Procesamiento de las muestras 1.

Orinas (debe llegar al laboratorio en contenedor estril y ha de conservarse a 4C en menos de 24 horas) [a] Agar sangre, chocolate o Cled/Cystine-Lactose-ElectrolyteDeficient (medios general y especifico para orinas) => se siembra en 3 direcciones/ cubrir totalmente la superficie (cuantitativa en Cled o AS para contar colonias; realizar antibiograma); crecern todo tipo de germenes: cocos Gram+, bacilos Gram-, levaduras; en Cled/AS no crecen cocos Gram- (Neisseria, Moraxella, Chlamydia); en AS se comprueba las caractersticas hemolticas o no de las bacterias e.j. Stafilococcus aureus (B hemoltico) y en Cled, las caracterstica lactosa (+) => amarillas o lactosa (-) sin cambio de color => azul verdosas. [b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por agotamiento en cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo para ayudar a la identificacin de E.coli (sensible a colistina - comn en orinas); crecen bacilos Gram- => Enterobacterias y tambin Pseudomonas; observaremos las caractersticas de lactosa (+) => colonias rojas y lactosa (-) sin cambio de color => rosa. [c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra en la lengeta del tubo preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras de citrato (+) => vira a azul y las que no, permanece verde; se usa para la diferenciacin de Enterobacterias (para diferenciar entre coliformes y coliformesfecales. Los coliformes fecales no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podan utilizar el citrato en este medio dando una reaccin alcalina) en base a su capacidad de utilizar el citrato (mediante citrato permeasa) Los grmenes mas frecuentes que podemos encontrar (en orina se identifican especies): - E. coli (el mas frecuente) => bacilo Gram-, mvil, sensible a Colistina, lactosa (+), indol (+) - Streptococcus faecalis => coco Gram+, catalasa (-), oxidasa (-). - Proteus spp (todas) => bacilo mvil Gram-, resistente a Colistina, lactosa (-), oxidasa (-), Triptfano Desaminasa/TDA (+), ureasa (+) tardo. - Stafilococcus aureus => coco Gram+, catalasa (+), coagulasa (+), B hemoltico, oxidasa(-). - Candidas spp (todas) => morfologa de levaduras (parece como hemates) - Klebsiella spp => bacilo Gram-, inmvil, sensible a Colistina, ureasa (+), colonias mucosas, lactosa (+), tardo. - Pseudomonas spp => bacilo Gram-, mvil, sensible a Colistina, lactosa (-), oxidasa (+)

2. Coprocultivos (contenedor especifico para coprocultivo "Cary y Blair" / bote de orina; conservada a 4C, procurar procesarla en <24H; se siembran por agotamiento en cuadrantes). [a] Hecktoen o SS => medios selectivos y diferenciales donde crecern el genero Salmonella y Shigella; en Hecktoen las Salmonellas spp => colonias lactosas (-), verdosas y pueden ser SH2/sulfihidrogeno/ acido sulfidrico (+) con fondo negro, son bacilos mviles, sensible a Colistina; las Shigellas spp => lactosas (-) , SH2 (-), bacilos inmviles en fresco y sensibles a Colistina; las colonias lactosas (+) en este medio sern amarillas; en SS las Salmonellas y Shigella sern el del medio (caramelo) y tambin con el fondo negro (Salmonellas SH+ y lactosa- ); colonias lactosa (+) => rojizas; las colonias lactosas+ no son patgenas (coliformes fecales) y no se investigan. [b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa clarito - Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.) que aparece como lactosa (+), sensible a Colistina y bacilos Gram- e mviles, fermentador de manitol. La inhibicin selectiva de organismos gram negativos y gram positivos se obtiene mediante cristal violeta (inhibidor de Gram+), desoxicolato sdico (inhibidor de Gam+) y los agentes antimicrobianos: cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina (inhibidor de S.epidermidis).

[c] Agar Campylosel => crecer Campylobacter spp (bacilos Gramcon flagelos) como colonias pequeas translucidas, sensibles a Nalidixico (especies C. coli y C.jejuni) resistente a Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S, ureasa (+) oxidasa (+) catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato C.jejuni seran (+) y C.coli (-); P. hipurato => un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimticamente (hipuricasa) el hipurato sdico que da lugar a acido benzoico y glicina un compuesto de color morado.

[d] Caldo Selenito => caldo enriquecido para los gneros Salmonella y Shigella. el selenito de sodio inhibe la flora Gram+ y la mayora de la flora entrica excepto Salmonella spp.

[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecern como colonias rojas por ser lactosas (+); no es necesario??? [f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae) => aparecen colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Gram- pleomrficos; el extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrgeno y las vitaminas. El citrato sdico, el tiosulfato sdico, la bilis de buey y un pH alcalino fuerte inhiben los organismos Gram+ y suprimir los coliformes (inhibidor para la mayora de las enterobacterias), favoreciendo el crecimiento de Vibrio cholerae porque este organismo es sensible a los entornos cidos. La alta concentracin de sodio favorece el crecimiento de Vibrio cholerae que es halotolerante (tolera el medio salado) y de otras especies de Vibrio, cuya mayora es haloflica. La sacarosa (+) es un carbohidrato fermentable, y el cloruro sdico estimula el crecimiento. El tiosulfato sdico es una fuente de azufre y acta con el citrato frrico como indicador para detectar la produccin de cido sulfhdrico/SH2. El azul de bromotimol y el azul de timol son indicadores de pH. En Mc, Vibrio Cholerae es lactosa (-).

3. Exudados vaginal y uretral (la muestra llegara en uno o varios escobillones; se siembra por agotamiento en cuadrantes). [a] Agar Sangre (medio general) => buscamos Streptococcus B hemoliticos del grupo B (S.agalactiae), que aparecern como colonias pequeas translucidas con un halo de B hemlisis alrededor de la colonia; son cocos Gram+, catalasa y oxidasa (-), anaerobio facultativo, prueba de ltex (+). [b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy pequeas grisceas que crecen bien por ser grmenes exigentes en su crecimiento que requieren factor X y/o V (proceden de la degradacin de la Hb); tambin podemos colocar discos de factor X y/o V y mirar el satelitismo; al fresco como coco-bacilos inmviles, Gram-; oxidasa y catalasa variable. [c] Agar Thayer Martin o New York => buscamos N.gonorrhoeae o N.meningitis que aparecern como colonias de color gris; son diplococos Gram-, catalasa (+), oxidasa (+) que fermentan la glucosa pero no el resto de los azucares. [d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias B-hemolticas y al fresco como bacilo pequeo, Gram variable, anaerobio facultativo, oxidasa (-) y catalasa (-). La presencia de sangre humana favorece el crecimiento de las especies estudiadas, ya que producen -hemlisis alrededor de las colonias. La -hemlisis en agar con sangre humana es altamente indicativa de presencia de G.vaginalis. Los antibiticos incluidos en el medio inhiben la mayora de los contaminantes Gram- y de las levaduras.

[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => crecen levaduras (Candidas spp) y Trichomonas (protozoo unicelular flagelado).

[f] Agar Sabouraud (se puede incluir para detectar Candidas spp) [g] Medio de deteccin de Micoplasmas y Chlamydias

4. Semen - la muestra llegara en contenedor estril/ bote de orina; se siembra por agotamiento en cuadrante en medios: Cled, McConkey , Agar Sangre, Agar chocolate, Thayer Martin o New York, Roiron, y cultivo de Clamydias, buscando en cada caso los mismos grmenes que en el caso del exudado vaginal. 5. Esputo - la muestra ha de llegar en contenedor esteril y conservarse menos de 24H a 4C; antes de sembrar se observa por el microscopio si la muestra es valida/ no esta contaminada por saliva; se siembra por agotamiento en cuadrantes; solo se siembra cuando en el Gram, el cociente leucocitos/ celulas epiteliales sea > 2,5 (recuento en fresco/al microscopio); si es < a 1,5 es dudoso. Cuando sean muestras de UCI o provenientes de neumonas se siembran siempre. [a] Agar Sangre => buscamos colonias de Streptococcus pneumoniae o Branhamella catharralis; S.pneumoniae >> colonias verdosas (alfa hemlisis) y al fresco como coco Gram+, catalasa (-), sensible a la Optoquina; Branhamella catarralis >> colonias blanco-grisceas y al fresco como cocos Gram-, oxidasa (+), catalasa (+) que no utiliza ningn azucar (no es fermentadora), pero reduce los nitratos a nitritos/ nitratasa+ (lo que le diferencia del genero Neisseria que ademas es fermentadora de glucosa y maltosa).

[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias puntiformes translucidas, que al fresco como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable; agar chocolate polyvitex (contiene factor V/ NAD y factor X /hemina procedente de la degradacin de Hb) [c] Agar McConkey => donde creceran Enterobacterias y otros bacilos Gram-. [d] Medio de Lowestein-Jensen (o Coletsos) => para rescatar Mycobacterium tuberculosis, bacilos acido alcohol resistente (Zhiel Neelsen+) de crecimiento muy lento; los niveles bajos de la penicilina y el cido nalidxico tambin estn presentes en el medio de LJ para inhibir el crecimiento de lo Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento de especies de micobacterias solamente. Presencia de verde malaquita en el medio inhibe las floras mayora acompaante; que se desinfecta y se solidifica mediante un proceso de espesamiento; el Glicerol mejora el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis. [e] Medio Legionella => muestras de UCI; la Legionella pneumophila es bacilo Gram- (en realidad, se tie muy mal, aerobio exigente, movil; en general, no fermenta ni oxida los azucares, sino que utiliza los aminoacidos; es hipurato+ => un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimticamente (hipuricasa) el hipurato sdico; necesita L-cisteina para crecer y tambin iones frricos Fe. La inhibicin del crecimiento de las bacterias Gram+, la mayora de las bacterias Gram-, levaduras y mohos, a travs de una combinacin optimizada de 3 antibiticos. Las colonias que crecen en medio Agar Legionella y no crecen en medio AS deben considerarse, con alta probabilidad, colonias de Legionella.

6. Cepillado bronquial (la muestra vendr en el cepillo y se conservara a 4C < de 24H); se siembra en los mismos medios que en el caso anterior (esputo) aadiendo ademas: agar sangre anaerobios (ASA) o medio AKV (agar sangre kanamicina-vancomicina), selectivo para bacilos Gramanaerobios y Bacteroides (bacilo Gram-, anaerobio estricto). 7. Exudado faringeo y oral (la muestra viene en torunda, se sembrara por agotamiento en cuadrante). [a] Agar sangre => crecera todo tipo de grmenes (medio general

enriquecido) [b] Agar chocolate => crecera todo tipo de grmenes [c] Agar Mac Conkey => creceran las Enterobacterias y otros bacilos Grampoco exigentes. [d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/ inhibe los Gram- => para deteccion de Streptococcus B-hemoliticos, Enterococcus y Staphylococcus?? [e] Agar Sabouraud (solo en orales) => deteccion de Candidas spp. 8. Exudados varios - abscesos heridas ... (se sembrara por agotamiento en cuadrantes. La muestra ha de llegar en tubo estril y se conservara a 4C menos de 24H. [a] Agar sangre => crecer todo tipo de grmenes [b] Agar chocolate => idem [c] Agar Mac Conkey => crecern las Entero-bacterias y otros bacilos Gram (-) poco exigentes. [d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/ inhibidor Gram- => crecern bien los Steptococcus B-hemolticos. [e] Agar ANA (agar sangre anaerobios/ASA, aunque tambin puede utilizarse agar AKV, agar sangre kanamicina y vancomicina) => medios selectivos para bacilos Gram- anaerobios (estrictos) y Bacteroides. [f] Caldo Tioglicolato => crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias; permite el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricional-mente exigentes. Adems, se observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte superior, mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio.

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENO EN TIOGLICOLATO En base a la relacin de las bacterias con el oxgeno, estas se pueden clasificar en : 1. Aerobio estricto: Un organismo el cual requiere utilizar el oxgeno como aceptador terminal de electrones , puede tolerar un nivel del oxgeno equivalente o mayor de una atmsfera de aire (oxgeno del 21%), y tiene un tipo terminantemente respiratorio de metabolismo (Mycobacterium tuberculosis, Bacillus). 2. Anaerobio o Aerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en ausencia del oxgeno y en la presencia de un nivel de oxgeno equivalente a una atmsfera del aire (oxgeno de 21%) => Enterobacterias, Vibrio spp, Haemophilus spp..

 3. Microaeroflico (anaerobio aerotolerante): Un organismo que es capaz de un crecimiento oxgeno-dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del oxgeno equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de <21%) => Campylobacter fetus, Pseudomonas y Neisseria. 4. Anaerobio estricto: Un organismo que es incapaz de crecimiento oxgeno-dependiente y no puede crecer en la presencia de una concentracin de oxgeno equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de 21% - nada de O2). (Clostridium botulinum). 5. Anaerobios aero-tolerantes: Pueden crecer con o sin oxgeno pero su metabolismo es siempre fermentativo (Lactobacillus) 9. Liquido cefalorraqudeo - se siembra por agotamiento en cuadrante del sedimento del tubo centrifugado a 1500 rpm a 3000 rpm durante 20 minutos, si en el tubo hay mas de 1 ml de muestra. Sino, vortear el tubo. La muestra se ha de procesar de inmediato y si no es posible, conservarse a 37C. [a] Agar sangre => buscamos Neisseria meningitidis, como pequeas colonias no hemolticas y al fresco se ve como diplococos, Gram-, oxidasa (+), catalasa (+), fermentador de glucosa y maltosa (la fermentacin de este azucar le diferencia del gonococo; tambin puede crecer Streptococcus pneumoniae (neumococo) que aparecen como colonias verdosas (Alfa hemolisis) y al fresco como cocos Gram+, catalasa (-), sensible a la optoquina. [b] Agar chocolate => dem y ademas pueden crecer Haemophilus spp como colonias puntiformes translucidas, que al fresco aparecer, como cocobacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable. [c] Agar Thayer-Martin => medio selectivo para Neisserias, crecern bien los meningococos /N.meningitidis. [d] Medio tioglicolato (caldo) => medios para anaerobios y aerobios. (f) Ademas se har una extensin para Gram. 10. Otros lquidos estriles (sinovial, pleural, pericardio...) - se siembran por agotamiento; la muestra ha de llegar en tubo estril y su conservacin no se ha de demorar mas de 24H a 4C. [a] Agar sangre => crecern casi todo tipo de microorganismos, con caractersticas hemolticas de algunos de ellos. [b] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, sobre todo exigentes. [c] Agar McConkey => crecern Enterobacterias y otros bacilos Grampoco exigentes. [d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo para Gram (+) [e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gramanaerobios y Bacteroides.

11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la tcnica de Maki (rodamiento del cateter) [a] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, y podrn crecer bien algunos exigentes como el Haemophillus. [b] Agar sangre => crecern bien casi todo tipo de grmenes y podr verse sus caractersticas hemolticas si las tuvieran. [c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se har un pase por Agar chocolate. [d] Tambin puede ponerse en una placa de agar MacConkey. 12. Hemocultivos - la muestra se introduce en el vial de hemocultivos, conservando a 37C en el Bactec (detecta CO2) hasta su identificacin.

Tema 6 - Medios de Cultivo en bacteriologa clnica (Clasificacin y Preparacin)

Medios de cultivo - compuesto por distintos nutrientes requeridos para cultivar grmenes como las bacterias, hongos y parsitos segn sus necesidades nutricionales de cada uno; en funcin de sus requerimientos, existen grandes diferencias entre los medios de cultivo que nos sirven para diferenciar cada tipo de microorganismo que podr crecer en unos medios de cultivo y no en otros. Funcin de medios cultivo: - separar y aislar distintas especies microbiales presentes en una muestra. - paso previo para el estudio de identificacin de un microorganismo problema. - conocer el metabolismo en funcin del nutriente o sustrato que utiliza (lactosa) o metabolito que produce (indol). - estudios macroscpicos => visualizar las caractersticas de las colonias en medios slidos. - realizar antibiogramas determinando la sensibilidad (mayor/menor) de la bacteria problema a distintos antibiticos. pruebas de CMI (concentracin minima inhibitoria) conservar las especies microbiales o muestras. Requerimientos energticos y no energticos de los medios de cultivo - fuente de energia (fuente de carbono y de nitrogeno) y fuente no energtica (azufre, fsforo, iones metlicos, factores de crecimiento, f. de arranque y inhibidores) necesarios para el desarrollo (crecimiento) de cultivos microbiales; fuente de carbono => acido acetico, alcohol, citrato sdico, azucares (mono o disacridos incluso almidn => glucosa, lactosa, maltosa), CO2 (bacterias fotosintetizantes y quimiolitotrofas); conocer el tipo de azucar utilizado => til para su identificacin bioqumica y clasificacin taxonmica; fuente de nitrgeno (menos energtica) => protenas completas (gelatina - determinar actividad proteoltica/gelatinasa; extractos de carne y sales de amonio), pptidos/polipeptidos (peptonas extractos de levadura, casena - trpsica de casena/triptfano => formacin

de indol) o aminocidos y otros => nitratos, nitrogeno organico, amoniaco, sales de amonio, aminoacidos; conocer la fuente nitrogenada => util para clasificacin taxonmica; fuente de azufre => sulfatos, tiosulfatos, aminoacidos (metionina, cisteina, tiamina); fuente de fosforo => fosfatos; iones metalico => hierro, potasio, sodio, magnesio y en concentraciones mas bajas => cinc, manganeso, cobre, cobalto, etc; Otros requerimientos no energticos: Factores de crecimiento => componentes que muchas bacterias no son capaces de fabricar por si solas para su crecimiento (aminocidos => cisteina; factor X y factor V procedente de la degradacin Hb; vitaminas, bases puricas y pirimidicas); factores de arranque => sustancias que permite a la bacteria salir de su fase de latencia y comenzar su fase de crecimiento exponencial (fuentes de energa => glucosa; iones metlicos que estimula el crecimiento); factores inhibidores => componentes que bloquar el proceso metablicos de algun microbio; muy tiles para la identificacin y tipificacin bioqumica de las bacterias (azida sodica => impide Gram-; antibiticos => inhibidores y destructores; colorantes la eosina azul de metileno utilizado por medio Levine; cristal violeta en medio Mac-Conkey => impide Gram+). Condiciones que ha de cumplir un medio de cultivo: 1. Una composicin de nutrientes adecuada (requerimientos energticos y no energticos) 2. Condiciones fsico-qumicas apropiadas: - Temperatura optima/ideal (segn la especie microbiana => psicrfilas <20C; mesfilas 18-45C; termfilas > 45C; las bacterias patgenas del hombre 35-37C; fuera de estas no crecen o crecen mucho mas despacio;) e.j.: Yersinia 22C, Campylobacter 45C (los dos son gastrointestinales) - Grado de humedad (cantidad de agua que necesita para crecer) - pH adecuado es en general cercano a la neutralidad +/- 7(estabilizante de pH => buffers o tampones que facilitan el crecimiento); pH acido => Tiobacilos (cerca a 0); pH alcalino => bacilos ureasa positivo/ Proteus (en torno a 8) y Vibrio cholerae (pH 9) - Presin osmtica en general isotnia (300 miliosmoles) - Presencia o ausencia de oxigeno; la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias son facultativos que se desarollan bien con y sin O2; existen pocos anaerobios estrictos; bacterias microaeroflica => produce mas CO2. Principales tipos de medios de cultivo - segn su proporcin de agua / su consistencia (slidos, lquidos, caldo) - segn su uso / su utilizacin (para aislamiento, crecimiento en general /recuento, identificacion, mantenimiento de cepas, para antibiogramas) - segn su origen del que proceden (naturales, sintticos y semi-sintticos, complejos) - segn su presentacin (deshidratados o liofilizados, slidos en placa petri, slidos en tubo, lquidos en tubo, semi-slidos en tubo, doble fase en frasco o tubo).

Medios de cultivo segn su proporcin en agua: - Medios slidos > 15% de agar; para aislamiento, identificacin, elaboracin de antibiogramas) =>1881 Koch utiliza la gelatina (inconveniente => se funde a 24oC y existen bacterias gelatinasa positiva que destruiran tal medio); posteriormente Hesse su alumno usa el agar (medio inerte). - Medios lquidos/caldos => contiene agua, fuente de carbono, sales minerales y algunos lleva factores de crecimiento, vitaminas, peptonas y aminocidos. - Medios semisolidos => agar semi-slidos (<5% de agar) Medios de cultivo segn su uso o utilizacin: - Medios para aislamiento => {a} medios enriquecidos (componentes basicos + caseina soja, triptofano para microorganismo exigente; e.j. agar sangre/chocolate {b} medios selectivos (componentes basicos + componentes que impiden el crecimiento de algn tipo bacteriano para seleccionar) e.j. medio Rothe (para aislar Streptococcus faecalis /Gram+) contiene azida sdica que impide Gram-; la mayoria de medios selectivos son tambin medios diferenciales {c} medios diferenciales (= medios selectivos + sustancias resalta las caracteristicas microbiales de algunas; e.j. medio Levine (contiene eosina y azul de metileno que inhibe Gram+ y algunas Gram-, facilita a las enterobacterias y lactosa (para las fermentadoras) - Medios para crecimiento en general => liquida o solida sirve para el crecimiento de la mayor parte de las bacterias (componentes basicos + sales y agua) ; e.j. el caldo comun (contiene extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro sodico y agua); el caldo Tioglicolato. - Medios de identificacin (= medios diferenciales) => sirve para clasificar taxonmica-mente el microoganismo; e.j. agua peptonada = indol positivo; caldo Stuart urea-indol = ureasa; glucosa = fermentacin de glucosa (sacarolitico = sacarosa positivo). - Medios de mantenimiento de cepas => mantener las cepas vivas durante periodos de tiempo relativamente largos a temperaturas bajas para impedir su crecimiento; e.j. leche descremada congelada - Medios para antibiogramas; e.j. Proctor (antibiogramas fungicas), Mueller Hinton (a.b.bacterianas), Wilkins-Chapman (a.b. bacteriana anaerobicas). Medios de cultivo segn su origen - Medios naturales => poco utilizados, se preparan artesanalmente, constituidos por ciertos tejidos, liquidos organicos (leche, huevo, patata, suero sanguineo) - Medios semi-sintticos => parte de su composicion son extractos naturales (levadura, malta, patata, sagre, leche) + constituyentes sintticos - Medios sintticos => estructuras sintticas mas o menos puras y qumicamente definidas disueltas en agua destilada (los mas utilizados en bacteriologia y en general); contiene: fuente de carbono o azucar, fuente de nitrgeno inorgnica como iones NO-3, NH+4 o orgnica como peptona, aminocidos, aminas, etc., compuestos minerales como oligoelementos, factores de crecimiento (vitaminas, aminoacidos, bases puricas o

pirimidnicas). - Medios complejos => son los primeros que se utilizaron en bacteriologa; en actualidad se uss mas en parasitologa y virologa; se preparan de forma compleja (tejidos animales/carne de musculo, higado, corazon, yema de huevo, azucares, pepetonas, vegetales, etc. Medios de cultivo segun su Medios deshidratados o Medios ya Medios solidos en Medios solidos Medios liquidos Medios semisolidos Medios de doble fase presentacion liofilizados preparados placa Petri en tubo en tubo en tubo en frasco

Principales medios utilizados en microbiologa 1. Agua peptonada (peptona en medio acuoso con pH 7 a 37C 24-48 horas) => determinacin de la produccin de indol debido a su alto contenido en triptfano; tras la adicin de 5/6 gotas de reactivo Kovacs en hidrxido potsico (KOH 40%) => anillo rojo en la superficie indicara indol positivo.

2. Medio Chapman (selectivo y diferencial) => aislamiento de Staphylococcus (halfilos) S.aureus (coagulasa+); Comp: alto contenido de cloruro sdico 75 gr (agar manitol salado); 15 gr de D-manitol (diferencial => azucar utilizado por algunos estafilococos), 25 gr de rojo fenol (indicador positivo de pH a 37C 24-48 horas => amarillo dorado); es orientativa, se debe completar la prueba con pruebas bioqumicas (coagulasa/latex); S.epidermidis no fermentan el manitol, por tanto el color sigue rojizo o purpureo.

3. Agar de Thayer y Martin (Agar New York City) => no permite el crecimiento de muchos microorganismos, pero si permite aislar gonococos y meningococos (Neisseria); Comp: agar chocolate/ sangre calentado + formula polyvitex (vitaminas y aminocidos) + VCAT (vancomicina => inhibe los Gram+, colistina => inhibe los coliformes /Gram-, anfotericina => antifngico, trimetropinsulfametroxazol => antibitico de amplio espectro).

4. Agar chocolate Polyvitex => medio general enriquecidos donde crecen la mayora de bacteria y Haemophyllus); Comp: agar chocolate + formula polyvitex (vitaminas y aminocidos) incluyendo factores X (hemina) y V (NAD/ nicotinamida adenina dinucletido) proporcionados por la hemoglobina y PolyViteX.

5. Medio base Christensen (lquidos y slidos) => para la prueba de la ureasa; ureasa+ de rojo => rosa; grmenes con ureasa+ => Proteus y Helicobacter pilory

6. Medio citrato de Simmons (agar solido) => prueba de citrato (como fuente de energa) para la investigacin de bacilos Gram- (la diferenciacin entre coliformes y coliformes fecales. Los coliformes fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podan utilizar el citrato en

este medio dando una reaccin alcalina); Comp: citrato sdico, azul de bromotimol (indicador pH, de que el citrato esta consumido /se alcalina; verde => azul); grmenes con citrato permeasa => Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Enterobacter aerogenes.

7. Medio Clark y Lubs (caldo/ liquido) => para diferenciar enterobacterias mediante prueba de Voges-Proskauer (produccin de acetona/ acetil metil carbinol => por reduccin a 2,3 butanodiol o por oxidacin a diacetilo); y prueba de Rojo de Metilo (acidificacin del medio con pH <4,5 y cambio de color a rojo); grmenes con VP+ => Klebsiella pneumoniae y Enterobacter aerogenes; grmenes con RM+ => Proteus, E.coli y Salmonella.

8. Medio Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (solido) => recuento e identificacin de grmenes en las vas urinarias; Comp: lactosa en alta cantidad, azul de bromotimol (indicador del consume lactosa verde => amarillo); las colonias mas frecuente => E.coli (amarilla L+), Proteus (azul L-), Klebsiella (amarilla azulada y muy mucosa (L+), Pseudomonas aeruginosa (verde L-), Streptococcus faecalis (amarilla L+), Staphylococcus aereus (amarilla L+).

9. Agar sangre (se comercializa con nombre TSA => tripticasa, soja, agar) => investigacin de microorganismos hemolticos (consume hemates); es un medio general enriquecida; Comp: sangre de cordero (agar columbia) o caballo o ternero => estriles y desfibrinadas; alfa hemlisis/ neumococo (parcial) => halo verdoso/difuso alrededor de la colonia; beta hemlisis/ Streptococcus B-hemoltico y Staphylococcus aureus que causan anginas (total) => halo transparente; gamma hemlisis/ Pseudomona causa gastro intestinales (no hemolizar) => sin halo.

10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y diferencial, para aislamiento de entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus, Klebsiella) Comp: alto contenido de lactosa (indicador fermentadora), eosina azul de metileno (indicador de pH y inhibidor los Gram+ y las floras de Gram- fastidiosas).

11. Medio de agar Hektoen (diferencial y selectivo) => aislamiento de entero-bacterias patgenas Gram-; Comp: sales biliares (inhibe Gram+), lactosa (indicador de L+ => amarillo/naranja) sacarosa, peptona, tiosulfato sdico y citrato frrico amoniacal (indicador de la produccin SH2/H2S => puntos negro), azul de bromotimol, fuschsina cida (indicadores de pH); en condicin normal es verde => fermentacion de lactosa/acidificacin => vira a amarillo/naranja (caractersticas de fermentadora L+ Escherichia, Serratia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter y Vibrio cholerae); cuando se consume lactosa + peptona (se acidifican primero, y despus se basifican) => verde;

cuando se consume azufre/ disulfurasas+ => precipita el hierro y la colonia se vuelve negro (caracterstica de Salmonella y Proteus vulgaris).

12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo); muy semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy utilizado para la identificacin de entero-bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y SH2; Comp: lactosa (indicador de L+), peptonas, glucosa, citrato frrico amoniacal y tiosulfato sdico (componentes para producir SH2), rojo fenol (indicador de pH); los grmenes productor de SH2+ => Proteus, Salmonella y Citrobacter; los productores del gas CO2+ => Salmonella y Citrobacter y E.coli.

13. Medio MacConckey (color rosa) => aislamiento e identificacin de entero-bacterias Gram-/ poco exigentes; Comp: sales biliares (inhibidor Gram+), lactosa (indicador L+), cloruro sodico, rojo neutro, cristal violeta (inhibidor los cocos de Gram+); L+ (consumidor de lactosa) => rojo (E.coli y Enterobacter aerogenes), L- (no fermentador)=> Salmonella, Shigella y Pseudomonas; Gram- exigentes => Neisseria, Haemophyllus.

14. Medio Mueller Hinton (general) => para la realizacion de antibiograma por el mtodo de Bauer-Kirby

15. Medio Ornitina Movilidad/ MIO (preparado en tubo/ semisolido) => identificacin de la movilidad bacteriana (entero-bacterias), capacidad para descarboxilar la ornitina (orinitina descarboxilasa /est dada por un color prpura/ alcalinidad del medio y la produccin de indol (al aadir reactivo de Kovacs); La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de inoculacin; el germen que da resultado positivo de los 3 pruebas => E.coli.

16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el aislamiento de Salmonella; Comp: selenito sdico (inhibidor de flora Gram+ y Gram- excepto Salmonella); despus tambin se hace cultivo con agar SS.

17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patgenas importantes Salmonella y Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de L), tiosulfato sdico y citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde brillante (inhibidor bacillos Gram+), rojo neutro

(indicador de pH); L+ (coliformes - E.Coli y Klebsiella) => rojas o rosadas; L- y SH2- => incoloras (tpico de Shigella); L- y SH2+ con la precipitacin de hierro => negro (tpico de Salmonella).

18. Medio Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) => se utiliza para el aislamiento y diferenciacin de bacilos entricos Gram-, especialmente del gnero Salmonella y especialmente Shigella (entero-bacterias patgenas); Comp.: xilosa (la fermentan los entricos menos Shigella), sacarosa y lactosa, desoxicolato de sodico (inhibe Gram+); se puede utilizar para la identificacin de lactasa+, lisina descarboxilasa+ => Salmonella que alcaliniza el medio y SH2+ (tiosulfato sdico + citrato de hierro amoniacal).

19.

Medio

caldo

Columbia

=>

caldos

para

hemocultivos.

20. Medio Castaeda (caldo y solido) => bsqueda de grmenes Brucella, Vibrios y Pasteurella en sangre (hemocultivos). 21. Medio de Lowenstein-Jensen (selectivo) => cultivo de Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias; Comp: fcula de patata, verde malaquita => inhibidor de la mayora de grmenes; la prueba se confirma con tincin de acido alcohol resistencia (Con la tincin de ZiehlNeelsen las micobacterias se observan como bacilos de color rojo); micobacterias patgenas crecen muy lenta (+ 7 das); los niveles bajos de la penicilina y el cido nalidxico tambin estn presentes en el medio de LJ para inhibir el crecimiento de Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento => nico de micobacterias.

22. Medio Sabouraud => para el aislamiento e identificacin de hongos micelares y levaduriformes. 23. Medio Sabouraud gentamicina tetrazolium => para el aislamiento e identificacin de Candida (levaduriformes); La gentamicina inhibe el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram- y Gram+.

24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo de anaerobios (estrictos y facultativos); La presencia de factores de crecimiento como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3 y la adicin de sangre de cordero permite el crecimiento incluso de las especies ms exigentes. El agente reductor (L-cistina) y la elevada concentracin de dextrosa en el medio favorecen el crecimiento de especies anaerobias p.ej. Lactobacillus, Streptococcus, Clostridios y Bacteroides. 25. Medio CPS cromognico (agar/ solido) => es un medio de aislamiento y de identificacin destinado a las muestras urinarias; permite realizar (1) el recuento microbiano (mtodo de inoculacin estandarizado); (2) identificacin de: Escherichia coli, Enterococcus del grupo D, KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), Proteeae (Proteus, Providencia, Morganella); la concentracin elevada de agar evita el crecimiento invasivo de Proteus; el medio se inocua directamente a partir de la orina, respetando tcnicas adecuadas de toma de muestras y su transporte; permite la identificacion directa de:

a. E.coli => coloracin espontanea (rosa a burdeos) de las colonias productores de B-glucuronidasa (B-GUR) y coloracin azul revelada por el reactivo indol cuando la cepa genera triptofanasa. b. Enterococcus y KES => coloracin espontanea azul-verde de las cepas que producen B-glucosidasa (B-GLU). c. Proteeae => coloracin marrn revelada por el reactivo TDA cuando la cepa genera triptfano desaminasa (sin reactivo es incoloro). Modo operativo - dejar atemperar las placas a temperatura ambiente; inocular la muestra con el asa calibrada de 10ul => sumergir el asa en la orina, mantenerlo verticalmente; descargar el asa al realizar una estra sobre un radio de la placa; realizar estras perpendiculares muy apretadas sobre toda la superficie de la placa; incubar en la estufa con la tapa hacia abajo a 37C en aerobiosis; se examinan los cultivos despus de 24 horas de incubacin. Lectura e interpretacin: Recuento - estimar la concentracin bacteriana comparando la densidad de las colonias presentes sobre la mitad superior de la placa con la del esquema; <1000 (negativo), entre 1000 - 100.000 (dudoso), mas de 100.000 (positivo) Identificacin observar las colonias (1) Colonias de color rosa a burdeos o translucidas con centro rosa a burdeos => presuncin de E.coli; confirmar mediante una deteccin de indol (depositar una colonia sobre un disco de papel previamente embebido de una gota de reactivo R1 del envase ID Indol TDA) => indol+ da una coloracin azul (E.coli); la ausencia de color azul (indol-) se debe proceder a la pruebas de API. (2) Colonias de color azul-verdoso y observacin de cocos Gram+ mediante examen directo => Enterococcus; si no cumple esta condicin, se debe proceder a las pruebas de API. (3) Colonias de color azul-verdoso y observacin de bacilos Gram- mediante examen directo => grupo KES; la identificacin se debe proseguir mediante pruebas bioqumicas (ureasa+ => Klebsiella; ornitina descarboxilasa+ => Enterobacter; gelatinasa+ => Serratia). (4) Colonias incoloras a marrn-anaranjado => efectuar TDA (depositar sobre algunas colonias idnticas, una gota de reactivo R2 del envase ID Indol TDA), observar la coloracin despus de unos 30 segundos => TDA+ da una coloracin marrn +/- oscuro; efectuar indol => indol+ da color azul (Proteus, Providencia o Morganella); ausencia de coloracin azul es indol- (Proteus mirabilis); TDA- da una coloracin amarilla y la identificacin se debe proceder a las pruebas de API.

Medio: Agua de peptona (Prueba de indol)

pH: 7,2 Esterilizacin: 121 oC, 20' Distribucin: Tubos de hemolisis, 2 ml Reactivo de Kovacs (prueba de indol)

p-dimetilamino benzaldehdo 5g Alcohol amlico 75 ml HCl concentrado 25 ml Medio base (agua de peptona) Prueba de fermentacin de azcares Peptona 10 g NaCl 5 g Prpura de bromocresol solucin alcohlica al 1% 2,5 ml Agua destilada 1000 ml Carbohidrato: Lactosa 2 g pH: 7,2 Esterilizacin: 112 oC, 30' Distribucin: Tubos de hemolisis con campanita Durham, 2 ml Medio Hugh-Leifson (prueba de O/F)

Medio base 10,4 g

Peptona 2 g NaCl 5 g K2HPO4 0,3 g Azul de bromotimol 0,03 g Agar 3 g Glucosa 10 g Agua destilada 1000 ml pH: 7,4 Esterilizacin: 112 oC, 30' Distribucin: Tubos de hemolisis, 2 ml Medio de Clark-Lubs (rojo de metilo)

Peptona 7 g K2HPO4 5 g Glucosa 5 g Agua destilada 1000 ml pH: 7,5 Esterilizacin: 112 oC, 30' Distribucin: Tubos de hemolisis, 2 ml Reactivo: Rojo de metilo

Rojo de metilo 0,2 g Alcohol etlico 200 ml Agua destilada 300 ml alfa-naftol al 5% en etanol (Voges-Proskauer) KOH al 40% en agua Medio de Koser (citratos) Medio de Simmons (citratos) Na2NH4PO4 1,5 g H2NH4PO4 1 g KH2PO4 1 g K2HPO4 1 g

MgSO4 0,2 g NaCl 5 g Citrato sdico 3 g Citrato sdico 2 g Agua destilada 1000 ml Azul de bromotimol 0,08 g Agar 15 g Agua destilada 1000 ml pH: 7,2 Esterilizacin: 121 oC, 20' Distribucin: tubos de hemolisis, 2 ml Medio de cultivo (reduccin de nitratos y nitritos):

Peptona 10 g NaCl 5 g KNO3 1 g Agua destilada 1000 ml pH: 7,2 Esterilizacin: 121 oC, 20' Distribucin: Tubos de hemolisis con campanita Durham, 2 ml Reactivos para la deteccin d nitritosde nitritos

Solucin de cido sulfanlico al 0,8% en cido actico 5 N Solucin de alfa-naftilamina al 0,5% en cido actico 5 N Granalla de zinc Medio de Kligler

Peptona 20 g Lactosa 10 g Glucosa 1 g NaCl 5 g Citrato frrico amnico 0,5 g Tiosulfato sdico 0,5 g

Rojo fenol 0,025 g Agar 17 g pH: 7,4 Esterilizacin: 112 oC, 30' Distribucin: Tubos de ensayo, 4 ml. Inclinar en pico de flauta.

Cultivo en medio de Kligler

Fundamento
Permite un diagnstico rpido orientativo del tipo de enterobacteria aislado. Las enterobacterias mas patgenas no suelen fermentar (producir cidos de) la lactosa. Se detecta la produccin de cidos (acompaada o no del desprendimiento de gases) de glucosa o lactosa y produccin de SH2. Medio de Kligler

1- Inocular los tubos con hilo de platino: primero por picadura y a continuacin una siembra en estra en la superficie inclinada. Incubar a 37 oC durante 24 horas 1- Produccin de cidos de la glucosa (no de la Resultados lactosa) En la superficie del medio las enterobacterias (amarillo=acidez; rosa= respiran consumiendo la glucosa: Cuando la agotan (solo tiene 0.1%) consumen los pptidos y se alcaliniza el medio alcalinidad; negro = SH2; (lsuperficie rosa). En el fondo las enterobacterias fractura o desplazamiento fermentan la glucosa produciendo cidos (fondo amarillo). del medio = gases) 2- Produccin de cidos de la lactosa (y de la glucosa): En la superficie del medio las enterobacterias respiran utilizando la glucosa y luego la lactosa. En el fondo producen una elevada cantidad de cidos y difunden hasta la superficie (todo el medio amarillo). 3-Produccin de SH2 (color negro): la bacteria ha realizado una respiracin anaerobia utilizando el tiosulfato como aceptor de electrones; el tiosulfato se convierte en SH2 que con el Fe3+ origina S3Fe2 (color negro) La imagen muestra (de izquierda a derecha): 1-cultivo lactosa -, SH2 + 2-cultivo lactosa + 3-cultivo lactosa 4- cultivo lactosa Produccin de cidos de : Lactosa Glucosa Todo el cultivo amarillo + + (b)

Materiales y reactivos Mtodo

Amarillo en el fondo y rosa en el pico de flauta Todo el cultivo rojo o rosa (d) Precipitado negro (a) Fractura o desplazamiento del medio (b y c)

Produccin de SH2 Produccin de gases