CITOTOXICIDAD IN VITRO E IN VIVO Introduccin

Cultivo de clulas

El cultivo de clulas se considera como la adaptacin y proliferacin de clulas dispersas tomadas de un tejido original, de un cultivo primario o de lneas celulares, por mecanismos enzimticos o disgregacin qumica y que sern capaces de crecer en suspensin en un medio lquido o como una monocapa adherente sobre un sustrato. Para el mantenimiento de un cultivo celular se requiere de subcultivos (tambin llamados pases), por lo que se requiere de la dispersin por tratamiento enzimtico de clulas en un cultivo que presentan una confluencia del 100% (o monocapa) cuando crecen sobre un substrato, o un crecimiento significativo cuando estn en suspensin, requiriendo el cambio a una botella de cultivo nueva en ambos casos. Condiciones requeridas para el cultivo de clulas El crecimiento de clulas in vitro requiere lo siguiente: 1) Substrato. La naturaleza del substrato o fase sobre la cual crecen las clulas, este puede ser slido como en el crecimiento de una monocapa sobre plstico, semislido como colgena o agar y lquido como en el cultivo en suspensiones. 2) Fase gaseosa. Los constituyentes significativos de la fase gaseosa son el oxigeno y el bixido de carbono, los cultivos varan en sus requerimientos en base al tipo celular o al tipo de cultivo como pueden ser de tejidos, rganos o de clulas. 3) pH. La mayora de las clulas crecen bien a pH 7.4, aunque el pH ptimo varia relativamente entre las diferentes lneas celulares. Para realizar una valoracin subjetiva del pH mediante el color se usa comnmente el rojo de fenol como indicador, as el medio es rojo a pH 7.4, naranja a pH 7.0, amarillo a pH 6.5, ligeramente rojizo a pH 7.6 y prpura a 7.8. 4) Temperatura. La temperatura ptima del cultivo de clulas depende de: a) La temperatura del cuerpo del animal del cul se obtuvieron las clulas. b) La incorporacin de un factor de seguridad que permita minimizar los errores en la incubacin. c) La temperatura recomendada para la mayora de las clulas humanas y lneas celulares derivadas de animales de sangre caliente es de 36.5 C. 5) Medios de cultivo. Son una mezcla de sales inorgnicas y otros nutrientes capaces de ayudar a la clula a que sobreviva in vitro por 24 horas o ms, uno de los medios ms sencillo es el medio mnimo esencial (MEM) el cual contiene aminocidos esenciales,

vitaminas y sales, otros medios se diferencian por contener adems de aminocidos y vitaminas, complementos como metabolitos extras (por ejemplo nucleosidos) y minerales.
Ensayos in vitro

Las nuevas drogas, cosmticos, aditivos de alimentos y muchos compuestos ms deben ser probados antes de ser liberados al pblico. Estas pruebas usualmente involucran un gran nmero de animales de experimentacin as que actualmente existe presin para llevar a cabo gran parte de los ensayos de citotoxicidad en cultivos de clulas animales. As la introduccin de lneas celulares especializadas y el cultivo de rganos han sido una proposicin razonable. La toxicidad es un evento complejo in vivo, donde hay dao directo a las clulas como la citotoxicidad provocada por las drogas anticancerosas, efectos fisiolgicos como transporte de membrana en el rin o neurotoxicidad en el cerebro, efectos inflamatorios tanto en el sitio de aplicacin y otros sitios, y otros efectos sistemticos. Es difcil monitorear los efectos sistemticos y fisiolgicos in vivo, sin embargo existen muchos ensayos in vitro para determinar efectos a nivel celular o de citotoxicidad. La definicin de citotoxicidad vara segn la naturaleza del estudio y si las clulas estn muertas o simplemente tienen su metabolismo alterado. Mientras un agente anticanceroso puede ser requerido para matar clulas, demostrar la falta de toxicidad de otros compuestos farmacuticos puede requerir un anlisis ms sutil de cambios en metabolismos menores o una alteracin entre clula y clula lo que puede llevar a una reaccin inflamatoria o respuesta alrgica. Todos estos ensayos son sumamente simples, baratos fciles de cuantificar y reproducibles.
Citotoxicidad celular

La citotoxicidad celular se define como una alteracin de las funciones celulares bsicas que conlleva a que se produzca un dao que pueda ser detectado. A partir de aqu, diferentes autores han desarrollado bateras de pruebas in vitro para predecir los efectos txicos de las drogas y los compuestos qumicos, utilizando como modelos experimentales cultivos primarios y rganos aislados como lneas celulares establecidas. Dentro de los ensayos ms conocidos y ya validados se encuentran el ensayo de captacin del rojo neutro, enlazamiento al azul de kenacid y por ltimo el ensayo de reduccin del Bromuro de 3 (4,5, dimetiazol 2 il) 2,5 bromo difeniltetrazolio (MTT) a formazan.

 Bibliografa:
Enrich M., Sharova L. 2000. Assessment of cell toxicity. En: Current Protocols in Toxicology. Costa L. (ed). John Wiley & Sons, Inc. USA. http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum
=HTB-22&Template=cellBiology

http://es.wikipedia.org/wiki/Azul_de_tripano http://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay http://www.biotek.es/es/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html