Diario de Composicin y Anlisis de Alimentos

Determinacin de hidrocarburos aromticos poli cclicos en el agua productos por HPLC-fluorescencia.

Hong Zhang *, Ming Xue, Zhiyuan Dai

Facultad de Ciencias de la Alimentacin e Ingeniera Biotecnologa, Universidad de Zhejiang Gongshang, No. 149, Jiaogong Road, Hangzhou 310035, China Informacin del artculo Historia del artculo: Recibido el 08 de abril 2009 Recibido en forma revisada 14 de septiembre 2009 Aceptado 31 de diciembre 2009 Palabras Claves Hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) productos acuticos anlisis de residuos seguridad de los alimentos contaminacin anlisis de alimentos composicin de los alimentos deteccin de fluorescencia Mtodo de determinacin Resumen En este trabajo se analizaron 12 hidrocarburos aromticos poli cclicos (PAHs), benzopireno, benzo[b]fluoranteno, benzo[k] fluoranteno, dibenzo[a,h]antraceno, benzo [g,h,i] perileno, fluoranteno, antraceno, benzo [a] antraceno, criseno, fluoreno, fenantreno y pireno, en los productos acuticos mediante el uso de un fluorimtrico de deteccin de RP-HPLC . El procedimiento de tratamiento preliminar se bas en extraccin asistida por microondas y la purificacin en fase slida de Al2O3 neutro, y un aislamiento selectivo de HAP a partir de muestras acuticas. Las fracciones aisladas de HAP se determinaron por HPLC con deteccin de fluorescencia. Los resultados de las pruebas sugieren que los lmites de deteccin para los HAP eran de 0,0048 ng / ml a 0,075 ng / ml sobre la base de una relacin de seal-a-ruido de 03:01. Las recuperaciones fueron desde 85.26 mas o menos 5,12% a 104.63 mas o menos 0,95%. Este mtodo propuesto se aplic con xito a 35 muestras acuticas, en que se detectaron niveles variables de resumir los HAP, que van desde 0,0 hasta 57,76 mg / kg.

Introduccion Hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) son compuestos qumicos que consisten en dos o ms anillos aromticos condensados. Actualmente, se han encontrado ms de 200 tipos de HAP, algunos de que son altamente cancergenos. Contaminacin por HAP de los resultados los alimentos no slo de los procesos de coccin, como el tabaquismo, asar, hornear y frer, sino tambin desde el aire a travs de los depsitos, del suelo, de la transformacin del agua, de la deposicin y la transferencia (Fany Peng, 2000; Tfouni y Toledo, 2007). Cuando se ingiere, PAHs pueden ser absorbido por el tracto gastrointestinal y distribuido en todo el cuerpo, resultando en una lesin aguda o crnica (Zhang et al, 2006;. Aguinaga et al, 2007).. Los ensayos con animales han demostrado que la ingesta a largo plazo de los HAPs pueden causar cncer y vulo inmaduros muertos (Benedetti et al., 2007). Dada la toxicidad conocida de HAP, ha habido numerosos estudios para determinar los residuos de PAHs. Sin embargo, los temas de anlisis y seguimiento de los HAP se han centrado en BaP, algunos HAP seleccionados o todos los 16 PAHs destacados por los EE.UU, en la Agencia de Proteccin Ambiental (EPA). La mayora de estas investigaciones empiricas se basan en alimentos ahumados en lugar de productos acuticos. El anlisis de residuos de HAP se ha logrado por muchos mtodos diferentes, tales como HPLC, cromatografa de gases, electroforesis capilar, y tcnicas acopladas (Wei y Jen, 2007; Garca-Falcon et al, 2004;. Tfouni et al, 2007;. Crimmins y Baker, 2006; Vives y Grimalt, 2002; Itoh et al, 2006).. El propsito de este trabajo fue determinar 12 HAP en los productos acuticos a la vez, por HPLC con deteccin por fluorescencia (HPLC-FLD). El procedimiento de tratamiento preliminar se concentra principalmente en la optimizacin de la extraccin asistida por microondas (MAE) y purificacin en fase slida. Adems hemos investigado sistemticamente la aplicabilidad del procedimiento de tratamiento preliminar desarrollado acoplado a HPLC-FLD a los productos acuticos.

2. Materiales y Mtodos
2.1. Materiales y reactivos: Normas: 12 PAHs se utilizaron para el estudio: benzo [a] pireno (BaP) (99,6%), el benzo [b] fluoranteno (BBF) (99,5%), benzo [k] fluoranteno (BKF) (99,4%), dibenzo (a, h) antraceno (D [a, h] A) (99,6%), benzo [g, h, i] perileno (B [g, h, i] P) (99,5%), fluoranteno (FLT) (99,6%), antraceno (ANT) (99,5%), el benzo [a] antraceno (BAA) (99,5%), criseno (CHR) (99,5%), fluoreno (FLR) (99,5%), fenantreno (PHE) (99,5%) y pireno (PYR) (99,5%) fueron adquiridos de la Metrologa Qumica y Divisin, Instituto Nacional de Metrologa (Beijing, China). Mezclas estndar (de 500 ng / ml, 250 ng / ml, 100 ng / ml,

50 ng / ml y 5 ng / ml en acetonitrilo) se prepararon partir de soluciones madre estndar (cada uno con una concentracin de 1 mg / ml en metanol). Todas las soluciones patrn de trabajo estaban recin preparado antes de su uso. Grado HPLC disolventes orgnicos metanol y acetonitrilo (Merck, Darmstadt, Alemania), y el agua de un agua simplificada. Se utiliz el sistema de purificacin (Millipore, Viena, Austria). tolueno, acetonitrilo, dicloruro de metileno, ciclohexano y acetato de absoluto de alcohol (grado analtico-reactivo) se adquirieron de QZJH (Zhejiang, China). Las columnas de extraccin de slidos llenos de neutro Al2O3 (Waters, 500 mg, 3 ml) se adquirieron de SPJG Dalian,China). 2.2 Aparatos El anlisis por HPLC de los HAP se realiz usando un Agilent 1100 cromatgrafo de lquidos (Amrica) equipada con una fluorescencia detector (Agilent 1046A, Amrica) y un bucle de inyeccin de 20 ml. El Sistema de extraccin de microondas utilizada fue CEM-MARS (2450 MHz, Amrica). El sistema analtico incluye un Hanban Ciencia y Tecnologa de la columna C18 (5 mm de tamao de partcula de 4,6 mm mas o menos 260 mm ID) y una mezcla de acetonitrilo y agua como fase mvil. Las separaciones se realizaron a 30 8C bajo condiciones de gradiente (velocidad de flujo: 0,8 ml / min, acetonitrilo 0-12 min 85-95%; 12 - 26 min acetonitrilo 95%). Se realiz la deteccin fluorescente aplicando la siguiente excitacin (Ex) y emisin (Em) programa de longitud de onda: 210/310 nm de 5,6-6,3 min (determinacin de FLR), 7,5-7,8 min (PHE), 8,1-8,5 min (ANT), 248/382 nm de 9,0-9,5 min (PYR), 9,7 a 10,2 min (FLT), 268/382 nm 10,5-11,2 min (BAA), 12 a 12,8 min (CHR), 286/410 nm 15,3-15,8 min (BBF), de 15,9 a 16,2 min (BKF), 17,5-18,1 min (BaP), 18,2-18,7 min (D [a, h] A), 21,622,6 min (B [g, h, i] P) (Fig. 1). Evaluacin cualitativa anlisis de HAP se compar con los tiempos de retencin para norma HAP con componentes adecuados, los cuales fueron identificados en las muestras acuticas enriquesidas y no enriquecida bajo las mismas condiciones. La determinacin cuantitativa se realiz mediante el uso de un mtodo de la curva de calibracin externa y la medicin del rea del pico. 2.3 Muestras de alimentos Los experimentos utilizan productos acuticos frescos. Los anlisis de muestras, incluyen peces de agua dulce (8 especies), peces de agua salada (8 especies), las algas (4 especies), mariscos (7 especies), camarn (4 especies) y cangrejos (4 especies), fueron adquiridos a nivel local en un mercado. Las muestras fueron deshuesadas antes de la preparacin. 2.4 Preparacin de la muestra. Una muestra de 2,0 g se pes en un tubo de centrfuga y luego Se aadi agua (09:01, v / v): 10 ml de 0,4 moles / L de KOH-etanol. La mezcla se calent en bao de agua durante 60 8C y se agit continuamente. La solucin se transfiri a la extraccin por

microondas en tanques. El tubo de centrfugado se limpio dos veces, utilizando 5 ml de ciclo hexano. El tanque se calent durante 10 min a 100 8C (con potencia de microondas a 230 kW), despus se enfri hasta 30 8C. La solucin se transfiri a tubos de vidrio de 30 mL. Despus de dejar en reposo, el lquido sobrante se transfiri a tubos de vidrio de 10 mL. Este mtodo se denomina hidrlisis-MAE. El lquido sobrenadante se evapor hasta sequedad con N2 a 45 8C, y se volvi a disolver con 3 ml de agua / metanol (90:10, v / v). A continuacin, la mezcla se carg en la columna SPE el neutro Al2O3,que haba sido pre acondicionado previamente con 4 ml de metanol y 3 ml de agua Milli-Q, sucesivamente. La columna se enjuag con 3 ml de agua / metanol (80:20, v / v) con el fin de quitar el alto grado de impurezas polares. Los cartuchos se secaron durante 15 min bajo de vaco, y los compuestos retenidos eluyeron usando 4 ml deciclohexano. Este volumen se evapor hasta sequedad bajo una corriente de nitrgeno (45 8C), y se volvi a disolver en 1 ml de metanol. El extracto se filtra utilizando un filtros de PTFE ,45 mm antes de la HPLC anlisis.

3. Resultados y Discusin
3.1 Optimizacin de la eficiencia de la extraccin microondas. Los procedimientos de extraccin lquido-lquido, la hidrlisis se compararon por extraccin ultrasnica y la hidrlisis-MAE. La figura 2 muestra las concentraciones de 12 HAP en la misma muestra, obtenido por tres procedimientos de extraccin diferentes. Es claro que la eficacia de la extraccin de hidrlisis-MAE es ms alto que el de los otros dos mtodos, lo cual es debido a principalmente las caractersticas de extraccin por microondas. Por un lado como la muestra de microondas se calienta simultneamente por iones la migracin y la rotacin dipolar - el calor se transfiere selectivamente a los diferentes componentes de la matriz del alimento. Por otra parte, las microondas solicitaran la generacin de molculas de energa de la colisin y la accin qumica rpida, pero no destruyen la estructura molecular (Xie y Chen, 2006). Debido a lo anterior, los analitos se extrajeron a partir de muestras de manera eficiente por las hidrlisis-MAE (n = 3), proporcionando as la mayor eficacia de la extraccin y las recuperaciones ms satisfactorios (96,17 mas o menos 1,73% a 102,37mas o menos 4,59%).

Para determinar la potencia de microondas (100, 150, 200, 230, 250 y 300 kW) necesarias para la eficiencia ptima de extraccin por MAE, muestras enriquecidas con los 12 analitos en un mg / kg el nivel 20, se sometido al mtodo de hidrlisis-MAE (n = 3). El resultado mostro que las muestras con potencia de microondas entre 200 kW (RSD%: 3,73%) y 250 kW (RSD%: 1,98%) resultaron en alta similares, la recuperacin de ms de 90,02%. Por otra parte, el mximo de recuperaciones se lograron a 230 kW (RSD%: 3,81%). Por consiguiente, Se recomienda la irradiacin de microondas a 230 kW potencia suministrada para ayudar a la toma de muestras a la hidrlisis MAE.

3.2 Optimizacin de la purificacin de SPE Al analizar los productos acuticos, es altamente deseable generar extractos limpios con el fin de disminuir las interferencias y aumentar la sensibilidad. Neutro Al2O3 es un tipo fuertemente polar adsorbente, que se une al electron de algunos compuestos, tales como compuestos aromticos y alifticos de aminas (Chen et al, 2004; Hu. et al., 2004). Por lo tanto, Al2O3 neutral en columnas SPE se utilizaron para determinar 12

PAHs en muestras. Esta limpieza protocolar desarrollada para ser simple, rpida y eficiente, y para cumplir con varios requisitos, tales como la capacidad para estudiar un gran nmero de muestras simultneamente, y proporcionar una buena sensibilidad y selectividad. Debido a la polaridad del analito de gran alcance, la elucin ptima del sistema de disolvente tuvo que incorporar una serie de disolventes para eluir todos los analitos eficazmente. As que se cargo 1 ml de una norma mixta, solucin que contiene los 12 analitos a nivel 20 ng / mL en cada respectivo cartucho, y se eluy usando diferente disolvente de elucin de los sistemas de (metanol, ciclohexano, cloruro de metileno, n-hexano, acetonitrilo).Las Recuperaciones de ciclohexano (96,44 mas o menos 6,82% a 105,18 mas o menos 0,14%) fueron superiores a los otros 4 disolventes para todos los analitos (n = 3). Las muestras cargadas con diferentes concentraciones (2, 5, 10 mg / kg) se utilizaron para probar la validez del protocolo SPE desarrollado. Las significativas recuperaciones obtenidas por MAE-neutral Al2O3 extraccin vari desde 85.26mas o menos 5,12% a 104.63mas o menos 0,95%, con una reproducibilidad satisfactoria, ninguna interferencia y el ruido de fondo correcto (n = 3) (Tabla 1).

3.3 La validacin del mtodo.

El mtodo fue validado en casa, utilizando los siguientes criterios de desempeo: Rango de linealidad y lineales lmites de deteccin y cuantificacin, precisin intra-da y entre das. Las soluciones para la calibracin y la fortificacin se prepararon en metanol y se almacenaron a mas o menos -4C. Linealidad, deteccin y cuantificacin de lmites se establecen a travs de las curvas analticas obtenidas por anlisis quintuplicado de HAP en cinco niveles de concentracin (0,25, 2,5, 10, 50 y 100 mg / kg) (Tabla 2). La precisin es una medida de qu tan cerca estn los resultados entre s, y se evala haciendo mediciones repetitivas de la totalidad del mtodo. La excelente precisin intra-da del mtodo fue expresada como la desviacin estndar relativa del rea del pico, mediciones, y evaluado a travs de los resultados que eran obtenido en un solo da, el uso de tres diferentes niveles de enriquecimiento (RSD: 1,26 a 6,95%, n = 7) en las mismas condiciones. La precisin inter-da se determin en los mismos niveles de concentracin (RSD: 0,40 a 4,82%, n = 7).

3.4 El anlisis de PAHs en muestras acuticas Las determinaciones analticas se llevaron a cabo por triplicado para cada muestra. El mtodo analtico completamente optimizado y validado se aplic ms tarde para estudiar los niveles de BaP, BBF, BKF, D [a, h] a, B [g, h, i] P, FLT, ANT, BAA, CHR, FLR, PHE y PYR en 35 muestras acuaticas (Tabla 3). Se observ que todas las muestras examinadas contenian HAP. El PAH ms representado fue FLR, PHE y ANT, detectada en ms de 50% de las muestras analizadas. Las concentraciones ms altas registradas para FLR, PHE y ANT fueron 57.76, 16,14 y 17,68 mg / kg, respectivamente. Mientras tanto, las concentraciones de casi todos los otros HAP fueron inferiores a 5,00 mg / kg. Los niveles de los 12 PAHs examinados en los productos acuticos estaban debajo de los lmites de migracin especfica impuestas por la Comisin Europea (CE 208/2005), lo que indica que todos los productos acuticos y objetos de ensayo eran seguros para el consumo. Los resultados mostraron la presencia de 12 HAP en los productos acuticos. Hubo diferencias notables entre los seis tipos de productos acuaticos (Fig. 3). Se detectaron niveles variables de los 12 PAHs en las muestras analizadas, que van desde 0 hasta 57,76 mg / kg. El transporte de los HAP en el aire se ve influida por su volatilidad, mientras que la reactividad qumica de los HAP puede afectar a la adsorcin de material orgnico o la degradacin en el medio ambiente. Todos estos factores podran contribuir a la persistencia y acumulacin de PAHs en la cadena alimentaria (Loutfy et al., 2007). Las concentraciones medias de algas, celentreos y los mariscos eran en su mayora inferiores a 7,00 mg / kg, mientras que algunas concentraciones ms altas de PAHs tambin fueron detectadas. Las concentraciones de PAHs en peces, gambas y cangrejos eran notablemente ms altos que en las otras muestras. Las cifras son especialmente altas en los peces de agua dulce y cangrejos, donde el contenido de algunos HAP superan los 30,00 mg / kg. Estos resultados fueron en general ms bajos que los encontrados para BAA, BBF, BaP y D [a, h] (Pensado et al., 2005), mientras que es similar a los obtenidos en los estudios anteriores sobre la carne ahumada (despus de 15 das de fumar) (Beefjamn, jamn, tocino sin piel) (Djinovic et al., 2008) y pescado ahumado (Stolyhwo y Sikorski, 2005). La exposicin a todos los compuestos aromticos polinucleares puede ser an mayor, ya que el BaPconstituye slo un 0,5-5% de la cantidad total de HAP en los alimentos y muestras.

4. Conclusiones.
En este trabajo se ha explorado un mtodo para la administracin simultnea y determinacin de BaP, BBF, BKF, D [a, h] A, B [g, h, i] P, FLT, ANT, BAA, CHR, FLR, PHE y PYR. Todo el proceso optimizado para la extraccin y separacin de los diversos hidrocarburos aromticos policclicos analitos esto fue verificado mediante la realizacin de experimentos de adicin de muestras, mostrando bajos lmites de deteccin, buenas recuperaciones y reproducibilidad. Ms importante an, el mtodo es un xito aplicado a diversos productos acuticos, que es vital para el examen de contaminantes de los alimentos indeseables en matrices alimentarias complejas. Cuantitativo los resultados indicaron que se detectaron 12 PAH en la variedad de

productos acuticos, pero sus niveles estaban por debajo de lo especfico en los lmites de migracin impuestas por la Comisin Europea. Agradecimientos Este trabajo ha sido apoyado financieramente por el 2007AA091803 Proyecto del Programa Nacional de I + D de alta tecnologa (Programa 863). Los autores desean agradecer a Wu Xuemei por su amable ayuda y debates cientficos tiles.