula, se puede estimar el nmero ms probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadstica. La precisin del mtodo del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que se usan; cinco tubos por dilucin se consideran como una relacin adecuada entre precisin y economa. Una condicin del mtodo es la necesidad de poder reconocer un atributo especfico de la poblacin en el medio de crecimiento que se emplee. La estimacin de la densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en sucesivas diluciones en serie y el empleo del clculo probabilstico. Hay muchas entidades discretas que son fciles de detectar pero difciles de contar. Una aplicacin es el de cualquier clase de reaccin de amplificacin o reaccin de catlisis que impide una cuantificacin fcil, pero permite que su presencia sea detectada de modo muy sensible. Algunos ejemplos comunes son: crecimiento de microorganismos, accin enzimtica, o catlisis qumica. El mtodo del NMP supone tomar la disolucin original o muestra y subdividirla en un factor (frecuentemente 10 veces, o 2 veces) y evaluar la presencia/ausencia en mltiples subdivisiones. El grado de dilucin para el cual comienza a aparecer la ausencia indica que los elementos se han diluido tanto que hay muchas sub muestras en las que no aparece. Un juego de repeticiones para cualquier concentracin dada permite una resolucin ms fina, para usar el nmero de muestras positivas y negativas que estiman la concentracin original dentro del apropiado orden de magnitud.

III.

PARTE EXPERIMENTAL Materiales ,equipos y reactivos Pipetas Tubos de prueba Gradilla Mechero Bunsen Pinza Tijera Estufa Solucin salina peptonada (ssp). Medio verde brillante. Muestra: tomate. Procedimiento Tomar el vaso vaco y pesar 50 g. de alimento en un vaso de licuadora estril y vaco. Aadir 450 ml de la solucin salina peptonoda (ssp) para obtener la disolucin 101 . Homogeneizar el alimento triturndolo por 3 minutos. Dejar reposar el tiempo necesario para que el sobrenadante sea el volumen adecuado. Depositar el sobrenadante en el matraz. Medir 1 ml del lquido sobrenadante y llevarlo a un tubo con 9 ml de ssp, para la obtencin de la dilucin 10-2. Homogenizar la dilucin de 10-2 absorbiendo y dejando caer repetidas veces, utilizando una nueva y estril pipeta. Medir nuevamente 1 ml de la dilucin anterior y llevarlo a un tubo con 9 ml de ssp, para obtener la disolucin 10-3. Sembrar 1 ml de cada una de las diluciones del homogenizado a tres tubos por dilucin en el medio brila, conteniendo en su interior tubos de fermentacin. Incubar os tubos a 37 C por 24 horas 48 horas. Realizar la lectura de cada tubo, y determinar en la tabla del NMP la cantidad de coliformes totales por gramo. A partir de los tubos que resultaron positivos (formacin de gas) sembrar en caldo brila y en paralelo sembrar en tubos en caldo triptona para determinar la formacin de indol e incubar a 44,5 C por un periodo de 24 a 48 horas.

 Leer como positivos, los tubos que presenten formacin de gas y adicionar gotas del reactivo de Kovacs para la prueba del indol. Determinar la cantidad de coliformes fecales por gramo segn la tabla del NMP. De cada tubo positivo de Caldo brila, sembrar por aislamiento una asado sobre la superficie del agar EMB. Incubar las placas sembradas, en posicin invertida, a 37 C durante 24 horas. Leer las placas, considerando como colonias caractersticas de Escherichia coli, a las colonias oscuras con o sin brillo metlico. Aislar las colonias tpicas y sembrar en tubos con agar TSI. Incubar los tubos a 37 C durante 24 horas. Con los cultivos obtenidos realizar las siguientes pruebas: Indol, Citrato de Simmons. Realizar la lectura correspondiente y determinar con las pruebas de confirmacin la presencia de Escherichia coli.

IV.

RESULTADO En todas las diluciones correspondientes de la primera siembra en caldo brila no hubo formacin de gas, por lo tanto la prueba fue negativa. Lectura:
Segn la tabla de Nmero Ms Probables tenemos: Tabla N 1: Nmero Ms Probables (NMP)

Nmero de tubos positivos en cada dilucin

Dilucin 10 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
-1

Dilucin 10 0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 2 2 2 3 3 3 3

-2

Dilucin 10 01 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3

-3

NMP por gramo o mililitro <3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 70 90 150 210 200 500 1100 >2400

* Para calcular el NMP de diluciones mayores de las que figuran en la tabla, multiplicar el NMP por el factor adecuado. Ejemplo: Si los tubos seleccionados corresponden a las diluciones 10- , 10- y 10- multiplicar por 100
3 4 5

V.

CONCLUSIONES Realizando la lectura de la tabla N 1: NMP con un lmite de confianza de 95% p; que nos dio negativas en todas las diluciones nos da un valor, < 3 bacteria/g de tomate por lo tanto se concluye que la muestra presenta bajo contenido de carga microbiana. La muestra estudiada: tomate no presenta coliformes totales. FUENTES BIBLIOGRFICAS SECRETARIA DE COMERCIO Y FOMENTO INDUSTRIAL. 1987. NNX-AA-42-1987.

VI.

ENUMERACIN

BACTERIANA: EL NMERO MS PROBABLE FRANCISCO FUENTES Y ARTURO MASSOL-DEY. MANUAL DE LABORATORIO. ECOLOGA DE MICROORGANISMOS. UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO, 2002