Estudos FQ e Estruturais de Lipossomas Compositos de Fosfatidilcolina e Cts

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

ESTUDOS FSICO-QUMICOS E ESTRUTURAIS
DE LIPOSSOMAS COMPSITOS DE FOSFATIDILCOLINA
E QUITOSANA

TESE DE DOUTORADO

Omar Mertins

Porto Alegre, 2008
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

ESTUDOS FSICO-QUMICOS E ESTRUTURAIS
DE LIPOSSOMAS COMPSITOS DE FOSFATIDILCOLINA
E QUITOSANA

OMAR MERTINS
Mestre em Qumica

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Qumica da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul para a obteno do ttulo de Doutor em Qumica.

Porto Alegre, julho de 2008.
iv
A presente tese foi realizada inteiramente pelo autor entre julho/2004 e junho/2008 no
Instituto de Qumica da UFRGS, sob orientao da Prof
a
. Dr
a
. Ndya Pesce da Silveira e co-
orientao da Prof
a
. Dr
a
. Adriana Raffin Pohlmann. No perodo de maio/2006 a abril/2007, o
trabalho foi desenvolvido no Institut Charles Sadron, em Strasbourg, Frana, sob superviso
do Prof. Dr. Carlos M. Marques.

Omar Mertins

Orientadora: Prof.
a
Dr.
a
Ndya Pesce da Silveira

Co-orientadora: Prof.
a
Dr.
a
Adriana Raffin Pohlmann

Co-orientador: Prof. Dr. Carlos M. Marques

Comisso Examinadora:

Prof. Dr. Watson Loh
Instituto de Qumica Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)

Prof.
a
Dr.
a
Izabel Cristina Riegel
Instituto de Cincias Exatas e Tecnolgicas Centro Universitrio Feevale (FEEVALE)

Prof.
a
Dr.
a
Magdolna Maria Vozari Hampe
Instituto de Cincias Bsicas da Sade Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Prof.
a
Dr.
a
Clarisse Maria Sartori Piatnicki
Instituto de Qumica Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Prof. Dr. Dimitrios Samios
Instituto de Qumica Universidade Federal do Rio Grande do Sul

v

We are not defined without each other.
Madonna

Ao Futuro

vi
Agradecimentos

Ndya, pela amizade constante, incentivo e orientao.
Adriana, pela amizade, apoio e co-orientao.
Ao Carlos, pela amizade, co-orientao e por ajudar a me fazer sentir em casa numa
terra estrangeira.
A todos os colegas do LINDIM, pelos inmeros auxlios e por fazerem do laboratrio
um lugar de companheirismo e amizade.
Yasmine e Maria pela colaborao e auxlios em alguns experimentos.
Ao Mateus, ao Fernando e Aline, pela amizade, ajuda e fora.
Ao professor Paulo Henrique pela obteno dos espectros de RMN de
31
P.
professora Irene pela amizade e o exemplo de determinao.
professora Maria Helena pelos incentivos e por acreditar neste trabalho.
Ao professor Dimitrios pela amizade e estmulo.
Capes e ao CNPq pelas bolsas, Solae do Brasil S.A. pela fosfatidilcolina, ao
LNLS pelas medidas de SAXS e s Redes de Nanobiotecnologia e Nanocosmtica
(CNPq/MCT) pelo auxlio financeiro.
Aos meus pais e irmo, pelo apoio. Em especial minha me Nair pelo afeto e
compreenso.
Ao Jorge, pela amizade incondicional, fora e honestidade.
Ao Alexandre, pela amizade e confiana.
Lislaine, por me mostrar que podemos sobreviver a muitas coisas e voltar a crescer.
Ao Nuno e ao Ernesto, pela amizade e ajudas.
Merci aussi Andr, pour lamitie et tous les enseignements lICS.
Merci Thierry, pour lamitie et les mesures de FRAP.
Merci Marc Schmutz, pour la TEM.
Merci M. Rinaudo, pour les conseils et rfrences.
Merci Franois, pour les expriences de microscopie.
Merci Marc Basler, Lea et tout le personnel lICS pour lamitie et tout laide.
Thanks to Christopher for all the help on the microscope.
Merci bien Martine, pour lamitie et laccueil maternel.
Merci beaucoup Jean Franois de mavoir montr le bonheur de la vie.

vii
Produo cientfica gerada a partir dos resultados descritos na Tese

Omar Mertins, Marcelo Sebben, Adriana R. Pohlmann, Ndya Pesce da Silveira.
Production of soybean phosphatidylcholine-chitosan nanovesicles by reverse phase
evaporation: a step by step study
Chemistry and Physics of Lipids, 138, 29-37, 2005.

Omar Mertins, Mateus B. Cardoso, Adriana R. Pohlmann, Ndya Pesce da Silveira.
Structural evaluation of phospholipidic nanovesicles containing small amounts of chitosan
Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 6, 2425-2421, 2006.

Omar Mertins, Maria I.Z. Lionzo, Yasmine M.S. Micheletto, Adriana R. Pohlmann, Ndya
Pesce da Silveira.
Chitosan effect on the mesophase behaviour of phosphatidylcholine supramolecular systems
Materials Science and Engineering C, in press.

Outras publicaes

Adriana R. Pohlmann, Valria Weis, Omar Mertins, Ndya Pesce da Silveira, Slvia S.
Guterres.
Spray-dried indomethacin-loaded polyester nanocapsules and nanospheres: development,
stability evaluation and nanostructure models
European Journal of Pharmaceutical Sciences, 16, 305-312, 2002.

Liliam B. Marn, Carlos P. Covas, Ndya P. Silveira, Adriana R. Pohlmann, Omar Mertins,
Leonardo N. Tatsuo, Osvaldo A.B. Santanna, Ana M. Moro, Clia S. Takata, Pedro S.
Arajo, Maria H.B. Costa.
LUVs recovered with chitosan: a new preparation for vaccine delivery
Journal of Liposome Research, 17, 155-163, 2007.

Omar Mertins, Marcelo Sebben, Paulo H. Schneider, Adriana R. Pohlmann, Ndya Pesce
da Silveira.
Caracterizaao da pureza de fosfatidilcolina da soja atravs de RMN de
1
H e de
31
P
Qumica Nova, in press.
viii
ndice Geral

Captulo 1. Introduo

1.1. Consideraes Preliminares ........................................................................... 1
1.2. Lipossomas ....................................................................................................... 3
1.2.1. Breve Histrico ......................................................................................... 6
1.2.2. Composies Molecular e Estrutural ..................................................... 7
1.2.3. Dinmica Molecular e Transies de Fase ........................................... 14
1.2.4. Importncia Cientfica e Tecnolgica ................................................... 20
1.3. Quitina e Quitosana ....................................................................................... 23
1.3.1. Reviso Bibliogrfica .............................................................................. 23
1.3.2. Importncia Cientfica e Tecnolgica ................................................... 30
1.4. Quitossomas .................................................................................................... 33
1.5. Referncias ..................................................................................................... 36

Captulo 2. Metodologias

2.1. Obteno de Quitosana Fluorescente .......................................................... 42
2.2. Lipossomas e Quitossomas Nanomtricos ................................................... 45
2.2.1. Mtodo da Evaporao em Fase Reversa ............................................ 45
2.3. Espalhamento de Luz .................................................................................... 50
2.3.1. Espalhamento de Luz Esttico ............................................................. 53
2.3.2. Espalhamento de Luz Dinmico .......................................................... 58
2.3.3. Recuperao de Fluorescncia Aps Foto-Branqueamento ............. 62
2.4. Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo ................................................. 69
ix
2.5. Microscopia ptica ....................................................................................... 75
2.6. Microscopia Eletrnica de Transmisso ..................................................... 76
2.7. Potencial Zeta ................................................................................................ 77
2.8. Ressonncia Magntica Nuclear de Fsforo ................................................ 80
2.9. Lipossomas Gigantes ..................................................................................... 83
2.9.1. Eletroformao ...................................................................................... 84
2.9.2. Proposta de Eletroformao a Partir da Fase Reversa ..................... 87
2.9.3. Microscopia ptica e de Fluorescncia .............................................. 89
2.9.4. Calibrao da Fluorescncia ............................................................... 93
2.10. Referncias .................................................................................................. 96

Captulo 3. Resultados e Discusses

3.1. Lipossomas e Quitossomas Nanomtricos ................................................. 99
3.1.1. Avaliao Estrutural ............................................................................ 99
3.1.1.1. Espalhamento de Luz .................................................................... 99
3.1.1.2. Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo ............................... 111
3.1.1.3. Microscopia ptica e Eletrnica ............................................... 125
3.1.2. Transies de Fase .............................................................................. 130
3.1.2.1. Espalhamento de Luz Esttico .................................................. 130
3.1.2.2. Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo ............................... 135
3.1.3. Dinmica e Interaes Moleculares .................................................. 142
3.1.3.1. Potencial Zeta ............................................................................. 143
3.1.3.2. Recuperao de Fluorescncia Aps Foto-Branqueamento ... 145
3.1.3.3. Ressonncia Magntica Nuclear de Fsforo ............................ 148
3.2. Lipossomas e Quitossomas Gigantes ........................................................ 154
3.2.1. Avaliao da Eletroformao a Partir da Fase Reversa ................ 155
x
3.2.2. Localizao da Quitosana nos Lipossomas Gigantes ....................... 158
3.2.3. Avaliao da Concentrao de Quitosana ........................................ 168
3.2.4. Estabilidade ......................................................................................... 172
3.3. Aspectos Aplicativos do Sistema Desenvolvido ........................................ 174
3.4. Referncias .................................................................................................. 176

Captulo 4. Concluses

4. Concluses ...................................................................................................... 178

Anexos

Artigos Publicados ............................................................................................. 182

xi
ndice de Figuras

Figura 1.1. Representao de um lipossoma dividido ao meio para evidenciar a sua
estruturao interna constituda de um ncleo polar cercado por uma dupla camada de
fosfolipdios............................................................................................................................ 5
Figura 1.2. Representao de diferentes organizaes estruturais de molculas anfiflicas e as
suas respectivas nomenclaturas.............................................................................................. 8
Figura 1.3. Representao de possveis formas de molculas anfiflicas relacionadas com a
simetria da organizao estrutural e respectivas fases mais provveis de estruturas
coloidais.................................................................................................................................. 9
Figura 1.4. Estruturas moleculares da 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (a) e
do 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (DOPG) (b)........................................ 10
Figura 1.5. Representao das diferentes mesofases da bicamada fosfolipdica juntamente
com suas respectivas simbologias e nomenclaturas e indicao da variao da distncia de
repetio (d). A dependncia do aumento do fornecimento de energia externa necessria para
que uma mesofase se transforme em outra est indicada pelo caminho das flechas............ 17
Figura 1.6. Estruturas moleculares da quitina 100% acetilada (a), da quitosana 100%
desacetilada (b) e da quitosana 100% desacetilada e ionizada (c)........................................ 24
Figura 2.1. Reao entre quitosana e isotiocianato de fluoroscena com a obteno da
quitosana fluorescente........................................................................................................... 43
Figura 2.2. Representao das diferentes etapas do mtodo de evaporao em fase
reversa................................................................................................................................... 46
Figura 2.3. Representao das diferentes etapas do mtodo de evaporao em fase reversa
com a adio de quitosana na etapa 2................................................................................... 47
Figura 2.4. Estruturas moleculares da 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) (a), L-
-lisofosfatidilcolina (LPC) (b), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (DPPA) (c) e da
1-oleoil-2-[12-[(nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoil]-sn-glicero-3-fosfocolina
(NBDPC) (d)......................................................................................................................... 48
xii
Figura 2.5. Geometria bsica de espalhamento onde a radiao incidente sobre um objeto
consiste num vetor de onda k
i
e a radiao espalhada consiste num vertor de onda k
f
num
ngulo em relao radiao incidente............................................................................. 51
Figura 2.6. Vista superior do equipamento de espalhamento de luz. O laser incide sobre a
amostra localizada no centro do gonimetro. A luz espalhada em determinado ngulo
coletada e amplificada pela fotomultiplicadora que envia os dados ao computador............ 58
Figura 2.7. Comparao entre raio de giro (R
g
) e raio hidrodinmico (R
h
) para duas cadeias
polimricas isoladas (linhas contnuas) representando uma cadeia tipo novelo (esquerda) e
uma cadeia extendida (direita).............................................................................................. 61
Figura 2.8. Representao grfica do perfil da intensidade de fluorescncia (I) em funo do
tempo (t) num experimento de FRAP. A linha de base (1) sofre um decaimento abrupto no
momento do foto-branqueamento (2). Com o passar do tempo a intensidade de fluorescncia
no ponto foto-branqueado volta a aumentar com a difuso de entidades que no foram foto-
branqueadas (3) at a estabilizao da recuperao de fluorescncia num valor constante (4)
que menor do que o inicial. A fluorescncia perdida no foto-branqueamento x e a
recuperada y. A mobilidade das entidades fluorescentes pode ser determinada pela
declividade da curva 3.......................................................................................................... 64
Figura 2.9. Representao esquemtica do equipamento de FRAP. As distncias a e b so
regulveis.............................................................................................................................. 66
Figura 2.10. Representao esquemtica da geometria de difrao de raios-X sobre uma
camada ordenada com distncia de repetio d.................................................................... 72
Figura 2.11. Representao da distribuio de ons em torno de uma partcula esfrica
negativamente carregada dispersa num lquido ionizado..................................................... 78
Figura 2.12. Representao da clula utilizada para medidas de Potencial Zeta (a) e esquema
do equipamento (b)............................................................................................................... 80
Figura 2.13. Representao do aparato experimental para a produo de vesculas gigantes. A
clula de eletroformao conectada ao gerador de tenso que fornece o campo eltrico, o
qual estimula a formao das estruturas a partir do filme de fosfolipdios.......................... 85
Figura 3.1. Funo de autocorrelao temporal representativa, obtida para uma amostra de
quitossomas em suspenso aquosa atravs do Espalhamento de Luz Dinmico................ 100
xiii
Figura 3.2. Variao do raio hidrodinmico (R
h
) obtido por Espalhamento de Luz Dinmico
para lipossomas e quitossomas em funo da concentrao de quitosana para amostras
filtradas a 0,45 e 1,20 m e amostras no filtradas, conforme indicado............................ 101
Figura 3.3. Representao seqencial (esquerda para direita) da passagem de uma vescula
atravs do poro de um filtro menor do que a estrutura a ser filtrada. A membrana da vescula
rompe durante a passagem da mesma e assim duas novas estruturas menores so formadas.
As flechas indicam a direo do fluxo da filtrao............................................................. 105
Figura 3.4. Distribuies do raio hidrodinmico (R
h
) em funo da amplitude do volume de
distribuio (A) obtidas a partir da anlise das funes de correlao temporal do
Espalhamento de Luz Dinmico para amostras de lipossomas (a, c, e) e quitossomas (b, d, f)
submetidas a diferentes tempos de ultrasonicao sob energia constante: 30 segundos (a, b);
1 minuto (c, d); 5 minutos (e, f).......................................................................................... 109
Figura 3.5. Representao do resultado de Cromatografia em Camada Delgada em placas de
slica gel (eluente: clorofrmio:metanol:gua (6,5:2,5:0,4)) reveladas em atmosfera saturada
de iodo para eluio de amostra de lipossomas e quitossomas antes e aps ultrasonicao
durante 10 minutos. As manchas correspondem ao cido fosfatdico (R
f
= 0,72) (1),
fosfatidilcolina (95%, R
f
= 0,21) (2) e lisofosfatidilcolina (R
f
= 0,07) (3).......................... 110
Figura 3.6. Espectros de SAXS obtidos para uma srie de amostras de lipossomas e
quitossomas com crescente concentrao de quitosana, conforme indicado, filtradas com
membrana de 0,45 m. Os perfis de espalhamento so demonstrados como intensidade de
radiao espalhada (y) em funo do vetor de onda q (x) sem reduo do rudo de
fundo................................................................................................................................... 112
Figura 3.7. Espectros de SAXS com aplicao de funes Lorentzianas (linhas contnuas)
para quitossomas no filtrados e preparados com a soluo de quitosana de 1,00 mg/mL (a),
quitossomas filtrados a 1,20 m e preparados com a soluo de quitosana de 0,50 mg/mL (b)
e lipossomas filtrados a 0,45 m (c)................................................................................... 114
Figura 3.8. Representao idealizada de duas bicamadas de fosfolipdios separadas por uma
camada de molculas de gua. A distncia de repetio d considera a espessura da bicamada
mais a poro aquosa.......................................................................................................... 117
xiv
Figura 3.9. Evoluo percentual relativa das reas da curva extendida (acima) e do primeiro
pico de difrao (abaixo) obtidas pela aplicao de funes Lorentzianas nos espectros de
SAXS das diferentes amostras de vesculas estudadas em funo da concentrao de
quitosana e da filtrao, conforme indicado....................................................................... 119
Figura 3.10. Variao do nmero mdio de bicamadas fosfolipdicas (<N>) obtido pela
largura meia altura do primeiro pico de espalhamento nos espectros de SAXS em estruturas
multilamelares para as diferentes amostras de vesculas estudadas em funo da concentrao
de quitosana e da filtrao, conforme indicado.................................................................. 121
Figura 3.11. Imagens de Microcopia ptica obtidas para amostras em suspenso aquosa de
lipossomas (L) e quitossomas (Q) (1,00 mg/mL de quitosana) no filtrados e filtrados a 0,45
m (LF e QF). A barra representa expanso de 10 m para todas as imagens.................. 125
Figura 3.12. Imagem de Microcopia ptica de Luz Polarizada obtida para uma amostra de
quitossomas no filtrada (1,00 mg/mL de quitosana). A textura em mosaico com a presena
de cruz de Malta caracteriza a organizao do sistema como fase lamelar num lquido
isotrpico. A barra representa expanso de 0,1 m............................................................ 126
Figura 3.13. Imagens de Microscopia Eletrnica de Transmisso obtidas para amostras de
lipossomas (a, b, e, f) e quitossomas (c, d, g, h) (1,00 mg/mL de quitosana) sem nenhum ps-
tratamento (a, b, c, d) e com aplicao de 5 minutos de ultrasonicao sob energia constante
(e, f, g, h). A barra representa expanso de 100 nm........................................................... 128
Figura 3.14. Representao de uma poro da superfcie externa de vescula fosfolipdica
onde as extremidades polares conferem uma superfcie homognea em determinada fase 1 e
uma superfcie no homognea com as extremidades polares desalinhadas na fase 2. As fases
podem ser relacionadas com a intensidade de luz espalhada (I
S
) em funo da temperatura
(T), onde o ponto meia altura da curva corresponde temperatura de transio de fase do
sistema................................................................................................................................ 131
Figura 3.15. Evoluo da intensidade de luz espalhada (I
S
) observada no ngulo de
espalhamento de 135 em funo do aumento da temperatura (T) obtida por Espalhamento de
Luz Esttico para lipossomas (a) e quitossomas contendo a maior concentrao de quitosana
utilizada (1,00 mg/mL) (b).................................................................................................. 132
xv
Figura 3.16. Perfis de difrao de intensidade (I) em funo do vetor de onda (q) obtidos por
SAXS em diferentes temperaturas (C), conforme indicado, para amostras de lipossomas (a)
e quitossomas contendo a maior concentrao de quitosana utilizada (1,00 mg/mL)
(b)........................................................................................................................................ 136
Figura 3.17. Perfis de espalhamento de intensidade em funo do vetor de onda (q) obtidos
por SAXS em diferentes temperaturas, conforme indicado, para amostras de lipossomas (a, c,
e) e quitossomas contendo a maior concentrao de quitosana utilizada (1,00 mg/mL) (b, d,
f). As linhas contnuas mostram o ajuste com funes Lonrentzianas que evidenciam a
presena de picos e curvas. A flecha indica a presena de um ombro extendido ao lado do
primeiro pico para os quitossomas na temperatura de 75 C.............................................. 137
Figura 3.18. Evoluo das distncias de repetio das bicamadas fosfolipdicas (d) obtidas
por SAXS para lipossomas () e quitossomas contendo a maior concentrao de quitosana
utilizada (1,00 mg/mL) () submetidos ao aquecimento.................................................. 139
S
) () observada no ngulo de
utilizada (1,00 mg/mL) (b). Evoluo comparativa das distncias de repetio das bicamadas
fosfolipdicas (d) () obtidas por SAXS e normalizadas em relao ao maior valor
encontrado para lipossomas (a) e quitossomas (b) submetidos ao aquecimento................ 140
Figura 3.20. Variao do Potencial Zeta () para lipossomas e quitossomas com crescente
concentrao polimrica para amostras filtradas a 0,45 m............................................... 144
Figura 3.21. Tempos de recuperao de fluorescncia caractersticos (
q
) em funo do
inverso do vetor de onda ao quadrado (q) obtidos por FRAP para lipossomas com 0,1% de
NBDPC () e quitossomas com quitosana fluorescente (1,00 mg/mL) () em suspenso
aquosa e sonicados por 5 minutos sob energia constante e quitosana fluorescente em soluo
tampo (7).......................................................................................................................... 146
Figura 3.22. Espectros de RMN de
31
P obtidos para lipossomas (coluna esquerda) e
quitossomas preparados com 1,00 mg/mL de quitosana (coluna direita) em diferentes
temperaturas conforme indicado. Os deslocamentos qumicos perpendicular (
) e paralelo
(
II
) so indicados nos espectros superiores....................................................................... 149
xvi
Figura 3.23. Variao do deslocamento qumico de anisotropia () obtido por RMN de
31
P
em funo da temperatura (T) para lipossomas () e quitossomas (). O desvio mximo do
de 2 ppm para todos os pontos................................................................................ 152
Figura 3.24. Imagens de Microscopia ptica do interior das clulas de eletroformao na
produo de vesculas gigantes pelo mtodo tradicional (a) e pelo mtodo modificado com a
adio de quitosana (b) aps trs horas sob ao de campo eltrico constante (1,5 V e 10 Hz)
em soluo de sacarose (0,095 M) na temperatura ambiente (20 C). A barra expande 10
micrmetros........................................................................................................................ 155
Figura 3.25. Imagens de Microscopia ptica de Contraste de Fase de lipossomas gigantes (a)
e quitossomas gigantes (b) dispersos em soluo de glicose (0,099 M). A barra expande 20
micrmetros........................................................................................................................ 156
Figura 3.26. Imagens de Microscopia ptica de Contraste de Fase (a) e de Fluorescncia (b)
para um quitossoma gigante contendo quitosana fluorescente. A barra expande 10
micrmetros........................................................................................................................ 159
Figura 3.27. Imagem de Microscopia ptica de Fluorescncia (a) e de Microscopia ptica de
Contraste de Fase (b) de um quitossoma gigante fluorescente em soluo de glicose (0,099
M). A sobreposio das imagens (c) mostra a co-localizao da quitosana fluorescente com a
membrana da estrutura pela comparao do perfil de intensidade de fluorescncia (grfico
superior) com o perfil da variao de intensidade de cinza (grfico inferior) de uma linha
equatorial sobre ambas as imagens. Nos grficos, em y medida a intensidade de cinza e em
x o nmero de pixels. A barra expande 10 micrmetros..................................................... 161
Figura 3.28. Imagens de Microscopia ptica de Fluorescncia de uma vescula gigante
contendo 1% de NBDPC na membrana (a) e de uma vescula gigante contendo fluorescena
encapsulada no volume do ncleo aquoso (c) e o correspondente perfil de distribuio da
intensidade de fluorescncia sobre uma linha equatorial de cada imagem (b e d). Os pontos
nos grficos representam os resultados experimentais e as linhas cheias os clculos tericos
obtidos pela convoluo da funo de propagao pontual do microscpio e a intensidade de
fluorescncia emitida unicamente pela membrana (b) ou unicamente pelo volume (d) de cada
vescula............................................................................................................................... 162
xvii
Figura 3.29. Intensidade de fluorescncia em funo da rea de superfcie de quitossomas
gigantes para concentraes relativas de 3 (), 6 () e 12 % () de quitosana fluorescente
adicionada na produo das estruturas................................................................................ 164
Figure 3.30. Fluorescncia por unidade de superfcie ( = F/S) obtida a partir da
extrapolao das contribuies de quitossomas gigantes de variados dimetros em funo da
concentrao relativa de quitosana (f) adicionada na produo das estruturas................... 165
Figura 3.31. Imagem de Microscopia ptica de Fluorescncia de um quitossoma gigante com
as anlises do perfil de distribuio da intensidade de fluorescncia sobre a linha horizontal
em cinco diferentes regies de alto a baixo da vescula. Nos grficos, em y medida a
intensidade de cinza e em x o nmero de pixels. A linha expande 50 micrmetros........... 166
Figura 3.32. Imagens de Microscopia ptica de Fluorescncia de dois quitossomas gigantes
com as respectivas anlises do perfil de distribuio da intensidade de fluorescncia sobre as
linhas horizontais. As setas indicam agregados de quitosana fluorescente. Nos grficos, em y
medida a intensidade de cinza e em x o nmero de pixels. As linhas expandem 100
micrmetros........................................................................................................................ 167
Figura 3.33. Intensidade de fluorescncia (I) em funo da concentrao de quitosana
fluorescente em soluo tampo (filtrada a 0,22 m) a 515 () e 533 nm ()................... 169
Figura 3.34. Intensidade de fluorescncia (I) em funo da concentrao de NBDPC contida
em lipossomas namomtricos em suspenso aquosa a 515 () e 533 nm ().................... 170
Figura 3.35. Variao temporal da intensidade de fluorescncia por unidade de superfcie ()
para quitossomas gigantes preparados com trs diferentes concentraes de quitosana
fluorescente: 0,94 (), 1,88 () e 3,75% () (m/m). As linhas horizontais pontilhadas
mostram os valores mdios para cada ............................................................................. 174

xviii
ndice de Tabelas

Tabela 1.1. Temperaturas de transio de fase caractersticas de fosfolipdios de extremidade
polar e cadeias hidrocarbonadas idnticas e saturadas relacionadas com o nmero de
carbonos presentes em cada cadeia....................................................................................... 19
Tabela 3.1. Variao da intensidade de luz espalhada (I
S
), do coeficiente de difuso diluio
infinita (D
o
), do raio hidrodinmico (R
h
), do ndice de polidisperso (Poly), do raio de giro
(R
g
) e da relao entre os raios ( = R
g
/R
h
) para as diferentes amostras estudadas atravs do
Espalhamento de Luz: vesculas filtradas a 0,45 m (a), vesculas filtradas a 1,20 m (b) e
vesculas no filtradas (c)................................................................................................... 102
Tabela 3.2. Coeficiente virial dinmico (k
D
) obtido por Espalhamento de Luz Dinmico para
amostras de lipossomas e quitossomas com concentrao polimrica crescente............... 106
S
infinita (D
o
h
(R
g
), da relao entre os raios ( = R
g
/R
h
), obtidos por Espalhamento de Luz e da distncia
de repetio das bicamadas fosfolipdicas (d), da razo de rea entre a curva extendida (2) e o
primeiro pico de difrao (1) e o nmero mdio de bicamadas fosfolipdicas em vesculas
multilamelares (<N>), obtidos por SAXS, para as diferentes amostras estudadas: vesculas
filtradas a 0,45 m (a), vesculas filtradas a 1,20 m (b) e vesculas no filtradas (c)...... 116
Tabela 3.4. Resultados para dimetro do ncleo aquoso (D
n
) e volume aquoso encapsulado
(V) no ncleo das vesculas filtradas a 0,45 m em funo da concentrao de quitosana. Os
valores so mdios e foram obtidos pela relao entre resultados de Espalhamento de Luz e
SAXS.................................................................................................................................. 122
Tabela 3.5. Valores obtidos para os coeficientes de difuso (D) para as diferentes amostras
fluorescentes estudadas por FRAP e raios hidrodinmicos aparentes (R
h
) para vesculas no
fluorescentes (mdia distribuio) e quitosana no fluorescente obtidos por Espalhamento
de Luz Dinmico................................................................................................................. 147

xix
Resumo

Lipossomas so vesculas coloidais onde uma membrana formada por uma ou mais
bicamadas fosfolipdicas encapsula um ncleo aquoso. Atravs do mtodo da evaporao em
fase reversa foram produzidos lipossomas nanomtricos modificados com a incorporao de
quitosana, um polissacardeo com caractersticas vantajosas para o sistema compsito
resultante. Lipossomas micromtricos compsitos tambm foram produzidos atravs de uma
modificao no mtodo da eletroformao de vesculas gigantes a partir de uma emulso
precursora.
Os estudos fsico-qumicos e estruturais desenvolvidos identificaram uma srie de
alteraes no sistema vesicular geradas pela presena da quitosana sob diferentes condies
energticas e de mtodos de padronizao estrutural. Lipossomas nanomtricos compsitos
apresentaram tamanhos, nmero de bicamadas, distncias de repetio de bicamadas,
coeficiente de difuso em suspenso aquosa, interao com o meio aquoso e volume aquoso
encapsulado que variaram com a presena e concentrao do polmero e com a utilizao ou
no de filtrao e ultrasonicao na sua preparao. As modificaes foram avaliadas
considerando aspectos energticos e de organizao molecular.
Com um significativo aumento de temperatura foram obtidas variaes estruturais
atenuadas nas vesculas compsitas em comparao com vesculas isentas de quitosana.
Desta forma foi idendificada uma estabilidade fsica maior como resultado da dissipao de
energia trmica devido presena do polmero.
O potencial superficial e o diferenciado coeficiente de difuso em suspenso aquosa
mostraram a incorporao efetiva da quitosana nas estruturas. As alteraes de mobilidade do
grupo fosfato indicaram interaes eletrostticas entre o polmero e os fosfolipdios.
A modificao do mtodo da eletroformao mostrou a viabilidade de incorporao
da quitosana na produo de vesculas micromtricas. A localizao do polmero nas
vesculas resultantes foi identificada na membrana das estruturas e o mesmo mostrou
estabilidade de incorporao. Assim, pde ser procedida a determinao quantitativa de
polmero por unidade de superfcie da membrana fosfolipdica das vesculas compsitas que
correspondeu a 0,2 mg de quitosana por metro quadrado de rea de superfcie, considerando
os dois lados da membrana fosfolipdica.

xx
Abstract

Liposomes are colloidal vesicles where a membrane formed by one or more
phospholipid bilayers encapsulates an aqueous core. Using the reverse phase evaporation
method, modified nanometric liposomes were produced with the incorporation of chitosan, a
polysaccharide with profitable characteristics for the resulting composite system.
Micrometric composite liposomes were also produced by a modification on the
electroformation method used to prepare giant vesicles through the application of a precursor
emulsion.
Structural and physico-chemical studies identified a series of alterations in the
vesicular system generated by the presence of chitosan under different energetic conditions
and methods of structure standardization. Nanometric composite liposomes featured sizes,
number of bilayers, repeat distances of bilayers, diffusion coefficient in aqueous suspension,
interactions with the aqueous media and encapsulated aqueous volume which varied with the
presence and concentration of the polymer and with the application or not of filtration and
sonication on the preparation method. The modifications were evaluated considering
properties of energy and organization at the molecular level.
Under a considerable increase of temperature, attenuated structural variations were
obtained in the composite vesicles in comparison with the vesicles free of chitosan. In this
way, a higher physical stability was identified as a result of thermal energy dissipation due to
the presence of the polymer.
The superficial potential and the distinguished diffusion coefficient in aqueous
suspension showed the effective incorporation of chitosan in the structures. The alteration of
the mobility of the phosphate group indicated electrostatic interactions between the polymer
and the phospholipids.
The modification of the electroformation method showed the practicable of chitosan
incorporation in the production of micrometric vesicles. The localization of the polymer in
the resulting vesicles was identified on the membrane of the structures, which showed
stability of incorporation. Besides, it was possible to determine the quantity of polymer per
unit of phospholipidic membrane surface of the composite vesicles corresponding to 0.2 mg
of chitosan per square meter of phospholipids, considering the two sides of the membrane.

xxi
Resum

Les liposomes sont des objets du monde collodal, composs dune membrane
comportant une ou plusieurs bicouches de phospholipides qui encapsule un noyau aqueux.
Grce la mthodologie de lvaporation en phase inverse, des liposomes nanomtriques
modifis par lincorporation de chitosane ont t fabriqus. Ce polysaccharide confre des
proprits intressantes au systme composite rsultant. Des liposomes composites
micromtriques ont galement t produits, par une modification de la mthodologie
dlectroformation de vsicules gantes, partir dune mulsion inverse comme prcurseur.
Les tudes physico-chimiques et structurales que nous avons ralises ont permis
didentifier de nombreuses altrations dans le systme vsiculaire, comme consquence de la
prsence du chitosane, mais aussi sur des diffrentes conditions de transfert dnergie et
dhomognisation structurale. Nous avons caractris la variation i) de la taille, ii) du
nombre de bicouches, iii) de la distance moyenne entre bicouches, iv) du coefficient de
diffusion en suspension, v) de linteraction avec le milieu aqueux et vi) du volume aqueux
encapsul, des liposomes nanomtriques composites en fonction des paramtres de
prparation suivants : concentration en polymre, utilisation ventuelle de filtration et
dultrasons. Les modifications observes ont t interprtes en considrant les
caractristiques dnergie et dorganisation molculaire.
Nous avons dmontr que lors dune considrable augmentation de temprature, les
importantes variations structurales observes pour les vsicules sans chitosane sont trs
attnues dans le cas des vsicules composites. Ainsi, une plus grande stabilit physique a t
attribue aux vsicules composites, comme rsultat de la dissipation dnergie thermique par
le polymre incorpor. Les tudes du potentiel de surface, et du coefficient de diffusion
diffrenci en suspension aqueuse, montrent lefficacit de lincorporation du chitosane dans
les liposomes. La mesure de laltration de mobilit du groupe phosphate indique lexistence
dinteractions lectrostatiques entre le polymre et les phospholipides.
Nous avons ainsi prouv la viabilit de lincorporation de chitosane dans des
vsicules micromtriques au moyen dune mthode dlectroformation modifie. Nous avons
pu localiser le polymre sur la membrane de ces structures, et nous avons montr leur grande
stabilit temporelle. Nous avons enfin dtermin de faon quantitative la densit de surface
de polymre sur les membranes de phospholipide dans ces vsicules composites.
1
Captulo 1. Introduo

1.1. Consideraes Preliminares

Os sistemas vesiculares representam uma vasta rea de estudos multidisciplinares
que tm produzido conceitos fundamentais na interface entre a Fsica, a Qumica e a Biologia
que muitas vezes resultam em aplicaes na Farmcia, Medicina e Engenharias. Cada
sistema vesicular nico e deve ser descrito quanto s suas propriedades fsicas e estruturais,
dentro de situaes especficas e atravs de parmetros definidos e razoavelmente
controlados, objetivando um desempenho adequado sob condies pr-estabelecidas.
Os estudos fsico-qumicos e estruturais desenvolvidos na presente tese, tm como
objetivo principal o desenvolvimento de um sistema vesicular especfico no qual a introduo
de um polmero de propriedades conhecidas proporciona caractersticas diferenciadas e que
podem ser vantajosas em determinadas condies ambientais de aplicao. O sistema
vesicular, definido como lipossoma, estruturalmente constitudo de fosfolipdios e foi aqui
estudado em suspenso aquosa. O polmero quitosana, um polissacardeo que tem atrado um
interesse crescente especialmente em sistemas aplicveis nas reas de Farmcia e Medicina,
foi incorporado em lipossomas na produo de um sistema vesicular compsito polmero-
fosfolipdio, aqui nomeado como quitossoma. A incorporao do polmero foi efetivada
atravs de uma metodologia peculiar e os efeitos resultantes dessa incorporao foram
investigados atravs de uma diferenciada gama de tcnicas experimentais, relevantes para os
estudos fsico-qumicos e estruturais.
Nas Sesses subseqentes do Captulo 1, atravs da reviso bibliogrfica, so
introduzidas as definies do sistema vesicular em questo com a descrio de variveis
estruturais pertinentes. Um breve histrico tambm resume o estado da arte desse tipo de
sistema desde a sua descoberta e evoluo at os dias atuais.
A partir de um contexto mais fundamental, a composio molecular e estrutural
detalhada visando a compreenso do sistema na sua organizao molecular. As diferentes
interaes moleculares so relacionadas com aspectos fsico-qumicos na interpretao da
estruturao energeticamente mais favorecida, bem como na avaliao de parmetros de
estabilidade.
2
A dinmica molecular inerente ao sistema fosfolipdico, representado pelos
lipossomas, considerada atravs de diferentes fenmenos de difuso. Os processos de
transio de fase, tpicos de sistemas lipdicos, so descritos em funo dos fatores
moleculares e energticos que resultam em conformaes caractersticas das diferentes
mesofases. A importncia cientfica e tecnolgica dos lipossomas descrita para diversas
reas, evidenciando o potencial aplicativo destes sistemas vesiculares.
De forma paralela, tambm apresentada uma reviso bibliogrfica da quitosana,
bem como do seu polmero precursor, a quitina. Aspectos importantes como origem,
propriedades fsicas e estruturais e solubilidade so considerados. Igualmente descrita a
importncia cientfica e tecnolgica com a variada gama de aplicaes.
A incorporao da quitosana em lipossomas vem sendo desenvolvida na pesquisa
h alguns anos. Diferentes formas dessa incorporao so descritas juntamente com
resultados promissores de potenciais de aplicao apresentados na literatura.
No Captulo 2 so descritas as metodologias, materiais e equipamentos utilizados
em todos os procedimentos experimentais efetuados, bem como as fundamentaes das
tcnicas empregadas para os diversos estudos desenvolvidos. A modificao de uma
metodologia de preparao de um tipo especfico de vescula foi desenvolvida para
proporcionar a incorporao da quitosana e as etapas envolvidas so detalhadas.
No Captulo 3, nos resultados e discusses, so avaliados primeiramente aspectos
estruturais das vesculas a partir dos dados obtidos pelas tcnicas de Espalhamento de Luz,
Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo, Microscopia ptica e Microscopia Eletrnica de
Transmisso. Os resultados das diferentes tcnicas so inter-relacionados para a proposio
de um modelo supramolecular dos sistemas.
As transies de fase, que qualificam propriedades fsico-qumicas e estruturais de
sistemas vesiculares sob variao de condies energticas, so discutidas a partir dos
parmetros e resultados de Espalhamento de Luz Esttico e Espalhamento de Raios-X a
Baixo ngulo. Os resultados das duas tcnicas tambm so relacionados na avaliao das
diferenas ocasionadas no sistema pela presena da quitosana.
A dinmica resultante da composio molecular e organizao supramolecular
relacionada com a estabilidade fsica dos sistemas e juntamente com a avaliao da
localizao da quitosana nas vesculas compsitas, a interao molecular entre fosfolipdios e
quitosana discutida. Nestas questes, os resultados produzidos pelas tcnicas de Potencial
3
Zeta, Recuperao de Fluorescncia Aps Foto-Branqueamento e Ressonncia Magntica
Nuclear de Fsforo mostram-se significativamente produtivas.
Nos estudos com vesculas gigantes, observveis com microscpio ptico, feita a
avaliao da modificao do seu processo de formao aqui proposto. Por meio da
Microscopia ptica de Fluorescncia procedida a localizao, a quantificao e o estudo da
estabilidade fsica da quitosana nas estruturas compsitas.
A avaliao de aspectos aplicativos procedida a partir de perspectivas geradas das
investigaes na presente Tese e igualmente de resultados preliminares gerados por estudos
in vitro e in vivo.
Por fim, no Captulo 4, so relatadas as concluses principais resultantes de cada
tpico especfico. A abordagem remete aos objetivos de forma que o sistema vesicular
compsito avaliado em diversos aspectos da sua fsico-qumica e estruturao em funo
das modificaes resultantes da incorporao da quitosana.

1.2. Lipossomas

Lipossomas so vesculas lipdicas coloidais organizadas por interaes de
polaridade e apolaridade. As estruturas mais conhecidas, como ilustradas na Figura 1.1,
consistem em uma membrana formada por uma dupla camada de fosfolipdios, molculas
que apresentam uma ou duas longas cadeias hidrocarbonadas apolares ligadas a uma
extremidade polar contendo um grupo fosfato. As cadeias apolares das molculas das duas
camadas interagem entre si. Desta forma, as molculas das duas camadas ficam posicionadas
de forma invertida com as extremidades polares voltadas para fora nos dois lados da
membrana. Esta membrana ou lamela, por sua vez, forma uma esfera que normalmente
contm um lquido polar no seu interior e que pode ser o mesmo lquido onde a esfera est
dispersa. Os tamanhos dos lipossomas podem variar dentro de uma relativa ampla faixa de
dimenses: de algumas dezenas de nanmetros a algumas centenas de micrmetros.
1,2
Existe uma gama variada de lipossomas no que concerne sua composio
molecular, estruturao e tamanhos. Lipossomas clssicos ou convencionais, formados
apenas por uma ou por mais de uma membrana fosfolipdica, so diferenciados de acordo
com seus tamanhos, morfologias, nmero e disposio das bicamadas fosfolipdicas. Os
lipossomas mais comumente produzidos so distinguidos pelas seguintes categorias:
2-4

4
a. Lipossomas unilamelares pequenos (Small Unilamelar Vesicles SUVs): a
membrana formada por uma nica bicamada fosfolipdica; so os menores na
escala de tamanhos, com dimetros variando entre 20 e 80 nm.
b. Lipossomas unilamelares grandes (Large Unilamellar Vesicles LUVs): a
membrana formada por uma nica bicamada fosfolipdica; so intermedirios
na escala de tamanhos, com dimetros variando entre 80 nm e 1 m.
c. Lipossomas multilamelares (Multilamelar Vescicles MLVs): a membrana
formada por vrias bicamadas fosfolipdicas dispostas de forma concntrica;
apresentam um dimetro mdio que varia entre 400 nm e alguns micrmetros.
d. Lipossomas multivesiculares (Multivesicular Liposomes MVLs): de certa
forma semelhantes aos MLVs, porm as bicamadas no so concntricas, o que
torna a vescula uma estrutura mais complexa, com um lipossoma que contm
vrios lipossomas encapsulados de foram aleatria e inclusive com membranas
bastante curvadas ou deformadas; tambm podem ser chamados de sistemas de
vescula em vescula e normalmente so estruturas mal formadas nos processos
de obteno dos outros tipos; a faixa de dimetros tambm varia como para
MLVs, entre 400 nm e alguns micrmetros.
e. Lipossomas gigantes (Giant Vesicles GVs): normalmente so formados por
uma nica bicamada fosfolipdica sendo assim designados como lipossomas
unilamelares gigantes (Giant Unilamelar Vesicles GUVs); so os maiores com
dimetros superiores a 1 m podendo chegar a dezenas de micrmetros.

O processo de preparao de lipossomas crucial para delinear o tipo de estrutura a
ser obtida. Na preparao clssica,
5
a qual continua sendo a mais difundida na literatura, os
fosfolipdios so dissolvidos num solvente orgnico dentro de um balo de vidro. O solvente
evaporado sob rotao constante do balo de forma a produzir um filme fino de
fosfolipdios na parede interna do balo. A seguir, adiciona-se gua ou tampo para
hidratao do filme. Agitao, ultra-agitao, sonicao e aquecimento podem ser aplicados
nessa etapa para auxiliar no processo de formao das duplas camadas que iro se auto-
organizar nos lipossomas encapsulando a gua ou o tampo no seu interior. Este processo de
preparao designado como mtodo da hidratao do filme.

5

Figura 1.1. Representao de um lipossoma dividido ao meio para evidenciar a sua
estruturao interna constituda de um ncleo polar cercado por uma bicamada de
fosfolipdios.

Normalmente os lipossomas obtidos por esse processo clssico so malformados e
apresentam uma enorme variao de tamanhos, parmetros que limitam a sua aplicao tanto
na pesquisa como na indstria. Assim, aps a preparao, os lipossomas podem ser
submetidos a tratamentos como agitao, ultra-agitao, sonicao, filtrao, extruso e
dilise, para a sua homogeneizao estrutural.
1-4
Porm, uma diferenciada gama de processos de preparao tem sido desenvolvida
para otimizao estrutural, capacidade de encapsulamento e reteno de material
encapsulado, rendimento e adaptao ao escalonamento.
2
A maioria desses processos
especfica para a produo de lipossomas de caractersticas peculiares e podem ser facilmente
encontrados na literatura. Alguns dos mais importantes j foram descritos na Dissertao de
Mestrado do mesmo autor.
3
Aqui ser tratada a evaporao em fase reversa (Sesso 2.2.1)
desenvolvida por Szoka e Papahadjopoulos em 1978 para a obteno de lipossomas
unilamelares grandes com alta capacidade de encapsulamento de substncias hidroflicas.
6
O
processo foi adaptado para a incorporao de quitosana nos trabalhos da Dissertao e da
presente Tese.
3,7
A eletroformao, metodologia desenvolvida por Angelova e Dimitrov em 1986
para a produo de lipossomas unilamelares gigantes,
8
tambm ser abordada (Sesso 2.9.1),
sendo que a mesma foi aperfeioada para a incorporao de quitosana (Sesso 2.9.2).

6
1.2.1. Breve Histrico

Em meados de 1965 Alec Bangham e colaboradores publicaram os resultados de
uma investigao fundamental a respeito da difuso de ons atravs de membranas lipdicas
artificiais.
5
Neste trabalho foi caracterizado um sistema de vesculas fosfolipdicas que trs
anos mais tarde foram denominadas de lipossomas, embora estas estruturas multilamelares
obtidas da hidratao de fosfolipdios j fossem conhecidas como figuras de mielina.
9,10
Nos anos seguintes os lipossomas passaram a assumir um sistema modelar simples
para o estudo de membranas biolgicas. A incorporao de enzimas em lipossomas
11

despertou o interesse da comunidade cientfica para fins de aplicao mdica e
farmacolgica.
Com o objetivo de desenvolver um sistema eficaz para o encapsulamento e
transporte de frmacos, o que j vinha sendo idealizado h muitos anos, Gregory Gregoriadis
props em 1971 a utilizao de lipossomas com essa finalidade.
12
Seguiu-se uma euforia na
dcada de 70 e incio da dcada de 80, devido ao potencial de aplicao dos lipossomas na
indstria farmacutica, o que resultou em questionamentos e mesmo dvidas a respeito de
alguns resultados da poca.
10,13
Nos anos seguintes foram surgindo sistemas variados, complexos e de alta
especificidade para aplicao como carreadores de frmacos. Alguns exemplos:
nanopartculas polimricas, co-polmeros, lipoprotenas, emulses, peptdeos e anticorpos.
14-
18
Os lipossomas seguiram a mesma tendncia de aumento da sua especificidade para a
aplicao com um objetivo pr-estabelecido, o que significa dizer que o design estrutural,
fsico-qumico e molecular tornou-se diretamente dependente do desempenho esperado num
meio de ao especfico.
Grandes centros de pesquisa dedicados ao desenvolvimento de lipossomas
carreadores de frmacos surgiram especialmente nos Estados Unidos, tendo amplos subsdios
governamentais e principalmente o patrocnio da indstria farmacutica.
19
Atravs da
pesquisa direcionada, o mundo viu nascer os primeiros lipossomas comerciais de eficcia
comprovada e com aprovao do Food and Drug Administration (FDA). Os exemplos
clssicos so o Doxil (carreador do agente anti-cancergeno doxorubicina, utilizado no
tratamento do sarcoma de Kaposi e cncer ovariano, no mercado desde 1995), Daunoxome
(carreador do anti-cancergeno citrato de daunorubicina para tratamento quimioterpico do
7
sarcoma de Kaposi em pacientes de baixa imunidade, no mercado desde 1996) e
Ambisome (para tratamento de infeces causadas por fungos, no mercado desde 1990).
Estes liposomas especficos atingiram os objetivos de otimizao do tratamento com drstica
ou mesmo total eliminao dos efeitos colaterais relacionados com a administrao do
frmaco.
19-25

Paralelamente, a pesquisa fundamental lanou mo de lipossomas como um sistema
modelo de alta potencialidade para estudos de interaes moleculares, de membranas
celulares, de fotosnteses, de catlise, transies de fase de lipdios e muitos outros como
detalhado na Sesso 1.2.4.
26-35
A pesquisa bsica, tendo sua importncia fundamental na
compreenso fenomenolgica e no desenvolvimento de qualquer produto ou metodologia, foi
e sempre ser a ferramenta necessria para abrir caminhos e proporcionar solues em todas
as reas do conhecimento.

1.2.2. Composies Molecular e Estrutural

De forma geral as molculas podem ser divididas em polares ou apolares
considerando a sua simetria e a distribuio das suas nuvens eletrnicas. Algumas molculas,
porm, so constitudas de uma regio polar e uma regio apolar na mesma estrutura, ligadas
de forma covalente. Estas ltimas so chamadas de molculas anfiflicas e justamente devido
a esta caracterstica elas apresentam a propriedade de auto-organizao produzindo diferentes
estruturas em solventes ou solues. No processo auto-associativo a orientao das molculas
evidentemente obedece ao estado de menor energia termodinmica: as regies polares em
contato com regies polares e meio polar e as regies apolares com as apolares e meio
apolar. Representando uma molcula anfiflica numa configurao de crculo (parte polar)
com cauda (parte apolar), a Figura 1.2 exemplifica distintas organizaes estruturais de
molculas anfiflicas e as suas respectivas nomenclaturas.
2,4,19
A simetria da auto-organizao est relacionada com a forma da molcula anfiflica.
Assim, definindo a rea da regio polar como A
p
e a da regio apolar como A
ap
, em situaes
onde A
p
> A
ap
a formao de estruturas de alta curvatura, tais como micelas, favorecida.
Para reas semelhantes, com A
p
A
ap
, a organizao em bicamadas ou lamelas mais
provvel. Quando A
p
< A
ap
, micelas inversas so mais favorecidas. A Figura 1.3 ilustra como
a geometria molecular pode influenciar a simetria da organizao molecular.
19
8

Figura 1.2. Representao de diferentes organizaes estruturais de molculas anfiflicas e as
suas respectivas nomenclaturas.
2,4,19

As molculas anfiflicas mais comuns que se organizam em bicamadas ou lamelas
so os fosfolipdios de duas cadeias hidrocarbonadas. Um fosfolipdio comum, como
apresentado na Figura 1.4, apresenta duas molculas de cido graxo esterificadas ao primeiro
e ao segundo grupo hidroxila do glicerol. O terceiro grupo hidroxila do glicerol forma uma
ligao ster com o cido fosfrico. Os fosfoglicerdios ainda contm um segundo lcool
esterificado ao cido fosfrico formando assim a parte polar da molcula. Na Figura 1.4.a
apresentada a estrutura da dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), onde a regio polar formada
pelo grupo alcolico colina (HO-CH
2
-CH
2
-N
+
-(CH
3
)
3
) e as cadeias hidrocarbonadas por dois
cidos palmticos (cadeia aclica de 16 carbonos).

9

Figura 1.3. Representao de possveis formas de molculas anfiflicas relacionadas com a
simetria da organizao estrutural e respectivas fases mais provveis de estruturas
coloidais.
19

A classificao dos fosfolipdios est relacionada com aspectos estruturais dos
grupos polares e das cadeias aclicas. Os grupos polares podem ser zwiterinicos (nutros) ou
carregados. A fosfatidilcolina apresentada na Figura 1.4.a um fosfolipdio zwiterinico,
pois o grupo fosfato tem carga negativa em pH 7 e o grupo colina carregado positivamente.
Em fosfolipdios carregados, a regio polar possui uma nica carga, como exemplificado na
Figua 1.4.b com o dioleoil fosfatidilglicerol (DOPG). J na regio apolar, as cadeias
hidrocarbonadas variam pelo nmero de carbonos e pelo grau de saturao. Com a variao
desses parmetros estruturais so obtidas bicamadas que constituem membranas sintticas ou
biolgicas de fluidez e caractersticas especficas ajustadas de acordo com a sua designada
funo.
2,4
10

Figura 1.4. Estruturas moleculares da 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (a) e
do 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (DOPG) (b).

O modelo clssico de membrana biolgica formada por bicamada de fosfolipdios
a membrana celular, chamada de modelo do mosaico fludo devido sua composio
fosfolipdica de alta fluidez incrustada de grupos funcionais como as protenas.
36
Os esforos
da biologia no sentido de compreender as paredes celulares contriburam de maneira
determinante para a compreenso moderna de membranas auto-associadas.
Para a formao das membranas ou bicamadas fosfolipdicas, considerando um
meio aquoso, as interaes de polaridade e apolaridade apresentam as suas peculiaridades.
Interaes polares ocorrem entre as partes polares das molculas com o meio polar formando
ligaes de hidrognio com a gua, o que pode ser denominado como interao hidroflica.
As partes polares tambm interagem entre si por atrao eletrosttica bem como atravs de
ligaes de hidrognio, no sentido de estabilizar a estrutura da membrana.
1,2,19, 37
Porm a formao das membranas governada principalmente pelas interaes
apolares entre as cadeias hidrocarbonadas, que podem ser designadas como interaes
hidrofbicas num meio aquoso. Quando os fosfolipdios so colocados na gua, o fenmeno
da auto-associao acontece principalmente devido ao vigor das ligaes de hidrognio da
gua que devem ser rompidas para proporcionar a dissoluo de alguma molcula. Em se
tratando de um soluto inico ou polar, ocorrem ligaes fortes do mesmo com as molculas
P
O
-
O
O
N
+ O
H
O
O
O
O
H
OH
OH
P
O
-
O
O
O O
O
O
O
b
a
11
de gua e que so energeticamente favorveis para romper as ligaes de hidrognio entre as
molculas de gua. Por outro lado, em se tratando de molculas apolares, no existe
compensao energtica para o rompimento das ligaes de hidrognio da gua. Assim, a
chamada interao hidrofbica, que proporciona a auto-associao das bicamadas
fosfolipdicas, governada pelo favorecimento energtico da manuteno das ligaes de
hidrognio entre as molculas de gua, ou seja, no estado de menor energia as regies
apolares permanecem unidas para proporcionar uma menor superfcie de contato destas
regies com as molculas de gua.
37,38
De menor importncia devido sua natureza de ligao fraca so as foras de van
der Waals entre as cadeias hidrocarbonadas. Embora fracas, elas tambm contribuem de
maneira significativa devido grande quantidade de interaes desse tipo que se formam no
sistema, especialmente pelo elevado nmero de metilas das cadeias apolares.
37,38
Teoricamente, na termodinmica da interao hidrofbica, a energia livre de
transferncia G
tr
de um composto apolar a partir de um estado de referncia, como um
solvente orgnico, para a gua, composta de um termo de entalpia H
tr
e de um termo de
entropia -TS:
G
tr
= H
tr
- TS (1.1)

Na temperatura ambiente a entalpia de transferncia desprezvel, pois a entalpia
de interao equivalente na soluo orgnica e na soluo aquosa. A variao de entropia,
entretanto, negativa. A gua tende a organizar os grupos apolares em compartimentos
ordenados o que leva a uma diminuio da entropia. Por outro lado, em temperatura elevada
(acima de 100 C) estes compartimentos podem ser rompidos porque a matriz formada pelas
ligaes de hidrognio no mais estvel e assim a contribuio da entropia tende a zero. A
entalpia de transferncia, porm, positiva neste caso (desfavorvel).
37,38
No processo de auto-associao de bicamadas fosfolipdicas num sistema aquoso,
as estruturas resultantes termodinamicamente mais favorecidas so os lipossomas, onde as
bicamadas formam esferas nano ou micromtricas. As esferas habitam no meio aquoso e
possuem o mesmo meio aquoso encapsulado no seu ncleo. Embora muitos autores
sustentem que lipossomas podem ser obtidos de forma espontnea pela hidratao de
lipdios, na prtica poucas estruturas so formadas sem a transferncia de alguma energia
significativa. De fato, lipossomas no representam estruturas termodinamicamente estveis,
12
assim no podem ser obtidas de forma espontnea. A curvatura da membrana, necessria
para que a estrutura assuma a forma esfrica, necessita de energia para ser viabilizada.
Portanto, para a produo de lipossomas alguma energia, seja ela trmica ou mecnica por
meio de aquecimento, agitao, sonicao ou extruso, deve ser fornecida ao sistema.
1,19
Por outro lado, aps a formao, os lipossomas so considerados cineticamente
estveis apesar da sua baixa estabilidade termodinmica. Isso pode ser interpretado
considerando que a energia necessria para abrir um orifcio na membrana do lipossoma,
suficiente para romper ou desestruturar a membrana, seria maior do que a energia despendida
para manter a estrutura esfrica.
1,19

A estabilidade de lipossomas pode ser dividida em estabilidade fsica, qumica e
biolgica, sendo que todas elas esto relacionadas. Do ponto de vista industrial, para a
obteno de produtos farmacuticos e cosmticos, as estabilidades fsica e qumica so
delineadas pela uniformidade de distribuio de tamanhos (baixo ndice de polidisperso de
tamanho de vesculas), eficincia de encapsulamento e degradao mnima de todos os
compostos. Pela otimizao da distribuio de tamanhos, ajustes de pH e fora inica, bem
como a adio de anti-oxidantes e agentes de gelificao, formulaes em suspenso lquida
de lipossomas podem ser estabilizadas por vrios anos. Mais alm, a adio de crioprotetores
permite a liofilizao de lipossomas (processo de congelamento brusco seguido de
sublimao do lquido de suspenso e recuperao de lipossomas em p) e o seu
armazenamento em temperaturas baixas.
19,39-41
A estabilidade biolgica, porm, depende de fatores mais complexos, pois est
relacionada com a presena de agentes que interagem com os lipossomas no seu meio de
aplicao. Para situaes de aplicao in vivo, por exemplo, a estabilidade biolgica tambm
depende da forma como os lipossomas so administrados.
19,41
Problemas de instabilidade coloidal, como fenmenos de agregao, podem ser
resolvidos pela adio de cargas (uso de fosfolipdios carregados) ou modificaes na fora
inica do meio de disperso. De forma alternativa, a estabilizao estrica com o uso de
molculas quimicamente ligadas ou que interagem com a superfcie do lipossoma tem-se
mostrado significativamente vantajosa. Desta forma, tanto a estabilidade coloidal ou em
suspenso, como a estabilidade biolgica, foram drasticamente modificadas pelo
revestimento dos lipossomas com polmeros inertes e hidroflicos.
1,19,42,43
13
Especificamente para lipossomas designados para aplicaes intravenosas, a
estabilizao estrica com o uso de polmeros tornou-se crucial para a produo de
lipossomas de prolongada circulao sangunea. A estabilizao estrica confere a
propriedade de extravasar os sistemas de defesa do organismo como as clulas do sistema
fagocitrio mononuclear, responsveis pela captao e transporte at o fgado e bao para
eliminao de qualquer substncia estranha na corrente sangunea. Tais lipossomas so
designados como lipossomas furtivos ou de longa circulao.
19,43,44
O lipossoma furtivo mais desenvolvido possui o polmero poli(etilenoglicol) (PEG)
revestindo as esferas. As cadeias hidratadas de PEG criam uma barreira retardando a
absoro de opsinas, que so reconhecidas pelos sistema fagocitrio mononuclear.
19,44,45
No caso de revestimento polimrico, a estabilidade desejada depende da densidade
da cadeia polimrica ou a distncia entre os pontos de ligao de uma cadeia polimrica com
a membrana do lipossoma (D) e do grau de polimerizao (N). Assim, a espessura do
revestimento polimrico (E) pode ser calculada:

E = DN (f / D)
3/5
(1.2)

onde f representa o tamanho do monmero.
19,46,47
Resultados de pesquisa demonstram que
um revestimento polimrico com espessura aproximada de 10% do dimetro da partcula
representa boa estabilidade.
44
Alm dos lipossomas furtivos, muitas outras variveis surgiram e esto sob
investigao e desenvolvimento: os imunolipossomas, que possuem ligantes especficos na
superfcie externa, como anticorpos que interagem com clulas de determinados tecidos;
lipossomas fusognicos, compostos de lipdios catinicos que podem condensar molculas de
DNA e aumentar a transfeco de gens; magnetolipossomas, os quais encapsulam um ferro
fludo coloidal permitindo que as estruturas sejam orientadas a pontos especficos pela ao
de um campo magntico; lipossomas elsticos, compostos de fosfolipdios e surfactantes que
proporcionam alta elasticidade e deformabilidade na estrutura; quitossomas, revestidos com o
polmero quitosana que lhes confere propriedades especficas, descritas na Sesso 1.4.
3,7,48-58

14
1.2.3. Dinmica Molecular e Transies de Fase

Para o estudo fsico-qumico de lipossomas, a compreenso de fenmenos fsico-
estruturais inerentes bicamada fosfolipdica so de suma importncia. A bicamada
fosfolipdica, seja ela de uma membrana celular ou produzida artificialmente no caso de
lipossomas, constitui uma estrutura dinmica passvel de sofrer deformaes, de abrir e
fechar poros, de sofrer fuses e permitir o deslocamento lateral de seu material estrutural. A
fluidez da bicamada delineada por diferentes tipos de movimentos moleculares:
4,59
a. Difuso lateral: as molculas da bicamada, os fosfolipdios, se deslocam de forma
aleatria dentro da camada em que esto localizadas; esta a forma de difuso que requer a
menor energia para acontecer, sendo assim a mais freqente; coeficientes de difuso lateral
considerados de longa distncia podem ser estudados com tcnicas como a Recuperao de
Fluorescncia Aps Foto-branqueamento (FRAP) e a Ressonncia Magntica Nulear (RMN)
utilizando-se fosfolipdios marcados (fluorescentes ou modificados quimicamente) e valores
comuns para esse coeficiente encontram-se na ordem de 10
-12
m
2
s
-1
; coeficientes de difuso
lateral de curta distncia podem ser obtidos por tcnicas empregando espalhamento de
nutrons.
b. Difuso rotacional: os fosfolipdios, dentro da sua monocamada, giram em
relao a eles mesmos; os coeficientes de difuso rotacionais mais comuns encontram-se na
ordem de 10
-8
s
-1
.
c. Movimento flip-flop: os fosfolipdios passam de uma monocamada para outra
monocamada; o movimento de flip-flop muito raro e pode levar at vrios dias para se
concluir; o mesmo necessita da passagem da regio polar do fosfolipdio atravs da regio
apolar da bicamada o que primeira vista parece impossvel, porm o fenmeno existe e o
mesmo pode configurar at certo ponto a simetria da distribuio dos fosfolipdios entre as
duas camadas da bicamada; o processo ocorre na ordem de 10
-8
s
-1
; nas membranas celulares
as protenas podem estimular este movimento.
d. Flexo das cadeias hidrocarbonadas dos fosfolipdios.
A importncia e freqncia de todos estes movimentos esto relacionadas com a
forma estrutural da molcula fosfolipdica. O comprimento das cadeias hidrocarbonadas bem
como o grau de insaturao so as caractersticas mais importantes. Cadeias curtas interagem
menos entre elas do que cadeias longas. Ligaes duplas em configurao cis possuem um
15
alto impedimento estrico. De forma geral, a fluidez da membrana aumenta com o aumento
da quantidade de ligaes duplas. Assim, determinadas bicamadas com alto grau de
insaturao nas cadeias hidrocarbonadas podem apresentar alta fluidez mesmo em
temperaturas reduzidas.
A temperatura tambm constitui um fator importante a ser considerado. A
temperatura baixa limita os movimentos moleculares e como conseqncia a fluidez da
bicamada reduzida. As bicamadas fosfolipdicas apresentam transies de fase que esto
relacionadas com a temperatura e presso externa. Uma transio de fase caracterizada pela
mudana conformacional das cadeias hidrocarbonadas. Os grupos metileno podem assumir
diferentes conformaes devido s rotaes das ligaes C-C resultantes de variaes de
temperatura e presso.
37,60
Considerando a isomeria conformacional das cadeias, as conformaes anti, de
menor energia prevalecem em relao s syn, de maior energia. Para a efetivao de uma
rotao de um grupo CH
2
em torno da ligao C-C, a energia da molcula deve ser alterada.
As interaes independentes de ligao, como as interaes entre os hidrognios ligados aos
tomos de carbono, devem ser vencidas, ou seja, uma energia maior do que a energia
envolvida nessas interaes deve ser fornecida para que ocorra a rotao em torno da ligao.
Quando a temperatura do sistema baixa, existe maior probabilidade de encontrar
as cadeias na conformao de menor energia, anti. Com o aumento da temperatura, ou seja,
com o fornecimento de energia, aumenta a probabilidade de ocorrncia de rotaes em torno
das ligaes C-C. Porm, as interaes entre as cadeias hidrocarbonadas, discutidas na
Sesso 1.2.2, impediro grandes mudanas de conformao de anti para syn at uma
temperatura suficientemente alta onde o fornecimento de energia seja suficiente para uma
transio de fase cooperativa. Essa temperatura efetiva de transio de fase depende de vrios
fatores:
37,60
a. Tamanho das cadeias hidrocarbonadas: as cadeias mais longas interagem mais
fortemente entre si, necessitando portanto de maior energia para uma transio.
b. Grau de saturao das cadeias hidrocarbonadas: cadeias saturadas so mais
organizadas e interagem mais; cadeias insaturadas de origem natural no apresentam um
ordenamento muito compacto devido s dobras nas cadeias nos pontos de insaturao
produzindo bicamadas mais fludas e de menor resistncia transio de fase; assim, quanto
16
maior o grau de insaturao das cadeias, menor ser a temperatura de transio de fase da
bicamada.
c. Natureza do grupo polar: as interaes entre os grupos polares dos fosfolipdios
dependem da geometria e das cargas; quanto maior a interao entre esses grupos, o que
acontece por exemplo entre grupos zwiterinicos, maior a temperatura de transio de fase.
d. Grau de hidratao do grupo polar: molculas de gua formando ligaes de
hidrognio com os grupos polares podem diminuir a interao entre os grupos polares,
reduzindo assim a temperatura de transio de fase.
e. Composio: a presena de compostos misturados aos fosfolipdios confere
alteraes de organizao e de interaes moleculares na bicamada; determinados compostos
podem fornecer uma blindagem entre os grupos polares reduzindo a temperatura de
transio; outros podem formar altas energias de interao com os fosfolipdios promovendo
um aumento na temperatura de transio de fase.
f. Fora inica do meio: a presena de ons no meio de disperso tambm pode agir
sobre os grupos polares aumentando ou diminuindo as interaes entre os grupos e alterando
assim a temperatura de transio de fase; cada situao vai apresentar suas peculiaridades.
As bicamadas fosfolipdicas, mais comumente denominadas de lamelas, apresentam
diferentes fases lamelares ou mesofases. A transio de uma fase para outra necessita de
energia e depende de fatores como os acima discutidos. A nomenclatura utilizada para
distinguir as diferentes fases est bem estabelecida na literatura. A simbologia representativa
de cada fase composta de uma letra maiscula seguida de mais uma letra. As letras
maisculas caracterizam o tipo de ordenamento a longo alcance, ou seja, a estrutura a baixo
ngulo com dimenses de algumas dezenas de ngstrons formada pelos planos que contm as
regies polares. Assim temos:
60-61
L: fase lamelar, em uma dimenso;
P: fase oblqua ou centrada, em duas dimenses.
A segunda letra significa o estado conformacional das cadeias hidrocarbonadas:
c, e : parcialmente ordenado;
: lquido-cristalino ou altamente desordenado.
A Figura 1.5 representa as diferentes mesofases juntamente com suas respectivas
simbologias e nomenclaturas. A dependncia do aumento do fornecimento de energia externa
17
necessria para que uma mesofase se transforme em outra, ou seja, para que ocorra uma
transio de fase, est indicada pelo caminho das flechas. A variao da espessura da
distncia de repetio da bicamada lamelar (d), tambm est representada e a mesma se
modifica ao longo do processo de transies de fases.

Figura 1.5. Representao das diferentes mesofases da bicamada fosfolipdica juntamente
com suas respectivas simbologias e nomenclaturas e indicao da variao da distncia de
repetio (d). A dependncia do aumento do fornecimento de energia externa necessria para
que uma mesofase se transforme em outra est indicada pelo caminho das flechas.

A conformao das cadeias hidrocarbonadas caracteriza cada mesofase:
37,60,61

a. A conformao c ou a mesofase Lc (subgel) representa o estado em que a energia
externa mnima: as molculas fosfolipdicas esto organizadas de acordo com suas
caractersticas e sob a influncia do meio tendendo para um estado de menor energia como
anteriormente discutido.
b. A mesofase L (gel) representa o estado em que todos os grupos metileno das
cadeias hidrocarbonadas esto na conformao anti, submetendo as mesmas sua forma
18
mais alongada e proporcionando distncias bastante regulares entre elas. Como
conseqncia, a espessura da bicamada lamelar aumenta.
c. A mesofase L (gel) difere da L na inclinao das cadeias ao plano das
bicamadas. A espessura da bicamada reduzida.
d. Na mesofase P (gel ondulado) as cadeias hidrocarbonadas iniciam um processo
de desordenamento molecular que provoca rotaes C-C dentro da bicamada e tambm
ondulaes na membrana como um todo. A espessura mdia da bicamada pode diminuir mais
em funo de interpenetraes de cadeias hidrocarbonadas entre uma monocamada e outra.
Nas conformaes e , as propriedades das fases so bastante sensveis s
variaes que ocorrem nas regies hidrofbicas pela presena de diferentes compostos ou
impurezas que influenciaro diretamente o ordenamento das cadeias.
e. Na mesofase L (lquido-cristalino) as cadeias hidrocarbonadas esto altamente
desordenadas, na conformao de maior isotropia, com rotaes C-C em alta freqncia;
devido alta desorganizao molecular resultante da aplicao de energia externa, as
propriedades desta fase no so muito sensveis s heterogeneidades qumicas das cadeias
nem mesmo presena de outros compostos misturados ao sistema; a espessura da bicamada
pode aumentar em relao mesofase P e a ondulao da bicamada como um todo
reduzida; porm, ocorre um efeito bastante peculiar: medida em que fornecida mais
energia para esta fase, especificamente com aumento de temperatura, a espessura da
bicamada diminui; o fenmeno pode ser comparado com certos polmeros altamente
desordenados: o aumento da temperatura aumenta a desordem e diminui a elongao.
62
Um
mecanismo similar explica o efeito nos lipdios: a temperaturas moderadas a tenso
interfacial tende a diminuir a rea por grupo polar na interface lipdio-gua, aproximando e
alongando as cadeias hidrocarbonadas; a temperaturas altas a conformao desordenada das
cadeias tende a reduzir a elongao; aumentar a temperatura significa, portanto, aumentar a
desordem e diminuir a anisotropia das cadeias.
60
Geometricamente as cadeias devem se
dobrar da melhor forma possvel buscando preencher os espaos oferecidos sem resistncia
ao ordenamento a longo alcance, ou seja, periodicidade no espaamento entre as camadas
que contm os grupos polares.
Considerando sistemas lamelares formados por fosfolipdios puros de cadeias
saturadas contendo de 15 a 22 tomos de carbono, submetidos ao aumento de temperatura,
pelo menos trs transies de fase podem ser detectadas:
61

19
1. sub-transio: a mesofase Lc passa para as mesofases L e L;
2. pr-transio: a mesofase L passa para a mesofase P;
3. transio principal: a mesofase P passa para a L.
A Tabela 1.1 exemplifica temperaturas de transio de fase caractersticas de
fosfolipdios de extremidade polar e cadeias hidrocarbonadas idnticas e saturadas
correspondentes ao nmero de tomos de carbono presentes em cada cadeia. Valores de
temperaturas de transies de fases podem ser determinados por diferentes tcnicas como
DSC, especialmente MDSC, espectroscopia, difrao de raios-X, FTIR e espalhamento de
luz (discutido na Sesso 3.1.2.1).
63-70
Os valores encontrados na literatura oscilam
dependendo do tipo de tcnica utilizada para a sua determinao, das condies
experimentais e do tipo de sistema investigado (filmes, gel, vesculas, lipossomas). Um
amplo levantamento de valores de temperaturas de transio de fase encontra-se disponvel
on-line no site LIPIDAT (http://www.lipidat.chemistry.ohio-state.edu) bem como no review
publicado por Koynova e Caffrey em 1998.
61

Tabela 1.1. Temperaturas de transio de fase caractersticas de fosfolipdios de extremidade
polar e cadeias hidrocarbonadas idnticas e saturadas relacionadas com o nmero de
carbonos presentes em cada cadeia.
61

Nmero de
carbonos
Sub-transio
(C)
Pr-transio
(C)
Transio principal
(C)
15 20,2 3,0 22,0 2,5 33,7 0,8
16 18,8 3,1 34,4 2,5 41,3 1,8
17 21,6 3,8 42,7 1,1 48,6 0,6
18 26,3 5,2 49,1 2,9 54,5 1,5
19 30,0 4,3 57,2 1,1 60,2 1,1
20 36,9 1,3 63,2 0,8 65,3 1,5

As transies de fase representam um parmetro importante no design e no
desempenho de lipossomas para fins especficos. Fosfolipdios podem ser escolhidos para a
formao de lipossomas pensando-se no aproveitamento de determinada transio de fase
para a satisfao de um comportamento desejado como, por exemplo, a liberao controlada
20
de material encapsulado. Assim as transies de fase podem ser exploradas para controlar a
liberao de frmacos. De forma geral, a liberao mxima em torno da transio de fase
principal devido aos inmeros defeitos estruturais e de interao entre as molculas, como
discutido acima. Por conseguinte, a escolha dos fosfolipdios torna-se um fator determinante
para fins aplicativos.
71-73

1.2.4. Importncia Cientfica e Tecnolgica

Lipossomas so estruturas que apresentam grandes similaridades s membranas
celulares, tanto do ponto de vista estrutural como de composio. De maneira geral so
produzidos com fosfolipdios encontrados na natureza, biodegradveis, no txicos e no
imunognicos. Assim, os lipossomas adquiriram uma larga aceitao tanto na cincia
fundamental como em reas mais aplicadas.
1-4,19
A utilizao de lipossomas como sistemas modelo de membranas est largamente
consagrada, tendo como resultado a publicao de milhares de artigos cientficos e o
desenvolvimento de metodologias.
10
Os lipossomas constituem sistemas estruturais para
estudos fsico-qumicos de lipdios, formao de domnios lipdicos em membranas,
interaes celulares e deformabilidade de sistemas lipdicos.
10,26-28,69

Os lipossomas gigantes, com dimetros micromtricos (detalhados na Sesso 2.9),
ocupam um lugar importante na pesquisa cientfica por representarem objetos facilmente
observveis no microscpio ptico. Esta vantagem permite a realizao de uma gama de
estudos fsicos e estruturais sob diferentes condies experimentais.
4,27,34,74-76
No aspecto mais fundamental, os estudos envolvendo energia trmica na difuso e
disperso destas estruturas coloidais, contriburam de forma significativa para o
desenvolvimento terico da fsica de membranas, que por sua vez contribuiu para o
desenvolvimento da fsica estatstica nas ltimas dcadas. As questes abordadas pela fsica
tambm encontraram correntes na matemtica, onde a geometria diferenciada ou a topologia
de objetos bi-dimensionais de alta elasticidade constituem assuntos de alto interesse de
pesquisa.
4,75,76
Nas reas de bioqumica e biologia importante ressaltar a grande quantidade de
estudos envolvendo protenas presentes nas membranas celulares, modificaes de
conformao induzidas por mudanas nas condies de pH, salinidade, luz, etc. em
21
lipossomas incorporando diferentes molculas, estudos de reconstituio do histrico celular
da evoluo das espcies, desenvolvimentos de sistemas de fotossntese artificiais, ou ainda a
atividade de bombas inicas membranares utilizando lipossomas.
77-79
Na qumica os lipossomas representam um sistema de significativa importncia
como um meio reacional dentro de um espao reduzido e limitado, encontrando aplicaes
para estudos de sntese molecular e catlise.
1-80
Do ponto de vista de aplicao tecnolgica e comercial, deve ser considerada a
capacidade que os lipossomas possuem de encapsular molculas hidroflicas no ncleo
aquoso e molculas hidrofbicas na regio apolar das bicamadas e liberar estas molculas
dentro de determinadas condies ambientais e energticas. Por conseqncia, estas
propriedades tornam o lipossoma um veculo extremamente atrativo para o transporte de
frmacos para locais especficos, processo que vem sendo designado como vetorizao de
frmacos.
1,2
Alterao da biodistribuio, farmacocintica (velocidades para atingir o stio de
ao e para ser eliminado) e tempo de meia vida (tempo no qual 50% da concentrao
permanece no organismo antes da sua eliminao total) de frmacos so alcanados com
lipossomas. De forma mais avanada, lipossomas especficos, que iro atuar em rgos ou
alvos especficos dentro do organismo, concorrem para uma sensvel reduo do grau de
toxicidade relacionada administrao do frmaco, bem como seus efeitos colaterais,
menores perdas de frmaco com reduo de custo e conseqente otimizao do
tratamento.
1,2,19,81
Para a efetiva aplicao de lipossomas como sistema carreador e vetorizador de
frmacos devem ser considerados os parmetros fsico-qumicos e coloidais tais como
composio, tamanho, capacidade e eficincia de encapsulamento ou incorporao do
frmaco, estabilidade no armazenamento e no meio de aplicao e interaes com clulas e o
meio de aplicao.
1,2,19,81

Lipossomas podem ser formulados em suspenses, como aerosol, gel ou mesmo em
p. A administrao in vivo pode ser tpica ou parenteral, sendo que a aplicao intravenosa
tem sido a forma mais promissora em tratamentos. Para esta ltima rota de administrao, o
desenvolvimento de lipossomas capazes de escapar ao sistema fagocitrio mononuclear
culminou na produo dos lipossomas furtivos e estericamente estveis revestidos com PEG.
A hidrofilia conferida superfcie de lipossomas furtivos estende a meia-vida do frmaco em
22
meio biolgico de poucos minutos, no caso de lipossomas convencionais, para vrias
horas.
19-25,44,45,57
De fato, foi na aplicao intravenosa para a vetorizao de frmacos anti-
cancergenos que os lipossomas encontraram possibilidades aplicativas com resultados
altamente satisfatrios. Tem sido demonstrado que os lipossomas de longo tempo de
circulao podem ser direcionados para vrios tipos de tumores pelo fato de poderem circular
por tempo prolongado e extravasar nos tecidos com permeabilidade vascular elevada.
Tumores slidos crescentes, bem como regies de infeco e inflamao, apresentam
capilares com permeabilidade aumentada, com dimetros de poros variando entre 100 e 800
nm. Lipossomas furtivos podem ser produzidos com dimetros entre 60 e 150 nm,
suficientemente pequenos para extravasar do sangue para os espaos intersticiais de tumores
passando atravs dos poros.
19-25,44,45,57

Uma outra estratgia em desenvolvimento o direcionamento ativo de lipossomas.
Consiste em acoplar um ligante especfico na superfcie externa aumentando sua seletividade
de ao com determinadas clulas ou com tecidos tumorais, atravs da ligao destes com
marcadores especficos localizados na membrana da clula ou do tecido. Em terapias
fotodinmicas, por exemplo, que promove o tratamento de tumores superficiais envolvendo a
administrao sistmica de fotossensores, o direcionamento ativo de lipossomas aumenta a
acumulao seletiva do frmaco no tumor. Os lipossomas potencializam o efeito
fotodinmico devido internalizao celular do fotossensor, minimizando os efeitos
colaterais observados na terapia fotodinmica convencional.
82
Aplicaes como veculos para vacinas tambm tm sido largamente estudadas,
tanto para aplicao por via intravenosa como por via oral. Deve ser mencionada tambm a
importncia na biomedicina, para testes diagnsticos e desintoxicao atravs da utilizao
de agentes quelantes; na agricultura, para estabilizao de fertilizantes; na pecuria, para
maturao de laticnios e na indstria qumica, em processos de solubilizao, purificao,
recuperao, catlise ou converso de energia.
19,31,33,80,83-88
Por fim, uma rea ampla de aplicao encontra-se na cosmetologia. Os primeiros
produtos cosmticos base de lipossomas foram lanados por duas indstrias francesas em
1987. Desde ento a gama de produtos s tem aumentado. O mecanismo de ao de
lipossomas no transporte de ativos hidratantes, nutrientes e outras substncias atravs da pele,
est associado composio epidrmica, o que permite a fuso das vesculas nos espaos
intercelulares da pele. Entretanto, deve ser salientado que muitos dos mecanismos
23
responsveis pela eficcia de inmeros produtos cosmticos lipossomados no so
suficientemente esclarecidos e que a pretendida eficcia muitas vezes questionvel.
Lipossomas com propriedades diferenciadas tm sido desenvolvidos. Como detentores de
uma alta deformabilidade estrutural, os lipossomas elsticos podem atingir camadas mais
profundas da pele atravessando os espaos intersticiais entre as clulas. J lipossomas
slidos, formados por lipdios slidos na temperatura do corpo humano, tambm
denominados de nanopartculas lipdicas, tm sido desenvolvidas para proporcionar uma
estabilidade maior em formulaes cosmticas.
3,4,19,53,89-94
Por fim, considerando dados estatsticos da importncia cientfica e tecnolgica de
lipossomas, aproximadamente 1500 artigos cientficos so publicados por ano envolvendo
estudos com lipossomas e mais de 20 mil patentes foram depositadas somente nos Estados
Unidos.

1.3. Quitina e Quitosana

1.3.1. Reviso Bibliogrfica

A quitina (Figura 1.6.a) representa o segundo polmero natural mais abundante no
planeta, depois da celulose. Foi isolada pela primeira vez em 1881 por Braconnot, 30 anos
antes do isolamento da celulose. Durante muitos anos a falta de conhecimentos fundamentais
da sua qumica e propriedades limitou o seu uso como um produto de aplicao industrial.
Somente nos anos 70 ocorreu um crescimento do interesse pela quitina e com o
desenvolvimento de tcnicas de caracterizao, sua estrutura e propriedades puderam ser
estudadas.
95,96

A quitina, poli(-(14)-N-acetil-D-glucosamina), sintetizada por um imenso
nmero de organismos vivos. Sua ocorrncia na natureza representa microfibrilas cristalinas
formando componentes estruturais no exoesqueleto de artrpodes ou de paredes celulares de
fungos e leveduras. Dependendo da fonte, a quitina ocorre nos estados alomorfos e , que
podem ser diferenciados por infravermelho e espectroscopia de RMN de estado slido, bem
como por difrao de raios-X. A quitina tambm foi identificada, embora a mesma possa
ser considerada como uma variante da .
95-98
24
Apesar da vasta ocorrncia da quitina, as principais fontes da sua obteno para
aplicao comercial tm sido cascas de siri e camaro. No processamento industrial, a quitina
extrada dos crustceos com tratamento cido para a dissoluo de carbonato de clcio
seguida de extrao alcalina, para solubilizao de protenas. Tratamentos para eliminao de
pigmentos tambm podem ser procedidos dependendo das exigncias conferidas ao produto
final.
95,96,99

Figura 1.6. Estruturas moleculares da quitina 100% acetilada (a), da quitosana 100%
desacetilada (b) e da quitosana 100% desacetilada e ionizada (c).

A quitina ocorre naturalmente com um reduzido grau de desacetilao, ou seja,
grupos acetila substitudos por grupos amino ao longo das cadeias do polmero (Figura
1.6.b). Variaes do grau de desacetilao dependem da fonte de obteno. Porm, tanto a
forma como a so insolveis na maioria dos solventes, o que limita estudos de
propriedades fsicas de quitina em soluo. Um estudo aprofundando da questo de
O
NH
OH
O H
C O
CH
3
O
O
NH
OH
O H
C O
CH
3
O
O
NH
OH
O H
O
C O
CH
3
O
NH
2
OH
O H
O
O
NH
2
OH
O H
O
O
NH
2
OH
O H
O
O
NH
3
+
OH
O H
O
O
NH
3
+
OH
O H
O
O
NH
3
+
OH
O H
O
a
b
c
25
solubilidade foi desenvolvido por Austin, inclusive com o depsito de uma patente, em 1975.
Austin obteve um complexo entre quitina e LiCl, o qual coordenado com o grupo acetila. O
complexo solvel em dimetilacetamida e em N-metil-2-pirrolidona. O emprego de cido
frmico e cidos di e tricloroacticos tambm foi avaliado por Austin.
96,100,101
Quando o grau de desacetilao da quitina atinge 50% ou mais, a mesma torna-se
solvel em solues aquosas cidas e passa a ser denominada de quitosana. A quitosana
tambm pode ser considerada um polmero natural, pois encontrada em alguns fungos.
Porm, a sua maior fonte de obteno comercial tem sido pela desacetilao da quitina, o que
pode ser facilmente procedido por tratamento em forte meio alcalino.
95,96,99,102,103
O tratamento alcalino, portanto, utilizado para a modificao do grau de
desacetilao da quitina para a produo de quitosana que, apresentando solubilidade em
meio aquoso, proporciona uma vasta gama de aplicaes. A solubilizao ocorre com a
protonao dos grupos amino, convertendo o polissacardeo em polieletrlito em meio cido
(Figura 1.6.c).
95,96,104-106
Para a obteno da quitosana a partir da quitina, o processo mais comum emprega
soluo aquosa de NaOH em alta concentrao. A quitina dispersa nesta soluo e
permanece em refluxo sob intensa agitao e aquecimento por perodos prolongados que
podem variar muitas horas dependendo do resultado pretendido.
3,99,102,103,107-109
Aps a reao, o precipitado filtrado e lavado exaustivamente com gua at a gua
de lavagem atingir um pH em torno de 8,0. O precipitado ento disperso em soluo cida
para a dissoluo da quitosana, permitindo assim a separao, por filtrao, de parte da
quitina que pode no ter suficientemente desacetilada.
3,7,99
O ajuste do pH da soluo final de
quitosana em torno de 7,5 pela adio de soluo de NaOH provoca a floculao da
quitosana obtida, resultante da desprotonao dos grupos amino, com conseqente
precipitao do polmero que pode ento ser filtrado, lavado e seco, oferecendo um estado
fsico de um p de aspecto arenoso ou floculado.
3,7,99
O grau de desacetilao resultante depende de muitas condies experimentais
como a concentrao do meio alcalino, temperatura, tempo de reao e agitao, tamanho e
densidade de partculas. Simultaneamente ao processo de desacetilao, a despolimerizao,
ou seja, quebra das cadeias com conseqente reduo da massa molecular mdia, tambm
pode ocorrer. Quitosanas de altos graus de desacetilao so de difcil obteno quando se
pretende obter um polmero de alto peso molecular. Condies de reao em atmosfera inerte
26
e adio de captadores de oxignio, como tiofenol, so recomendadas.
95,102,107,109
Uma
patente de 1993 prope um processo em que mltiplas desacetilaes so procedidas durante
pouco tempo seguidas por lavagens, secagem e dissoluo, resultando em desacetilaes
maiores do que 95% com reduzido teor de despolimerizao.
110

A protonao dos grupos amino da quitosana em meio cido, ocorre normalmente
em valores de pH abaixo de 5,5. A dissoluo do polmero vai evidentemente depender de
fatores como o grau de desacetilao, a distribuio dos grupos acetila remanescentes ao
longo das cadeias, distribuio de massa molecular e massa molecular mdia, alm do pH da
soluo. cidos orgnicos ou inorgnicos podem ser empregados, sendo que cido actico e
cido clordrico representam os mais comuns.
105,106
Rinaudo e colaboradores demonstraram
que a concentrao de prtons deve ser no mnimo igual concentrao de grupos amino a
serem protonados pra que ocorra a dissoluo do polmero.
106

Apesar da propriedade vantajosa de dissoluo em meio aquoso cido, o emprego
de quitosana em meio neutro e alcalino restrito. Para contornar esta limitao, sais de
quitosana tm sido obtidos e os mesmos podem ser submetidos a uma variao de pH mais
ampla.
95,111
Soluo aquosa de quitosana em pH 7 tambm foi obtida com o uso de glicerol-
2-fosfato.
112-114
O grau de desacetilao pode ser caracterizado por diferentes formas. Metodologias
descritas na literatura lanam mo de tcnicas como infravermelho,
115,116
ultravioleta,
117

RMN de
1
H no estado lquido
118
e de
13
C e
15
N no estado slido.
119-121
Pelletier e
colaboradores tambm propem o uso de uma reao enzimtica.
122
Entre as tcnicas espectroscpicas para a determinao do grau de desacetilao, o
infravermelho o mais popular devido facilidade de preparao das amostras (em pastilhas
de KBr ou filmes) e obteno dos espectros. Deve-se apenas tomar os cuidados requeridos e
fazer uma boa escolha das linhas de base e bandas de referncia.
3,7,99,115,116

Pelo mtodo proposto por Moore e Roberts em 1980,
115
o grau de desacetilao
pode ser determinado relacionando-se a banda de amida I a 1655 cm
-1
e a banda de hidroxila
a 3450 cm
-1
, que serve como banda de referncia interna, pois relativamente isolada e a sua
intensidade aproximadamente constante para todas as faixas de graus de desacetilao. A
porcentagem dos grupos amino-acetilados (%N-acetila) obtida pela equao:

% N-acetila = (A
1655
/ A
3450
) 100 / 1,33 (1.3)

27
onde: A
1655
= absorvncia a 1655 cm
-1
; A
3450
= absorvncia a 3450 cm
-1
e 1,33 uma
constante que representa a razo A
1655
/ A
3450
para amostras de quitina completamente
acetiladas.
Atualmente a RMN de
1
H considerada a metodologia de maior exatido para
amostras em soluo. A quitosana dissolvida em gua deuterada acidificada com cido
clordrico. O pico dos tomos de hidrognio ligados ao carbono do grupo acetila que ocorre
em 1,95 ppm utilizado como referncia em relao aos picos em 4,79 (H-1 para D-
glucosamina) e 4,50 ppm (H-1 para N-acetil-D-glucosamina), o que permite a determinao
do grau de desacetilao pelo uso das integraes dos sinais.
118
Para a avaliao de graus de
acetilao amplos, variando desde 0 at 100%, a RMN de
13
C e de
15
N em estado slido tem
se mostrado muito satisfatria.
119-121

A distribuio dos grupos acetila ao longo das cadeias polimricas, que pode ser de
forma aleatria ou em blocos, influencia a solubilidade bem como as interaes entre as
cadeias por ligaes de hidrognio e hidrofobia dos grupos acetila. Esta distribuio tambm
foi avaliada por RMN de
13
C.
123,124
Para a determinao da massa molecular mdia, mtodos como cromatografia de
excluso de tamanhos,
125
viscosimetria
108
e espalhamento de luz
126
so os mais difundidos.
95

As duas primeiras tcnicas representam metodologias de obteno simplificada e no
constituem medidas absolutas para a massa molecular, pois empregam curvas padro
relativas. Por outro lado, o espalhamento de luz constitui uma tcnica absoluta para a
determinao da massa molecular de macromolculas, embora a obteno de dados e a
interpretao dos resultados sejam mais complexas. A maior dificuldade est ligada aos
fenmenos de agregao e de solvatao. Assim, a dissoluo do polmero deve ser
procedida de maneira a evitar a agregao e promover uma tima solvatao, o que pode ser
obtido pela escolha correta do solvente e das concentraes do polmero em soluo, bem
como eliminao de impurezas como poeira, fibras e outras partculas com uso de filtraes e
centrifugao.
126
Rinaudo e colaboradores propuseram uma soluo 0,3 M cido actico/0,2
M acetato de sdio (pH 4,5) como tampo ideal para solues de quitosana livre de
agregados.
127
A determinao do incremento no ndice de refrao dn/dc (onde c significa a
concentrao) necessria para a obteno da massa molar mdia por espalhamento de luz e
o parmetro pode ser obtido com uso de refratmetro convencional.
Em uma soluo polimrica a flexibilidade e a conformao das cadeias em soluo
determinam suas propriedades hidrodinmicas e reolgicas.
128
As dimenses das cadeias de
28
quitosana e seus correspondentes volume hidrodinmico e viscosidade dependem do carter
semi-rgido das cadeias do polissacardeo. A concentrao de sal pode influenciar de forma
drstica estes parmetros e a determinao de viscosidades intrnsecas em solues contendo
excesso de eletrlitos de baixo peso molecular largamente empregada na avaliao do
efeito da fora inica nas dimenses de cadeias de polieletrlitos. A worm-like theory
permite uma estimativa do comprimento de cadeias de polieletrlitos a partir de medidas de
viscosidade em funo de diferentes foras inicas.
125,127,128
Esta teoria estende o modelo
worm-like incluindo o efeito da carga eletrosttica, a qual modula as conformaes novelo e
estendida do polieletrlito em soluo em funo da fora inica do solvente. O comprimento
total da cadeia polimrica em soluo (L
T
) definido pelas contribuies do comprimento
intrnseco (L
o
) e o comprimento eletrosttico (L
e
):

L
T
= L
o
+ L
e
(1.4)

com L
o
correspondendo caracterstica rgida da cadeia polimrica independente de
interaes eletrostticas e L
e
variando com o inverso da raiz quadrada da fora inica.
95
A aplicao desta teoria quitosana forneceu valores para L
o
entre 5 e 10 nm,
127

embora valores maiores, como 22 nm, tambm tenham sido caracterizados.
129-131
Foi
demonstrado que L
o
depende de forma moderada do grau de acetilao do polmero, sendo
que a mesma aumenta com o nmero de grupos acetila presentes na cadeia.
130,131
A rigidez estrutural da quitina e da quitosana est relacionada com a conformao
molecular e depende principalmente da rede de ligaes de hidrognio formada dentro de
cada cadeia. A mesma decresce com o aumento da temperatura sendo que uma temperatura
crtica em torno de 40 C foi determinada para quitosana, onde L
o
comea a decrescer mais
rapidamente com o aumento da temperatura, resultado da desestabilizao das ligaes de
hidrognio.
132
De forma geral, a rigidez das cadeias representa um parmetro significativo no seu
comportamento reolgico, mesmo em sistema diludo. Os fenmenos de ligaes de
hidrognio bem como interaes de carter hidrofbico influenciam as caractersticas em
soluo, sendo que a agregao molecular tambm pode estar relacionada, qualquer que seja
o grau de acetilao do polmero.
133
29
A questo da fora inica deve ser considerada com cautela e cuidados especiais,
como o uso de solues tampo para dissoluo de quitosana, so recomendados. Solues
tampo de pH em torno de 4,5 e de fora inica definida so empregadas para dissoluo,
assegurando um ambiente de fora inica constante. Entre os solventes mais utilizados
destacam-se tampes de acetato como NaOAc/HOAc 0,3 M,
127
solues diludas de cido
actico
134
e de cido clordrico.
135
A influncia da concentrao de NaCl em soluo aquosa para a dissoluo de
quitosana foi avaliada por Signini e colaboradores.
136
Amostras de quitosanas foram
dissolvidas em vrias solues de NaCl de 0,06 a 0,30 M e medidas de viscosidade foram
obtidas. Com o comportamento caracterstico de um polieletrlito, a viscosidade intrnseca
diminui com o aumento da fora inica do meio. Este comportamento descrito pela
equao:

[]
= []
+ S
-1/2
(1.5)

onde: []
a viscosidade intrnseca na fora inica , []
a viscosidade intrnseca
extrapolada fora inica infinita e S a tolerncia ao sal.
Em suma, para a faixa de concentrao de NaCl investigada, ou seja, com fora
inica 0,06 M 0,30 M, boas solues so obtidas. Assim, os processos de agregao
so evitados, o que permite uma avaliao concisa das caractersticas dinmicas e estruturais
da quitosana em soluo.
136
Nos ltimos anos, uma gama de novos solventes tem sido proposta tanto para
quitina como para quitosana. Consequentemente, reaes dos polmeros em meio homogneo
ou semi-homogneo tm sido desenvolvidas.
129
Particularmente no caso da quitosana, a
presena dos grupos amino fornece stios de fcil modificao qumica. Alteraes de
propriedades fsico-qumicas providas por modificaes a nvel molecular e supramolecular
fornecem estruturas de caractersticas e comportamentos especficos.
Modificaes qumicas de quitina e quitosana procedidas sob condies moderadas,
objetivando a proteo das ligaes glicosdicas e acetamdicas, fornecem polmeros de
diferenciados graus de solubilizao. De forma geral, as propriedades so delineadas visando
aplicaes tanto no estado slido como em soluo.
30
1.3.2. Importncia Cientfica e Tecnolgica

Conhecimentos importantes a respeito da quitina, suas modificaes qumicas,
propriedades fsicas e aplicaes foram descritas em dois livros publicados nos anos 70:
Natural Chelating Polymers
137
e Chitin.
138
Mais adiante devem ser citados Chitin
Chemistry
139
e Chitin Handbook,
140
com dados atualizados dos anos 90.
95
Trabalhos cientficos e de cunho mais aplicativo podem ser encontrados em
peridicos especializados, especialmente os que tratam de polmeros. De considervel
importncia devem ser citados tambm livros e proceedings de congressos internacionais em
quitina e quitosana, sendo que o primeiro deles ocorreu em 1977 nos Estados Unidos e os
trabalhos submetidos foram editados em 1978 por Muzzarelli e Pariser.
141
Por ocasio da
stima conferncia internacional de quitina e quitosana, organizada pela Sociedade Europia
de Quitina, os trabalhos apresentados foram lanados no livro Advances in Chitin
Chemistry.
142
Portanto, a importncia cientfica de quitina e quitosana tem sido altamente
valorizada com a criao da European Chitin Society e da Sociedad Latinoamericana de
Quitina y Quitosana.
95
A quitina considerada como um polmero de baixa toxicidade e inerte no sistema
gastrointesintal de mamferos. biodegradvel devido existncia na natureza de processos
degradativos (quitinase) gerados por fungos e bactrias que tambm esto presentes no
sistema digestivo de muitos animais. Processos de quitinase esto envolvidos em sistemas de
defesa contra invaso bacteriana nos organismos que a promovem. Lisozimas encontrados
em claras de ovos, figueiras e mamoeiros papaya tambm degradam quitina.
96,143,144
Quitina foi utilizada em coluna cromatogrfica para a separao de lectinas. Quitina
e 6-O-carboximetilquitina ativam macrfagos in vivo, suprimem o crescimento de clulas
cancergenas em camundongos e estimulam a resistncia contra infeces por Escherichia
Coli. Quitina tambm acelera a cura de ferimentos.
145,146
A quitina largamente empregada para a imobilizao de enzimas e clulas. No
caso de imobilizao enzimtica, aplicaes so encontradas na indstria de alimentos para
clarificao de sucos de frutas e no processamento do leite, onde e amilases ou invertase
so ligadas em quitina.
147
Considerando suas propriedades de biodegradabilidade, baixa
toxidez, inrcia fisiolgica, propriedades anti-bacterianas, capacidade de formao de gis e
afinidade por protenas, a quitina tem sido aplicada em muitas outras reas alm da indstria
31
de alimentos. Devem ser destacado o seu uso como biosensores, no tratamento de poluentes
industriais e na recuperao de complexos de tiosulfato de prata.
147-149
Fibras de quitina foram desenvolvidas por Austin
150
e Hirano.
151
As fibras,
juntamente com celulose ou seda, produzem um material anti-alrgico, desodorizante, anti-
bacteriano e controlador de umidade.
152
Derivados de fibras de quitina so utilizados como
ligantes no processo de fabricao de papel: a adio de 10% de n-isobutilquitina melhora a
resistncia mecnica do papel.
153
Tanto da forma de fibras como de filmes, a quitina encontrou uma vasta aplicao
nas reas mdica e farmacutica, como material de revestimento para ferimentos e sistemas
carreadores de frmacos.
154
Quitina tem sido empregada como excipiente e carreador de
frmaco em forma de filme, gel ou mesmo em p em aplicaes envolvendo
mucoadesividade.
155
Um compsito produzido com hidroxiapatita/quitina/quitosana
utilizado como material de recuperao estrutural de ossos no tratamento de defeitos
sseos.
156
Quitinas modificadas tm sido investigadas como potenciais frmacos anti-
cancergenos.
157
Quanto quitosana, ainda considerada como a principal derivada da quitina, esta
encontra aplicaes na maioria das reas em que a quitina est presente. Alm disso, com a
sua vantagem de solubilizar em meio aquoso, a sua gama de aplicaes torna-se ainda muito
maior do que a da quitina. O carter catinico da quitosana em soluo lhe confere uma
propriedade nica: consiste no nico polmero natural catinico. Suas propriedades
biolgicas e a facilidade em formar filmes e gis promovem um amplo espectro
aplicativo.
95,96,158
A aplicao da quitosana est ligada a pelo menos uma de suas caractersticas.
Consiste num polmero biocompatvel, biodegradvel, formador de filmes, pode atuar como
agente hidratante, no txico, possui alta tolerncia biolgica, hidrolisado por lisozimas,
age na cura de ferimentos, eficiente contra bactrias, vrus e fungos. Detentora de todas
estas vantagens, a quitosana encontra-se largamente inserida na biomedicina em suportes e
acessrios cirrgicos, agentes hemostticos e anticoagulantes, implantes dentrios, peles
artificiais, filmes para reconstruo estrutural de ossos, revestimentos para ferimentos, lentes
de contato bem como sistemas de encapsulamento e liberao controlada de
frmacos.
95,96,143,159,160
32
No carreamento de frmacos e vacinas, a quitosana toma parte em sistemas
designados para todas as vias de administrao: oral, nasal, parenteral, transdermal bem
como em implantes e distribuio de gens. A administrao pelas mucosas tem sido cogitada
considerando a alta mucoadesividade da quitosana e de seus derivados catinicos.
160-163

Taxol, um importante frmaco anticancergeno, porm hidrofbico, foi solubilizado
em micelas de n-lauril-carboximetilquitosana o que aumentou suas propriedades
teraputicas.
164
O mesmo foi observado para micelas de N-mPEG-N-octil-O-sulfato de
quitosana para solubilizao de paclitaxel, um derivado do taxol.
165
Ainda considerado
sistemas carreadores de frmacos, uma vasta produo de micro e nanopartculas
estruturalmente formadas por quitosana ou tendo quitosana na sua composio, podem ser
encontradas na literatura.
166-168
No mesmo sentido em forma de gis.
159,169
Quitosanas modificadas tambm encontram aplicao em sistemas de transfeco
de gens. A atrao eletrosttica entre quitosana e DNA negativamente carregado induz um
processo associativo entre os dois polieletrlitos, levando formao de nanopartculas de
quitosana-DNA biodegradveis. Foi demonstrado que estas partculas tm a capacidade de
extrapolar as barreiras de membranas celulares e assim induzir transfeco de gens.
170
A atividade biolgica da quitosana, considerando seu efeito antivrus como
exemplo, favorece seu uso na agricultura inibindo o crescimento de bactrias e infeces
bacterianas e estimulando a defesa natural de plantas. Ainda na mesma rea, o crescimento
de plantas tambm pode ser estimulado com quitosana, sementes revestidas com quitosana
podem ser protegidas de temperatuas muito baixas e o tempo ideal da disponibilidade de
fertilizantes no solo pode ser controlado.
171
No tratamento de gua e efluentes industriais a quitosana empregada em
processos de purificao de gua potvel e de piscinas, remoo de ons metlicos, reduo
de odores e eliminao de contaminantes como polmeros sintticos.
172,173
Por no ser digervel ao ser humano, a quitosana comercializada como fibra
alimentar para pessoas em dieta. Lipdios podem se ligar na quitosana e assim o colesterol
pode ser absorvido. Em alimentos e bebidas encontram-se aplicaes como agente
estabilizante e espessante de molhos, em forma de revestimento para frutas como
conservante, fungicida e antibacteriano.
174,175
Por fim, uma outra grande rea de aplicao que merece destaque a cosmetologia.
Com o seu poder eletrosttico, a quitosana entra em formulaes de xampus para a reduo
33
da eletricidade esttica dos cabelos. Tambm em produtos hidratantes, tratamento de acne,
tonificao da pele e produtos de uso oral como creme dental e gomas.
96

1.4. Quitossomas

A presena de polissacardeos nas superfcies celulares e os conseqentes estudos
funcionais levaram tambm ao interesse em estudar interaes entre lipossomas e diferentes
grupos de polissacardeos.
48,176,177
Processos de agregao de lipossomas induzidos por polissacardeos foram
estudados por Sunamoto e colaboradores.
177
Os pesquisadores observaram a agregao na
presena de vrios polissacardeos sob diferentes condies de temperatura, fora inica e
carga superficial das vesculas.
Polissacardeos tambm foram adicionados a lipossomas objetivando sua
estabilizao para aplicao como carreadores de frmacos e como glbulos vermelhos
artificiais.
178,179
Muitos destes estudos empregaram derivados de quitina como
polissacardeo. Kato e colaboradores utilizaram carboximetilquitina na produo de glbulos
vermelhos artificiais encapsulando hemoglobina em lipossomas e revestindo os mesmos com
esta quitina negativamente carregada.
178
Alamelu e Panduranga Rao utilizaram um processo
semelhante para encapsulamento de um frmaco.
179
Ambos os grupos encontraram como
resultado um aumento considervel na estabilidade de reteno de material encapsulado
comparando com lipossomas no revestidos.
J a quitosana, com as suas cargas positivas em soluo aquosa cida, foi estudada
como um polissacardeo com alta capacidade de ligao em uma grande variedade de clulas
microbianas e de mamferos.

Essa propriedade de interao com membranas celulares est
relacionada com a estrutura catinica caracterstica de polieletrlito, apresentada pela
quitosana em soluo. Assim a quitosana passou a ser empregada para floculao de
suspenses celulares e mesmo em floculaes seletivas de clulas proporcionando
desempenho altamente satisfatrio.
180,181
A propriedade de mucoadesividade da quitosana tambm foi estudada. Lehr e
colaboradores avaliaram essa caracterstica em mucosa intestinal de porcos.
182
Assim,
lipossomas bioadesivos para aplicaes de uso tpico, tratamento de ferimentos e
34
queimaduras e para administrao nos olhos e narinas e em alguns tumores, tm sido
sugeridos.
168,183-185
As propriedades de biocompatibilidade e biodegradabilidade tornam a quitosana um
polmero de real aplicabilidade na associao com lipossomas, principalmente considerando
o aperfeioamento de caractersticas como estabilidade, reteno de material encapsulado e
especificidade para meios onde a bioadesividade requerida.
51,168,183-185
O termo
quitossoma tem aparecido com freqncia na literatura na designao de lipossomas
contendo quitosana como parte integrante da sua estrutura. Portanto, deve-se considerar que
dentre os vrios tipos de lipossomas descritos, definidos como convencionas, furtivos,
direcionados, fusognicos, elsticos, polimerizados ou magnticos, os quitossomas so
identicamente estabelecidos como uma espcie distinta com caractersticas e propriedades
especficas e vantagens em relao s outras espcies.
As interaes entre lipossomas e quitosana tm sido estudadas por diferentes
metodologias.
48,51,186-188
Porm, os parmetros fsicos da interao entre o polmero e a
bicamada fosfolipdica da membrana da vescula ainda permanecem como objeto de larga
investigao, sendo que os mesmos ainda no esto totalmente esclarecidos.
188
O assunto
abordado nas discusses da presente tese.
A maioria dos trabalhos da literatura aborda parmetros aplicativos para os sistemas
formados por quitossomas e uma gama diferenciada de estruturas desenvolvida. A
quitosana pode estar revestindo a membrana do lipossoma externamente, internamente ou
ambos os casos.
3,7,48,51,58,189,190
Tambm pode estar inserida entre as bicamadas de vesculas
multilamelares ou mesmo dentro da bicamada, ou seja, na regio hidrofbica.
187,188
A
localizao da quitosana, portanto, depende da metodologia de preparao das estruturas
propostas.
O quitossoma clssico formado por um lipossoma revestido externamente com
quitosana, por interao eletrosttica da regio polar dos fosfolipdios com as cargas da
quitosana ionizada. Comumente os lipossomas so prepardos separadamente e aps so
dispersos em soluo aquosa contendo quitosana.
183-185,189-192
Perugini e colaboradores
investigaram a liberao de cido gliclico a partir de lipossomas revestidos com
quitosana.
189
Um significativo controle de liberao foi apresentado em relao lipossomas
sem quitosana. Takeuchi e colaboradores testaram quitossomas carreadores de frmacos
peptdicos por via oral em camundongos e observaram uma liberao mais prolongada em
comparao com lipossomas.
183-185
Feng e colaboradores revestiram lipossomas com
35
quitosana para serem encapsulados em microesferas formadas por um copolmero. O
revestimento de quitosana protege a integridade da vescula no processo de encapsulamento
que emprega solvente orgnico.
192
Sistemas diferenciados, obtidos com metodologias mais apuradas, tambm tm sido
descritos. McPhail e colaboradores prepararam um interessante sistema de nanopartculas de
quitosana modificada para o encapsulamento de agentes bioativos no seu ncleo aquoso.
Essas nanopartculas, por sua vez, foram encapsuladas em lipossomas unilamelares. O
sistema, denominado de vescula dentro de vescula, retardou a liberao do material
encapsulado em mais de 50% em comparao com as nanopartculas de quitosana no
encapsuladas em lipossomas.
193
Huang e colaboradores tambm investigaram um sistema
semelhante onde lipossomas encapsulam um ncleo slido de quitosana contendo um
frmaco hidroflico. Os estudos in vitro e in vivo constataram uma farmacocintica
vantajosa.
194
No mesmo sentido, Diebold e colaboradores produziram nanopartculas de
quitosana revestidas com bicamada de fosfolipdios para vetorizao de frmacos no sistema
ocular. Um alto potencial para a aplicao sugerida foi observado nos estudos in vitro e in
vivo com reduo de toxicidade e alterao da distribuio de frmaco.
168
Um gel termo-sensvel de quitosana modificada contendo lipossomas foi
desenvolvido por Ruel-Garipy e colaboradores como sistema carreador de frmacos. Eles
demonstraram que a associao dos dois sistemas, favorece uma vetorizao mais controlada,
sendo que os lipossomas difundem lentamente no gel de quitosana retendo o material
encapsulado por perodos que podem variar de algumas horas at vrios dias.
169
Uma estrutura diferenciada foi proposta por Magdassi e colaboradores, consiste
numa micro-cpsula com ncleo oleoso: micro-gotas de leo so estabilizadas com
molculas de lecitina em meio aquoso; quitosana adicionada e pela interao com a parte
polar da lecitina que est formando a camada externa das micro-gotas, ocorre um
revestimento polimrico produzindo micro-partculas aplicveis no encapsulamento e
carreamento de substncias hidrofbicas.
195
Por fim, os trabalhos desenvolvidos na presente Tese propem a estruturao de
quitossomas uni e multilamelares com quitosana revestindo a membrana de fosfolipdios
interna e externamente. Os quitossomas obtidos j tm demonstrado aplicabilidade como
sistemas para carreadores de vacinas, proporcionando um significativo aumento da eficcia
da vacina como agente imunolgico em testes in vitro e in vivo.
88
36
Quitossomas gigantes, ou vesculas gigantes contendo quitosana, tm sido descritos
recentemente na literatura em estudos de interao do polissacardeo com a membrana da
vescula.
196,197
O tema tambm explorado aqui a partir de uma modificao do processo de
obteno de quitossomas gigantes tendo como base uma metodologia empregada na
produo de lipossomas unilamelares grandes.

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42
Captulo 2. Metodologias

2.1. Obteno de Quitosana Fluorescente

Os grupos amino ao longo das cadeias da quitosana representam uma regio de alta
reatividade qumica.
1
A interao entre a quitosana e glicoprotenas tem sido estudada na
investigao das propriedades mucoadesivas da quitosana, sendo que glicoprotenas formam
uma camada de gel que reveste as clulas epiteliais das mucosas. As interaes entre
diferentes molculas adesivas e as mucosas foram caracterizadas como foras de van der
Waals, interaes eletrostticas, ligaes de hidrognio ou interaes hidrofbicas.
2

Qaquish e Amiji estudaram as foras de atrao envolvidas na ligao entre
quitosana e glicoprotenas sob diferentes condies de pH e fora inica atravs de
espectrofotometria de fluorescncia.
1
Para tanto, quitosana foi modificada pela reao com
isotiocianato de fluoroscena (Figura 2.1), uma molcula fluorescente. No presente estudo a
mesma modificao foi procedida objetivando o monitoramento da localizao da quitosana
por Microscopia ptica de Fluorescncia (Sesso 3.2), bem como seu efeito na dinmica dos
sistemas vesiculares investigados, atravs da Recuperao de Fluorescncia Aps Foto-
branqueamento (Sesso 3.1.3.2).
A reao entre o grupo isotiocianato da fluorescena e o grupo amino da quitosana
(Figura 2.1) ocorre em meio cido com a protonao do nitrognio da fluoroscena que deixa
o carbono do grupo isotiocianato eletronegativo. O nitrognio da quitosana, positivamente
carregado em meio cido, atrado pela densidade eletrnica do carbono formando a ligao
N-C entre as duas molculas.
No procedimento experimental, 1 g de quitosana (Sigma-Aldrich, 99%, 85%
desacetilada) com massa molar mdia de 150 000 g/mol determinada conforme descrito na
Sesso 2.3.1, foi dissolvido em 100 mL de soluo de cido actico (Merck) 0,1 M por
agitao com barra magntica durante trs horas. Da mesma forma, 40 mg de isotiocianato de
fluorescena ismero I (FITC) (Fluka BioChemika, 90%) foram dissolvidos em 40 mL de
metanol (Normapur). Uma poro de 100 mL de metanol foi misturada soluo de
quitosana aps a dissoluo do polmero para favorecer a ambientao da fluorescena.
Assim, a soluo de fluorescena em metanol foi lentamente adicionada na soluo de
43
quitosana sob intensa agitao. O sistema permaneceu sob agitao durante uma hora na
ausncia de luz e na temperatura ambiente.

Figura 2.1. Reao entre quitosana e isotiocianato de fluoroscena com a obteno da
quitosana fluorescente.
1

A concentrao de FITC no meio reacional foi calculada em relao concentrao
de quitosana considerando uma substituio de grupos amino protonados por grupos amino
fluorescentes na relao aproximada de 1:50, ou seja, a cada 50 grupos amino, um foi
modificado com a ligao molcula fluorescente. Para isso, foi considerada uma massa
molar de 150 000 g/mol e um grau de desacetilao de 85%. A massa molar do monmero
desacetilado de 161 g enquanto que a massa do monmero acetilado de 203 g. Em uma
molcula de quitosana, portanto, temos aproximadamente 792 grupos amino considerando
que em 150 000 g 85% da massa representam o monmero de 161 g e 15% o monmero de
O
NH
2
OH
O H
O
O
NH
2
OH
O H
O
N C S
O
OH
OH
O
O
cido actico (0,1 M) / metanol (1:1)
O
NH
2
OH
O H
O
N H C
S
O
OH
OH
O
O
O
NH
OH
O H
O
+
44
203 g. A massa de 40 mg de FITC (389 g/mol) representa uma molcula do composto para
aproximadamente 50 monmeros desacetilados de quitosana.
Aps a agitao, a quitosana fluorescente obtida foi precipitada em 500 mL de
soluo de hidrxido de sdio (Merck, 99%) 0,1 M sob agitao inicial seguida de
decantao natural. Em seguida o precipitado foi separado por filtrao com filtro sinterizado
(porosidade G4, Schott Duran) sob vcuo e vigorosamente lavado com grande quantidade de
gua MilliQ at que a gua de lavagem apresentou-se incolor. O precipitado de quitosana
fluorescente, de colorao laranja intenso, foi seco em dessecador de silicagel (Merck) sob
vcuo durante 24 horas. A massa final foi de 0,8 g representando uma recuperao de 80% da
massa de quitosana. Ocorreram perdas nos processos de precipitao e filtrao.
Um procedimento complementar foi efetuado para garantir o polmero livre de
molculas de fluorescena, que poderiam no estar quimicamente ligadas na quitosana. Para
isso, aps a secagem, o polmero em forma de flocos foi disperso em 50 mL de metanol e
permaneceu sob agitao durante 15 minutos. Em seguida a poro lquida foi separada e
uma nova quantidade de metanol foi adicionada repetindo-se o processo cinco vezes. Com
isso garantiu-se a separao de FITC livre, solvel em metanol, da quitosana, insolvel em
metanol. Por fim, o polmero fluorescente foi seco no dessecador por 24 horas e aps
transferido para um frasco mbar fechado e acondicionado em geladeira.
Os comprimentos de onda de excitao e emisso da quitosana fluorescente foram
verificados atravs de espectrofotometria de fluorescncia. A quitosana fluorescente foi
dissolvida na soluo tampo padro, utilizada em todos os experimentos. A soluo tampo
de pH 4,5 0,1 consiste de cido actico 0,02 M e acetato de sdio (Aldrich, 98%) 0,02 M
contendo 0,1 M de NaCl (Merck, 99%). Tipicamente, para a preparao de 100 mL de
soluo, 0,17 g de acetato de sdio e 0,6 g de NaCl so dissolvidos em gua MilliQ, 120 L
de cido actico so adicionados e o volume completado e homogeneizado.
A dissoluo do polmero na soluo tampo, em proporo de at 2,5 mg/mL,
ocorreu por agitao vigorosa com barra magntica durante 3 horas na temperatura ambiente.
Em seguida, a soluo de quitosana foi filtrada atravs de membranas hidroflicas (Millipore)
de 0,45 e 0,22 m de porosidade. Uma poro de 5 L da soluo filtrada foi diluda a 3 mL
com a soluo tampo numa clula de quartzo e a anlise dos comprimentos de onda foi
procedida em espectrofluormetro (Hitachi F-4010) na temperatura ambiente. A avaliao da
perda de polmero pela filtrao est descrita na Sesso 2.9.4.
45
2.2. Lipossomas e Quitossomas Nanomtricos

2.2.1. Mtodo da Evaporao em Fase Reversa

O mtodo clssico para a produo de lipossomas nanomtricos, descrito por
Bangham e colaboradores,
3
continua sendo utilizado na pesquisa devido a sua simplicidade e
baixo custo. Para contornar as desvantagens da distribuio de tamanhos elevada e tipos de
lipossomas obtidos, sonicao, extruso e ultra-agitao tm sido aplicadas para a
padronizao das estruturas.
Porm, esses procedimentos de ps-tratamento no resolvem um parmetro
importante para fins de aplicao. Normalmente os lipossomas preparados pelo mtodo da
hidratao do filme so caracterizados por taxas de encapsulamento de substncias
hidroflicas geralmente inferiores a 15%.
4
Uma tentativa para resolver o problema do
reduzido encapsulamento e da baixa proporo entre volume encapsulado e rea de superfcie
foi proposta em 1978 por Szoka e Papahadjopoulos com o desenvolvimento do processo da
evaporao em fase reversa para a produo de lipossomas unilamelares grandes.
5
Nesta metodologia os seguintes passos so seguidos como ilustrado na Figura 2.2:
1. Os fosfolipdios so dissolvidos em solvente orgnico.
2. Uma poro aquosa adicionada, ocorrendo a formao de duas fases; a tendncia
dos fosfolipdios de se depositarem sobre a interface gua/solvente orgnico pelas
interaes de polaridade das extremidades polares com a gua e interaes de
apolaridade entre as cadeias hidrocarbonadas e o solvente orgnico.
3. A mistura submetida sonicao; ocorre formao de micelas reversas onde
gotculas de gua so cercadas pelos fosfolipdios; a mistura torna-se transparente ou
opalescente, porm de aspecto homogneo.
4. O solvente orgnico evaporado; as micelas reversas concentram.
5. Com a eliminao total do solvente orgnico, muitas micelas colapsam e ocorre a
formao de um organogel de alta viscosidade.
6. Na etapa final, sob agitao, os lipossomas so formados e o sistema torna-se um
lquido leitoso; uma poro aquosa pode ser adicionada para acelerar a formao das
estruturas.
46

Figura 2.2. Representao das diferentes etapas do mtodo de evaporao em fase reversa.
5,6

Neste processo, substncias hidroflicas a serem encapsuladas nos lipossomas
podem estar presentes na poro aquosa adicionada na etapa 2. A metodologia foi
investigada para diferentes compostos hidroflicos e percentuais de encapsulamento entre 24
e 68% foram observados.
4,5
Esses percentuais so elevados se comparados com os obtidos
em outras metodologias para as mesmas substncias e desta forma a evaporao em fase
reversa continua sendo um processo de produo de lipossomas acessvel caracterizado pela
alta capacidade de encapsulamento.
4
Analisando as desvantagens desta metodologia em relao s tcnicas mais
modernas, a evaporao em fase reversa necessita do uso de solvente orgnico que, apesar da
evaporao na etapa 4, pode permanecer como elemento trao contaminando a regio apolar
da membrana dos lipossomas. Outra desvantagem o uso da sonicao, que pode no ser
adequada para determinadas molculas que podem desestruturar ou sofrer reaes
indesejadas sob ao da energia dissipada.
7,8
Nos trabalhos desenvolvidos com lipossomas e quitossomas nanomtricos na
presente Tese, o mtodo da evaporao em fase reversa foi empregado para a incorporao
da quitosana.
6
Enquanto a maioria dos trabalhos desenvolvidos com quitossomas prepara as
vesculas separadamente e aps dispersa as mesmas em soluo aquosa contendo o polmero,
47
a adio de uma soluo aquosa contendo quitosana na etapa 2 da evaporao em fase
reversa permite a obteno de quitossomas contendo polmero tambm no interior das
estruturas (Figura 2.3).

Figura 2.3. Representao das diferentes etapas do mtodo de evaporao em fase reversa
com a adio de quitosana na etapa 2.
6

Para a preparao de quitossomas nanomtricos, solues de quitosana entre 0,1 e
1,0 mg/mL foram preparadas com tampo cido actico de pH = 4,5 0,1 conforme descrito
na Sesso 2.1. A quitosana utilizada na maioria dos trabalhos foi obtida pela reao de
hidrlise da quitina, o que foi procedido durante o desenvolvimento da Dissertao de
Mestrado do mesmo autor.
6
A caracterizao do polmero tambm foi feita, sendo que o grau
de desacetilaao de 83% foi determinado por Infra Vermelho. Quitosana comercial (Sigma-
Aldrich, 99%) tambm foi empregada assumindo-se o grau de desacetilaao de 85%
conforme informado pelo fabricante. Parmetros fsicos e dinmicos para os dois polmeros
em soluo foram determinados conforme descrito na Sesso 2.3.1.
O fosfolipdio fosfatidilcolina da lecitina de soja, fornecido pela Solae do Brasil S.
A., foi utilizado para a preparao dos lipossomas e quitossomas nanomtricos. O composto
apresenta um aspecto pastoso, amarelado e higroscpico sendo que o mesmo mantido
congelado (-14 C) sob atmosfera inerte. O grau de pureza da fosfatidilcolina de
48
aproximadamente 95% e uma estrutura caracterstica est representada na Figura 2.4.a. A
molcula representa um fosfolipdio de massa molar M = 790 g/mol. O grau de hidratao de
6,2% foi determinado pelo mtodo de Karl Fisher. As impurezas presentes consistem na
lisofosfatidilcolina (LPC), o primeiro produto de degradao (Figura 2.4.b), e no cido
fosfatdico (DPPA) (Figura 2.4.c).

Figura 2.4. Estruturas moleculares da 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) (a), L-
-lisofosfatidilcolina (LPC) (b), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (DPPA) (c) e da
1-oleoil-2-[12-[(nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoil]-sn-glicero-3-fosfocolina
(NBDPC) (d).

H
P
O
-
O
O
N
+ O
NH N
+
N
O
N
O
O
O
O
- O
O
P
O
-
O
O
N
+ O
H
O
O
O
O
b
a
P
O
-
O
O
N
+ O
H
O H
O
O
P
O
-
OH
O
O
H
O
O
O
O
c
d
49
A lisofosfatidilcolina resultante da hidrlise da funo ster no carbono de
posio 1 ou 2 do glicerol, o que produz uma molcula com apenas uma cadeia apolar.
9
Sua
presena aumenta consideravelmente a permeabilidade das membranas de lipossomas,
diminuindo a capacidade de reteno de material encapsulado.
4
Alm disso, possui relativa
toxidez.
10
O cido fosfatdico apresenta carga negativa na regio polar e pode alterar o
potencial superficial das vesculas. Sua presena modifica as caractersticas de interao dos
lipossomas em suspenso, podendo ser empregado para evitar processos de agregao das
estruturas, sendo que as mesmas iro repelir umas as outras com a presena da carga
superficial. A mesma carga tambm pode ser vantajosa para a promoo de interaes entre
os lipossomas e outras molculas.
O grau de pureza da fosfatidilcolina foi monitorado por cromatografia em camada
delgada (CCD) com placas de slica (Merck) atravs da metodologia proposta por Marinetti
em que o eluente consiste numa mistura de clorofrmio, metanol e gua nas propores de
6,5:2,5:0,4.
11
A mistura tambm se mostrou eficiente para a purificao da fosfatidilcolina a
partir da lecitina de soja bruta em coluna cromatogrfica de slica-gel.
6,12
Para a preparao dos lipossomas, 60 mg de fosfatidilcolina foram dissolvidos em
10 mL de acetato de etila (Nuclear) ou clorofrmio (Sigma-Aldrich) em balo de fundo
redondo para evaporador rotatrio; 200 L de gua (MilliQ) ou de soluo tampo contendo
quitosana foram adicionados para produzir respectivamente lipossomas e quitossomas. A
mistura foi submetida ao ultrassom de banho (Brason 1200) durante 3 minutos fornecendo
disperses opalescentes e homogneas de micelas reversas.
O solvente orgnico foi evaporado em evaporador rotatrio sob vcuo, com rotao
constante e aquecimento do banho em at 35 C. Um organogel de aspecto altamente viscoso
foi obtido. Em seguida, uma poro de gua pura foi adicionada e um lquido visivelmente
leitoso de lipossomas ou quitossomas foi obtido sob agitao manual. A poro de gua
adicionada variou de acordo com a diluio necessria para a tcnica de anlise procedida e a
mesma est descrita em cada Sesso respectiva. Para as anlises de RMN, por exemplo, o gel
foi diludo a 2 mL com gua deuterada (Aldrich).
Estudos do efeito da filtrao foram procedidos atravs de espalhamento de luz e
SAXS.
13
Para isso, amostras de lipossomas e quitossomas de diferentes concentraes
polimricas foram filtradas por filtros de porosidade 0,45 e 1,20 m (Millipore).
50
Estudos do efeito da ao da ultrasonicao tambm foram procedidos atravs de
espalhamento de luz e microscopia eletrnica. Amostras diludas a 5 mL foram sonicadas
empregando-se um ultrassom de ponta (VibraCell 72412 tip Bioblock Scientific) com ponta
de 2 mm de dimetro aplicando-se uma energia de 50 mW, freqncia nominal de 40 kHz
sob amplificao de 10%. Os tempos de sonicao foram variados entre 30 segundos e 10
minutos temperatura ambiente.
Estes foram os nicos ps-tratamentos procedidos nas vesculas. Eventualmente, as
mesmas permaneceram acondicionadas em frascos fechados sob atmosfera de argnio e em
geladeira durante no mximo 15 dias, porm, normalmente as anlises foram procedidas logo
aps a preparao das amostras.
Lipossomas e quitossomas fluorescentes tambm foram preparados pela mesma
metodologia. Para lipossomas fluorescentes uma poro de 600 L do fosfolipdio
fluorescente 1-oleoil-2-[12-[(nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoil]-sn-glicero-3-
fosfocolina (NBDPC, Avanti Polar Lipids, 99%) (Figura 2.4.d), dissolvido em clorofrmio
concentrao de 0,1 mg/mL, foi adicionada na etapa 1 da preparao, juntamente com a
fosfatidilcolina da soja dissolvida igualmente em clorofrmio. Para quitossomas
fluorescentes foi utilizada a quitosana fluorescente preparada conforme descrito na Sesso
2.1 e adicionada em soluo tampo na etapa 2.

2.3. Espalhamento de Luz

A luz pode ser descrita como uma onda eletromagntica, pois resultante da soma
vetorial do campo eltrico e do campo magntico que se propagam pelo espao
perpendicularmente entre si. Esta onda pode exercer foras eltrica e magntica em partculas
carregadas e sobre dipolos magnticos.
14,15
Na interao da luz com as molculas, o campo eltrico da luz fornece uma energia
que estimula os movimentos dos eltrons. Dessa forma, os eltrons excitados comportam-se
como dipolos oscilantes que emitem energia na forma de radiao para retornar ao seu estado
fundamental. As possveis interaes entre a luz e uma molcula dependem da variao de
energia de oscilao dos eltrons da molcula. Tipicamente, as freqncias nas quais os
eltrons oscilam esto na faixa de 10
15
a 10
16
s
-1
. Estas freqncias correspondem quelas da
luz com comprimentos de onda na regio fotoqumica de 200 a 700 nm, ou seja, nas regies
51
do ultravioleta e do visvel. Assim, com a induo de um momento de dipolo com a ao do
campo eltrico, produzida uma radiao eletromagntica secundria que espalhada por
uma molcula quando a mesma iluminada com luz monocromtica. O fenmeno do
espalhamento de luz , por conseguinte, uma caracterstica da matria.
A relao entre comprimento de onda da radiao eletromagntica incidente e o
tamanho do objeto que est espalhando luz estabelecida pelo vetor de onda q. A geometria
bsica do espalhamento (Figura 2.5) consiste no vetor de onda da radiao incidente sobre o
objeto (k
i
) e no vetor de onda da radiao espalhada pelo objeto observado (k
f
).
16-18

Figura 2.5. Geometria bsica de espalhamento onde a radiao incidente sobre um objeto
consiste num vetor de onda k
i
e a radiao espalhada consiste num vetor de onda k
f
num
ngulo em relao radiao incidente.

Assim o vetor de onda num experimento de espalhamento definido:

q = k
f
- k
i
(2.1)

Para a luz visvel, as magnitudes de k
i
e k
f
so respectivamente 2n/
i
e 2n/
f

onde n representa o ndice de refrao. Porm, no espalhamento definido como elstico, o
comprimento de onda da radiao incidente
i
igual ou muito prximo ao da radiao
espalhada
f
, ento:

k
i
k
i
k
f
52
k
i
= k
f
(2.2)

Aplicando-se a lei dos cossenos, o vetor de onda q calculado:
16-18

=
2
4
2
2

sen
n
sen k q
i
(2.3)

Na luz visvel os comprimentos de onda da radiao esto entre 400 e 700 nm. As
tcnicas de espalhamento de luz empregam uma fonte de luz de alta intensidade, como um
laser, dentro dessa faixa de comprimentos de onda. Desta forma possvel observar e
caracterizar macromolculas e estruturas particuladas que se encontram includas na faixa
dimensional nanomtrica em soluo ou em suspenso num solvente apropriado.
A intensidade da luz espalhada depende da direo de polarizao do feixe
incidente, do ngulo de espalhamento e das caractersticas das amostras.
16,19
Com a luz incidente linearmente polarizada, ou seja, com o campo eltrico
incidente e espalhado perpendiculares ao plano de espalhamento, a intensidade de luz
espalhada I
S
por uma nica molcula com dimenses muito menores do que o comprimento
de onda da radiao incidente assume a forma:
16,20,21

2
0
2 4 2
0
2 2 2 2
) / )( ( 4
R
SI
R N
I dc dn sen M
I
A
S
= =

(2.4)

onde M a massa molecular, dn/dc o incremento no ndice de refrao da soluo em que a
molcula se encontra, I
0
a intensidade da luz incidente, N
A
o nmero de Avogadro, o
comprimento de onda da luz incidente, R a distncia entre o ponto de espalhamento e o
ponto de observao e o ngulo formado entre a direo de propagao da luz espalhada
com o campo eltrico da radiao incidente.
A forma de aquisio da intensidade de luz espalhada por uma amostra que define
o tipo de tcnica de espalhamento de luz. Quando a forma de aquisio leva em considerao
as pequenas flutuaes de intensidade geradas pela difuso Browniana do sistema, temos o
53
Espalhamento de Luz Dinmico, tambm denominado de espalhamento quase-elstico. Na
situao em que as flutuaes de intensidade no so consideradas temos o Espalhamento de
Luz Esttico, tambm denominado de espalhamento elstico. Quando grandes modificaes
na freqncia da luz espalhada so analisadas, temos as tcnicas como Brillouin e Raman,
conhecidas como formas de espalhamento inelstico.
22,23
No que concerne a parmetros dimensionais das estruturas que podem ser
observadas por tcnicas de espalhamento, deve-se considerar a relao inversa entre o vetor
de onda q e a dimenso L do objeto. Nas condies em que qL > 1, a radiao espalhada
contm informaes sobre a estruturao interna de macromolculas. Quando qL < 1, a
radiao espalhada contm informaes sobre a regio do espao maior do que uma
macromolcula ou partcula. J com qL << 1, informaes de vrias macromolculas,
agregados e conjuntos de partculas podem ser acessadas. Para o ajuste da condio desejada,
o vetor de onda pode ser modificado pela alterao do ngulo de observao, pelo ndice de
refrao da soluo ou pelo comprimento de onda do feixe de luz empregado. Nas condies
experimentais dos trabalhos desenvolvidos nesta Tese, foi estabelecida a relao qL 1 para
as tcnicas de espalhamento de luz.
14,16

2.3.1. Espalhamento de Luz Esttico

No espalhamento de luz elstico considera-se apenas a quantidade mdia da luz
espalhada em uma determinada direo, sem levar em conta a modificao na distribuio de
freqncias. Neste caso, tem-se o Espalhamento de Luz Esttico (Static Light Scattering
SLS) onde medido o excesso de intensidade da luz espalhada por uma soluo comparada
intensidade de luz espalhada pelo solvente puro.
A teoria de espalhamento de luz para lquidos puros e solues contendo
macromolculas foi descrita por Smoluchowski, Einstein e Debye na teoria da flutuao-
dissipao. A partir desta teoria a seguinte relao estabelecida:
16,18

... 3 2
1
3 2
+ + + = c A c A
M R
Kc
(2.5)
54
onde K uma constante ptica calculada a partir do incremento no ndice de refrao
especfico das amostras em solvente (dn/dc) no mesmo comprimento de onda da luz
incidente na amostra (
o
):

4
2 2
) / ( 4
o A
o
N
dc dn n
K
= (2.6)

c a concentrao, R
a razo de Rayleigh (R
= I
S
/ I
0
= 16
2
/
4
R
2
), A
2
o segundo
coeficiente virial, n
o
o ndice de refrao do meio, I
S
a intensidade de luz espalhada total
menos a intensidade de luz espalhada pelo solvente puro, I
0
a intensidade de luz incidente,
a polarizabilidade da molcula e R a distncia entre o detector e o centro espalhador.
Na prtica a determinao do valor absoluto da intensidade primria muito difcil,
assim o R
determinado em relao R
de um padro, como benzeno ou tolueno. Ento a

razo de Rayleigh obtida:

padro
pado
solvente soluo
R
I
I I
R

= (2.7)

O segundo coeficiente virial A
2
descreve o afastamento da equao limite (2.7)
resultante das interaes intermoleculares entre as partculas e o solvente. O terceiro
coeficiente virial A
3
muito pequeno, assim como os subseqentes, portanto podem ser
desprezados.
O Espalhamento de Luz Esttico uma das tcnicas mais utilizadas para a
caracterizao de polmeros em soluo. A tcnica considerada uma metodologia absoluta
para a determinao da massa molar mdia de macromolculas. Um dos mtodos mais
empregados para a anlise da luz espalhada a relao de Zimm:
24,25

c A
q R
M R
Kc
g
w
2
2 2
2
3
1
1
+
+ =
(2.8)

55
onde M
w
a massa ponderal mdia e R
g
o raio de giro.
A relao de Zimm requer medidas do excesso de intensidade de luz espalhada pela
soluo comparada intensidade de luz espalhada pelo solvente puro a diferentes ngulos de
espalhamento e diferentes concentraes da soluo polimrica. Desta forma, o
conhecimento da mdia das intensidades espalhadas pelas n partculas contidas no volume de
espalhamento, juntamente com o incremento no ndice de refrao polmero-solvente,
fornece atravs do mtodo de Zimm a massa molar ponderal mdia, o raio de giro e o
segundo coeficiente virial.
Na prtica, traado um grfico de Kc / R
versus sen
2
( / 2) + kc, onde k uma
constante aleatria para proporcionar a separao grfica das curvas de espalhamento
individuais obtidas a diferentes concentraes. Com a extrapolao dos dados para
concentrao zero e ngulo zero, a massa ponderal mdia obtida pela interseco das
curvas no eixo das ordenadas. Pelas inclinaes das curvas desta extrapolao, tambm so
obtidos o raio de giro e o segundo coeficiente virial.
O raio de giro descreve a distribuio estatstica das distncias entre os extremos da
superfcie externa de uma macromolcula ou partcula e o centro de massa. Em suma, o R
g

a medida da mdia dos raios da estrutura a partir do seu centro de massa. Para uma cadeia
polimrica isso significa a mdia das distncias de cada um dos segmentos da cadeia ao seu
centro de massa.
Uma outra forma de obter o R
g
de partculas em suspenso atravs do mtodo da
dissimetria angular, que considera:

d
s
() = I() / I(180
o
- ) (2.9)

onde I() a intensidade de luz espalhada no ngulo de observao e I(180
o
- ) a
intensidade de luz espalhada no ngulo de 180
o
subtrado da intensidade de luz espalhada no
ngulo de observao. Pela relao:

d
s
() 1 + 2 (R
g
2
/ 3) q
2
(2.10)

56
obtm-se o raio de giro aproximado.
6,12,13,26,27
O Espalhamento de Luz Esttico, atravs do mtodo de Zimm, foi utilizado para a
caracterizao do polmero quitosana em soluo tampo. Da mesma forma como procedido
para a caracterizao da quitosana obtida pela hidrlise da quitina,
6,26
a quitosana comercial
(Sigma-Aldrich) foi dissolvida na soluo tampo, conforme descrito na Sesso 2.1, em
concentraes variando entre 0,1 e 1,0 mg/mL. A presena de impurezas como
contaminantes, poeira, fibras e partculas, prejudicam as medidas de espalhamento de luz, por
isso as amostras em soluo devem ser cuidadosamente filtradas e/ou centrifugadas antes da
realizao das medidas. Desta forma, as amostras foram filtradas a 0,45 e 0,22 m para
cubetas pticas e centrifugadas por 99 min a 4000 rpm (ALC Centrifuge PK120) na
temperatura ambiente.
Para a obteno do grfico de Zimm, a intensidade da luz espalhada foi medida a
temperatura de 20 C em intervalos angulares de 10
o
entre os ngulos de 30
o
e 150
o
para cada
amostra. O tolueno foi usado como padro para a determinao da razo de Rayleigh. Para o
clculo da constante ptica K, o incremento no ndice de refrao em funo da concentrao
foi obtido refratometricamente (Brookhaven Instruments BI-DNDCW) para as mesmas
concentraes a 620 nm como dn/dc = 0,198 mL/g a temperatura de 20
o
C.
6
Com a obteno da M
w
e do R
g
tambm foi calculada a concentrao crtica (c*) das
amostras de quitosana atravs da relao: c* = M
w
/ N
A
R
g
3
4/3.
6,26
A c*, assim como o A
2
,
um parmetro de avaliao da qualidade do solvente para o polmero em soluo. O A
2
est
relacionado interao entre soluto e solvente, quanto maior o seu valor, maior ser essa
interao. De forma simplificada, valores positivos de A
2
significam que temos um bom
solvente e valores negativos significam um mau solvente, onde pode ocorrer a formao de
agregados ou precipitados. J a c*, o inverso da viscosidade intrnseca, significa a
concentrao mxima do soluto no solvente em questo onde h ausncia de interaes entre
as macromolculas. O soluto est bem dissolvido at a c*, ou seja, est no regime diludo. O
sistema no se encontra mais em regime diludo acima da c*. Portanto, quanto maior a c*,
melhor ser o solvente para manter o sistema no regime diludo.
Este estudo detalhado do polmero em soluo foi procedido nos trabalhos de
Mestrado do mesmo autor,
6
sendo aqui novamente descrito por ter sido repetido para o
polmero comercial (Sigma-Aldrich, 99%). Foi obtida uma massa molar mdia M
w
= 150 000
g/mol, A
2
= 1,55.10
-5
cm
3
.mol/g
2
, R
g
= 48 nm e c* = 0,53 mg/mL, o que demonstra que o
57
polmero comercial apresenta caractersticas semelhantes ao polmero obtido pela hidrlise
da quitina: M
w
= 164 000 g/mol, A
2
= 2,87.10
-3
cm
3
.mol/g
2
, R
g
= 44 nm e c* = 0,79 mg/mL.
O mtodo da dissimetria angular foi empregado para a avaliao do raio de giro dos
lipossomas e quitossomas nanomtricos em suspenses aquosas altamente diludas. Para
tanto, o organogel obtido na etapa 5 da preparao em fase reversa (Sesso 2.2.1) foi diludo
a 100 mL em gua MilliQ para a formao das vesculas. Pores de 10, 50 e 100 L foram
diludas a 10 mL de gua e transferidas para as cubetas pticas sob filtrao quando
requerido. A dissimetria foi medida entre os ngulos de 35 e 155 em intervalos de 10 na
temperatura de 20 C.
Medidas simples de intensidade de luz espalhada (I
S
) tambm foram obtidas para
lipossomas e quitossomas com variao de temperatura para a determinao das temperaturas
de transio de fase das bicamadas das vesculas. Para isso, pores da diluio a 100 mL
foram transferidas para cubetas pticas. O equipamento de espalhamento de luz dispe de um
sistema de circulao de gua que permite, atravs de um banho externo acoplado (Science
Electronics), submeter amostras a diferentes temperaturas. Assim, as amostras foram
aquecidas entre 20 e 87 C seguindo uma rampa de 1 C/min com intervalos de 10 minutos a
cada 2 C quando foram efetuadas as medidas de intensidade de luz em 10 repeties a cada
0,1 minuto. As medidas foram obtidas no ngulo de espalhamento de 135.
O equipamento de espalhamento de luz utilizado (Figura 2.6) consiste de um laser
He-Ne de 35 mW e comprimento de onda de 632,8 nm, modelo 127 da Spectra-Physics
acoplado a um gonimetro BI-200M verso 2.0 e com correlador digital BI-9000AT da
Brookheaven Instruments.
O gonimetro montado sobre uma base circular e conectado a um motor que
permite a seleo automtica dos ngulos de medida. As cubetas pticas de vidro contendo as
amostras permanecem no centro do gonimetro dentro de uma cuba tambm de vidro e
imersas em decaidronaftaleno (Aldrich, 99%), cujo ndice de refrao semelhante ao do
vidro, para impedir a interferncia das paredes da cubeta.
O correlador dispe de uma fotomultiplicadora (BI-9863 Brookheaven Instruments)
que faz a deteco e amplificao da luz espalhada. O sistema ligado a um computador que
atravs de um software faz a armazenagem e o tratamento dos pulsos provenientes do
equipamento.

58

Figura 2.6. Vista superior do equipamento de espalhamento de luz. O laser incide sobre a
amostra localizada no centro do gonimetro. A luz espalhada em determinado ngulo
coletada e amplificada pela fotomultiplicadora que envia os dados ao computador.

2.3.2. Espalhamento de Luz Dinmico

No espalhamento quase-elstico so consideradas as pequenas variaes de
intensidade da luz espalhada, resultantes das flutuaes do ndice de refrao da soluo
dentro do volume de espalhamento. As flutuaes do ndice de refrao podem ser
resultantes da difuso translacional das molculas ou partculas em soluo ou suspenso, o
denominado movimento browniano. Essas flutuaes podem ser correlacionadas e avaliadas
em termos de vrios processos de relaxao atravs de uma funo de correlao temporal,
obtida por um correlador, caracterizando a espectroscopia de correlao de ftons, mais
conhecida com Espalhamento de Luz Dinmico (Dynamic Light Scattering DLS).
17,18,20
A funo de correlao temporal estabelece uma periodicidade entre os sinais de
intensidade obtidos durante certo tempo, correlacionando-os, considerando que existe uma
similaridade entre os movimentos das partculas que espalham luz. As flutuaes de sinal
podem ser registradas no domnio do tempo atravs de uma funo de correlao de
intensidade temporal G
(2)
():
16,28

+ = + =
T
T T
dt t J t I
T
t J t I G ) ( ) (
2
1
lim ) ( ) ( ) (
) 2 (
(2.11)
LASER
59
onde I(t) e J(t) so sinais que dependem do tempo, 2T o perodo no qual feita a medida e
o tempo de retardo, cujo valor muito pequeno se comparado ao perodo das flutuaes.
A G
(2)
() chamada de funo de autocorrelao de intensidades ou de correlao
cruzada, dependendo se I(t) e J(t) so iguais ou diferentes, respectivamente, e a mesma pode
ser relacionada com a funo de correlao temporal do campo eltrico, g
(1)
(), pela
relao de Siegert:
16,28

+ =
2
) 1 ( ) 2 (
) ( 1 ) ( g A G (2.12)

onde A a linha de base medida e o fator de coerncia ptica, um parmetro que depende
da ptica de deteco.
A funo de correlao temporal pode ser aproximada a um nico decaimento
exponencial relacionado a uma nica taxa de relaxao :

t
o
Ae A G

+ = ) (
) 2 (
(2.13)

Porm, a equao (2.13) vlida somente para sistemas onde as partculas,
movendo-se num fludo, so rgidas, esfricas, no interatuantes e monodispersas. Como na
maioria dos casos as solues e disperses de partculas so polidispersas, a G
(2)
()
definida por uma distribuio de exponenciais, que podem ser representadas como uma
integral de Laplace do tipo:

=
0
) 2 (
) ( ) (
t
e G G (2.14)

Atravs de mtodos matemticos de anlise da equao (2.14) determinada a
freqncia de relaxao . Nas rotinas mais comuns tm sido empregados os mtodos dos
cumulantes
29,30
e da inverso da integral de Laplace, sendo este ltimo mais elaborado que os
cumulantes e bastante utilizado atravs da anlise de histograma pela amostragem
60
exponencial, o que foi aplicado neste trabalho atravs do programa computacional
CONTIN.
31
Com o valor de , considerando-se qL < 1 conforme discutido na Sesso 2.3, pode-
se determinar o valor do coeficiente de difuso aparente:
17

2
q
D
ap

= (2.15)

onde corresponde a meia largura a meia altura da curva de distribuio de freqncias.
O coeficiente de difuso diluio infinita, D
o
, pode ser determinado a partir da
extrapolao do D
ap
para concentrao zero e q zero. D
o
possui uma relao linear com o
coeficiente de difuso a uma dada concentrao, D
c
:

) 1 ( c k D D
D o c
+ = (2.16)

onde k
D
o coeficiente virial dinmico relacionado com as interaes termodinmicas entre
as partculas e o solvente.
Com a determinao do D
o
, o raio hidrodinmico R
h
das partculas facilmente
obtido atravs da relao de Stokes-Einstein:
17

h
B
o
R
T k
D
6
= (2.17)

onde k
B
a constante de Boltzmann, T a temperatura e a viscosidade do solvente.
De forma hipottica, o raio hidrodinmico define o raio de uma esfera rgida que
difunde com a mesma velocidade da partcula que est sendo examinada pelo Espalhamento
de Luz Dinmico. Na prtica, macromolculas e tambm muitas partculas, no so rgidas,
pois possuem dinmica interna com movimentos entre cadeias que podem estender ou
contrair com a difuso, por exemplo. Macromolculas e partculas tambm so solvatadas, ou
61
seja, possuem certa interao com o meio solvente, sendo que uma poro deste ltimo pode
difundir juntamente com a partcula. Sendo assim, o raio hidrodinmico representa o raio
mdio de uma partcula dentro da sua dinmica de difuso, considerando a camada de
solvatao. Em comparao com o raio de giro, o mesmo pode ser maior ou menor,
dependendo das caractersticas estruturais e de interao das partculas com o solvente ou
lquido de suspenso. A Figura 2.7 ilustra de forma comparativa os dois tipos de raios
obtidos pelas tcnicas de espalhamento de luz para duas espcies de cadeia polimrica.

Figura 2.7. Comparao entre raio de giro (R
g
) e raio hidrodinmico (R
h
) para duas cadeias
polimricas isoladas (linhas contnuas) representando uma cadeia tipo novelo (esquerda) e
uma cadeia extendida (direita).

A relao entre R
g
, obtido por Espalhamento de Luz Esttico (Sesso 2.3.1), e R
h
,
obtido por Espalhamento de Luz Dinmico, fornece o parmetro = R
g
/ R
h
que um
indicativo da conformao de cadeias polimricas em soluo. Um amplo estudo
relacionando valores de com a estruturao de polmeros em soluo foi desenvolvido por
Burchard e Richtering.
32
Assim, uma classificao do tipo de cadeia polimrica em soluo
tem se estabelecido em funo de diferentes valores de .
32-35
Nas medidadas de Espalhamento de Luz Dinmico, as funes de correlao
temporal foram obtidas em modo multi- pelo correlador analgico multicanal. O correlador
est acoplado ao computador que dispe de um software denominado BI-ISDA, o qual
contm um programa baseado em cumulantes (BI-PCS), um programa para anlise
exponencial mltipla (NNLS) e uma verso simplificada do programa CONTIN.
31
Uma
R
h

R
g

R
h

R
g

62
verso completa do programa CONTIN tambm foi aplicada para avaliao posterior dos
resultados das medidas. Eventualmente o programa REPES, variante atualizado, foi aplicado
para esta avaliao.
8,36
Os valores de R
h
foram obtidos para quitosana em soluo tampo, com amostras
preparadas conforme descrito na Sesso 2.3.1. Para lipossomas e quitossomas, o gel obtido
na etapa 5 da preparao em fase reversa (Sesso 2.2.1) foi diludo a 100 mL em gua MilliQ
para a formao das vesculas. Pores de 1, 2, 3, 5 e 7 mL foram diludas a 10 mL de gua e
transferidas para as cubetas pticas sob filtrao quando requerido.
Medidas efetuadas no ngulo de espalhamento de 90 forneceram R
h
aparentes.
Para a determinao dos R
h
absolutos, medidas com variao angular entre 30 e 150 foram
procedidas com amostras de diferentes concentraes e extrapoladas a ngulo e concentrao
zero. Para as vesculas, os valores do k
D
tambm foram obtidos.
13
Todas as medidas foram
realizadas a temperatura ambiente de 20 C no mesmo equipamento descrito na Sesso 2.3.1.

2.3.3. Recuperao de Fluorescncia Aps Foto-Branqueamento

A Recuperao de Fluorescncia Aps Foto-Branqueamento (Fluorescence
Recovering After Photobleaching FRAP) consiste numa tcnica ptica que analisa a perda
de fluorescncia sobre um objeto fluorescente que foi submetido a uma irradiao que
induziu a perda. O foto-branqueamento significa a perda da capacidade de fluorescncia de
uma molcula fluorescente, que pode ser resultante de uma degradao qumica induzida
pela exposio a um fluxo de ftons.
37
De forma concisa, no processo de fluorescncia um fton absorvido por uma
molcula criando um estado eletrnico excitado. Durante o tempo de vida do estado excitado,
a molcula pode experimentar mudanas conformacionais e interaes com o ambiente
molecular imediato. Ambos os processos modificam as probabilidades de transio para o
estado fundamental e as interaes moleculares podem inclusive reduzir a populao de
molculas excitadas promovendo sua desativao no radioativa. No estgio final, um fton
emitido como resposta energtica e a molcula retorna ao seu estado fundamental.
14
Normalmente o fenmeno de fluorescncia consiste num processo reversvel e
assim a mesma molcula pode ser repetidamente excitada. Porm, no foto-branqueamento, a
energia fornecida faz com que as molculas no estado excitado sofram efetivamente
63
mudanas conformacionais, interaes e reaes (de oxidao, por exemplo) que levam as
mesmas a um estado irreversvel com a conseqente perda da fluorescncia. A taxa de perda
da fluorescncia proporcional ao nmero de ftons recebidos, ou seja, depende da energia
do foto-branqueamento e do tempo de exposio.
37
A FRAP uma tcnica que se beneficia desse fenmeno com a irradiao de uma
regio delimitada de um material ou amostra atravs de um laser de alta energia (tipicamente
1 W/mm
2
durante 1 segundo) que destri a capacidade de fluorescncia naquela regio. Com
o tempo, a regio que perdeu a fluorescncia acaba se homogeneizando com as regies que
continuam fluorescentes. Medindo essa recuperao progressiva da fluorescncia, torna-se
possvel estudar a mobilidade de molculas fluorescentes no sistema em anlise e, por
extrapolao, de todas as molculas que o constituem. A metodologia possui uma alta
versatilidade, pois medidas podem ser efetuadas em amostras lquidas ou em superfcies. A
tcnica tem sido empregada na determinao da difuso de polmeros e partculas em
soluo, bem como no estudo da mobilidade de protenas em membranas modelo ou
celulares.
37-41
Dois parmetros fundamentais podem ser determinados conforme ilustrado na
Figura 2.8:
1. A quantidade de fluorescncia recuperada, ou seja, o percentual de fluorescncia
aps a homogeneizao do sistema submetido a foto-branqueamento em relao
fluorescncia inicial.
2. A velocidade com que as molculas fluorescentes migram para a regio que foi
foto-branqueada, ou seja, a velocidade de difuso.

A forma e o tamanho da regio sob foto-branqueamento dependem do aparato
experimental e do tipo de amostra. A tcnica pode ser aplicada em microscopia ptica de
fluorescncia ou em equipamento especfico, semelhante ao espalhamento de luz com uso de
luz laser, fotomultiplicadora e tratamento da intensidade da luz pela correlao de ftons.
Neste caso, considera-se a FRAP tambm como uma tcnica de espalhamento de luz
dinmico, mas que detecta a dinmica de molculas ou partculas fluorescentes.

64

Figura 2.8. Representao grfica do perfil da intensidade de fluorescncia (I) em funo do
tempo (t) num experimento de FRAP. A linha de base (1) sofre um decaimento abrupto no
momento do foto-branqueamento (2). Com o passar do tempo a intensidade de fluorescncia
no ponto foto-branqueado volta a aumentar com a difuso de entidades que no foram foto-
branqueadas (3) at a estabilizao da recuperao de fluorescncia num valor constante (4)
que menor do que o inicial. A fluorescncia perdida no foto-branqueamento x e a
recuperada y. A mobilidade das entidades fluorescentes pode ser determinada pela
declividade da curva 3.

Nos trabalhos aqui realizados com o uso de molculas fluorescentes foi empregado
o equipamento de FRAP representado na Figura 2.9. O feixe de luz laser de argnio de 488
nm com potncia de 1 W (Spectra Physics) dividido em dois sendo que um segmento segue
uma trajetria at atingir a amostra e o outro reflete sobre um espelho localizado a uma
distncia varivel da lmina semi-refletora antes de ser re-orientado sobre o sistema
estudado. Os dois feixes coerentes criam uma figura de grades sobre a amostra com o
espaamento entre as grades definido como:

2
2

sen
i = (2.18)
2
x
t
4
y
3
I
1
65

onde o ngulo entre os dois feixes incidentes. Considerando o vetor de onda:

2
4
sen q = (2.19)

temos:
i
q
2
= (2.20)

A intensidade dos feixes pode ser regulada e para as medidas experimentais a
mesma significativamente atenuada atravs de um polarizador/analisador cruzado de modo
a produzir um feixe incidente de alguns miliwats. Uma clula Pockels intercalada entre o
polarizador e o analisador e a mesma consiste num dispositivo dotado de um cristal orientado
que, sob efeito de uma tenso elevada, torna-se fortemente birrefringente. Assim possvel
controlar a polarizao do feixe incidente em funo da tenso. Com a aplicao de tenso
nas bordas da clula possvel aumentar consideravelmente a potncia incidente a partir de
alguns miliwats at algumas centenas de miliwats produzindo-se assim, a energia necessria
para o foto-branqueamento.
O espelho refletor est sobre um cristal sobre o qual possvel aplicar uma tenso
senoidal o que resulta na variao da defasagem entre os dois feixes e tem como resultado a
oscilao da posio da grade de foto-branqueamento sobre a amostra sem, no entanto, variar
as distncias entre as barras da grade. A fluorescncia emitida pela amostra integrada e
coletada por uma fibra ptica para a fotomultiplicadora.
Na prtica a experincia passa pelas seguintes etapas:
1. Antes do foto-branqueamento as estruturas ou molculas fluorescentes esto
homogeneamente distribudas no volume da amostra.
2. A intensidade luminosa sobre a amostra aumenta consideravelmente por um
instante; uma tenso de alta freqncia aplicada na clula Pockels alterando a polarizao
do feixe que por conseqncia incide sobre a amostra em alta intensidade e assim as
partculas iluminadas so foto-branqueadas; as grades do foto-branqueamento so
66
impressas sobre a amostra; a eficcia do foto-branqueamento depende de fatores como a
intensidade de irradiao, a concentrao de molculas fluorescentes e ordem da reao
qumica envolvida no processo de perda da fluorescncia; consequentemente, o perfil da
concentrao de partculas fluorescentes logo aps o foto-branqueamento peridico, porm
mais complexo do que uma senoidal; mesmo assim, por razes de simplicidade, assumido
um perfil senoidal.

Figura 2.9. Representao esquemtica do equipamento de FRAP. As distncias a e b so
regulveis.

3. O feixe retorna sua intensidade inicial interrompendo o foto-branqueamento; o
cristal submetido a uma tenso senoidal de freqncia 1 kHz que provoca as oscilaes da
grade sobre diferentes regies da amostra; as posies em fase (foto-branqueamento) e fora
de fase (intensidade irradiada mnima, sem foto-branqueamento) se alternam; assim, a
intensidade coletada pela fibra ptica revezada pela intensidade mxima (I
max
) e pela
intensidade mnima (I
min
) e a diferena entre as duas fornece o contraste produzido pela
grade; uma deteco sincronizada permite a filtrao do sinal recebido que restringido
67
freqncia caracterstica de vibrao de 1 kHz, o que permite uma reduo considervel no
rudo de fundo melhorando a qualidade das medidas.
Aps o foto-branqueamento, as molculas ou partculas branqueadas bem como as
fluorescentes difundem pelo movimento Browniano passando de uma grade para outra. A
fluorescncia re-homogeneizada e o contraste das grades diminui com um tempo
caracterstico relacionado com a difuso das partculas.
Considerando a difuso Browniana, a equao de conservao do nmero de
molculas fluorescentes associadas lei fenomenolgica de Fick fornece a equao que rege
a difuso no sistema:

) , (
) , (
t r c D
dt
t r dc r
r
= (2.21)

onde c( r
r
, t) a concentrao local de molculas fluorescentes e D o coeficiente de difuso
das mesmas.
Supondo um meio infinito, pela transformada de Fourier da equao (2.21) temos:

) , (
) , (
2
t q Dc q
dt
t q dc r
r
= (2.22)

sendo r d e t r c t q c
r q I 3 . 3 / 2
) , ( ) 2 ( ) , (

=
r r
r r
.
A resoluo da equao (2.22) fornece:

t Dq
e q c t q c
2
) 0 , ( ) , (

=
r r
(2.23)

onde ) 0 , (q c
r
a concentrao de molculas fluorescentes no espao de Fourier no tempo t=0,
ou seja, imediatamente aps o foto branqueamento.
Por conseguinte, a forma da regio foto branqueada assume um papel muito
importante. Na maioria das tcnicas essa forma uma mancha correspondente forma da
68
fonte que ilumina a amostra, como o feixe do laser ou o diafragma no microscpio. Neste
caso a concentrao em molculas fluorescentes ) 0 , (q c
r
semelhante a uma gaussiana; uma
infinidade de modos de q so excitados e evoluem simultaneamente com tempos
caractersticos diferentes tornando a anlise dos dados extremamente complexa.
Por outro lado, o equipamento de FRAP utilizado na presente Tese, com foto-
branqueamento em forma de grades e medidas de intensidade conforme descrito acima,
permite medidas dos coeficientes de difuso com alta preciso. Mesmo com a presena de
uma infinidade de modos, tendo cada um seus tempos de recuperao de fluorescncia
caractersticos, a leitura atravs de uma figura em forma de grades de interferncia permite a
seleo de um nico valor de q. Assim, para um sistema uniforme de apenas um componente,
o sinal de recuperao de fluorescncia coletado evolui com um tempo caracterstico bem
definido:

2
1
Dq
q
= (2.24)

As curvas de recuperao de fluorescncia obtidas so ajustadas pela equao:

) ( ) ( ) (
0
q
t
e C C C t C
+ =

(2.25)

onde C
0
e C
so respectivamente os contrastes logo aps e um tempo infinitamente depois

da iluminao laser do foto-branqueamento. Desta forma determinado o tempo de
recuperao de fluorescncia
q
com uma preciso superior das medidas convencionais.
Lecuyer constatou o bom funcionamento deste equipamento de FRAP durante seus
trabalhos de doutoramento. A pesquisadora verificou a lei de Stokes-Einstein, equao
(2.17), atravs de medidas de foto-branqueamento de esferas fluorescentes comerciais de
tamanhos padronizados. O resultado experimental obtido para o coeficiente de Stokes foi de
2,17 0,37 x 10
-19
m
3
/s, bem prximo ao terico, 2,45 x 10
-19
m
3
/s.
37
Nos trabalhos desenvolvidos na presente Tese, foram analisados os coeficientes de
difuso de amostras de lipossomas e quitossomas fluorescentes em suspenso aquosa (Sesso
69
2.2.1), bem como de quitosana fluorescente em soluo tampo (Sesso 2.1). Para as
vesculas, o organogel obtido na etapa 5 da preparao em fase reversa contendo NBDPC ou
quitosana fluorescente, foi dissolvido em 5 mL de gua. Como ps-tratamento foi adotado
um procedimento de ultrasonicao atravs do uso de um ultrasonicador de ponta, conforme
descrito na Sesso 2.2.1, sendo que as amostras consideradas ideais para as medidas de
FRAP foram sonicadas durante 5 minutos. Aps, uma alquota de 10 L de cada amostra foi
diluda em 3 mL de gua MilliQ em cubeta de quartzo para a realizao das medidas. Para a
quitosana foi utilizada a mesma diluio descrita na Sesso 2.1 igualmente em cubeta de
quartzo. As medidas foram procedidas na temperatura ambiente (23-25 C).

2.4. Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo

O Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo (Small Angle X-ray Scattering
SAXS) representa uma das tcnicas mais adequadas para estudos estruturais a nvel atmico
e molecular. A ordem dos comprimentos de onda dos raios-X est dentro do intervalo de
alguns ngstrons at algumas centenas de ngstrons.
O SAXS consiste num processo de espalhamento elstico que ocorre quando os
raios-X de alta energia (da ordem de 1,5 ) atingem um material e interagem com os eltrons
do mesmo.
42
A radiao espalhada pelos eltrons nesse caso isotrpica e as ondas
espalhadas interferem entre si de forma construtiva ou destrutiva, dependendo da fase
relativa das diferentes ondas. As interferncias produzidas dependem das relativas posies
atmicas e por conseqncia, a amplitude e intensidade da onda difratada em uma
determinada direo estaro relacionadas com a distribuio espacial dos tomos do
material.
43
Quando existe alta organizao a nvel atmico, com todas as unidades
espalhantes em fase, ocorre um espalhamento cooperativo que produz um perfil de difrao
onde as chamadas reflexes de Bragg apresentam uma alta definio. Num material que
apresenta desorganizao a nvel atmico, as unidades espalhantes estaro fora de fase, o que
resulta num espalhamento difuso ou no-cooperativo e de baixa intensidade, ocorrendo numa
ampla faixa angular.
44
Para a situao onde todas as ondas esto exatamente em fase, a curva de
espalhamento em funo do ngulo tem um mximo em zero e a mesma decresce
suavemente medida que o ngulo aumenta. Supondo os centros espalhantes no vcuo, a
70
amplitude de espalhamento proporcional ao nmero de mols de eltrons por unidade de
volume, ou seja, densidade eletrnica. Com os centros espalhadores imersos em outro
meio, apenas a diferena de densidade eletrnica entre os meios ser considerada. Neste caso,
os centros espalhadores so vistos como inomogeneidades de densidade eletrnica. No caso
de anlise de partculas em suspenso ou em solvente, o espalhamento resultante do
contraste de densidade eletrnica entre a partcula e o solvente. Este contraste pode ser muito
fraco para alguns sistemas constitudos de tomos leves como H, C, N, O e P, constituintes
de muitas macromolculas biolgicas de interesse. Para os casos de contraste fraco, a
utilizao de raios-X provenientes de radiao sncrotron possibilita a realizao de medidas
com maior eficincia devido ao alto fluxo do feixe que incide sobre o material.
45
A amplitude de uma onda espalhada elasticamente na direo do vetor de
espalhamento q por um tomo localizado na posio r pode ser definida como:

r q i
e r q A
r r
r r
.
) ( ) (

= (2.26)

onde (r) a densidade eletrnica mdia do sistema.
A amplitude total espalhada na direo do vetor q a integrao das ondas
espalhadas por todos os tomos da amostra:

r d e r q F
r q i
r r r
r r

=
.
) ( ) ( (2.27)

Portanto, essa amplitude, mais conhecida como fator forma, a transformada de
Fourier da distribuio eletrnica da amostra. O SAXS fornece a intensidade da onda
representada pelo mdulo ao quadrado do fator forma:

) ( ) ( q F q I
r r
=
2
=
2 1
) .(
2 1
2 1
) ( ) ( r d r d e r r
r r q i
r r r r
r r r

(2.28)

Introduzindo-se a funo ) (
2
r como uma integral de convoluo:

71
1 1 1
2
) ( ) ( ) ( r d r r r r
r r r r
= (2.29)

temos que:

r d e r q I
r q i
r r r
r r

=
. 2
) ( ) ( (2.30)

Calculando a mdia do fator de fase considerando um sistema com simetria
esfrica, temos:

dr
qr
qr sen
r p q I

=
) (
) ( 4 ) ( (2.31)

onde p(r) = ) (
2 2
r r a funo de autocorrelao (pair distance distribution function) que
expressa a probabilidade de encontrar um par de eltrons separados pela distncia r.
Com a introduo da integral de convoluo no clculo, considerada a diferena
de densidade eletrnica que expressa as inomogeneidades dos centros espalhadores imersos
em outro meio. Como resultado, o espalhamento vai ser mais intenso quanto maior for o
contraste entre as inomogeneidades e o meio.
45
Para o tratamento das medidas de SAXS determinado a p(r) pela transformada de
Fourier da I(q) medida, e pela deconvoluo de ) (
2
r deduzida a distribuio de
densidade eletrnica do sistema. Programas computacionais de rotinas numricas como a
transformao de Fourier indireta e a tcnica de convoluo da raiz quadrada (DECON),
podem ser aplicados.
46
A estrutura em bicamadas ou lamelas apresentada pelos sistemas vesiculares aqui
estudados, representa um sistema de relativo ordenamento atmico com unidades de
repetio da ordem de alguns angstrons. A Figura 2.10 representa uma camada ordenada com
distncia de repetio d submetida a um feixe de radiao de comprimento de onda que
incide em uma direo que forma um ngulo com os planos do ordenamento. Interferncias
construtivas entre os feixes refletidos iro ocorrer se todos os parmetros satisfazem a
72
condies de Bragg, ou seja, quando 2dsen for igual a um nmero inteiro vezes o
comprimento de onda:
42,43

2dsen = n (2.32)

Figura 2.10. Representao esquemtica da geometria de difrao de raios-X sobre uma
camada ordenada com distncia de repetio d.

Os feixes incidente e difratados so especificados pelos seus vetores de onda, cujos
mdulos so / 2 = =
s i
k k
r r
. A intensidade difratada pode ser traada como uma funo do
vetor de espalhamento q, que representa a mudana no vetor de onda do feixe difratado.
Assim, o mdulo do vetor de onda fornece:

q = 4 sen / (2.33)

No SAXS, os valores de q so menores do que 0,1
-1
o que significa valores de
em torno de 1.
Uma equao equivalente para a lei de Bragg definida como:

73
q = n (2 / d) (2.34)

Considerando uma srie de planos ou bicamadas igualmente espaados, a
intensidade espalhada I(q) quase sempre zero, exceto onde a lei de Bragg satisfeita. Nesta
condio o perfil de difrao fornece uma srie de picos igualmente espaados a uma
distncia 2 /d ao longo de uma direo normal aos planos.
43
Para um sistema constitudo de muitos microdomnios, com diversas orientaes
distribudas aleatoriamente, as condies de Bragg sero satisfeitas para todos os valores de n
e assim todos os picos de difrao sero obtidos. Cada projeo em duas dimenses estar
num anel em torno do feixe incidente, j que o sistema representa muitos domnios diferentes
alinhados a um determinado ngulo
n
, com ngulos aleatrios de rotao em torno do feixe.
A mdia equivalente a rodar o vetor q em torno do feixe incidente k
i
, produzindo um anel
de possveis feixes espalhados k
s
, para cada pico de Bragg. Consequentemente, tais projees
de difrao so intrinsicamente unidimensionais e especificadas pelo raio de vrios anis, ou
seja, os ngulos de difrao 2. Assim, a intensidade medida no detector de SAXS varia
somente com a magnitude de q, no com sua direo. Portanto, o perfil de espalhamento
pode ser representado por um grfico de I(q) versus q.
16,43
Em sistemas vesiculares multilamelares ou de multicamadas com distncia de
repetio da ordem de 60 , a primeira ordem de difrao que representa o primeiro pico de
Bragg com n = 1, observada em torno de 2 = 1,5 numa radiao incidente de = 1,54 .
Considerando o interior da dupla camada fosfolipdica, a matriz dos grupos
metilenos das cadeias hidrocarbonadas tambm constitui uma estrutura ordenada dentro dos
sistemas de vesculas. O espaamento entre as cadeias hidrocarbonadas, menor do que o
espaamento interlamelar, apresenta valores da ordem de 5 . Nas mesmas condies
anteriores, a primeira ordem de difrao neste caso observada em torno de 2 = 22, que
no mais considerado baixo ngulo e sim alto ngulo, o que caracteriza a geometria de
outra tcnica.
45
O SAXS foi empregado para uma avaliao criteriosa das distncias de repetio
das bicamadas dos lipossomas e quitossomas com o objetivo de investigar as modificaes
provocadas pela presena do polmero. Os estudos foram procedidos num primeiro momento
na temperatura constante de 20 C. Numa segunda abordagem, foi estudada a transio de
fase da bicamada das vesculas sob temperatura crescente.
74
As amostras de lipossomas e quitossomas foram preparadas conforme descrito na
Sesso 2.2.1 sendo que o gel obtido na etapa 5 da preparao foi diludo em 10 mL de gua
MilliQ. Amostras no filtradas e filtradas a 1,20 ou 0,45 m foram obtidas. Para
quitossomas, as concentraes de polmero de 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 e 1,00 mg/mL na
soluo tampo adicionada na etapa 2, foram preparadas fornecendo amostras de variadas
concentraes polimricas. Para o estudo da transio de fase, o gel tambm foi diludo a 10
mL, porm apenas uma amostra de lipossomas e uma de quitossomas com a maior
concentrao polimrica foram preparadas e sem o uso da filtrao no final. As amostras
foram mantidas em frascos mbar sob atmosfera de argnio at a hora das medidas,
normalmente entre 24 e 48 horas aps a preparao.
Todas as medidas foram realizadas na linha de luz SAS do Laboratrio Nacional de
Luz Sncrotron (LNLS, Campinas, Brasil). As amostras foram introduzidas por meio de
seringa em porta-amostras de ao inoxidvel de aproximadamente 0,5 mL com janelas de
mica
47
e termostatizadas a 20 C 0,1 C. O tempo de exposio foi de 15 minutos. Para o
estudo da transio de fase, foi aplicada uma rampa de aquecimento semelhante rampa
aplicada no mesmo estudo pelo Espalhamento de Luz Esttico (Sesso 3.1.2.1), com tempo
de exposio de 10 minutos a cada 2 C. O comprimento de onda da radiao incidente foi de
1,605 e o detector linear (Princeton Instruments) foi posicionado a 43,5 cm da amostra,
correspondendo a uma regio de q entre 0,01 e 0,4
-1
. As intensidades foram corrigidas com
relao resposta do detector, aos sinais de corrente escura, bem como para a transmisso da
amostra e o espalhamento de fundo. Os perfis de difrao obtidos pelo SAXS em I(q) versus
q foram analisados por funes Lorentzianas atravs do software Microcal Origin.
6,13,26
As distncias de repetio d foram determinadas atravs da relao de Bragg (2.34)
para o primeiro pico de difrao. O nmero mdio das distncias de repetio <N> para cada
vescula tambm foi determinado atravs da metodologia proposta por Bouwstra e
colaboradores, que emprega a largura meia altura do primeiro pico de difrao.
48
Os empilhados de bicamadas fosfolipdicas apresentados por sistemas
multilamelares produzem um efeito considervel no padro de difrao do SAXS. Neste caso
as curvas de difrao tambm dependem das diferenas de fase introduzidas nas ondas
difratadas pela sobreposio das bicamadas da membrana. Assim, para a intensidade, o fator
forma multiplicado por uma funo de interferncia que depende unicamente do nmero
das distncias de repetio N e da distncia de repetio d:
75

) ( ) ( q F q I
r r
=
2
x
)
2
1
( / )
2
1
(
2 2
qd sen Nqd sen W
N
(2.35)

onde W
N
a frao de vesculas com N bicamadas e W
N
igual a 1.
48
Numa sobreposio de bicamadas ideal, onde no existem distores ou
ondulaes, a amplitude da funo de interferncia igual a N
2
e com isso a largura meia
altura do primeiro pico de Bragg assume 2 / Nd , sendo portanto, inversamente proporcional
ao nmero de bicamadas na vescula. Desta forma, foi calculado o nmero mdio das
bicamadas <N> nas vesculas multilamelares. A partir deste resultado, bem como do
resultado de R
g
obtido por Espalhamento de Luz, tambm foi possvel calcular a mdia do
dimetro do ncleo aquoso D
n
no interior das vesculas, pela relao:

D
n
= 2R
g
(2d <N> ) (2.36)

e consequentemente, o volume mdio encapsulado tambm pde ser calculado:

V = 4/3 (D
n
/2)
3
(2.37)

2.5. Microscopia ptica

A Microcopia ptica foi empregada para uma avaliao microscpica das vesculas
estudadas atravs de um microscpio ptico convencional. Numa anlise preliminar de
lipossomas e quitossomas foi utilizado um Olympus BX-43 sob luz normal, para observao
direta, e sob luz polarizada, para a caracterizao das cruzes de Malta, as quais indicam a
organizao lamelar.
49
O microscpio dispe de objetivas de 10X e 40X. As imagens foram
registradas atravs de uma cmera fotogrfica (Olympus PM20), com controlador de tempo
de exposio, acoplada ao microscpio.
76
As amostras foram preparadas da mesma forma como para as medidas de SAXS,
porm no momento da visualizao, um pequena alquota de cada amostra concentrada foi
depositada sobre uma lmina de vidro apropriada de 10x3 cm, uma poro considervel de
gua MilliQ foi adicionada para disperso da amostra e uma outra lmina foi sobreposta.
Amostras de lipossomas e quitossomas (contendo a maior concentrao polimrica) no
filtrados e filtrados a 0,45 m foram observadas na temperatura ambiente (20 C).

2.6. Microscopia Eletrnica de Transmisso

Estudos de crio-Microscopia Eletrnica de Transmisso (cryo-Transmission
Electronic Microscopy cryo-TEM) foram efetuados para a investigao estrutural de
lipossomas e quitossomas, bem como para avaliar o efeito da ultrasonicao na morfologia,
nos tamanhos e na distribuio de tamanhos das vesculas.
As vesculas observadas por crio-microscopia eletrnica apresentam imagens em
forma de discos. O contraste entre as vesculas e o fundo ocorre por espalhamento de eltrons
pela matria e o mesmo diretamente proporcional ao nmero atmico. Sendo assim, no
existe emprego de agente contrastante nesta tcnica. A imagem observada a projeo em
duas dimenses de um objeto em trs dimenses. A mesma obtida quando um feixe de
eltrons atravessa uma vescula tangencialmente ao seu volume. Os eltrons interagem com
as molculas que a constituem, produzindo um contraste mais elevado nas bordas da vescula
(a membrana), que consequentemente visualizada como um anel cinza.
As amostras de lipossomas e quitossomas contendo a maior concentrao de
polmero foram preparadas conforme descrito na Sesso 2.2.1. O gel obtido na etapa 5 foi
diludo em 5 mL de gua MilliQ. Amostras sonicadas durante 5 minutos e amostras sem
nenhum ps-tratamento foram observadas. Para a preparao das mesmas para a observao
no microscpio eletrnico, algumas gotas da disperso foram depositadas sobre um suporte
poroso. O excesso foi absorvido com material absorvente. Em seguida, o suporte contendo
amostra foi mergulhado em nitrognio lquido e seguiu-se o procedimento habitual de
Microscopia Eletrnica de Transmisso.

77
2.7. Potencial Zeta

Sistemas coloidais como lipossomas em suspenso aquosa podem apresentar
comportamentos variados no que concerne a fenmenos de agregao. Uma forma de
investigar a relativa estabilidade coloidal dessas partculas determinar o Potencial Zeta das
mesmas que, dependendo da sua intensidade, pode contribuir significativamente nos
processos de agregao ou no agregao.
A presena de uma carga superficial em partculas suspensas num lquido afeta a
distribuio de ons que esto numa regio muito prxima da partcula, ou seja, na interface
entre a superfcie da partcula e o meio de suspenso. O efeito resultante um acmulo de
ons de carga oposta carga da superfcie, na regio que cerca a partcula. Esses ons acabam
formando uma camada eltrica que reveste a partcula e a mesma dividida em duas partes
(Figura 2.11): uma camada interna, onde os ons esto fortemente ligados partcula, e uma
camada externa, onde os ons difundem e esto fracamente ligados. A camada externa
representa uma barreira de proteo dentro da qual a partcula e os ons formam uma
entidade com relativa estabilidade inica. Quando a partcula difunde no lquido, sob ao de
uma diferena de potencial na ordem de 150 V, os ons contidos dentro dessa barreira
difundem juntamente com a partcula, o que no acontece com os ons externos barreira. O
potencial que existe nesta barreira denominado de potencial eletrocintico, mais conhecido
como Potencial Zeta.
50

Potencial Zeta , portanto, a diferena de potencial entre o meio de disperso e a
camada externa. A magnitude deste potencial permite uma avaliao da estabilidade das
partculas em suspenso considerando que, se todas as partculas apresentam um valor
altamente positivo ou altamente negativo de Potencial Zeta, elas iro repelir umas s outras
evitando a agregao. No caso de valores de Potencial Zeta muito baixos, prximos zero, a
ausncia de carga superficial pode favorecer, em alguns casos, interaes entre partculas o
que promove processos de floculao ou agregao. De forma geral, a fronteira entre
suspenses estveis e no estveis considerada como sendo o valor de Potencial Zeta de
30 mV. Sendo assim, suspenses com valores acima de +30 mV, bem como com valores
inferiores a -30 mV, so consideradas estveis. J as suspenses com valores entre -30 e +30
mV so instveis, sendo o valor de 0 mV como o de maior instabilidade, o chamado ponto
isoeltrico.
50
Evidentemente essa no uma regra, considerando que partculas tambm
podem ser preparadas com materiais que proporcionam um impedimento estrico que
78
desfavorece fenmenos de agregao. Assim, as especificidades de cada sistema devem ser
avaliadas para concluses a respeito de estabilidade.

Figura 2.11. Representao da distribuio de ons em torno de uma partcula esfrica
negativamente carregada dispersa num lquido ionizado.
50

O parmetro mais influente no Potencial Zeta o pH. Considerando que o pH do
lquido de suspenso pode fornecer cargas positivas ou negativas que iro interagir com as
partculas, o mesmo deve ser conhecido nas avaliaes de estabilidade.
O Potencial Zeta pode ser obtido pela mobilidade eletrofortica das partculas em
suspenso. A presena de cargas na superfcie externa das partculas faz com que as mesmas
apresentem determinados efeitos sob a ao de um campo eltrico. Esses efeitos so
definidos como efeitos eletrocinticos. A mobilidade eletrofortica, ou eletroforese, constitui,
portanto, o movimento de partculas carregadas relativo ao lquido de suspenso, sob a
influncia de um campo eltrico aplicado.
50
A eletroforese pode ser promovida atravs de um campo eltrico aplicado numa
suspenso contendo eletrodos positivo e negativo. As partculas carregadas so atradas pelo
eletrodo de carga oposta, embora algumas foras, como a viscosidade do meio, possam
retardar esse movimento. Enfim, quando um equilbrio de foras estabelecido, as partculas
se movem em direo ao eletrodo de carga oposta com velocidade constante. Essa velocidade
de uma partcula num campo eltrico denominada de mobilidade eletrofortica e a mesma
79
depende da potncia do campo eltrico, da constante dieltrica do meio, da viscosidade do
meio e do Potencial Zeta.
50

Desta forma, o Potencial Zeta de partculas em suspenso obtido pela aplicao da
equao de Henry:

3
) ( 2 ka f
U
E
= (2.38)

onde U
E
a mobilidade eletrofortica, a constante dieltrica, o Potencial Zeta, a
viscosidade e f(ka) a funo de Henry.
50
Valores aproximados de 1,5 ou 1,0 so assumidos para a funo de Henry.
Basicamente, nas determinaes de Potencial Zeta em meio aquoso de moderada
concentrao de eletrlito, o valor de 1,5 empregado. Nesta condio considera-se o
modelo de Smoluchowski com partculas de tamanhos em torno de 200 nm ou mais,
dispersas em eletrlitos contendo uma concentrao de sal maior de que 10
-3
M. Para
partculas menores, dispersas num meio de baixa constante dieltrica (geralmente meios no
aquosos), o valor de 1,0 utilizado e o mesmo refere-se aproximao de Huckel.
50
Na prtica o Potencial Zeta determinado pelas medidas de mobilidade
eletrofortica das partculas em suspenso. O equipamento utilizado (Zetasizer Malvern
Instruments ZEN3500) dispe de uma clula contendo eletrodos de cargas opostas, um em
cada terminal de um tubo em forma de U (Figura 2.12.a). A metodologia de anlise consiste
na velocimetria de Laser Doppler (Laser Doppler Velocimetry LDV). Conforme
representado na Figura 2.12.b, um laser de 633 nm (He-Ne, 4.0 mV) utilizado e o feixe
dividido em dois: o feixe de referncia e o incidente que passa por um atenuador automtico,
que modula a intensidade de luz de acordo com as caractersticas da amostra, e em seguida
atinge a amostra no centro da parte inferior do tubo (Figura 2.12.a). A luz espalhada no
ngulo de 17 detectada e combinada com o feixe de referncia. Quando um campo eltrico
aplicado na clula contendo a amostra, o movimento das partculas causar flutuaes de
intensidade da luz espalhada. Essas flutuaes tm freqncia proporcional velocidade das
partculas. O detector envia essa informao ao processador de sinal digital e atravs do
computador um software produz um espectro de freqncia calculando o Potencial Zeta
resultante.
80
Amostras de lipossomas e quitossomas para todas as concentraes polimricas
foram preparadas (Sesso 2.2.1). O gel obtido na etapa 5 foi diludo a 100 mL em gua
MilliQ e a soluo resultante foi filtrada a 0,45 m. Para as medidas de Potencial Zeta,
pores de 200 L foram novamente diludas a 10 mL em soluo aquosa de NaCl (1 mM)
para proporcionar um meio eletroltico. Em seguida, foram transferidas para as clulas
eletroforticas de aproximadamente 1 mL. As medidas foram obtidas em triplicata sob 150
V, a 25
o
C, com pH = 5,8 e f(ka) = 1,5.

Figura 2.12. Representao da clula utilizada para medidas de Potencial Zeta (a) e esquema
do equipamento (b).
50

2.8. Ressonncia Magntica Nuclear de Fsforo

A Ressonncia Magntica Nuclear de Fsforo (RMN de
31
P) representa uma tcnica
muito til para acessar o ambiente qumico do tomo de fsforo. O
31
P constitui o nico
istopo natural do fsforo e o nucldeo tem spin e razo giromagntica positiva de
10.840.
51
Em disperses de fosfolipdios possvel obter informaes sobre a ordem local e a
mobilidade da regio do fosfato presente na extremidade polar da molcula.
52
A RMN de
31
P tambm fornece dados interessantes no estudo de lipossomas, sendo
que os espectros resultantes do ncleo de fsforo apresentam formatos e deslocamentos
qumicos que esto relacionados com fatores como tamanho e polimorfismo (tipo de fase)
81
das estruturas.
53,54
Para sistemas lamelares fosfolipdicos em suspenso, a RMN de
31
P
fornece um resultado caracterstico representado por um pico estendido (isotrpico)
juntamente com um ombro estendido de menor intensidade ao lado esquerdo (anisotrpico).
Assim, temos um mximo em campo alto definido com o seu deslocamento qumico como
deslocamento qumico perpendicular
e um ombro estendido em campo baixo definido

com o seu deslocamento qumico como deslocamento qumico paralelo
II
. Esse formato
caracterstico do espectro denota os lentos tempos de relaxao longitudinal dos ncleos de
fsforo num sistema lamelar. A diferena entre
II
e
fornece o deslocamento qumico de

anisotropia do sistema:
53-56

=
II
-
(2.39)

O depende da liberdade de mobilidade do grupo fosfato, quanto menor o seu
valor, maior ser a mobilidade. Considerando que movimentos atmicos podem ser
termicamente ativados, o decresce com o aumento da temperatura em uma amostra de
lipossomas.
57,58
A transio de fase da bicamada lipdica, de gel para cristal lquido, tambm
foi caracterizada com uma significativa reduo do .
59,60
Em sistemas onde no h uma boa resoluo espectral para a obteno do valor do
II
, pode ser obtido indiretamente:

= 3 (
i
-
) (2.40)

onde
i
o deslocamento qumico isotrpico do fosfolipdio que forma as vesculas.
54,55

Porm, os valores do
i
so dependentes do pH, temperatura e fora inica, o que requer
cautela na utilizao deste parmetro.
61,62
A relao entre e tamanho de vesculas tem sido explorada na literatura. Burnell
e colaboradores determinaram = 25 ppm para vesculas com 500 nm de dimetro.
63

Quanto menores as estruturas, menor ser o valor de . Modificaes qualitativas dos
espectros de
31
P tambm tm sido analisadas na interpretao de mudanas estruturais em
82
vesculas sob a influncia da temperatura,
55,56
da adio de outras molculas
64,65
e da
degradao dos fosfolipdios resultante da hidrlise.
59
Diferentes arquiteturas de fases lamelares produzem espectros de formatos
peculiares. Desta forma, possvel distinguir entre organizaes lamelares, hexagonal e
cbica.
53,54
Fases hexagonais produzem um ombro estendido no lado direito do pico (campo
alto) e fases cbicas fornecem picos isotrpicos no lado esquerdo (campo baixo).
65
Pereira e
colaboradores observaram a transio da fase lamelar para a fase hexagonal inversa H
II

(estruturas cilndricas), da bicamada fosfolipdica, com o surgimento de um ombro no lado
direito do pico estendido.
65
Lopes e colaboradores observaram mudanas considerveis nos
espectros de RMN de
31
P com a adio de um frmaco hidroflico.
66
Os resultados foram
interpretados em funo de uma maior blindagem ou desblindagem do fsforo de acordo com
os deslocamentos qumicos, resultante da interao da extremidade polar do fosfolipdio com
o frmaco.
A RMN de
31
P tambm permite o estudo de transies estruturais entre sistemas
lamelares e micelares. No caso de micelas fosfolipdicas em suspenso aquosa, a extremidade
polar de todas as molculas est submetida a um nico ambiente qumico. Alm disso,
devido s caractersticas estruturais inerentes s micelas, a alta curvatura da superfcie
fornece um volume espacial muito elevado para a extremidade polar. Como resultado dessa
organizao molecular produzido um pico caracterstico de alta intensidade e reduzido
valor de largura meia altura. Zuidam e colaboradores observaram a transformao da curva
extendida com o pico alargado em um nico pico estreito na converso de lipossomas em
micelas, como resultado de hidrlise qumica sob aquecimento.
59
Nos trabalhos desenvolvidos na presente Tese, a RMN de
31
P foi utilizada para a
investigao dos efeitos resultantes da presena de quitosana nos lipossomas na temperatura
ambiente e sob aquecimento at 60 C. As amostras foram preparadas conforme descrito na
Sesso 2.2.1, porm, o gel obtido na etapa 5 foi diludo em 2 mL de gua deuterada (Sigma-
Aldrich, 99%). Quitossomas foram preparados com a maior concentrao polimrica (1
mg/mL). Em seguida, as amostras foram transferidas para um frasco apropriado com tampa e
centrifugadas em repetidos ciclos de 5 minutos a 4000 rpm para a concentrao das vesculas
no sobrenadante, o qual foi subseqentemente transferido para o tubo de RMN (0,5 mm)
atravs de uma pipeta Pasteur aps cada centrifugao. O processo foi repetido de trs a
quatro vezes at completar aproximadamente 0,3 mL de amostra no tubo de RMN. A alta
concentrao de vesculas na suspenso necessria para a obteno do sinal na RMN
31
P.
83
Os espectros foram obtidos em equipamento Varian de 300 MHz (Inova-300) e
observados a 121,42 MHz. O pulso utilizado foi de 16,0 s a 45 com um tempo de aquisio
de 1,600 s, largura espectral de 15785,3 Hz com 5000 repeties em 6 h e 24 min. A
temperatura foi controlada com preciso de 0,5 C e espectros foram obtidos nas
temperaturas de 25, 40, 50 e 60 C.
O cido fosfrico a 85% (Merck) foi diludo a aproximadamente 5% e utilizado
como referncia externa. A alta diluio foi necessria devido aos sinais pouco intensos
produzidos pelas amostras. Espectros foram obtidos com a presena do padro externo e sem
a presena do mesmo. Os deslocamentos qumicos foram comparados utilizando a posio do
pico do cido fosfrico a 0 ppm como posio de referncia.

2.9. Lipossomas Gigantes

Lipossomas Gigantes so vesculas formadas por bicamada fosfolipdica e que
apresentam tamanhos na escala micromtrica, conforme descrito na Sesso 1.2. Para a
preparao destas vesculas existem basicamente dois mtodos: a formao espontnea e a
Eletroformao.
Na formao espontnea feita uma simples hidratao de um filme de
fosfolipdios. Aps algumas horas as molculas se auto-organizam pelas interaes de
polaridade e apolaridade, formando as bicamadas que constituem a membrana das vesculas,
conforme discutido na Sesso 1.2.2. O filme pode ser facilmente obtido com a deposio de
alguns microlitros de uma soluo de fosfolipdios em solvente orgnico sobre uma lmina
de vidro.

Deixa-se o solvente secar sob vcuo e aps a lmina com o filme seco pode ser
mergulhada num recipiente com gua ou soluo aquosa durante vrias horas ou alguns dias.
As vesculas so formadas dentro da soluo.
67
Uma variao desta metodologia utilizar
uma pastilha rugosa de teflon.
67
O filme de fosfolipdios sobre a superfcie rugosa, produzido
da mesma forma como sobre a lmina de vidro, pr-hidratado sob uma atmosfera de vapor
dgua. Aps, a pastilha tambm imersa em soluo aquosa para a formao das
vesculas.
67
Entretanto, as vesculas obtidas por formao espontnea so na maioria estruturas
altamente inhomogneas, constituindo estruturas uni e multilamelares, vesculas mal
formadas com defeitos ou agregados de fosfolipdios e estruturas no esfricas.
84
Por outro lado, a Eletroformao proporciona a estruturao de uma grande
quantidade de vesculas gigantes esfricas e unilamelares, com tamanhos variados, mas que
podem atingir at centenas de micrmetros. Angelova e colaboradores optimizaram as
condies experimentais desta metodologia
68
e a mesma foi aplicada nos trabalhos
desenvolvidos na presente Tese para a investigao da interao da bicamada com a
quitosana.

2.9.1. Eletroformao

O procedimento de Eletroformao pode variar ligeiramente quanto a algumas
caractersticas ou tipos de aparatos experimentais, temperatura, tempo de exposio do filme,
tipo de soluo aquosa, dentre outros. A metodologia descrita aqui foi aplicada como
procedimento padro para a preparao dos lipossomas gigantes unilamelares investigados.
Dioleoilfosfatidilcolina (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DOPC)
(Sigma-Aldrich, 99%) foi o fosfolipdio utilizado na produo dos lipossomas gigantes. A
DOPC foi dissolvida em clorofrmio (Sigma-Aldrich) numa concentrao de 1 mg/mL. A
soluo foi vedada sob atmosfera de argnio e mantida a -14 C. Para os estudos de
lipossomas gigantes pela Microscopia de Fluorescncia, o fosfolipdio fluorescente NBDPC
(Sesso 2.2.1) a 0,1 mg/mL foi misturado uma concentrao de 1% na soluo de DOPC.
Duas lminas de vidro de 10 por 3 cm revestidas em um lado com xido de ndio e
titnio (Indium Titane Oxide ITO) so empregadas para a formao de uma clula
condutora. Atravs de uma microseringa, 10 L da soluo de DOPC (ou de DOPC contendo
1% de NBDPC) foram espalhados sobre a superfcie revestida com ITO de uma das lminas.
O clorofrmio evapora imediatamente, porm a lmina foi depositada em dessecador de
silicagel submetido sob vcuo durante pelo menos 30 minutos temperatura ambiente para a
completa remoo do solvente. Eventualmente esse procedimento foi efetuado nas duas
lminas para a produo de uma quantidade maior de lipossomas gigantes.
A clula condutora (Figura 2.13) formada com a sobreposio das duas lminas
com as faces revestidas com ITO uma contra a outra, separadas por um anel de massa de
modelagem (Vitrex) depositado nas bordas das lminas. A espessura interna da clula variou
entre 1 e 3 mm. A clula foi preenchida com uma soluo aquosa de sacarose (Sigma-
85
Aldrich, 99%) a 0,095 M de presso osmtica 0,095 0,003 medida pelo menos trs vezes
presso osmtica constante em Osmmetro (Osmomat 030 Gonotec).

Figura 2.13. Representao do aparato experimental para a produo de vesculas gigantes. A
clula de eletroformao conectada ao gerador de tenso que fornece o campo eltrico, o
qual estimula a formao das estruturas a partir do filme de fosfolipdios.

Em uma extremidade de cada lmina foram conectadas as extenses que, ligadas a
um gerador de tenso alternada, fornecem o campo eltrico que estimula a produo dos
lipossomas gigantes. Assim, a clula condutora formada conforme ilustrado na Figura 2.13.
A tenso aplicada com a regulagem do gerador a uma amplitude de 1,5 V e freqncia de
10 Hz.
O revestimento de ITO sobre as lminas de vidro no interior da clula proporciona
uma superfcie condutora. Com a ao do campo eltrico, o filme de fosfolipdios vibra na
direo do campo e incha, formando bolhas. Concomitantemente, os fosfolipdios se
organizam nas duplas camadas que constituem a membrana dos lipossomas. Pequenas
vesculas uni e multilamelares surgem na superfcie do filme e as mesmas continuam a
aumentar de tamanho com o passar do tempo incorporando mais fosfolipdios. As vesculas
unilamelares que atingem entre 20 e 30 m de dimetro so facilmente desestabilizadas pelos
movimentos do ambiente fludo no interior da clula e consequentemente fundem com as
vesculas que esto a sua volta o que acaba produzindo estruturas maiores. Aps um tempo
aproximado de 30 minutos, uma considervel quantidade de lipossomas gigantes est
86
formada e os mesmos continuam a aumentar de tamanho com o passar do tempo.
Observando a clula de eletroformao no microscpio ptico possvel visualizar as
diferentes etapas de crescimento e inclusive os movimentos de vibrao das membranas e as
fuses. As vesculas formadas apresentam uma alta polidisperso, sendo que as maiores
podem atingir algumas centenas de micrmetros. Como procedimento rotineiro, a
Eletroformao foi mantida durante trs horas sob o campo eltrico e na temperatura
ambiente (20-25 C).
Os mecanismos de formao de lipossomas gigantes unilamelares sob a ao de um
campo eltrico oscilante ainda no esto totalmente desvendados. Diferentes interpretaes
sugerem, por exemplo, a interao eletrosttica entre os eletrodos e a bicamada fosfolipdica,
ou a ocorrncia de reaes eletroqumicas, ou ainda a incorporao pela bicamada de cargas
provenientes dos eletrodos. Sens e Isambert sugerem uma desestabilizao do filme de
fosfolipdios provocada por um acmulo de cargas sobre a bicamada, sendo que o campo
aplicado produziria uma tenso sobre a bicamada suficientemente forte para proporcionar
flutuaes que incham o filme e fazem com que o mesmo se curve para produzir as
vesculas.
69
Este processo seria apenas uma primeira etapa na formao das estruturas, pois
diferentes parmetros influenciam a formao de vesculas uni e multilamelares: as
propriedades eltricas dos lipdios, seu impedimento estrico, o comprimento das cadeias
hidrocarbonadas, a organizao da bicamada e a presso osmtica do meio.
67,69
Um modelo que considera a geometria e a termodinmica de sistemas dispersos foi
desenvolvido por Vila e colaboradores
70,71
e o mesmo descreve a energia necessria para a
formao de um lipossoma como sendo a soma da energia mecnica de superfcie com a
energia de curvatura e com a energia da variao do excesso de potencial qumico, resultante
da modificao da tenso de superfcie da gua pela presena de fosfolipdios. Vila e
colaboradores definiram uma relao entre a variao do potencial qumico, a superfcie
ocupada pela extremidade polar do fosfolipdio, o raio da vescula e a espessura da sua
membrana. Os clculos obtidos mostram uma boa concordncia com dados experimentais
obtidos para vrios fosfolipdios. Tambm demonstrado que as fuses de vesculas so
termodinamicamente favorecidas sendo que as mesmas levam formao de vesculas de
tamanhos maiores, as quais apresentam maior estabilidade.
70,71
Aps a Eletroformao, os lipossomas podem permanecer estocados na clula
temperatura ambiente durante algumas horas. Porm, devido utilizao da soluo aquosa
de sacarose, recomendado o armazenamento das vesculas em geladeira para retardar a
87
multiplicao de bactrias. Normalmente, a soluo de sacarose contendo as vesculas foi
transferida para um frasco Eppendorf e mantida na geladeira a 4 C para uso em no mximo
dez dias.
Para a observao dos lipossomas no microscpio ptico, foi utilizada uma clula
composta de duas lminas de vidro ultrafinas de 10 por 3 cm. Um suporte de borracha semi-
aderente e plano (3 por 3 cm e 1 mm de espessura), com um grande orifcio esfrico (2 cm de
dimetro), depositado sobre uma das lminas. Atravs de um pipetador uma pequena
quantidade (20 L) da soluo de sacarose contendo lipossomas gigantes foi depositada em
forma de gotas sobre a primeira lmina, dentro do orifcio da borracha. Uma outra soluo
constituda de glicose em gua a 0,099 M com presso osmtica constante de 0,099 0,003
tambm foi gotejada lentamente sobre a lmina j contendo a soluo de vesculas, de forma
a preencher o orifcio esfrico sobre a lmina (100 L). Em seguida a segunda lmina foi
depositada sobre o suporte de borracha, formando assim uma clula semelhante clula de
eletroformao, porm no condutora e mais fina.
O emprego de soluo de sacarose na clula de eletroformao e de glicose na
clula de observao tem uma razo importante. Existe uma diferena de densidade entre
sacarose e glicose, sendo que a densidade da sacarose um pouco maior. Isso faz com que as
vesculas, contendo sacarose no seu ncleo, fiquem mais pesadas dentro da soluo de
glicose, e assim as mesmas tendem a se depositar na superfcie inferior da clula, permitindo
uma boa observao no microscpio ptico utilizado. Alm disso, a soluo de glicose
quase iso-osmtica soluo de sacarose. A pequena diferena de presso osmtica foi
considerada apropriada para uma melhor estabilizao das vesculas no sentido de reduo de
flutuaes da membrana e de preservao estrutural. Uma outra vantagem a diferena de
ndice de refrao entre as duas solues, que favorece uma boa definio ptica em
contraste de fase do contorno das vesculas.

2.9.2. Proposta de Eletroformao a Partir da Fase Reversa

A Eletroformao clssica, descrita na Sesso anterior, permite a obteno de
lipossomas gigantes cuja membrana formada por fosfolipdios. Contudo, neste trabalho
objetivamos o estudo dos efeitos da presena de quitosana no sistema, bem como as formas
88
de interao da quitosana com a bicamada fosfolipdica. Desta forma, torna-se importante a
introduo do polmero nos lipossomas gigantes.
Nos trabalhos em que so feitos estudos de lipossomas gigantes com polmeros, as
vesculas so preparadas previamente e em seguida o polmero em questo adicionado por
solubilizao na disperso das vesculas ou as vesculas so dispersas na soluo
polimrica.
72,73
Essa metodologia apresenta suas vantagens, porm as interaes entre as
vesculas e as cadeias polimricas dependem de uma srie de variveis relacionadas com a
concentrao de componentes e com a termodinmica, o que torna as investigaes
extremamente complexas e de difcil padronizao e interpretao.
Na presente Tese, a inteno foi investigar mais profundamente a interao entre a
membrana das vesculas gigantes e a quitosana. Sabe-se que na preparao em fase reversa
(Sesso 2.2.1), para a obteno de quitossomas nanomtricos, as interaes entre os
fosfolipdios e a quitosana so significativamente estimuladas considerando a adio prvia
do polmero na etapa 2, antes mesmo da formao das micelas reversas, do organogel e das
vesculas propriamente ditas.
Desta forma, consideramos que para os estudos envolvendo lipossomas gigantes
com quitosana, uma interao mais acentuada entre polmero e vesculas seria extremamente
vantajosa para proporcionar efeitos diferenciados no sistema e permitir uma avaliao mais
consistente.
Sendo assim, objetivando a introduo de quitosana em lipossomas gigantes,
desenvolveu-se uma modificao do mtodo da Eletroformao baseada na preparao de
lipossomas em fase reversa. O objetivo foi produzir quitossomas gigantes onde a estruturao
vesicular a nvel molecular pudesse ser comparvel dos nanoquitossomas, mesmo
considerando a grande diferena de tamanhos.
A metodologia foi desenvolvida com a introduo de uma soluo precursora. A
solubilizao prvia de quitosana comercial ou quitosana fluorescente foi feita em soluo
tampo de acetato de pH 4,5 (Sesso 2.1) a uma concentrao de 2,5 mg/mL e sob agitao
vigorosa com barra magntica durante 3 horas. A soluo foi filtrada a 0,45 e 0,22 m e
mantida em geladeira at a utilizao. A perda de polmero devido filtrao foi determinada
por calibrao atravs de fluorometria empregando-se soluo de quitosana fluorescente
filtrada e no filtrada, conforme descrito na Sesso 2.9.4.
89
A soluo precursora foi ento obtida pela adio de 5, 10 ou 20 L da soluo
polimrica filtrada em 400 L de soluo de DOPC a 1 mg/mL. A mistura foi sonicada em
sonicador de banho (Brason 1200) durante dois minutos para a formao das micelas
reversas contendo polmero. Esta emulso foi empregada como soluo precursora na
Eletroformao de quitossomas gigantes.
Uma poro de 10 L da soluo precursora foi espalhada sobre a lmina de vidro
revestida com ITO e secada em dessecador de silicagel sob vcuo, durante pelo menos 30
minutos. Em seguida, seguiu-se o processo normal de Eletroformao sob as mesmas
condies descritas na Sesso 2.9.1.

2.9.3. Microscopia ptica e de Fluorescncia

A Microscopia ptica foi extensivamente aplicada na presente Tese para os estudos
com vesculas gigantes. As clulas de observao, preparadas conforme descrito na Sesso
2.9.1, contendo lipossomas gigantes ou quitossomas gigantes (Sesso 2.9.2), foram
observadas no microscpio ptico invertido Nikon TE 200 com objetivas 40X em contraste
diferencial de interferncia (Differential Interference Contrast DIC) e 40X em contraste de
fase.
A microscopia em modo DIC possvel atravs de um prisma birrefringente que
divide o feixe de luz polarizada em dois feixes parciais que incidem sobre a amostra com um
deslocamento lateral um em relao ao outro. Numa superfcie totalmente plana, nada
observado no microscpio. Porm, onde existe algo acima da superfcie, um contraste
acentuado produzido em forma de relevos. Desta forma, a DIC fornece imagens ntidas das
vesculas gigantes evidenciando a membrana das mesmas em acentuado contraste com o
fundo.
A microscopia de contraste de fase tambm gera um contraste adequado nas
imagens das vesculas gigantes. Isto proporcionado pela modificao da defasagem e da
amplitude dos feixes de luz diretos e difratados do microscpio, permitindo que a
interferncia seja totalmente construtiva ou destrutiva, tornando detectvel a morfologia do
material. A lente do sistema de contraste de fase contm no seu plano focal posterior uma
placa com um anel de fase, o qual produz um atraso ou um avano de 90 nas ondas e reduz
sua intensidade luminosa. Como o percurso do feixe direto no afetado pelas dimenses
90
nem pela forma da estrutura difratora da amostra, o prprio feixe direto que deve passar no
anel de fase para ser retardado ou avanado relativamente aos feixes difratados.
74
Para a Microscopia ptica de Fluorescncia foi empregado o mesmo microscpio,
o qual possui um sistema constitudo de lmpada fluorescente de mercrio com caminho
ptico dotado de filtros (EX 450-490 nm/BA 520 nm) para a seleo do comprimento de
onda da luz incidente na amostra, bem como um bloqueador da passagem da luz fluorescente.
Ao microscpio acoplada uma cmera de vdeo (Diagnostic Instruments NDIAG 1800) que
filma e automaticamente grava as imagens na memria de um computador.
Para a determinao das condies ideais de anlise no microscpio, uma srie de
medidas preliminares foi efetuada para os ajustes de cada parmetro. Com a observao de
vesculas teste foram otimizados os valores de abertura do diafragma, filtro nutro de
cinza, ganho de imagem da cmera e tempo de exposio. Desta forma foram estabelecidas
as melhores condies para a obteno de imagens fluorescentes com reduzido rudo de
fundo. O tempo de exposio da cmera apresenta uma preciso de aquisio de imagem de 1
ms, o que permite uma alta preciso em medidas quantitativas de intensidade de
fluorescncia com um erro inferior a 1%.
Nas anlises de vesculas fluorescentes, o processo de quenching, correspondente
perda indesejada de fluorescncia das amostras devido incidncia da radiao da luz
fluorescente durante a observao, foi evitado pela adoo de um procedimento padronizado.
Primeiramente a clula de observao permaneceu em repouso durante pelo menos dez
minutos, j devidamente posicionada para a microscopia e na ausncia de luz incidente, de
forma a permitir a decantao das vesculas dentro da clula. Em seguida, a fonte de luz
visvel do microscpio foi acesa em baixa intensidade e ento foi localizada uma vescula
adequada, esfrica, unilamelar, sem defeitos aparentes, de tamanho razovel, sem flutuaes
visveis da membrana, esttica e completamente isolada de outras vesculas. O foco foi
ajustado para o contraste mximo entre a membrana e o fundo. Com a vescula localizada e
em foco, a cmera de vdeo foi acionada e um curto filme de imagens da amostra foi
gravado. Em seguida a fonte de luz visvel foi desligada e imediatamente o bloqueador da luz
fluorescente foi aberto durante poucos segundos e logo fechado. Todo o processo foi gravado
pela cmera e assim, as vesculas fluorescentes puderam ser analisadas pelas primeiras
imagens filmadas pela cmera, ou seja, quando ainda no houve quenching. As mesmas
tambm foram comparadas com as correspondentes imagens sob luz visvel.
91
Para a avaliao das imagens de microscopia, o computador acoplado ao
microscpio possui um software (Magneto) desenvolvido no laboratrio (Institut Charles
Sadron). O programa analisa as imagens gravadas pela cmera na memria do computador.
O mesmo permite a determinao de tamanho das vesculas nas imagens no fluorescentes
atravs da avaliao dos contrastes de cinza entre a membrana e o fundo da imagem. Atravs
de um grfico de distribuio de intensidades que variam do branco ao preto, integrando os
pixels de uma linha sobre a diagonal da vescula, possvel determinar com exatido o
dimetro da estrutura pela transformao da quantidade de pixels, envolvidos entre um
extremo e outro da vescula, em micrmetros, usando um fator de converso adequado.
Para as imagens fluorescentes, a anlise tambm leva em conta o perfil da escala de
cinza, subtraindo o fundo. Neste caso, o programa permite uma anlise global ou parcial do
perfil de fluorescncia, atravs da integrao dos pixels dentro de uma rea selecionada sobre
a imagem. Na prtica, seleciona-se a rea da vescula fluorescente mais uma pequena rea do
seu contorno. Primeiramente, a intensidade mdia por pixel do fundo I
0
computada. Em
seguida, a intensidade total calculada:

) (
0
= I I F
i
(2.41)

onde I
i
o teor de cor cinza do pixel i. Desta forma foi obtida a intensidade total de
fluorescncia das vesculas gigantes, descontada da intensidade de fundo.
A distribuio de fluorescncia sobre a vescula pode ser relacionada com o teor de
cor cinza, considerando O (x, y, z) como a funo tri-dimensional que descreve a distribuio
de fluorescncia sobre o objeto. Para uma fluorescncia total F distribuda sobre a superfcie
de uma esfera temos:

O (r, , ) = F x (4R
2
)
-1
d(r - R) (2.42)

onde R o raio da esfera. Para a mesma intensidade distribuda no volume da esfera temos:

O (r, , ) = F x 3 / (4R
3
) (2.43)
92

para r < R. Assim, a imagem observada I (x, y, 0) no plano focal, o produto da
convoluo da imagem do objeto O (x, y, z) e a funo de propagao pontual (FPP) do
microscpio:
75

= ) ' , ' , ' ( ) ' 0 , ' , ' ( ' ' ' ) 0 , , ( z y x O z y y x x FPP dz dy dx y x I (2.44)

A FPP a capacidade do microscpio em considerar as contribuies de
fluorescncia da vescula que esto fora de foco. Sendo que a vescula est focalizada no seu
equador, necessrio considerar tambm a quantidade de fluorescncia acima e abaixo do
equador.
A FPP pode ser determinada, em condies de observao devidamente ajustadas
no microscpio, pela obteno da funo I (x, y, z) da rea delimitada de uma mancha
fluorescente:

= ) ' , ' , ' ( ) ' , ' , ' ( ' ' ' ) , , ( z y x d z z y y x x FPP dz dy dx z y x FPP (2.44)

Para as condies experimentais utilizadas nos trabalhos de microscopia de
fluorescncia, a FPP foi determinada e a mesma pde ser aproximada pela funo simtrica:

FPP (, z) = (2 (0,05 + 0,17 |z|)
2
)
-1
e {-
2
/ (2(0,05 + 0,17|z|)
2
)} (2.45)

onde = x
2
+ y
2
e todas as distncias so medidas em micrmetros. Para toda quantidade
fora de foco, a integrao da intensidade total constante:

=1 ) , ( 2 z FPP d (2.46)

e assim, a dimenso da FPP varia linearmente com a distncia do plano focal.
93
Resumidamente, os ajustes so padronizados e as condies ideais de obteno da
intensidade de fluorescncia das vesculas so estabelecidas. A fluorescncia sobre toda rea
da vescula ento calculada, sendo que a fluorescncia proveniente da regio fora de foco
considerada pela FPP.

2.9.4. Calibrao da Fluorescncia

A Calibrao da Fluorescncia foi procedida para a determinao da frao em
massa de polmero fluorescente presente na bicamada dos quitossomas gigantes. Sendo que o
processo de Eletroformao pode levar a uma transferncia varivel dos componentes
aplicados sobre a lmina para a efetiva estrutura das vesculas, uma determinao
quantitativa desta ordem torna-se importante para a avaliao das propriedades, vantagens e
desvantagens da modificao da Eletroformao proposta na Sesso 2.9.2. Para tanto, a
dependncia da fluorescncia em relao concentrao foi comparada entre as diferentes
espcies fluorescentes estudadas aqui. As amostras foram diludas em diferentes
concentraes em clula de quartzo e as medidas de comprimentos de onda foram efetuadas
em espectrofluormetro (Hitachi F-4010) na temperatura ambiente.
A quitosana fluorescente, obtida e preparada em soluo tampo conforme descrito
na Sesso 2.1, foi avaliada quanto ao comprimento de onda de emisso na poro de 5 L da
soluo filtrada e diluda a 3 mL na clula de quartzo. Os comprimentos de onda
caractersticos para a quitosana fluorescente so de 470 nm para excitao e de 515 nm para
emisso.
1
Diferentes concentraes, entre 0,003 e 0,030 mg/mL, tambm foram preparadas e
medidas foram realizadas para a obteno da variao da intensidade de emisso em funo
da concentrao. As medidas de intensidade foram efetuadas nos comprimentos de onda de
515 nm e 533 nm. Este segundo comprimento de onda corresponde ao mximo de emisso
do fosfolipdio fluorescente NBDPC.
As mesmas medidas foram feitas com soluo de quitosana no filtrada, usando-se
as mesmas concentraes descritas acima. Este procedimento permitiu a determinao da
perda de polmero pela filtrao, atravs das membranas de 0,45 e 0,22 m, pela avaliao
comparativa das variaes de intensidade em funo da concentrao entre a amostra filtrada
e a no filtrada. Desta forma foi possvel conhecer a massa real de quitosana aplicada sobre a
placa de eletroformao para a produo de quitossomas gigantes.
94
O NBDPC foi utilizado, na concentrao de 0,1%, para a preparao de lipossomas
nanomtricos fluorescentes (Sesso 2.2.1). O gel obtido na etapa 5 foi diludo em 100 mL de
gua e pequenas pores foram novamente diludas na clula de quartzo, resultando em
concentraes entre 6x10
-4
e 6x10
-5
mg/mL de NBDPC. As intensidades de fluorescncia
tambm foram medidas nos comprimentos de onda de 515 e 533 nm.
Tambm foram medidas as intensidades a 515 e 533 nm para uma amostra de
quitossomas gigantes contendo a maior concentrao de quitosana fluorescente, mais 1% de
NBDPC na mesma vescula (Sesso 2.9.2), sendo que o NBDPC foi previamente misturado
na soluo de DOPC (Sesso 2.9.1). A massa de NBDPC aplicada sobre a lmina de
eletroformao tambm conhecida. As vesculas foram transferidas da clula de
eletroformao para a clula de quartzo do fluormetro e o volume foi completado a 3 mL
com a soluo de glicose 0,099 M.
As variaes da intensidade em funo da concentrao para os dois comprimentos
de onda foram, portanto, graficadas para a quitosana em soluo e para lipossomas
nanomtricos contendo NBDPC. A calibrao foi procedida considerando o comportamento
linear de aumento de intensidade de emisso em funo da concentrao para cada
comprimento de onda.
Considerando a equao da reta obtida pelas intensidades de emisso I = + x,
(onde x representa a concentrao c do componente fluorescente), para o primeiro
comprimento de onda (
1
= 515 nm) e para o segundo comprimento de onda (
2
= 533 nm),
respectivamente para os lipossomas nanomtricos contendo NBDPC e a soluo de quitosana
filtrada, temos:

NB
I
1 =
NB
1 +
NB
1
NB
c
NB
I
2 =
NB
2 +
NB
2
NB
c
Q
I
1 =
Q
1 +
Q
1
Q
c
Q
I
2 =
Q
2 +
Q
2
Q
c

As intensidades de fluorescncia medidas para os quitossomas gigantes contendo
quitosana fluorescente filtrada e NBDPC, nos dois comprimentos de onda, correspondem ao
95
somatrio das intensidades de fluorescncia provenientes de cada componente em cada
comprimento de onda:

I
1 =
NB
1 +
NB
1
NB
c +
Q
1 +
Q
1
Q
c
I
2 =
NB
2 +
NB
2
NB
c +
Q
2 +
Q
2
Q
c

Resolvendo o sistema acima para as concentraes, temos:

NB
c =
Q
1 ( I
2 -
NB
2 -
Q
2 ) -
Q
2 ( I
1 -
NB
1 -
Q
1 ) (2.47)

NB
2
Q
1 -
Q
2
NB
1

Q
c =
NB
1 ( I
2 -
NB
2 -
Q
2 ) -
NB
2 ( I
1 -
NB
1 -
Q
1 ) (2.48)

NB
2
Q
1 -
Q
2
NB
1

Desta forma foi possvel obter as concentraes efetivas de fosfolipdio fluorescente
e quitosana fluorescente nas vesculas gigantes. Por um clculo simples de propores
obteve-se a concentrao total de fosfolipdio, evidentemente considerando que NBDPC
representa 1% deste total. A comparao com as concentraes aplicadas sobre a placa de
eletroformao permitiu a determinao aproximada do percentual de transferncia de massa
dos componentes. Assim, com as quantidades em massa conhecidas, foi possvel calcular
tambm a distribuio de polmero sobre a membrana das vesculas, ou seja, a massa de
polmero pela rea de fosfolipdios considerando a rea de uma molcula de DOPC como
sendo 0,725 nm
2
.
76

96
2.10. Referncias

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99
Captulo 3. Resultados e Discusses

3.1. Lipossomas e Quitossomas Nanomtricos

3.1.1. Avaliao Estrutural

A estruturao dos lipossomas e quitossomas preparados pela evaporao em fase
reversa foi estudada para que se pudesse inferir sobre as caractersticas morfolgicas e de
tamanho de cada espcie. Independentemente do mtodo de preparao empregado para a
formao de vesculas, as estruturas obtidas devem ser criteriosamente estudadas para
viabilizar no somente as informaes sobre parmetros fundamentais, mas tambm
propiciar o desenvolvimento de caractersticas aplicativas.
No caso particular de quitossomas, a avaliao estrutural torna-se de suma
importncia considerando que as modificaes inferidas nas vesculas com a presena do
polissacardeo so desconhecidas, especialmente com a sua introduo pela metodologia
aplicada nos trabalhos da presente Tese. A constante comparao de quitossomas com
lipossomas, permitiu avaliar tambm as vantagens e desvantagens decorrentes da introduo
da quitosana na estrutura das vesculas.

3.1.1.1. Espalhamento de Luz

O Espalhamento de Luz representa uma tcnica experimental importante no estudo
de caractersticas estruturais de vesculas em suspenso. Atravs do Espalhamento de Luz
Dinmico, as funes de correlao temporal obtidas mostraram-se unimodais, ou seja, com
um nico tempo de relaxao representativo de uma populao de estruturas de tamanhos
relativamente prximos. A Figura 3.1 mostra uma funo de correlao caracterstica obtida
para uma amostra de quitossomas. Todas as amostras estudadas apresentaram funes
semelhantes. A partir das mesmas foram calculados os demais parmetros apresentados a
seguir.
100
1 10 100 1000 10000 100000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

G

(
2
)

(

)
t (s)

Figura 3.1. Funo de autocorrelao temporal representativa, obtida para uma amostra de
quitossomas em suspenso aquosa atravs do Espalhamento de Luz Dinmico.

Primeiramente comeamos por avaliar os tamanhos das estruturas em suspenso
atravs do raio hidrodinmico R
h
. importante lembrar que as vesculas foram obtidas pela
evaporao em fase reversa seguida ou no de algum ps-tratamento para a homogeneizao
estrutural. A Figura 3.2 mostra a variao do R
h
sob influncia da filtrao atravs de
membranas de dimetros de poros de 0,45 e 1,20 m para lipossomas e quitossomas
preparados com diferentes concentraes de quitosana. Para todas as amostras, fica
evidenciado um aumento do R
h
com a presena do polmero, bem como um contnuo
aumento com a concentrao do mesmo para as amostras filtradas a 0,45 m. Para as
amostras filtradas a 1,20 m e para as amostras no filtradas, o aumento de R
h
ocorre at a
concentrao de 0,5 mg/mL de quitosana e, acima dessa concentrao, foi observada uma
relativa estabilizao do tamanho mdio das vesculas. Os resultados indicam que o polmero
perturba fisicamente o sistema at uma concentrao limite. Porm, o processo no foi
observado para as amostras filtradas a 0,45 m.
A caracterstica fundamental evidenciada por este estudo consiste na considervel
diferena no s do tamanho mdio, mas tambm da distribuio de tamanhos, obtidos para
as vesculas filtradas a 0,45 m, quando comparadas aos sistemas no filtrados. Ambos os
101
parmetros foram drasticamente reduzidos quando a suspenso passou pela filtrao. Por
outro lado, entre as amostras filtradas a 1,20 m e no filtradas, as diferenas no foram
significativas, sendo que para as concentraes 0,10, 0,25 e 0,50 mg/mL de quitosana, as
variaes mdias esto dentro da vario da distribuio de tamanhos. Como esta variao de
distribuio igualmente elevada para todas as amostras destes dois casos, os resultados
sugerem que a filtrao a 1,20 m praticamente no altera o sistema no filtrado, ou seja, a
filtrao a 1,20 m pode ser considerada desnecessria em relao ao R
h
.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
R
h

(
n
m
)
quitosana (mg/mL)
0.45m
1.20m
sem filtr.

Figura 3.2. Variao do raio hidrodinmico (R
h
) obtido por Espalhamento de Luz Dinmico
para lipossomas e quitossomas em funo da concentrao de quitosana para amostras
filtradas a 0,45 e 1,20 m e amostras no filtradas, conforme indicado.
1

A extenso da variao de tamanhos tambm pode ser avaliada pelo valor do ndice
de polidisperso (Poly), mostrado na Tabela 3.1. O mesmo est diretamente relacionado com
variao no R
h
, representando a distribuio de tamanhos das vesculas em suspenso.
A outra caracterstica demonstrada aqui, o aumento do R
h
das vesculas com a
presena da quitosana e o aumento da sua concentrao. Este resultado indica que o polmero
est efetivamente presente nas estruturas e de alguma forma est delineando a estruturao
das mesmas.
102
Outro dado importante fornecido pelo Espalhamento de Luz Dinmico o
coeficiente de difuso diluio infinita D
o
. Considerando o movimento Browniano das
vesculas em suspenso, o D
o
atua de forma inversa ao R
h
, ou seja, com o aumento do R
h
o
D
o
diminui.
2

S
infinita (D
o
h
(R
g
) e da relao entre os raios ( = R
g
/R
h
) para as diferentes amostras estudadas atravs do
Espalhamento de Luz: vesculas filtradas a 0,45 m (a), vesculas filtradas a 1,20 m (b) e
vesculas no filtradas (c).
a)
quitosana
(mg/mL)
S
(kcts/s)
D
o
.10
-8
(cm
2
/s)
R
h

(nm)
Poly
(%)
R
g

(nm)
= R
g
/R
h

1,00 373 1,48 1458 0,25 10230 0,71
0,75 352 1,60 1345 0,37 10740 0,80
0,50 284 1,72 1254 0,29 997 0,80
0,25 255 1,90 1137 0,110 924 0,82
0,10 202 2,02 10610 0,36 887 0,84
0,00 145 2,08 10311 0,35 815 0,79

b)
quitosana
(mg/mL)
S
(kcts/s)
D
o
.10
-8
(cm
2
/s)
R
h

(nm)
Poly
(%)
R
g

(nm)
= R
g
/R
h

1,00 763 0,79 27278 0,58 10640 0,41
0,75 646 0,80 26864 0,417 10630 0,42
0,50 566 0,84 25681 0,515 923 0,37
0,25 414 0,95 22688 0,59 987 0,44
0,10 345 1,05 20447 0,612 986 0,49
0,00 214 1,31 16362 0,510 915 0,57

c)
quitosana
(mg/mL)
S
(kcts/s)
D
o
.10
-8
(cm
2
/s)
R
h

(nm)
Poly
(%)
R
g

(nm)
= R
g
/R
h

1,00 952 0,80 26987 0,46 1068 0,40
0,75 843 0,79 27075 0,57 1017 0,39
0,50 715 0,75 28785 0,610 10415 0,38
0,25 554 0,78 27598 0,58 985 0,37
0,10 394 0,92 23278 0,69 1035 0,46
0,00 266 1,24 17392 0,618 7910 0,47

103
A Tabela 3.1 ilustra este comportamento comparando os dados de R
h
com o D
o
.
Sendo assim, vesculas com R
h
maior difundem com uma velocidade menor e vice-versa. A
presena de quitosana concorre, portanto, para a reduo do D
o
em funo da sua
concentrao. Como pode ser observado na Tabela 3.1, este efeito mais pronunciado para
as amostras filtradas a 0,45 m, onde a distribuio de tamanhos mais estreita resulta em
dados de maior linearidade.
Alm do Espalhamento de Luz Dinmico, o Espalhamento de Luz Esttico tambm
forneceu dados importantes para as vesculas em suspenso. A intensidade de luz espalhada
I
S
aumentou consideravelmente com a presena de quitosana e o aumento da sua
concentrao (Tabela 3.1). Considerando por exemplo a amostra filtrada a 0,45 m, a I
S

mdia passou de 14 kcts/s para as amostras sem quitosana, at 37 kcts/s para as amostras com
a maior concentrao de quitosana. A diferena significa um aumento mdio de 164%. Aqui
deve ser lembrado que as amostras foram diludas mesma concentrao de vesculas em
gua, ou seja, a diluio do gel obtido na evaporao em fase reversa foi a mesma para todas
as amostras. Evidentemente existe uma diferena considervel de concentrao de partculas
entre amostras filtradas a 0,45 m, 1,20 m e no filtradas, considerando a possibilidade de
perdas no processo de filtrao. Porm, o aumento de I
S
com a concentrao polimrica
ocorre dentro da mesma srie de amostras. Como a concentrao de fosfolipdios na
preparao das vesculas mantida constante, lembrando que o R
h
das vesculas com
quitosana tambm aumentou, no seria razovel supor que o nmero de partculas produzidas
com a presena de quitosana seria maior. Pelo contrrio, o nmero de vesculas deve ser
menor. Sendo assim, as amostras com quitosana possuem uma tendncia de apresentar
menos vesculas, porm maiores, sem levar em conta efeitos morfolgicos, ou seja, supondo
que temos somente vesculas esfricas, onde o R
h
conta com uma camada de solvatao
semelhante para todas as amostras da mesma srie. Supondo o sistema nesta situao ideal,
uma amostra com menor concentrao de partculas, porm de R
h
maior, apresentaria I
S

maior do que uma amostra de R
h
menor, o que corresponde aos resultados obtidos.
De acordo com a equao 2.4 (Sesso 2.3), a I
S
depende diretamente da massa
molar da estrutura espalhante, considerando um dn/dc pouco varivel entre as diferentes
amostras da mesma srie. Na mesma situao espera-se uma massa molar maior para
estruturas maiores, as quais contm um nmero maior de molculas da mesma espcie. Por
fim, o que pode ser afirmado a respeito do comportamento da variao da I
S
, que o
104
parmetro corrobora com os resultados de espalhamento dinmico, confirmando o
comportamento de aumento de R
h
proporcionado pela concentrao do polmero.
Atravs da I
S
medida a diferentes ngulos de espalhamento, aplicando o mtodo da
dissimetria angular (Sesso 2.3), foi obtido tambm o raio de giro R
g
das vesculas em
suspenso. Como pode ser observado na Tabela 3.1, de forma geral o R
g
tambm aumenta
com a presena de quitosana e com a sua concentrao. Porm, nenhuma diferena
significativa foi observada entre as diferentes sries de amostras, ou seja, o R
g
manteve-se
aparentemente independente do uso da filtrao ou no.
Na prtica, foi observada certa dependncia angular na determinao das
intensidades de luz espalhada a diferentes ngulos. Essa dependncia angular foi maior para
vesculas de R
h
maiores. Em funo do tamanho da vescula e do vetor de onda utilizado,
sabe-se que R
g
q 1, indicando que a I
S
contm informaes sobre o fator estrutura da
suspenso. Isso significa que uma parte da intensidade provm da interao entre partculas.
Sabe-se que I
S
P(q) S(q), onde P(q) conhecido como o fator forma e S(q) fator estrutura.
Enquanto o primeiro relaciona-se estrutura interna da partcula, o segundo corresponde s
interaes inter-partculas. Este comportamento totalmente esperado no fenmeno de
espalhamento de luz, sendo que partculas maiores espalham mais luz em ngulos menores
(abaixo de 90) do que em ngulos maiores (acima de 90). Essa dependncia angular acaba
gerando uma incerteza maior na determinao do R
g
pelo mtodo da dissimetria.
De qualquer forma, os valores de R
g
foram determinados e com isso pde-se
tambm calcular a relao = R
g
/ R
h
para inferir sobre a morfologia das vesculas em
soluo. De acordo com a Tabela 3.1, os valores de para as amostras filtradas esto
prximos ao valor de 0,77 que foi determinado por Burchard como sendo correspondente a
uma estrutura esfrica rgida e homognea.
3,4
Neste caso a combinao das tcnicas de
Espalhamento de Luz Esttico e Dinmico fornece um resultado de definio estrutural para
as vesculas em suspenso aquosa.
Para as amostras filtradas a 1,20 m e no filtradas, o valor de forneceu
resultados bem menores e que sugerem a presena de estruturas mais complexas, com regies
alongadas, de alta massa molar, agregados ou mesmo microgis.

Burchard determinou
valores de entre 0,3 e 0,5 para agregados e microgis de celulose onde cadeias polimricas
extendidas fora do agregado principal atuam como uma espcie de esponja, retendo uma
camada de solvatao considervel, o que aumenta significativamente o R
h
e
105
consequentemente reduz o valor de .
3
Neste caso, os valores de encontrados aqui
demonstram um sistema de homogenidade estrutural menor com a presena de estruturas no
esfricas. A presena de agregados micromtricos e microgis pode ser descartada, j que
no foram observadas estruturas desta ordem no Espalhamento de Luz Dinmico.
Como concluso mais abrangente, os resultados de demonstram que existe uma
necessidade de ps-tratamento das vesculas para que as mesmas possam ser estruturalmente
homogeneizadas. Pelos resultados obtidos, a filtrao das vesculas pela membrana de 0,45
m mostra-se bastante adequada para a seleo de estruturas esfricas. Mais alm,
considerando a Figura 3.2, os resultados tambm demonstram que a filtrao reduz o R
h
das
vesculas para valores abaixo dos obtidos para as amostras filtradas a 1,20 m e no filtradas.
Esse resultado sugere que a filtrao a 0,45 m promove uma re-estruturao das partculas
atravs da passagem das mesmas pela membrana porosa que constitui uma submisso a um
estado de estresse fsico pela ao de presso durante a filtrao com o uso de seringa.
5

Sendo que as bicamadas fosfolipdicas das vesculas foram determinadas como sistemas de
alta coeso mecnica, ou seja, dotadas de alta elasticidade e compressibilidade,
6
essa re-
estruturao pela filtrao pode ser devidamente compreendida. As vesculas
dimensionalmente maiores do que os poros do filtro podem ser parcialmente desestruturadas
com a presso e o fluxo da filtrao. Aps a passagem pelo filtro, as mesmas se reorganizam
em vesculas menores. A membrana de uma vescula pode, por exemplo, romper durante a
passagem pelo poro e assim se reorganizar novamente em duas vesculas menores, como
representado na Figura 3.3.

Figura 3.3. Representao seqencial (esquerda para direita) da passagem de uma vescula
atavs do poro de um filtro menor do que a estrutura a ser filtrada. A membrana da vescula
rompe durante a passagem da mesma e assim duas novas estruturas menores so formadas.
As flechas indicam a direo do fluxo da filtrao.
106
A energia conferida pelo processo de filtrao suficiente para moldar as vesculas
sendo que a mesma pode atuar a nvel molecular, rompendo ou estimulando interaes entre
as molculas envolvidas na estruturao das vesculas. Deve-se considerar que para vesculas
fosfolipdicas em gua a estruturao de energia livre mais favorecida consiste na
estruturao da bicamada em uma vescula esfrica,
7
conforme discutido na Sesso 1.2.2.
Desta forma, a re-estruturao das vesculas em estruturas esfricas pode ser devidamente
justificada.
1
De qualquer forma, o processo de filtrao no parece estar atuando no sentido de
excluir o efeito provocado pela quitosana, considerando novamente as variaes de todos os
parmetros discutidos aqui. Em vista destes resultados, razovel afirmar que as amostras
filtradas a 0,45 m so mais adequadas para viabilizar estudos nos quais as vesculas esto
sujeitas menores variaes em sua estrutura e capazes, portanto, de proporcionar processos
reprodutveis. Assim, um outro parmetro foi determinado para estas amostras. Consiste no
coeficiente virial dinmico k
D
, apresentado na Tabela 3.2.
Atravs dos valores de k
D
possvel inferir sobre a qualidade do solvente
empregado na manuteno das partculas em soluo, j que o mesmo est relacionado com
as interaes termodinmicas entre as partculas e o solvente. Quanto maiores os valores de
k
D
melhor a interao termodinmica, ou seja, o solvente atua de forma mais eficaz na
dissoluo das partculas e , portanto, considerado um bom solvente. Para valores negativos
as interaes termodinmicas so fracas ou desfavorecidas e assim o solvente considerado
um mal solvente ou mesmo um no solvente. Neste caso significa que temos um lquido de
suspenso onde as partculas esto dispersas e no dissolvidas.

Tabela 3.2. Coeficiente virial dinmico (k
D
) obtido por Espalhamento de Luz Dinmico para
amostras de lipossomas e quitossomas com concentrao polimrica crescente.
1

quitosana
(mg/mL)
k
D

(L/g)
1,00 -0,070
0,75 -0,062
0,50 -0,050
0,25 -0,034
0,10 -0,021
0,00 -0,013
107
Todos os valores de k
D
obtidos para as amostras de vesculas filtradas a 0,45 m
foram negativos (Tabela 3.2). Este resultado significa que o sistema vescular em gua forma
uma suspenso de partculas onde as estruturas difundem sob reduzida influncia
termodinmica das molculas de gua, por baixa afinidade com o solvente. Outro resultado
interessante reside no decrscimo do valor de k
D
com o aumento da concentrao de
quitosana. Por conseguinte, as interaes entre as vesculas e a gua so ainda menores
quando existe quitosana na estrutura vesicular. Considerando o pH do meio igual a 5,8 1, o
mesmo no constitui um ambiente favorvel para interaes com a quitosana, j que a mesma
normalmente precipita em pH acima de 5,5.
8
De forma global, este resultado tambm sugere
que existe quitosana interagindo ou revestindo a regio externa das vesculas que foram
preparadas na presena da mesma.
Para alguns estudos efetuados na parte mais avanada da presente Tese, a
ultrasonicao foi utilizada como processo de homogeneizao estrutural das vesculas. A
filtrao pela membrana de 0,45 m, sem desconsiderar todas as suas vantagens discutidas
nesta Sesso, pode ocasionar perda em massa dos componentes que esto sendo filtrados,
como normalmente ocorre nos processo de filtrao. Sendo assim, a ultrasonicao foi
aplicada como um processo diferenciado para a obteno de vesculas esfricas.
Na ultrasonicao alguns parmetros devem ser padronizados para que os
resultados possam ser reprodutveis. Normalmente a energia despendida pelo processo de
ultrasonicao alta para estruturas vesiculares como as aqui estudadas. Em outras palavras,
a energia aplicada, dependendo da sua intensidade, pode facilmente produzir fenmenos
indesejados a nvel molecular, como quebra de molculas, especialmente as longas cadeias
hidrocarbonadas dos fosfolipdios, bem como as cadeias polimricas da quitosana. Processos
de oxidao molecular e reaes entre molculas e/ou entre fragmentos de molculas
produzidos pela ultrasonicao tambm podem facilmente ocorrer assim como a hidrlise.
9,10
Alm da energia aplicada na ultrasonicao, um tempo excessivamente prolongado
das amostras sob a ao da ultrasonicao pode gerar os mesmos problemas acima
enunciados. Ainda mais considerando que a ultrasonicao tambm aquece o sistema, depois
de um determinado tempo, como forma de dissipar parte da energia transferida ao mesmo.
Os parmetros de ultrasonicao de vesculas fosfolipdicas foram cuidadosamente
estudados por Pereira-Lachataignerais e colaboradores para a obteno de vesculas com
reduzido ndice de polidisperso.
11
As condies de energia aplicada e tempo de
108
ultrasonicao foram optimizadas. Para as sonicaes procedidas na presente Tese, foi
utilizada uma energia menor do que a energia mxima proposta por Pereira-Lachataignerais e
colaboradores. O tempo de ultrasonicao, tambm menor, foi optimizado medindo-se a
distribuio de tamanhos obtidos para diferentes tempos atravs do Espalhamento de Luz
Dinmico.
Lipossomas e quitossomas (contendo a maior concentrao polimrica, 1,0
mg/mL) foram ultrasonicados com ultrasonicador de ponta metlica com tempos variando
entre 30 segundos e 10 minutos sob energia constante de 50 mW, freqncia nominal de 40
kHz sob amplificao de 10%. As distribuies de R
h
foram medias logo em seguida a 90 e
foi observada uma ntida reduo de R
h
e principalmente da sua distribuio.
A Figura 3.4, onde foram graficadas as distribuies de R
h
em funo da amplitude
do volume de distribuio obtidas pelo tratamento matemtico (REPES) das curvas de
correlao temporal, demonstra as diferenas geradas pela energia da ultrasonicao para os
dois tipos de amostras investigadas. As funes de correlao temporal obtidas tambm
foram unimodais e da mesma forma como no estudo anterior, as amostras no submetidas a
nenhum ps-tratamento resultaram num R
h
mdio caracterstico e de larga distribuio
nanomtrica.
Na Figura 3.4 so apresentadas as distribuies para os tempos de ultrasonicao de
30 segundos, 1 minuto e 5 minutos. Pode ser observado que houve uma contnua e
considervel reduo de R
h
mdio e um estreitamento do pico de distribuio com o aumento
do tempo de sonicao.
Os tempos intermedirios entre 1 minuto e 5 minutos seguiram a mesma tendncia
de reduo de R
h
mdio e estreitamento do pico de distribuio. Os tempos acima de 5
minutos apresentaram a mesma tendncia, porm de forma menos acentuada. Como
resultado, as amostras sonicadas a 10 minutos apresentaram R
h
e distribuio menores para
ambas as amostras, porm no significativamente menores. Por esta razo o tempo de 5
minutos de ultrasonicao foi considerado ideal para os objetivos aqui propostos: estruturas
esfricas, nanomtricas, com uma distribuio de R
h
razoavelmente estreita e sem indcios de
degradao molecular.

109

Figura 3.4. Distribuies do raio hidrodinmico (R
h
) em funo da amplitude do volume de
distribuio (A) obtidas a partir da anlise das funes de correlao temporal do
Espalhamento de Luz Dinmico para amostras de lipossomas (a, c, e) e quitossomas (b, d, f)
submetidas a diferentes tempos de ultrasonicao sob energia constante: 30 segundos (a, b);
1 minuto (c, d); 5 minutos (e, f).

As amostras sonicadas durante 5 minutos ou mais sofreram um leve aquecimento,
porm o mesmo no ultrapassou os 35 C, temperatura enventualmente utilizada para a
evaporao do solvente orgnico no processo de preparao em fase reversa. Essa
temperatura aplicada durante um tempo relativamente curto, no demonstrou gerar produtos
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225
0
5
10
15
20
A
R
h
(nm)
a
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225
0
5
10
15
20
25
d
A
R
h
(nm)
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225
0
5
10
15
20
b
A
R
h
(nm)
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
f
A
R
h
(nm)
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
e
A
R
h
(nm)
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225
0
5
10
15
20
25
c
A
R
h
(nm)
110
de degradao fosfolipdica detectveis pela Cromatografia em Camada Delgada, sendo que
amostras de vesculas eludas antes e aps aquecimento sob sonicao apresentaram
resultados equivalentes conforme representado na Figura 3.5. Estes resultados de eluio so
igualmente idnticos aos apresentados para a eluio do fosfolipdio utilizado, simplesmente
dissolvido em clorofrmio, o que demonstra que a produo de vesculas a princpio no gera
degradaes fosfolipdicas perceptveis pela CCD. Deve ser considerado que o fosfolipdio
utilizado apresenta um grau de pureza aproximado de 95%, sendo que uma das impurezas
constitui o produto de degradao, conforme discutido na Sesso 2.2.1.
Na prtica, a energia de ultrasonicao provoca a desestruturao das bicamadas
fosfolipdicas das vesculas, com rompimentos de membranas as quais acabam se auto-
organizando em estruturas menores para voltar ao estado de menor energia livre, onde as
interaes de polaridade e apolaridade so optimizadas. O processo pode ser comparado at
certo ponto com a filtrao sob presso, porm na ultrasonicao, a energia fornecida
provoca agitaes moleculares intensas que resultam nos rompimentos das membranas.

Figura 3.5. Representao do resultado de Cromatografia em Camada Delgada em placas de
slica gel (eluente: clorofrmio:metanol:gua (6,5:2,5:0,4)) reveladas em atmosfera saturada
de iodo para eluio de amostra de lipossomas e quitossomas antes e aps ultrasonicao
durante 10 minutos. As manchas correspondem ao cido fosfatdico (R
f
= 0,72) (1),
fosfatidilcolina (95%, R
f
= 0,21) (2) e lisofosfatidilcolina (R
f
= 0,07) (3).

Um aspecto diferenciado observado neste estudo estrutural de vesculas submetidas
ultrasonicao pode ser percebido pela comparao entre as Figuras 3.4 e e f. Os valores de
R
h
e tambm a sua distribuio foram levemente inferiores para a amostra contendo
111
quitosana. O resultado oposto ao obtido pelo processo de filtrao e sugere a existncia de
algum efeito gerado pela presena do polmero sob a ao da energia de sonicao.
Considerando que a energia de ultrasonicao provoca agitaes a nvel molecular, uma
possibilidade seria a desestruturao mais eficiente dos quitossomas justamente pela
presena do polmero que, interagindo com a membrana das vesculas e sendo susceptvel a
uma agitao molecular maior do que a membrana, colaboraria para o rompimento da
mesma. Uma outra possibilidade seria a perda de polmero sob a ao da ultrasonicao.
Neste caso, quitossomas poderiam estar sendo transformados em lipossomas. Para a
avaliao destas hipteses, as amostras sonicadas a 5 minutos foram investigadas por
Microscopia Eletrnica de Transmisso (Sesso 3.1.1.3) e Recuperao de Fluorescncia
Aps Foto-branqueamento (Sesso 3.1.3.2). Para esta segunda tcnica as amostras foram
preparadas com fosfolipdio fluorescente NBDPC a 0,1% para lipossomas e com quitosana
fluorescente para quitossomas (Sesso 2.2.1). As vesculas fluorescentes apresentaram
resultados de R
h
semelhantes sob a ao da ultrasonicao.

3.1.1.2. Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo

O Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo, SAXS, consiste numa tcnica
fundamental para o estudo da organizao de sistemas vesiculares a nvel molecular. A
interao da radiao com a estrutura eletrnica e o seu subseqente espalhamento fornece
informaes detalhadas de aspectos estruturais que dificilmente poderiam ser obtidas por
outras tcnicas.
Nos estudos estruturais das vesculas nanomtricas deste trabalho o SAXS foi
empregado para a avaliao das sries de amostras j discutidas na Sesso anterior, ou seja,
os lipossomas e os quitossomas filtrados a 0,45 ou 1,20 m e no filtrados, apresentados na
Tabela 3.1.
A Figura 3.6 mostra perfis de espalhamento de SAXS obtidos para a srie de
amostras filtradas a 0,45 m. Pode ser observado um comportamento peculiar apresentado
sistematicamente para todas as sries de amostras. Este comportamento evidencia o aumento
da definio dos picos de espalhamento com o concomitante crescimento da concentrao de
quitosana utilizada na preparao dos quiossomas. Conforme discutido na Sesso 2.4, picos
de Bragg bem definidos esto relacionados com uma maior organizao a nvel molecular,
112
pois o espalhamento coerente. Por outro lado, curvas extendidas denotam uma inconstncia
na organizao molecular, e so o resultado de um espalhamento incoerente.

Figura 3.6. Espectros de SAXS obtidos para uma srie de amostras de lipossomas e
quitossomas com crescente concentrao de quitosana, conforme indicado, filtradas com
membrana de 0,45 m. Os perfis de espalhamento so demonstrados como intensidade de
radiao espalhada (y) em funo do vetor de onda q (x) sem reduo do rudo de fundo.

Bouwstra e colaboradores procederam a um estudo detalhado de SAXS aplicado
para lipossomas.
12
Os espectros de SAXS foram relacionados com o perfil de densidade
eletrnica das bicamadas das vesculas. Dados como a distncia de repetio das bicamadas e
o nmero de bicamadas sobrepostas em estruturas multilamelares foram determinados e a
influncia da curvatura da bicamada das vesculas no perfil de espalhamento foi avaliada.
No que concerne influncia da curvatura da membrana, apenas lipossomas com
dimetros inferiores 50 nm foram caracterizados por influenciarem significativamente os
lipossomas
quitossomas (0,10 mg/mL)

113
perfis de espalhamento.
12
Como neste trabalho as vesculas apresentaram dimetros muito
acima deste valor, o parmetro curvatura da membrana foi desconsiderado.
Atravs de clculos aplicando modelos tericos, Bouwstra e colaboradores
obtiveram perfis de espalhamento de SAXS tericos que puderam ser relacionados com os
resultados experimentais. Assim, foi estabelecido que espectros de SAXS com picos
intensos, de boa definio, correspondem lipossomas multilamelares, enquanto que curvas
extendidas de relativa baixa intensidade significam lipossomas unilamelares. O perfil de
espalhamento de lipossomas multivesiculares corresponderia tambm ao de unilamelares.
12
Por conseguinte, analisando os dados obtidos para as vesculas estudadas aqui, os
perfis de espalhamento demonstram que a presena de quitosana produz vesculas
multilamelares, j que os picos de Bragg aumentam com o aumento da concentrao do
polmero.
13

Os resultados mostram que a quitosana influencia o sistema a nvel molecular. As
bicamadas fosfolipdicas so mais organizadas e desta forma produzem um espalhamento
mais coerente que resulta nos picos bem definidos. Esta maior organizao molecular pode
ser obtida em estruturas multilamelares, onde a sobreposio concntrica de bicamadas
requer uma organizao maior. Como efeito glogal, a rigidez da membrana de uma vescula
multilamelar acaba sendo maior do que a rigidez de uma vescula unilamelar. Em outras
palavras, a sobreposio de bicamadas produz vesculas mais rgidas em que a membrana
est menos sujeita s oscilaes termodinmicas. No caso de estruturas unilamelares, a
rigidez da membrana menor. A bicamada nica, detentora de alta flexibilidade, passvel
de deformaes constantes com a difuso das vesculas na suspenso. O resultado, neste
caso, o espalhamento difuso que produz uma curva extendida nos espectros de SAXS.
Para a avaliao dos perfis de espalhamento foram aplicadas funes Lorentzianas
que permitiram analisar os picos e as curvas de forma padronizada para a obteno de dados
estruturais e avaliao da proporo de formao de estruturas multilamelares.
1,13
A Figura
3.7 apresenta trs espectros de SAXS que so representativos para os resultados obtidos para
as amostras estudadas. As funes Lorentzianas tambm so apresentadas. A Figura 3.7a foi
obtida para a amostra no filtrada e de maior concentrao de quitosana. Os picos de Bragg
apresentaram a maior definio encontrada e a relao 1/2 entre os valores de q para o
primeiro e o segundo pico indica que o sistema lamelar, ou seja, organizado em bicamadas
fosfolipdicas.
12

114

Figura 3.7. Espectros de SAXS com aplicao de funes Lorentzianas (linhas contnuas)
para quitossomas no filtrados e preparados com a soluo de quitosana de 1,00 mg/mL (a),
quitossomas filtrados a 1,20 m e preparados com a soluo de quitosana de 0,50 mg/mL (b)
e lipossomas filtrados a 0,45 m (c).
1
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

a
I

(
u
.
a
.
)
q (
-1
)
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

I

(
u
.
a
.
)
q (
-1
)
b
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

c
I

(
u
.
a
.
)
q (
-1
)
115
Entre o primeiro e o segundo pico possvel observar uma discreta elevao, ou
seja, a intensidade no corresponde linha de base. Atravs das funes Lorentzianas foram
determinadas trs contribuies, nomeadamente dois picos e uma curva extendida bastante
discreta entre eles.
A Figura 3.7b mostra o resultado para a amostra filtrada a 1,20 m e preparada com
a concentrao intermediria de quitosana e representa bem a situao de transio entre os
espectros de maior e menor definio dos picos. As funes Lorentzianas forneceram dois
picos de bases extendidas e uma curva mais elevada entre eles.
J a Figura 3.7c, que corresponde amostra de lipossomas filtrada a 0,45 m,
mostra a situao em que o pico de difrao muito discreto. Um pequeno sinal pode ser
observado entre o rudo de fundo com a ampliao do espectro. Porm, o que prevalece
uma acentuada curva extendida por toda a regio de q investigada.
interessante observar que a curva central, extendida, cresce aproximadamente na
mesma regio em todos os espectros.
A posio do primeiro pico de difrao obtida pelo ajuste Lorentziano, forneceu o
valor de q utilizado para o clculo da distncia de repetio d das bicamadas fosfolipdicas
das vesculas. As reas do primeiro pico (1), tambm obtidas pelas Lorentzianas, foram
calculadas e comparadas com as reas da curva extendida (2). Os resultados dos parmetros
obtidos pelo SAXS esto na Tabela 3.3, que retoma novamente os resultados de
Espalhamento de Luz discutidos na Sesso anterior para que se possa estabelecer uma
avaliao estrutural baseada nos resultados das duas tcnicas.
Como demonstrado na Tabela 3.3, as distncias de repetio d das bicamadas das
vesculas sofreram uma pequena, porm contnua reduo com o aumento da concentrao
de quitosana. A relao de rea entre a curva extendida (2), que correspode s estruturas
unilamelares, e o primeiro pico (1), relacionado com as estruturas multilamelares, tambm
decresce com o aumento da concentrao de quitosana para as trs sries de amostras. O
outro parmetro, obtido pela largura meia altura do primeiro pico de difrao, representa o
nmero mdio de bicamadas sobrepostas nas vesculas multilamelares <N>, que aumenta
significativamente com o aumento da concentrao de quitosana.
Estes resultados esto evidentemente todos relacionados entre si. Considerando que
a quitosana aumenta a proporo de estruturas multilamelares, a rea da curva extendida deve
diminuir, enquanto que a rea do pico deve aumentar. Com o aumento da sobreposio de
116
bicamadas numa vescula, aumenta a organizao molecular, conforme discutido
anteriormente. Esta maior organizao molecular acaba refletindo tambm nas distncias de
repetio entre as bicamadas, que so consequentemente reduzidas. A menor movimentao
molecular numa estrutura multilamelar, mais rgida, impede grandes oscilaes de d,
colaborando com a reduo do seu valor efetivo.

S
infinita (D
o
h
(R
g
), da relao entre os raios ( = R
g
/R
h
), obtidos por Espalhamento de Luz e da distncia
de repetio das bicamadas fosfolipdicas (d), da razo de rea entre a curva extendida (2) e o
primeiro pico de difrao (1) e o nmero mdio de bicamadas fosfolipdicas em vesculas
multilamelares (<N>), obtidos por SAXS, para as diferentes amostras estudadas: vesculas
filtradas a 0,45 m (a), vesculas filtradas a 1,20 m (b) e vesculas no filtradas (c).

a)
quitosana
(mg/mL)
S
(kcts/s)
D
0
.10
-8

(cm
2
/s)
R
h

(nm)
Poly
(%)
R
g

(nm)
=R
g
/R
h

d
(nm)
razo de
rea (2/1)
<N>
1,00 373 1,48 1458 0,25 1023 0,71 6,43 4,96 9
0,75 352 1,60 1345 0,37 1074 0,80 6,45 9,20 8
0,50 284 1,72 1254 0,29 997 0,80 6,46 8,60 7
0,25 255 1,90 1137 0,110 924 0,82 6,50 12,46 5
0,10 202 2,02 10610 0,36 887 0,84 6,49 13,28 5
0,00 145 2,08 10311 0,35 815 0,79 6,57 20,17 2

b)
quitosana
(mg/mL)
S
(kcts/s)
D
0
.10
-8

(cm
2
/s)
R
h

(nm)
Poly
(%)
R
g

(nm)
=R
g
/R
h
d
(nm)
razo de
rea (2/1)
<N>
1,00 763 0,79 27278 0,58 1064 0,41 6,47 1,23 13
0,75 646 0,80 26864 0,417 1063 0,42 6,49 3,10 12
0,50 566 0,84 25681 0,515 923 0,37 6,50 4,80 12
0,25 414 0,95 22688 0,59 987 0,44 6,52 10,62 13
0,10 345 1,05 20447 0,612 986 0,49 6,54 14,60 10
0,00 214 1,31 16362 0,510 915 0,57 6,62 30,57 7

c)
quitosana
(mg/mL)
S
(kcts/s)
D
0
.10
-8

(cm
2
/s)
R
h

(nm)
Poly
(%)
R
g

(nm)
=R
g
/R
h
d
(nm)
razo de
rea (2/1)
<N>
1,00 952 0,80 26987 0,46 1068 0,40 6,49 1,09 20
0,75 843 0,79 27075 0,57 1017 0,39 6,51 1,22 19
0,50 715 0,75 28785 0,610 10415 0,38 6,51 2,10 17
0,25 554 0,78 27598 0,58 985 0,37 6,50 3,11 13
0,10 394 0,92 23278 0,69 1035 0,46 6,50 11,30 12
0,00 266 1,24 17392 0,618 7910 0,47 6,59 27,51 8

117
Um outro fator que pode ser considerado a reduo de molculas de gua entre as
bicamadas. As extremidades polares dos fosfolipdios esto hidratadas e uma determinada
quantidade de gua encontra-se entre uma bicamada e outra, conforme representado na
Figura 3.8. Como a d considera tambm a espessura da camada aquosa juntamente com a
espessura da membrana, a reduo do seu valor tambm pode estar relacionada com a
diminuio da quantidade de gua entre as bicamadas. Neste caso, a quitosana atuaria no
sentido de desidratar as membranas das vesculas.

Figura 3.8. Representao idealizada de duas bicamadas de fosfolipdios separadas por uma
camada de molculas de gua. A distncia de repetio d considera a espessura da bicamada
mais a poro aquosa.

Assim sendo, tanto a maior organizao a nvel molecular quanto a reduo da
camada aquosa so os possveis fatores envolvidos nos resultados da d. Como discutido nesta
Sesso, os perfis de espalhamento de alta definio correspondem a uma organizao
molecular maior. Sendo assim, este seria o parmetro mais influente na d. Por outro lado, a
poro aquosa um fator real que no pode ser negligenciado. Portanto, os dois fatores
podem estar atuando juntamente no sentido de reduzir a d.
A existncia da curva extendida em todos os espectros de SAXS, bem como o sinal
constante do primeiro pico, evidenciam que o sistema constitudo de uma mistura de
estruturas uni e multilamelares. A avaliao da proporo entre uni e multilamelares difcil
e requer a aplicao de clculos matemticos sofisticados para relacionar os dados
experimentais com modelos tericos. Bouwstra e colaboradores procederam uma criteriosa
anlise neste sentido produzindo uma srie de dados quantitativos tericos que podem ser
118
relacionados com os perfis de difrao dos espectros.
12
Alm da relao entre o primeiro pico
e a curva extendida, a diferena de intensidade entre o primeiro e o segundo pico de difrao
tambm fornece informaes a respeito da proporo entre estruturas uni e multilamelares.
De forma qualitativa, quando a intensidade do segundo pico de Bragg muito reduzida em
relao intensidade do primeiro pico, significa que a proporo de estruturas multilamelares
presentes no sistema pequena em relao s estruturas unilamelares. Isso tambm
independente do <N> das multilamelares. A questo pode ser entendida fisicamente
considerando que o segundo pico uma reflexo do primeiro. Quando esta reflexo pouco
intensa, significa pouca reprodutibilidade de espalhamento, mesmo que o espalhamento seja
coerente. E este resultado est relacionado com a quantidade da populao que produz o
espalhamento coerente em relao quantidade da populao que produz o espalhamento
incoerente.
Em sistemas exclusivamente multilamelares o segundo pico pode apresentar uma
intensidade acima de 50% da intensidade do primeiro e at mesmo um terceiro pico de
difrao pode ser detectado. Nos perfis de espalhamento obtidos aqui, a amostra de
quitossomas no filtrada contendo a maior concentrao do polmero apresentou intensidade
do segundo pico correspondente aproximadamente 25% da intensidade do primeiro. Tal
resultado corresponde a uma proporo mxima de 20% de estruturas multilamelares
presentes na mistura.
12
Deve ser lembrado que aqui o parmetro considerado puramente
qualitativo.
Esta anlise torna-se mais complicada com o aumento da intensidade da curva
correspondente s estruturas unilamelares. Como pode ser observado na Figura 3.7, a
diferena de intensidades entre os dois picos de Bragg mostra-se menor na situao
intermediria (Figura 3.7b) em comparao com a amostra de maior concentrao polimrica
(Figura 3.7a). O resultado sugere que nesta amostra a quantidade de estruturas multilamelares
proporcionalmente maior do que a quantidade de unilamelares, quando comparada com a
amostra com a maior concentrao de quitosana. Porm, como pode ser observado na Tabela
3.3, estas estruturas lamelares da amostra intermediria apresentam um menor <N>. Assim,
teramos mais estruturas multilamelares, porm as mesmas apresentariam menos lamelas por
vescula multilamelar.
Levando em considerao que o mtodo da evaporao em fase reversa foi
desenvolvido para a produo de lipossomas unilamelares, os resultados mostram que a
presena de quitosana modifica os resultados da metodologia. Uma proporo aproximada de
119
20% de estruturas multilamelares com a presena de quitosana pode ser considerada como
um resultado razovel. Mesmo os lipossomas produzidos aqui, forneceram uma pequena
poro de estruturas multilamelares no caso das amostras no filtradas ou filtradas a 1,20 m
(Tabela 3.3). As amostras filtradas a 0,45 m forneceram uma poro de estruturas
bilamelares. O resultado sugere a necessidade de um ps-tratamento das vesculas para
homogeneizao estrutural.
Interpretando os dados obtidos para as trs sries de amostras, pode ser observado
que a filtrao tambm exerce um efeito considervel nos resultados de SAXS. A evoluo
comparativa das reas de pico e curva para as trs sries apresentada na Figura 3.9 em
funo da concentrao de quitosana.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
(no filtradas)
(1,20 m)
(0,45 m)
r
e
a

d
o
s

p
i
c
o
s

(
%
)
quitosana (mg/mL)

Figura 3.9. Evoluo percentual relativa das reas da curva extendida (acima) e do primeiro
pico de difrao (abaixo) obtidas pela aplicao de funes Lorentzianas nos espectros de
SAXS das diferentes amostras de vesculas estudadas em funo da concentrao de
quitosana e da filtrao, conforme indicado.
1

O sistema no filtrado sofre variaes maiores com o aumento da concentrao de
quitosana. A rea da curva extendida diminui consideravelmente enquanto que a rea do pico
de Bragg aumenta na mesma proporo relativa. As amostras filtradas a 1,20 m evoluem no
120
mesmo sentido, mas de forma mais discreta, assim como as amostras filtradas a 0,45 m que
apresentaram as menores variaes. Atravs destes resultados, pode ser considerado que a
filtrao a 1,20 m produz um efeito no sistema no sentido de reduzir, no a quantidade de
estruturas multilamelares presentes no sistema (que depende tambm da diferena entre o
primeiro e segundo pico, confrome discutido nesta Sesso), mas sim o nmero de bicamadas
nas estruturas multilamelares, como pode ser observado tambm na Figura 3.10. Sendo
assim, a filtrao a 1,20 m apresenta um efeito detectvel por SAXS que no foi detectado
pelo Espalhamento de Luz, onde foi considerado que amostras no filtradas e filtradas a 1,20
m apresentam praticamente o mesmo comportamento. Os raios hidrodinmicos no
variaram significativamente entre amostras no filtradas e filtradas a 1,20 m. Por
conseguinte, se o nmero de bicamadas est diminuindo, porm o tamanho das vesculas no
diminuiu na mesma proporo, significa afirmar que as vesculas esto adquirindo um ncleo
aquoso maior na filtrao a 1,20 m. Este comportamento mostra a alta sensibilidade do
sistema s variaes das condies de preparao. Cada condio de preparao produz
vesculas de caractersticas distintas. Mesmo sendo alta, a porosidade de 1,20 m em
comparao com os tamanhos das estruturas obtidas logo aps a sua formao, o processo de
passagem das amostras pela membrana porosa parece exercer influncia na estruturao final
das vesculas, mesmo que esta influncia seja discreta e pouco perceptvel pelo
Espalhamento de Luz.
J as amostras filtradas a 0,45 m, que apresentaram variaes de rea do primeiro
pico e da curva mais discretas ao longo do aumento da concentrao de quitosana, podem
assim ser consideradas mais uma vez como o sistema de maior homogeneidade estrutural.
Analisando os resultados para o nmero mdio de bicamadas <N> (Figura 3.10), as
diferenas para as trs sries de amostras seguem uma tendncia semelhante ao da variao
relativa de reas (Figura 3.9). Porm, os valores do <N> para as amostras filtradas a 1,20 m
seguem uma tendncia semelhante ao das amostras no filtradas at a concentrao de 0,25
mg/mL. Aps, a tendncia muda para valores inferiores e segue mais prxima ao das
amostras filtradas a 0,45 m. Por conseguinte, pode ser considerado que as filtraes
exercem efeito no sistema no sentido de reduzir o <N>.
Torna-se importante salientar os aspectos dimensionais do <N>. Os valores
encontrados neste estudo podem ser considerados altos. Principalmente os obtidos para as
amostras no filtradas. Vesculas com <N> acima de 15 so pouco provveis em estruturas
121
multilamelares. O procedimento de clculo do <N> (Sesso 2.4) foi desenvolvido a partir de
clculos tericos que consideram o sistema multilamelar como uma sobreposio de
bicamadas fosfolipdicas ideal, ou seja, dispostas de forma linear num plano, empilhadas
umas sobre as outras de forma repetitiva e sem influncia de ondulaes ou distores.
Evidentemente esta situao ideal no procede na prtica, onde as variaes termodinmicas
provocam diversas oscilaes estruturais, principalmente em estruturas de menor
homogeneidade estrutural, como as vesculas com as maiores concentraes de quitosana e
no filtradas. Por conseguinte, deve ser reconhecido que os valores do <N> podem estar
subestimados, especialmente para as amostras no filtradas.

Figura 3.10. Variao do nmero mdio de bicamadas fosfolipdicas (<N>) obtido pela
largura meia altura do primeiro pico de espalhamento nos espectros de SAXS em estruturas
multilamelares para as diferentes amostras de vesculas estudadas em funo da concentrao
de quitosana e da filtrao, conforme indicado.
1

De qualquer forma, a tendncia dos resultados permanece e as discusses proferidas
so fundamentadas e interelacionadas, levando em considerao os diversos aspectos que
definem a estruturao das vesculas a partir da diferenciada gama de resultados.
A relao entre os dados de Espalhamento de Luz e SAXS pode fornecer mais
alguns parmetros estruturais interessantes.
1
Os valores mdios de R
g
foram relacionados
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
(no filtradas)
(1,20 m)
(0,45 m)
<

N

>
quitosana (mg/mL)
122
com os valores de <N> e de d, conforme descrito na Sesso 2.4, e assim foi possvel obter o
dimetro do ncleo aquoso, ou seja, o dimetro da regio aquosa da vescula
desconsiderando a membrana fosfolipdica. Por conseqncia, tambm foi possvel calcular o
volume do ncleo aquoso, ou o volume de gua encapsulado no ncleo das vesculas. A
quantidade de gua entre as bicamadas de estruturas multilamelares no considerada neste
volume, sendo que o seu valor descontado no clculo j que a d considera a sua
contribuio. Os clculos foram efetuados para a srie de amostras filtradas a 0,45 m que
apresentaram a maior homogeneidade estrutural e os resultados so apresentados na Tabela
3.4.

Tabela 3.4. Resultados para dimetro do ncleo aquoso (D
n
) e volume aquoso encapsulado
(V) no ncleo das vesculas filtradas a 0,45 m em funo da concentrao de quitosana. Os
valores so mdios e foram obtidos pela relao entre resultados de Espalhamento de Luz e
SAXS.
quitosana
(mg/mL)
D
n

(nm)
V
(10
-16
cm
3
)
1,00 88 3,57
0,75 110 6,97
0,50 108 6,60
0,25 119 8,82
0,10 111 7,16
0,00 136 13,17

Os resultados de D
n
e V mostram que as vesculas apresentam um considervel
ncleo aquoso dentro do qual possvel encapsular uma quantidade considervel de
molculas hidroflicas. Dimetro e volume internos so reduzidos com a presena de
quitosana e o aumento da sua concentrao. Esta reduo ocorre devido formao das
multicamadas que acabam preenchendo mais o espao interno das estruturas multilamelares.
O R
g
das vesculas tambm aumentou com a quitosana, porm, a variao dos valores de D
n
e
V demonstra que a multilamelaridade tambm cresce na direo oposta, ou seja, para dentro
das vesculas.
Consequentemente conclui-se pelo conjunto dos resultados de Espalhamento de Luz
e de SAXS que a informao estrutural a respeito do sistema vesicular estudado pode ser
acessada. O Espalhamento de Luz mostrou o aumento de tamanho das estruturas e o SAXS o
aumento do nmero mdio de bicamadas, comportamentos resultantes do aumento da
123
concentrao de quitosana. Ambos os resultados mostram juntamente que a quitosana atua
tambm no sentido de aumentar a massa estrutural das vesculas, com a sobreposio de
bicamadas, para o interior das estruturas, reduzindo o ncleo aquoso. Lembrando que este
efeito est possivelmente relacionado tambm com o processo de filtrao, que possui a
capacidade de moldar as estruturas, conforme discutido na Sesso anterior.
De qualquer maneira, deve ser considerado que uma vescula multilamelar, onde as
bicamadas se sobrepem tambm para o interior, estruturalmente mais rgida ou de
organizao molecular superior em relao a uma vescula multilamelar na qual as bicamadas
se sobrepem para o exterior da estrutura. Em outras palavras, uma estrutura multilamelar
contendo um nmero de bicamadas <N> e um ncleo aquoso reduzido menos passvel de
oscilaes estruturais do que uma estrutura multilamelar com o mesmo nmero de bicamadas
<N> e um ncleo aquoso maior. Assim sendo, a concentrao de quitosana juntamente com a
filtrao a 0,45 m, reduz o ncleo aquoso produzindo estruturas com mais bicamadas e
consequentemente com uma capacidade potencial maior de incorporao de substncias
hidrofbicas, considerando a regio apolar das bicamadas fosfolipdicas.
Por fim, um ltimo parmetro estrutural a ser considerado refere-se localizao da
quitosana nos quitossomas. At aqui foram discutidos os diversos efeitos provocados no
sistema pela sua presena. Porm, a localizao exata da quitosana complexa e consiste
numa informao que necessita de um estudo bastante aprofundado, atravs de diferentes
tcnicas. Os dados das diferentes tcnicas devem ser relacionados entre si e levando em
considerao os fatores fsico-qumicos de interao molecular, possvel determinar a
posio ou algumas posies da quitosana nos quitossomas preparados neste estudo.
A tcnica de SAXS permite uma anlise preliminar neste sentido. Conforme
descrito na literatura,
12
os perfis de espalhamento de estruturas multilamelares, com
bicamadas concntricas, correspondem a picos de Bragg bem definidos. J as estruturas
unilamelares e tambm as multivesiculares, onde as bicamadas no so concntricas,
fornecem uma curva extendida de baixa intensidade. Considerando que a presena de
quitosana leva formao de estruturas multilamelares com bicamadas concntricas, pouco
provvel que exista quitosana entre as bicamadas.
Imaginando uma situao simplificada, como a massa molar mdia de quitosana de
164 000 g/mol como a massa nica, sem considerar a distribuio, o nmero mdio de
monmeros presentes na amostra de quitossomas preparados com a soluo de 1,00 mg/mL
124
de quitosana corresponde 7,2 x 10
17
monmeros. Neste clculo foram levadas em
considerao as contribuies de 83% de monmeros desacetilados e 17% de monmeros
acetilados. J para o nmero de molculas de fosfolipdio, considerando uma massa molar
mdia de 800 g/mol, as 60 mg de material utilizado na preparao das amostras representam
4,5 x 10
19
molculas. Por conseguinte, relacionando os valores mdios, teramos uma
proporo de 63 molculas de fosfolipdios por monmero de quitosana. O clculo, embora
simplificado, mostra que existe pouco polmero presente nas amostras em relao
quantidade de fosfolipdios.
Por outro lado, atravs dos estudos de SAXS, foi estimada uma proporo mxima
de estruturas multilamelares de 20%. Se a quitosana estiver presente apenas nas estruturas
multilamelares, esta proporo diminui sensivelmente. Contudo, o perfil de espalhamento
mostra a alta organizao molecular das estruturas multilamelares. Com a presena de
quitosana entre as lamelas, esta organizao seria perturbada, pois as cadeias polimricas
certamente exigem uma considervel regio espacial (fsica e de agitao molecular) que
pode ser maior em alguns pontos (onde h mais monmeros) e menor em outros (onde h
menos monmeros ou mesmo nenhum). A no ser que as cadeias polimricas estejam quase
totalmente extendidas e homogeneamente distribudas entre as lamelas. Neste caso, as
bicamadas no seriam to perturbadas quanto sua organizao estrutural.
Lembrando ainda que a quitosana utilizada constituda de dois tipos de
monmeros, com aproximadamente 17% de grupos acetila os quais ocupam uma rea
espacial diferente dos grupos amino e evidentemente interagem de forma diferente com as
extremidades polares dos fosfolipdios, gerando mais perturbaes diferenciadas que
contribuiriam no sentido de reduzir a organizao das bicamadas.
Todas estas razes sugerem que a presena de quitosana entre as bicamadas das
estruturas multilamelares pouco provvel. Seria mais razovel imaginar que o polmero
esteja revestindo as estruturas externamente e internamente ou tambm encontrar-se
encapsulado no ncleo aquoso. Assim teramos vesculas multilamelares com a membrana
revestida externa e internamente com quitosana. Esta situao mais simples pode justificar as
interpretaes discutidas at aqui: a maior rigidez da membrana bem como a maior
organizao molecular das bicamadas.
A questo intrigante discutida tambm ao longo da presente Tese, com base nos
resultados obtidos pelas outras tcnicas empregadas no estudo das vesculas e pela questo de
interao molecular entre a quitosana e o fosfolipdio.
125
3.1.1.3. Microscopia ptica e Eletrnica

A Microscopia ptica foi empregada para que se pudesse ter uma idia do aspecto
micromtrico das amostras de lipossomas e quitossomas. Na Figura 3.11 foram comparadas
as amostras no filtradas com as amostras filtradas a 0,45 m para os dois sistemas
observadas no microscpio ptico sob luz direta.

Figura 3.11. Imagens de Microcopia ptica obtidas para amostras em suspenso aquosa de
lipossomas (L) e quitossomas (Q) (1,00 mg/mL de quitosana) no filtrados e filtrados a 0,45
m (LF e QF). A barra representa expanso de 10 m para todas as imagens.

Tratando-se de um sistema sub-micromtrico, a definio de imagem das estruturas
muito baixa. Mesmo assim, foi possvel perceber duas diferenas importantes entre os
sistemas. A primeira refere-se ao uso da filtrao. Comparando as imagens das estruturas no
filtradas (Figura 3.11 L e Q) com as imagens das estruturas filtradas (Figura 3.11 LF e LQ),
fica evidenciado, mesmo a nvel microscpico, que a filtrao realmente produz um efeito
determinante na homogenizao estrutural das vesculas em suspenso. Enquanto que as
126
amostras no filtradas apresentam uma vasta diversidade de estruturas, as amostras filtradas
mostram uma infinidade de pequenos pontos sem grandes variaes de forma ou tamanho.
A segunda diferena pde ser percebida comparando as imagens de lipossomas
(Figura 3.11 L e LF) com as imagens de quitossomas (Figura 3.11 Q e QF), preparados com
a maior concentrao de quitosana (1,00 mg/mL). Independentemente da filtrao, parece
que no caso das amostras de quitossomas as estruturas se apresentam relativamente mais
aglomeradas, formando conjuntos de partculas que podem indicar a formao de agregados
de vesculas interagindo umas com as outras. Este comportamento sugere uma alterao de
carga superficial das vesculas com a presena do polmero, alm do aumento de interao de
superfcie entre as vesculas. Sendo assim, os dois fatores podem sugerir que o polmero
reveste a membrana das vesculas na parte externa, o que seria uma localizao da quitosana
na estrutura dos quitossomas. Atravs de Microcopia ptica de Luz Polarizada foi possvel
indentificar a textura mosaico caracterstica, com a presena de cruzes de Malta
14-16
para as
amostras de vesculas (Figura 3.12).

Figura 3.12. Imagem de Microcopia ptica de Luz Polarizada obtida para uma amostra de
quitossomas no filtrada (1,00 mg/mL de quitosana). A textura em mosaico com a presena
de cruz de Malta caracteriza a organizao do sistema como fase lamelar num lquido
isotrpico. A barra representa expanso de 0,1 m.
127
Neste caso no houve diferena entre lipossomas e quitossomas, to pouco entre
amostras filtradas ou no filtradas. A textura caracteriza a organizao lamelar dos sistemas
vesiculares (bicamadas fosfolipdicas) e apresentada aqui como confirmao microscpica
desta organizao.
A Microscopia Eletrnica de Transmisso permitiu uma anlise visual mais
detalhada dos lipossomas e dos quitossomas. Neste caso foram observadas as mesmas
amostras no filtradas bem como amostras ultrasonicadas durante 5 minutos sob energia
constante, sendo que os quitossomas tambm foram preparados com a maior concentrao de
quitosana (1,00 mg/mL).
A Figura 3.13 apresenta algumas imagens selecionadas de Microcopia Eletrnica de
Transmisso. Assim, foi visualmente constatado que todas as amostras apresentam estruturas
esfricas. Da mesma forma como indicado pela Microscopia ptica, a Microcopia Eletrnica
mostrou que as amostras que no passaram por nenhum tratamento aps a sua formao
(Figura 3.13a, b, c, d) apresentam uma variada gama de vesculas de formatos variados, alm
das esfricas. Estruturas multivesiculares foram observadas, bem como estruturas alongadas
e de formatos no esfricos. Portanto, este resultado pode ser usado como justificativa da alta
polidisperso de vesculas obtidas para estas amostras pelo Espalhamento de Luz, bem como
o reduzido valor da relao = R
g
/ R
h
, o qual foi inferior a 0,50.
Uma anlise global de tamanhos pela Microscopia Eletrnica no a forma mais
adequada de estudar este parmetro, pois a obteno de uma grande quantidade de imagens a
partir de muitas preparaes de amostras para observao seria necessria para a produo de
uma estatstica aceitvel. De qualquer forma, nas imagens observadas, foram encontradas
vesculas maiores com mais freqncia nas amostras de quitossomas do que nas amostras de
lipossomas, ainda considerando as amostras sem ps-tratamento. Assim, a polidisperso
tambm pareceu maior nos quitossomas do que nos lipossomas.
No que concerne presena de estruturas multilamelares, na Figura 3.13c
apresentada uma vescula multilamelar encontrada na amostra de quitossomas, confirmando
a sua presena. Porm, poucas vesculas deste tipo foram observadas, o que corrobora com a
avaliao de SAXS, onde foi estimada uma poro mxima de 20% de estruturas
multilamelares para a amostra de quitossomas.

128

Figura 3.13. Imagens de Microscopia Eletrnica de Transmisso obtidas para amostras de
lipossomas (a, b, e, f) e quitossomas (c, d, g, h) (1,00 mg/mL de quitosana) sem nenhum ps-
tratamento (a, b, c, d) e com aplicao de 5 minutos de ultrasonicao sob energia constante
(e, f, g, h). A barra representa expanso de 100 nm.

129
A localizao da quitosana no pde ser obtida pelas imagens de Microscopia. Um
diferencial observado nas amostras de quitossomas foi a freqncia de estruturas semelhantes
s duas vesculas esfricas maiores da Figura 3.13d, as quais apresentam uma membrana
escurecida. Essa membrana diferenciada pode, evidentemente, ser uma bi ou trilamela
onde as bicamadas esto totalmente sobrepostas. Mas a possibilidade de este tipo de estrutura
conter quitosana tambm deve ser cogitada. Pode ser observado que a vescula multilamelar
da Figura 3.13c tambm apresenta tal membrana.
Analisando agora as imagens e, f, g, h da Figura 3.13, que correspondem s
amostras ultrasonicadas, em comparao com as imagens a, b, c, d, fica evidenciada a grande
diferena de polidisperso e do tipo de estruturas entre os dois sistemas. Praticamente todas
as vesculas sonicadas observadas foram esfricas ou semi-esfricas e a distribuio de
tamanhos foi muito reduzida em comparao com as amostras no sonicadas, confirmando os
resultados de Espalhamento de Luz. Comparando as amostras de lipossomas com
quitossomas, a freqncia de estruturas multilamelares foi bem maior para quitossomas. Por
outro lado, quitossomas tambm apresentaram muitas estruturas multivesiculares. O
resultado pode sugerir que as condies de sonicao utilizadas podem ser suficientes para
reduzir a distribuio de tamanhos, como demonstrado pelos resultados de Espalhamento de
Luz, porm no totalmente eficientes para homogeneizar o tipo de estruturas presentes no
sistema. Assim, estruturas multivesiculares continuam presentes. A analogia pode parecer
desvantajosa, mesmo assim, deve ser lembrado que o que est sendo prioritariamente
estudado so os efeitos da quitosana sobre o sistema vesicular e, portanto, uma
homogeneizao excessiva do sistema poderia dificultar mais a interpretao destes efeitos.
Visualmente, as distribuies de tamanhos encontradas pela Microcopia Eletrnica
podem ser comparadas com as distribuies obtidas por Espalhamento de Luz para as
diferentes amostras. Por fim, a Microscopia Eletrnica provou que vesculas esfricas foram
obtidas atravs da evaporao em fase reversa com a adio de quitosana e que o sistema
continuou apresentando estruturas esfricas, porm de distribuio de tamanhos menor, aps
a ultrasonicao.

130
3.1.2. Transies de Fase

Conforme discutido na Sesso 1.2.3, as transies de fase das bicamadas
fosfolipdicas so uma caracterstica que qualifica propriedades fsico-qumicas e estruturais
dos sistemas vesiculares sob diferentes condies energticas. Lembrando que a presena de
compostos misturados aos fosfolipdios produz alteraes de organizao e de interaes
moleculares na bicamada, as transies de fase tambm sero afetadas por estas
diferenciaes geradas por outras molculas. Neste sentido, de se esperar mudanas
considerveis na transio de fase das vesculas com a presena de uma macromolcula
como a quitosana que provoca diversas mudanas estruturais, conforme discutido nas
Sesses anteriores. A transio de fase foi investigada atravs do aumento da temperatura
para lipossomas e quitossomas para a avaliao dos efeitos da quitosana sobre o sistema
submetido a um estado de transio metaestvel.

3.1.2.1. Espalhamento de Luz Esttico

O comportamento das bicamadas fosfolipdicas de lipossomas e quitossomas
submetidos ao aquecimento foi investigado atravs do Espalhamento de Luz Esttico.
Conforme descrito na literatura, o nmero mdio de ftons detectados por segundo
representativo de fenmenos macrocpicos emergentes de um sistema em suspenso. As
variaes de intensidade de luz espalhada so resultantes das modificaes das propriedades
pticas do material durante o decorrer de mudanas estruturais.
17
De fato, as transies de fase das bicamadas fosfolipdicas alteram as propriedades
pticas das vesculas em soluo, sendo que nas temperaturas de transio podem ocorrer
modificaes de difuso lateral, da espessura da bicamada, da organizao das cadeias
apolares, da permeabilidade da membrana, etc.
17,18
Essas modificaes tambm provocam
variaes superficiais nas vesculas, consequentemente a superfcie da membrana externa
pode oscilar com variaes espaciais das extremidades polares dos fosfolipdios, como
representado na Figura 3.14. Estas variaes superficiais refletem na intensidade de luz
espalhada.

131

Figura 3.14. Representao de uma poro da superfcie externa de vescula fosfolipdica
onde as extremidades polares conferem uma superfcie homognea em determinada fase 1 e
uma superfcie no homognea com as extremidades polares desalinhadas na fase 2. As fases
podem ser relacionadas com a intensidade de luz espalhada (I
S
) em funo da temperatura
(T), onde o ponto meia altura da curva corresponde temperatura de transio de fase do
sistema.
17

Na transio de fase as propriedades da membrana de vesculas fosfolipdicas
apresentam descontinuidades que esto relacionadas com a coexistncia de duas fases
lamelares na regio de transio, com a formao de microdomnios.
19
Considerando as
propriedades pticas peculiares de cada fase, a transio da fase 1 para a fase 2 (Figura 3.14)
envolve necessariamente um estgio intermedirio em que os microdomnios das duas fases
esto presentes. Esse estgio intermedirio representado pela inflexo da curva
representada na Figura 3.14. O ponto a meia altura da queda da curva corresponde, no eixo
horizontal, temperatura de transio de fase.
17
Michel e colaboradores obtiveram seqncias sigmoidais da variao de intensidade
de luz espalhada em funo da temperatura para alguns fosfolipdios. Desta forma foi
possvel determinar todas as transies de fase, ou seja, a sub-transio, a pr-transio e a
transio principal, sendo que cada temperatura de transio foi atribuda ao ponto mdio de
cada curva.
17
A metodologia foi aplicada na presente Tese no estudo das propriedades dos
quitossomas sob aquecimento em comparao com lipossomas nas mesmas condies. A
Figura 3.15 mostra a I
S
obtida em funo da temperatura para os dois sistemas.
fase 2
I
S
T
fase 1
o
132

S
) observada no ngulo de
utilizada (1,00 mg/mL) (b).

Para os lipossomas (Figura 3.15a) a I
S
foi significativamente mais reduzida entre 53
e 65 C. A queda de I
S
no totalmente abrupta, como pode ser encontrado na literatura para
alguns fosfolipdios.
17
Deve ser lembrado que o fosfolipdio utilizado na preparao das
vesculas, a fosfatidilcolina da lecitina de soja, apresenta uma pureza aproximada de 95%.
Assim, as impurezas esto influenciando o estado de transio proporcionando uma curva
mais extendida. Alm disso, como a prpria fosfatidilcolina apresenta alguma variao
30 40 50 60 70 80 90
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
a
I
S

(
1
0
3

k
c
t
s
/
s
)
T (C)
30 40 50 60 70 80 90
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
b
I
S

(
1
0
3

k
c
t
s
/
s
)
T (C)
133
quanto constituio das suas cadeias apolares, a produo da curva estendida totalmente
esperada. Na prtica, a transio de fase neste sistema governada pelo somatrio das
influncias das diferentes molculas, o que resulta num retardamento da transio efetiva, a
qual acaba produzindo um estado metaestvel mais prolongado do que teramos para um
fosfolipdio totalmente puro.
De qualquer forma, a temperatura de transio de fase de 57 C foi obtida pelo
ponto meia altura atravs da derivada primeira da curva para a amostra de lipossomas. Essa
temperatura prxima temperatura de transio de fase principal, de P para L, para a
molcula de DSPC (55,6 C),
20
principal componente da fosfatidilcolina da lecitina de soja
utilizada. As outras molculas presentes contribuem, portanto, no sentido de aumentar em
aproximadamente 1,4 C a temperatura de transio de fase principal da DSPC determinada
pelo Espalhamento de Luz Esttico. As temperaturas de sub-transio e pr-transio so
mais difceis de serem determinadas experimentalmente e os resultados no mostram dados
conclusivos para estas transies.
Uma pronunciada diferena do perfil da curva de transio foi encontrada para a
amostra de quitossomas preparada com a maior concentrao de quitosana utilizada, 1,00
mg/mL (Figura 3.15b). Neste caso, em vez de uma queda acentuada de I
S
, uma moderada e
gradativa reduo ocorreu ao longo de uma ampla faixa de temperatura, entre
aproximadamente 53 e 85 C. Esta faixa corresponde a um intervalo de mais de 30 C. A
determinao da temperatura correspondente meia altura da curva forneceu 64 C. O
resultado representa um aumento de 7 C em relao temperatura determinada para os
lipossomas.
Sabe-se que a presena de compostos misturados aos fosfolipdios confere
alteraes de organizao e de interaes moleculares na bicamada, conforme j constatamos
para os quitossomas. Determinados compostos podem proporcionar uma blindagem entre os
grupos polares reduzindo a transio de fase, enquanto que outros podem formar altas
energias de interao com os fosfolipdios promovendo um aumento na transio de fase.
O comportamento observado para os quitossomas sugere que o polmero atua de
forma a dissipar a energia fornecida ao sistema, que assim pode estar passando por uma
transio de fase extremamente moderada, com lenta transio dos microdomnios de uma
fase para outra. Pelos resultados encontrados, tambm pode ser cogitado que a quitosana
esteja mesmo previnindo o sistema de uma transio de fase completa, at a temperatura
estudada (87 C).
134
Com a presena de quitosana, parece que a desordem das bicamadas fosfolipdicas,
resultantes da mobilidade das molculas de fosfolipdios sob aquecimento, que produz a
reduao de I
S
, minimizada de alguma forma por uma compensao energtica ou
organizao molecular. Essa interpretao pode ser assumida se for considerada a formao
de estruturas mais rgidas com a presena da quitosana.
A presena da quitosana tambm pode levar a uma transio de fase no
homognea. Por exemplo, partes da estrutura podem sofrer a transio enquanto que outras
permanecem na fase anterior produzindo um sistema totalmente metaestvel e dependente da
energia fornecida. Assim, a quitosana concorre para a manuteno dos microdomnios na
superfcie da membrana.
Uma outra abordagem seria considerar que na suspenso existem vesculas com
quitosana na sua estrutura e vesculas sem quitosana, ambas misturadas. Porm, neste caso as
vesculas com quitosana poderiam estar passando pelos processos discutidos acima de
qualquer forma. Por conseguinte, o sistema como um todo estaria sendo modulado pelas
contribuies de vesculas sem quitosana, equivalentes aos lipossomas, e pelas alteraes
provocadas pelas vesculas com quitosana. Abordagem semelhante pode ser feita entre
estruturas unilamelares e multilamelares, respectivamente, misturadas na suspenso.
Considerando a localizao da quitosana na superfcie externa das vesculas, a
queda extremamente moderada da I
S
provavelmente est sendo delineada por esta
diferenciao estrutural. De qualquer maneira, essa reduo da I
S
ao longo de uma faixa de
aumento da temperatura significativamente extendida, deve ser reconhecida como uma
propriedade importante dos quitossomas.
A temperatura de 64 C, determinada atravs da metodologia proposta por Michel e
colaboradores,
17
deve ser considerada com cautela quanto ao seu significado como
temperatura de transio de fase. Embora a mesma possa representar um estado de transio
entre uma fase e outra, a presena da quitosana pode estar mascarando a quantidade de luz
espalhada pelas vesculas, principalmente assumindo que o polmero esteja tambm na
superfcie externa das estruturas. Certamente as propriedades pticas das vesculas contendo
quitosana so diferentes das dos lipossomas. Isso demonstrado pela I
S
relativamente maior
dos quitossomas, como pode ser obsevado comparando as Figuras 3.15a e b.
De qualquer forma, a temperatura de 64 C, mesmo que aparente, bem como a
atenuada queda de I
S
com o aumento da temperatura, caracterizam um sistema diferenciado,
135
onde as interaes entre fosfolipdios e cadeias polimricas devem ser efetivas. Essa
interao pode perfeitamente resultar no retardamento da transio de fase principal da
bicamada fosfolipdica das vesculas.

3.1.2.2. Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo

Uma das modificaes estruturais mais importantes das bicamadas fosfolipdicas
conseqente das transies de fase a variao da espessura da bicamada, a qual pode ser
estudada pela distncia de repetio d fornecida pelo Espalhamento de Raios-X a Baixo
ngulo (SAXS). Da mesma forma como nos estudos procedidos na temperatura ambiente
(20 C), o SAXS forneceu os perfis de espalhamento caractersticos relacionados com a
densidade eletrnica de cada amostra em funo do aumento da temperatura (Figura 3.16).
No incio da rampa de aquecimento foram obtidos perfis de espalhamento de
definio maior com os picos de Bragg na relao 1/2, com as caractersticas conforme
discutido na Sesso 3.1.1.2. Com o aumento da temperatura, os picos foram perdendo a
intensidade relativa. Especialmente para a amostra de lipossomas, essa perda de intensidade
foi drstica, sendo que acima de 59 C apenas um pequeno sinal pde ser detectado entre o
rudo e uma curva estendida com a ampliao do espectro (Figura 3.17e). A 63 C apenas a
curva estendida pde ser detectada e a mesma permaneceu at a ltima temperatura medida
(71 C). Este comportamento pode ser interpretado como uma transio de fase que ocorre
entre as temperturas de 57 e 59 C, onde a eliminao dos picos com o concomitante
aumento da curva estendida mostram uma reduo da densidade eletrnica espalhada, ou
seja, o espalhamento tornou-se totalmente incoerente evidenciando uma reduo na
organizao molecular.
21
Sendo que atravs do Espalhamento de Luz Esttico foi
determinada uma temperatura de transio de fase aproximada de 57 C para os lipossomas
nas mesmas condies de preparao (sem nenhum ps-tratamento), essa variao acentuada
do perfil de espalhamento em torno dessa mesma temperatura pode realmente ser a
comprovao de que a transio de fase principal ocorre bem prxima a 57 C.
Outra semelhana com os resultados de Espalhamento de Luz Esttico, a reduo
mais acentuada de I
S
constatada entre 53 e 65 C tambm pode ser comparada com a
diminuio mais pronunciada da intensidade dos picos de Bragg entre 51 e 63 C (Figura
3.16a).
136

Figura 3.16. Perfis de espalhamento de intensidade (I) em funo do vetor de onda (q)
obtidos por SAXS em diferentes temperaturas (C), conforme indicado, para amostras de
lipossomas (a) e quitossomas contendo a maior concentrao de quitosana utilizada (1,00
mg/mL) (b).

Em contrapartida, a amostra de quitossomas, mais uma vez, demonstrou resultados
diversos para os espectros de SAXS ao longo da rampa de aquecimento. Ambas as amostras
apresentaram perfis de espalhamento semelhantes nas temperaturas menores (Figura 3.16 e
Figura 3.17), com uma alta definio espectral. As diferenas entre a relao de reas entre o
pico e a curva no foram consideradas, j que as mesmas esto discutidas na Sesso 3.1.1.2.
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
a
35
37
39
41
45
47
49
51
53
55
57
59
61
63
66
I

(
u
.
a
.
)
q (
-1
)
71
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
b
31
35
37
39
41
43
45
47
49
53
57
61
65
69
75
81
I

(
u
.
a
.
)
q (
-1
)
137

Figura 3.17. Perfis de espalhamento de intensidade em funo do vetor de onda (q) obtidos
por SAXS em diferentes temperaturas, conforme indicado, para amostras de lipossomas (a, c,
e) e quitossomas contendo a maior concentrao de quitosana utilizada (1,00 mg/mL) (b, d,
f). As linhas contnuas mostram o ajuste com funes Lonrentzianas que evidenciam a
presena de picos e curvas. A flecha indica a presena de um ombro extendido ao lado do
primeiro pico para os quitossomas na temperatura de 75 C.

138
O que se torna relevante neste caso a considervel manuteno do perfil de
espalhamento, mesmo que sofrendo uma reduo atenuada de intensidade, ao longo de todo
processo de aquecimento da amostra de quitossomas. Os picos de Bragg puderam ser
observados at a temperatura de 81 C (Figura 3.16b). Um alargamento mais pronunciado do
primeiro pico foi observado na temperatura de 65 C (Figura 3.16b e Figura 3.17d). Essa
temperatura prxima temperatura determinada para a transio de fase aparente atravs
do Espalhamento de Luz Esttico, a 64 C. Alm disso, na temperatura de 75 C, um
pequeno ombro estendido se formou no lado direito do pico e o mesmo persistiu at a ltima
temperatura medida (81 C) (Figura 3.16 e Figura 3.17f). Este resultado pode indicar a
formao de uma fase hexagonal do tipo H
II
, onde as vesculas passam para um outro estgio
de organizao estrutural, mais complexo, sob influncia da energia trmica.
21
Essa
organizao consite em cilindros alongados com ncleo aquoso, formados apartir da
agregao e fuso de vesculas submetidas a uma condio extrema, como reduo
significativa da poro aquosa ou aquecimento elevado. O resultado sugere que parte das
vesculas esteja sofrendo esse processo de reorganizao estrutural sob influncia da alta
temperatura. O fenmeno esperado e tem sido descrito na literatura.
21-23
A presena de
quitosana no sistema pode estar favorecendo a formao desta fase, j que a mesma no pde
ser observada para os lipossomas.
Analisando os valores resultantes para as distncias de repetio d, na Figura 3.16
possvel perceber um contnuo deslocamento dos picos para valores menores de q conforme a
temperatura vai aumentando. Assim, os valores da d aumentam com a temperatura (Figura
3.18). Porm, para lipossomas, o aumento da d ocorre de forma relativamente mais acentuada
apartir de 55 C. Esse comportamento demonstra que realmente existe uma modificao
estrutural da bicamada em torno dessa temperatura. Para os quitossomas, um aumento maior
da d pode ser observado aps 61 C. Em torno de 75 C, onde foi observada a formao de
um ombro ao lado direito do primeiro pico, essa continuidade de aumento foi relativamente
reduzida.
Embora esses aumentos da d sejam discretos em relao temperatura imediata, os
mesmos no podem ser negligenciados ao longo de toda a rampa de aquecimento, levando
em considerao a preciso da tcnica de SAXS. O comportamento global da d para a
amostra de quitossomas poderia ser extrapolado para uma reta se for excludo o ltimo ponto
(acima de 75 C). Por outro lado, para a amostra de lipossomas, uma curva ascendente seria
mais adequada. Os resultados tambm mostram que a d menor, obtida para quitossomas em
139
relao lipossomas, na temperatura ambiente (20 C), no persiste quando a amostra
submetida ao aquecimento. Com a pequena quantidade de quitosana presente no sistema em
relao quantidade de molculas de fosfolipdios, a agitao molecular causada pelo
aumento da temperatura deve prevalecer sobre o efeito de reduo da d provocada pela
quitosana a 20 C.

Figura 3.18. Evoluo das distncias de repetio das bicamadas fosfolipdicas (d) obtidas
por SAXS para lipossomas () e quitossomas contendo a maior concentrao de quitosana
utilizada (1,00 mg/mL) () submetidos ao aquecimento.

Outra observao dos pontos da d dos quitossomas pode ser feita considerando os
patamares, por exemplo, em torno de 40 C e em torno de 55 C, onde houve uma pequena
estagnao no aumento da d. A segunda temperatura pode ser aproximadamente relacionada
com a temperatura de transio de fase da DSPC (55,6 C).
Analisando os dados de SAXS juntamente com os dados de Espalhamento de Luz
Esttico no grfico conjunto apresentado na Figura 3.19, com os valores da d normalizados
pelo maior valor de d em cada caso por razes de ajuste comparativo, possvel demonstrar
o efeito global da quitosana sobre o sistema submetido ao aquecimento, evidenciado pelas
duas tcnicas. Tanto a I
S
obtida pelo Espalhamento de Luz quanto a d obtida pelo SAXS,
mostram que os lipossomas sofrem modificaes mais acentuadas em torno da mesma faixa
20 30 40 50 60 70 80 90
6,4
6,5
6,6
6,7
6,8
6,9
7,0
7,1
7,2
7,3
7,4
7,5
d

(
n
m
)
T (C)
140
de temperatura, enquanto que quitossomas sofrem modificaes relativamente menos
pronunciadas durante a maior parte da rampa de aquecimento. Estes resultados colaboram
com a interpretao de que a quitosana submete o sistema a um estado de transio
moderado, dissipando a energia trmica fornecida ao sistema, conforme distutido na Sesso
3.1.2.1.

S
) () observada no ngulo de
utilizada (1,00 mg/mL) (b). Evoluo comparativa das distncias de repetio das bicamadas
fosfolipdicas (d) () obtidas por SAXS e normalizadas em relao ao maior valor
encontrado para lipossomas (a) e quitossomas (b) submetidos ao aquecimento.
30 40 50 60 70 80 90
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
a
d

(
n
m
)

/

7
,
0
4
I
S

(
1
0
3

k
c
t
s
/
s
)
T (C)
1,01
1,00
0,99
0,98
0,97
0,96
0,95
0,94
0,93

30 40 50 60 70 80 90
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,00
0,98
0,96
0,94
0,92
0,90
0,88
b
I
S

(
1
0
3

k
c
t
s
/
s
)
T (C)

d

(
n
m
)

/

7
,
3
8
141
Uma questo de complexidade maior consiste no significado fsico da d.
Lembrando que o parmetro engloba a espessura de uma bicamada fosfolipdica mais a
poro aquosa entre uma bicamada e outra, a sua variao est sujeita no somente
modificaes da organizao molecular da bicamada, mas tambm variao do volume
ocupado pela gua entre as bicamadas das estruturas com mais de uma bicamada.
Conforme descrito na Sesso 1.2.3, a d pode variar com as diferentes fases
lamelares, sendo que na transio da mesofase Lc para a L a mesma deve aumentar como
resultado da elongao das cadeias apolares dos fosfolipdios. Porm, na transio da L para
a L a espessura da bicamada deve ser reduzida como consequncia da inclinao das
cadeias. Entre a L e a P (pr-transio) a espessura pode diminuir ainda mais devido as
interpenetraes das cadeias apolares. Finalmente, entre as mesofases P e L (transio
principal) a bicamada volta a aumentar de espessura, resultado do alto desordenamento das
cadeias apolares.
Essas modificaes da espessura da bicamada influenciam a d diretamente,
considerando um volume aquoso constante entre uma bicamada e outra. Porm, o volume
aquoso pode variar, o que torna a avaliao da variao da d at certo ponto independente da
variao da espessura. Evidentemente com o aumento da temperatura a agitao molecular
das molculas de gua tambm aumenta. Consequentemente essas molculas de gua em
crescente agitao molecular iro ocupar um volume maior. Alm disso, a rea ocupada pelas
extremidades polares dos fosfolipdios tambm aumenta com a temperatura, principalmente
em conseqncia da maior mobilidade das cadeias apolares,
15
mas tambm devido ao maior
volume livre gerado pela agitao da gua. A Figura 3.18 evidencia algumas regies de
estagnao, ou mesmo de pequena reduo da d para os dois sistemas. Porm, a questo da
variao da d apresenta uma alta complexidade e por si s este parmetro no conclusivo
quanto espessura efetiva da bicamada fosfolipdica em cada mesofase.
A presena de gua entre bicamadas facilita as modificaes de curvatura das
bicamadas que podem ocorrer em determinadas transies de fase.
16
Admitindo um aumento
do volume aquoso por agitao molecular, possvel justificar o concomitante aumento da
flutuao das bicamadas que acaba produzindo picos de SAXS menos definidos com o
aumento da temperatura. Assim, a organizao lamelar das vesculas, especialmente em
estruturas multilamelares, continua existindo no sistema, embora a agitao molecular
causada pela temperatura provoque incoerncias no perfil de espalhamento, mostrado pela
reduo dos picos e aumento da curva extendida.
142
Comparando mais uma vez os espectros de SAXS para os dois sistemas (Figura
3.16), fica evidenciado que a quitosana atua na manuteno da organizao molecular das
bicamadas fosfolipdicas dos quitossomas submetidos ao aquecimento, j que picos de Bragg
podem ser observados at a temperatura de 81 C. Neste caso, uma menor desordem
molecular deve ser energeticamente favorecida, mesmo com o fornecimento crescente de
energia trmica. A quitosana deve atuar no sentido de reduzir a agitao molecular das
molculas de fosfatidilcolina e talvez tambm das molculas de gua incorporadas nas
vesculas.
Em outras palavras, os resultados demonstram que a quitosana fornece ao sistema
vesicular certa estabilidade fsica sob energia trmica. possvel submeter os quitossomas a
temperaturas bem mais elevadas do que os lipossomas, com a manuteno de algumas
caractersticas estruturais originais. A maior rididez da estrutura das vesculas contendo
quitosana pode mais uma vez ser sugerida.
Quanto transio de fase, considerando todo o conjunto de resultados e discusses
abordados nesta Sesso bem como na Sesso 3.1.2.1, parece coerente concluir que a
transio de fase principal das bicamadas fosfolipdicas foi deslocada para uma temperatura
maior com a presena de quitosana. Por outro lado, no possvel precisar exatamente essa
temperatura, sendo que os dados sugerem uma temperatura aparente em torno de 64 C.
Todos os resultados de Espalhamento de Luz Esttico e de SAXS mostram que em
relao aos lipossomas, os quitossomas apresentam um comportamento bem mais atenuado,
com variaes progressivas tambm, porm minimizadas. Ao longo do aumento da
temperatura, o processo apresentado pelos quitossomas certamente pode ser denominado
como um regime de transio de uma fase metaestvel.

3.1.3. Dinmica e Interaes Moleculares

A membrana fosfolipdica de lipossomas apresenta propriedades dinmicas
caractersticas da sua composio molecular e organizao estrutural. A presena da
quitosana, seja qual for a sua localizao na bicamada, produz alteraes no somente
estruturais, mas principalmente na estabilidade fsico-qumica. Essas alteraes levam o
sistema para um estado energtico diferenciado que pode apresentar menor ou maior
estabilidade termodinmica em determinadas condies ambientais. Os movimentos
143
moleculares dos fosfolipdios estaro limitados s conseqncias resultantes do tipo de
interao estabelecida com a quitosana. Considerando a vescula na sua totalidade, alm dos
parmetros estruturais, as condies inicas da superfcie externa tm um papel importante
no comportamento das partculas em suspenso frente a processos de interao entre elas,
que podem estimular ou inibir fenmenos de agregao e fuso, por exemplo. A difuso das
vesculas em suspenso tambm representa um parmetro indicativo de caractersticas fsicas
peculiares, sendo que a velocidade com que uma partcula se desloca depende de fatores
relacionados com a sua estrutura e composio. Por fim, o tipo de interao estabelecida
entre fosfolipdios e quitosana condiciona diversos comportamentos dinmicos a nvel
molecular e estrutural dos quitossomas. Propriedades dinmicas e de interao foram
estudadas para que se pudesse verificar a localizao da quitosana e inferir sobre o tipo de
interao predominante no sistema vesicular estabelecido entre fosfatidilcolina e quitosana.

3.1.3.1. Potencial Zeta

Os comportamentos eletrocinticos de partculas em suspenso constituem uma
propriedade dinmica das partculas como resposta ao de um campo eltrico aplicado. A
presena de cargas na superfcie externa e a sua magnitude influenciam os processos
dinmicos das estruturas na suspenso.
O potencial eletrocintico, ou Potencial Zeta, das partculas em difuso numa
suspenso de concentrao de eletrlito conhecida, sob ao de um campo eltrico constante,
foi determinado para lipossomas e quitossomas com variada concentrao polimrica. Sendo
que as vesculas apresentam faixas de tamanhos em torno de 200 nm de dimetro ou mais,
conforme determinado por Espalhamento de Luz, foi considerado o modelo de
Smoluchowski com a funo de Henry igual a 1,5.
24
Os resultados obtidos para as vesculas filtradas a 0,45 m em suspenso aquosa de
pH 5,8 e concentrao de 1 mM de NaCl so apresentados na Figura 3.20. Para lipossomas, o
Potencial Zeta foi de -42 3 mV. O valor negativo significa que as vesculas apresentam
superfcie externa com predominncia de cargas negativas, onde os ons Na
+
da suspenso
esto sendo atrados pela carga superficial negativa dos lipossomas. Lembrando que a
fosfatidilcolina constitui um fosfolipdio zwiterinico, ou seja, de carga efetiva igual a zero,
144
essa carga superficial negativa deve ser resultante da presena de cido fosfatdico na
composio da fosfatidilcolina utilizada na preparao das vesculas.
O valor de -42 3 mV significa que os lipossomas podem apresentar relativa
estabilidade coloidal em relao a processos de agregao. A carga superficial negativa
proporciona uma proteo inica s partculas e desta forma, quando uma partcula em
difuso encontra outra na suspenso, ambas se auto-repelem devido carga superficial.

Figura 3.20. Variao do Potencial Zeta () para lipossomas e quitossomas com crescente
concentrao polimrica para amostras filtradas a 0,45 m.

Para os quitossomas o Potencial Zeta variou entre -39 4 mV e -29 6 mV, com
potencial crescente com a concentrao de quitosana (Figura 3.20). A constante variao do
potencial para valores maiores mostra a influncia da quitosana na carga superficial das
vesculas. Como a quitosana representa um polieletrlito de carga positiva nos grupos amino
ionizados em suspenso aquosa, de se esperar uma interao eletrosttica entre as cadeias
positivamente ionizadas do polmero e a superfcie externa das vesculas com potencial
predominante negativo. A presena de quitosana na superfcie dos quitossomas aumenta a
densidade de cargas positivas em contra partida s cargas negativas. O resultado o
crescimento do Potencial Zeta efetivo, conforme observado.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-50
-48
-46
-44
-42
-40
-38
-36
-34
-32
-30
-28
-26
-24
-22
-20

(
m
V
)
quitosana (mg/mL)
145
O resultado de Potencial Zeta maior em relao ao valor encontrado para os
lipossomas, bem como o aumento contnuo com a concentrao de polmero sugere,
portanto, a presena efetiva de quitosana na superfcie externa dos quitossomas.
Os valores de Potencial Zeta para os quitossomas representam uma carga
moderadamente negativa que, como para os lipossomas, significa um parmetro que pode
proporcionar uma relativa estabilidade coloidal, evitando as interaes entre partculas de
mesma carga. Porm, medida que a concentrao da quitosana aumenta o valor efetivo
tambm cresce e com isso o poder contra processos de agregao pode diminuir. Um valor de
Potencial Zeta de -29 mV, encontrado para os quitossomas de maior concentrao de
quitosana, j pode ser considerado como um valor crtico, pois est acima do limite inferior
(-30 mV) definido como potencial de colides de estabilidade moderada,
24
ou seja, o valor
encontra-se dentro da faixa de -30 a +30 mV, onde os fenmenos de agregao so mais
freqentes.
Nos experimentos de Microsopia ptica foram observados aglomerados
micromtricos para a amostra de quitossomas de maior concentrao polimrica (Sesso
3.1.1.3). Assim, os resultados de Potencial Zeta tambm podem indicar que os quitossomas
esto sujeitos agregao em suspenso com uma probabilidade maior do que os lipossomas.

3.1.3.2. Recuperao de Fluorescncia Aps Foto-Branqueamento

A dinmica dos sistemas vesiculares foi estudada atravs da difuso das partculas
em suspenso com a finalidade de investigar a associao da quitosana s vesculas. A
Recuperao de Fluorescncia Aps Foto-Branqueamento (FRAP) permite a determinao
deste parmetro a partir da mobilidade de molculas fluorescentes presentes no sistema.
Lipossomas fluorescentes contendo 0,1% de NBDPC na sua composio e
quitossomas fluorescentes, preparados com a quitosana fluorescente (1,00 mg/mL),
submetidos ultrasonicao de 5 minutos para homogeneizao da distribuio de tamanhos
(Sesso 3.1.1.1) foram submetidos tcnica de FRAP. A quitosana fluorescente, dissolvida
na soluo tampo de acetato (pH 4,5), tambm foi avaliada.

146

Figura 3.21. Tempos de recuperao de fluorescncia caractersticos (
q
) em funo do
inverso do vetor de onda ao quadrado (q) obtidos por FRAP para lipossomas com 0,1% de
NBDPC () e quitossomas com quitosana fluorescente (1,00 mg/mL) () em suspenso
aquosa e sonicados por 5 minutos sob energia constante e quitosana fluorescente em soluo
tampo (7).

Os tempos de recuperao de fluorescncia obtidos em funo do vetor de onda
pela FRAP (Figura 3.21) esto relacionados com a dinmica difusional das partculas em
suspenso ou soluo. Os lipossomas apresentaram os maiores tempos, seguidos pelos
quitossomas e quitosana em soluo, respectivamente.
O perfil de recuperao mostra uma relativa linearidade individual para as trs
espcies. A quitosana apresenta tempos inferiores em relao aos quitossomas para todos os
vetores de onda. Esse resultado evidencia que na amostra de quitossomas no existe polmero
livre na soluo, j que nenhum tempo de recuperao caracterstico do polmero foi
identificado na amostra. Sendo assim, a quitosana adicionada na formao destas vesculas
est totalmente associada estrutura das mesmas. Portanto, pode-se concluir tambm que o
processo de ultrasonicao, aplicado para homogeneizao de tamanhos das estruturas, no
leva perda de quitosana das vesculas mesmo com a ao de uma energia de relativa
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
q

(
s
-
1
)
1/q
2
(10
-10
m
2
)
147
intensidade. O resultado sugere que o polmero est fortemente ligado estrutura das
vesculas, o que torna a interao inica mais provvel do que foras de van der Waals,
considerando a existncia de polmero na superfcie externa das estruturas, conforme
observado pelos resultados de Potencial Zeta.
A comparao dos tempos de recuperao entre quitossomas e lipossomas tambm
sugere comportamentos diferenciados para as duas espcies. Porm, neste caso as diferenas
no so muito pronunciadas, o que mostra uma proximidade das velocidades de difuso das
duas vesculas em suspenso, bem como a semelhana na distribuio de tamanhos. De
qualquer forma, a extrapolao dos pontos mostra duas espcies distintas com seus
respectivos tempos de recuperao caractersticos.
A partir da extrapolao dos dados da Figura 3.21, foram obtidos os coeficientes de
difuso de cada amostra. Os resultados so apresentados na Tabela 3.5.

Tabela 3.5. Valores obtidos para os coeficientes de difuso (D) para as diferentes amostras
fluorescentes estudadas por FRAP e raios hidrodinmicos aparentes (R
h
) para vesculas no
fluorescentes (mdia distribuio) e quitosana no fluorescente obtidos por Espalhamento
de Luz Dinmico.

Amostra

D

(10
-7
cm
2
s
-1
)
R
h

(nm)
Lipossomas 1,52 0,05 65 15
Quitossomas 1,76 0,04 55 10
Quitosana 3,52 0,50 10 1

Os coeficientes de difuso determinados pela FRAP mostram que quitossomas
apresentam velocidade mdia de difuso 14% maior do que lipossomas. Evidentemente esta
maior velocidade tambm resultante do menor tamanho mdio e distribuio de tamanhos
encontrados para quitossomas ultrasonicados, como pode ser comparado na Tabela 3.5. A
quitosana em soluo apresenta a difuso maior pelo seu reduzido R
h
.
Em suma, os resultados de FRAP mostram que a quitosana est realmente presente
na estrutura das vesculas, considerando que as mesmas apresentam fluorescncia efetiva
detectada pela tcnica, bem como tempos de recuperao de fluorescncia caractersticos que
148
resultam numa velocidade de difuso diferenciada. Quitosana livre no faz parte do sistema
formado pelos quitossomas, o que prova que mesmo a ultrasonicao das vesculas no
resulta em perda polimrica. Assim, uma grande estabilizao estrutural pela alta energia de
interao entre quitosana e fosfatidilcolina sugerida.

3.1.3.3. Ressonncia Magntica Nuclear de Fsforo

A estruturao de lipossomas e quitossomas bem como as interaes entre os
fosfolipdios e a quitosana tambm foram estudadas pela RMN de
31
P. A tcnica representa
um mtodo adequado para que se possa acessar o ambiente eletrnico do tomo de fsforo.
O aspecto de maior interesse nos estudos de RMN da presente Tese consiste na
avaliao das interaes entre a extremidade polar dos fosfolipdios, onde encontra-se o
grupo fosfato, e a quitosana. Montenez e colaboradores, por exemplo, estudaram a interao
entre os grupos amina protonados da azitromicina com o grupo fosfato de fosfolipdios em
lipossomas e alteraes na mobilidade molecular dos fosfolipdios foram caracterizadas.
25
Considerando os grupos amino positivamente ionizados das cadeias do
polissacardeo, espera-se que as interaes da quitosana com a regio polar dos fosfolipdios
proporcionem alteraes na mobilidade do grupo fosfato, negativamente ionizado. A Figura
3.22 mostra os espectros de RMN de
31
P para lipossomas e quitossomas preparados com a
maior concentrao de quitosana (1,00 mg/mL), para quatro temperaturas diferentes.
Comparando primeiramente os espectros obtidos para a temperatura ambiente (25
C), os resultados evidenciam uma significativa diferena na ressonncia do
31
P entre
lipossomas e quitossomas. Os perfis de ressonncia so caractersticos de sistemas lamelares,
apresentando o pico isotrpico (
) em campo alto e a curva anisotrpica de intensidade

menor (
II
) em campo baixo. Porm, um pico isotrpico distinto est presente em torno de 0
ppm. Para os lipossomas o mesmo apresenta alta intensidade em relao ao pico
caracterstico (
). Por outro lado, para quitossomas a sua intensidade consideravelmente

reduzida em relao ao pico de referncia.
O pico isotrpico a 0 ppm corresponde a uma ressonncia distinta do
31
P, resultado
de uma mobilidade diferenciada do grupo fosfato. Neste caso existe um tempo de relaxao
menor que sugere um novo ambiente eletrnico para o grupo fosfato. A sua presena pode
149
ser interpretada considerando pelo menos dois aspectos dos sistemas: tamanho ou forma de
partculas e interaes moleculares.

Figura 3.22. Espectros de RMN de
31
P obtidos para lipossomas (coluna esquerda) e
quitossomas preparados com 1,00 mg/mL de quitosana (coluna direita) em diferentes
temperaturas conforme indicado. Os deslocamentos qumicos perpendicular (
) e paralelo
(
II
) so indicados nos espectros superiores.
150
Conforme introduzido na Sesso 2.8, o padro de picos no espectro de RMN de
31
P
pode ser relacionado com os tamanhos de partculas fosfolipdicas.
26
Burnell e colaboradores
mostraram que lipossomas com dimetros inferiores a 100 nm apresentam um pico de
ressonncia centrado a 0 ppm com reduzida largura meia altura de 1,5 ppm, resultante da
rpida dinmica das partculas.
27
A alta curvatura da membrana de lipossomas de tamanhos
reduzidos fornece um volume espacial maior para a extremidade polar, principalmente da
camada fosfolipdica externa dos lipossomas. Assim, a mobilidade rotacional do grupo
fosfato elevada, o que resulta num pico de alta definio e intensidade no espectro de
RMN. A curvatura da camada fosfolipdica interna dos lipossomas no restringe o volume
espacial do grupo fosfato (que neste caso estaria sendo reduzido), pois a mesma
compensada pela reduo do nmero de fosfolipdios em relao camada externa, para
propiciar a alta curvatura. Para lipossomas unilamelares pequenos a razo entre molculas de
fosfolipdios contidas no interior e no exterior da bicamada de aproximadamente 1/2.
28
A difuso rotacional das vesculas e a difuso lateral dos fosfolipdios dentro da
bicamada fosfolipdica, como discutido na Sesso 1.2.3, so os principais fatores influentes
na mobilidade do grupo fosfato da extremidade polar.
27
Evidentemente essas difuses so
mais expressivas em estruturas menores.
Com o aumento do tamanho dos lipossomas a curvatura da membrana diminui, a
proporo de molculas entre camada interna e externa da bicamada mais equilibrada e
consequentemente o empacotamento das molculas torna-se mais organizado, ao mesmo
tempo em que o volume espacial das mesmas reduzido. Assim, a mobilidade do grupo
fosfato tambm reduzida o que resulta num espectro de extendido . Para lipossomas com
dimetro de 500 nm um valor de de 25 ppm foi determinado por Burnell e
colaboradores.
27
Quanto maior o dimetro das estruturas, maior ser o .
26
Lembrando que as amostras analisadas por RMN de
31
P no foram submetidas a
nenhum ps-tratamento, apresentando assim uma larga distribuio de tamanhos de
partculas (Sesso 3.1.1.1), bem como a presena de estruturas no esfricas (Sesso 3.1.1.3),
o pico isotrpico em 0 ppm pode ser relacionado com a maior liberdade rotacional do grupo
fosfato. Conforme discutido acima, essa liberdade rotacional resultante do maior volume
espacial proporcionado regio polar dos fosfolipdios devido alta curvatura da bicamada
das partculas menores e das partculas no esfricas. Esse resultado pode ser comparado, por
exemplo, com os estudos de Toraya e colaboradores, que observaram uma transio entre
151
lipossomas esfricos e alongados com o surgimento de um pico isotrpico de alta intensidade
na RMN de
31
P.
29
Para os sistemas estudados aqui, o pico isotrpico no atinge uma intensidade muito
elevada, j que a presena de estruturas esfricas de dimetros acima de 100 nm predomina
tanto para os lipossomas como para os quitossomas. Contudo, os resultados mostram que,
para os lipossomas, a intensidade do pico significativamente maior do que para os
quitossomas. O fato sugere, portanto, uma proporo maior de estruturas de dimetros
reduzidos e estruturas no esfricas para os lipossomas.
Por outro lado, as interaes moleculares entre fosfolipdios e quitosana tambm
devem ser consideradas na avaliao dos espectros. Sendo que o pico isotrpico representa
uma liberdade espacial maior para o grupo fosfato, o seu decrscimo, por conseguinte,
significa uma reduo nesta referida liberdade espacial. Assim, o resultado sugere que, com a
presena de quitosana, a liberdade espacial do grupo fosfato menor. Portanto, o ambiente
do fsforo influenciado pela quitosana o que pode sugerir interaes moleculares efetivas
entre quitosana e o grupo fosfato da regio polar dos fosfolipdios. Timoszyk e colaboradores
relacionaram o aumento de um pico isotrpico com uma maior fluidez da membrana de
lipossomas.
30
Nesse sentido, a quitosana estaria reduzindo a fluidez da membrana e
produzindo estruturas mais rgidas conforme observado tambm por SAXS.
Aps aquecimento, os sistemas tambm apresentam um comportamento
diferenciado. Para lipossomas as intensidades do pico isotrpico a 0 ppm e da curva
anisotrpica foram reduzidas a 40 C. Na temperatura de 50 C no foi observada nenhuma
alterao pronunciada. Porm, na temperatura de 60 C o pico isotrpico a 0 ppm diminuiu
significativamente.
J para quitossomas, na temperatura de 40 C apenas a intensidade da curva
anisotrpica foi reduzida. Em seguida, o sistema mostra-se praticamente inalterado sob o
aumento da temperatura, com a manuteno dos dois picos isotrpicos de menor e maior
intensidade a 50 e 60 C.
Conforme discutido anteriormente, o aumento da temperatura reduz o deslocamento
qumico de anisotropia . A Figura 3.23 mostra os resultados para o em funo do
aumento da temperatura para os dois sistemas.

152

Figura 3.23. Variao do deslocamento qumico de anisotropia () obtido por RMN de
31
P
em funo da temperatura (T) para lipossomas () e quitossomas (). O desvio mximo do
de 2 ppm para todos os pontos.

Uma significativa queda no valor de foi observada tanto para lipossomas como
para quitossomas com o aumento da temperatura de 25 para 40 C. Essa reduo do
mostra o crescimento da mobilidade rotacional do grupo fosfato com o aumento da energia
trmica para os dois sistemas Aps, o subseqente aumento de temperatura no provocou
mais qualquer alterao considervel de at 60 C.
Deve ser lembrado que entre 50 e 60 C deve ocorrer a transio de fase de gel para
cristal lquido no sistema formado pelos lipossomas (Sesso 3.1.2.1). Conforme descrito na
literatura, normalmente ocorre uma significativa reduo do valor de na temperatura
dessa transio de fase. Porm, esse comportamento no consiste numa regra estabelecida,
sendo que muitos trabalhos tambm observam a ausncia da reduo do na temperatura
de transio de fase de fosfolipdios formadores de lipossomas.
31
De fato, nos sistemas aqui
estudados, nenhuma grande variao desse parmetro foi observada entre 50 e 60 C e o
valor de permaneceu praticamente constante nestas duas temperaturas.
O que pode ser observado entre os espectros de 50 e 60 C de lipossomas a
reduo da intensidade do pico isotrpico, relacionado com a maior mobilidade espacial do
grupo fosfato. Assim, essa reduo, mais significativa entre 25 e 40 C, culmina com a
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34

(
p
p
m
)
T (C)
153
eliminao quase total dessa ressonncia peculiar a 60 C. O fato pode estar relacionado
tanto com a transio de fase como com a fuso de partculas de estabilidade estrutural
menor com o aumento da temperatura. A curvatura acentuada da membrana de lipossomas de
reduzido dimetro ou de formas no esfricas, representa uma condio geomtrica
desfavorvel em nvel de estabilidade estrutural especialmente numa situao de elevada
agitao molecular, como ocorre com o aumento da temperatura. Assim, processos de fuso
dessas vesculas de baixa estabilidade tm sido observadados em funo da temperatura.
32,33

Neste caso, os lipossomas estariam fundindo e formando estruturas onde a liberdade espacial
do grupo fosfato menor. Consequentemente, o pico isotrpico em torno de 0 pmm
reduzido.
Os valores mdios de foram maiores para quitossomas em todas as
temperaturas, o que poderia reforar a idia de menor mobilidade espacial do grupo fosfato
com a presena do polmero. Porm, a diferena no muito significativa considerando que
existe uma variao de at 2 ppm na determinao deste parmetro.
O que fica bastante evidenciado nos espectros de RMN de
31
P a manuteno
praticamente inalterada do pico isotrpico em torno de 0 ppm para os quitossomas entre 25 e
60 C. Esse resultado pode sugerir ausncia de processos de fuso vesicular, ou seja, as
estruturas permanecem imunes aos processos de agregao trmica. Assim, a quitosana
proporciona estruturas termodinamicamente mais estveis.
Do ponto de vista das interaes moleculares, a ressonncia peculiar do
31
P
representada pelo referido pico isotrpico permanece, portanto, pouco influenciada pela
energia trmica, o que pode ser o resultado das interaes entre quitosana e regio polar dos
fosfolipdios. Como observado nos estudos de transio de fase (Sesso 3.1.2), os
quitossomas mostram-se efetivamente menos influenciados pelo aumento da temperatura do
que os lipossomas. Os resultados de RMN de
31
P comprovam tambm esses resultados.
De fato, a quitosana parece modular a ressonncia do
31
P. Mesmo com o aumento
da mobilidade espacial do grupo fosfato entre 25 e 40 C, mostrada pela significativa reduo
do , a mobilidade do grupo fosfato representada pelo pico isotrpico em torno de 0 ppm,
no est sendo afetada pela energia trmica, o que significa que a quitosana est blindando o
fosfato de forma constante. A energia trmica no parece afetar essa blindagem oferecida
pela quitosana, o que refora a discusso a respeito da dissipao da energia trmica da
Sesso 3.1.2, proporcionada pela presena do polissacardeo.
154
Em suma, pode-se concluir que a quitosana reduz efetivamente na temperatura
ambiente (25 C) a mobilidade do grupo fosfato. O mesmo torna-se blindado de tal forma
que o aumento da temperatura at 60 C no altera significativamente as suas propriedades
de ressonncia detectveis pela RMN de
31
P. Os resultados mostram uma interao molecular
entre a quitosana e o grupo fosfato da extremidade polar dos fosfolipdios nos quitossomas.
Considerando igualmente os resultados de Potencial Zeta onde foi observada uma
constante alterao do potencial superficial das estruturas, concomitante com o aumento da
concentrao de quitosana, bem como os tempos de recuperao de fluorescncia
caractersticos obtidos por FRAP, que forneceram uma velocidade de difuso diferenciada,
provando que no existe quitosana livre no sistema mesmo aps a ultrasonicao, juntamente
com a alterao do perfil de ressonncia do
31
P, torna-se bastante razovel sugerir a interao
eletrosttica entre os grupos amino positivamente ionizados da quitosana e o grupo fosfato de
carga negativa da fosfatidilcolina como a interao predominante entre as duas entidades.
Portanto, os estudos dinmicos e de interao mostram que a presena da quitosana no
sistema vesicular representa uma camada polimrica nas regies polares das estruturas. A
camada influencia as propriedades do sistema como carga superficial, difuso, liberdade
espacial molecular, fluidez da membrana e estabilidade termodinmica. Essas propriedades
so diferenciadas no sistema compsito formado pelos quitossomas.

3.2. Lipossomas Gigantes

Lipossomas Gigantes, tambm conhecidos como vesculas gigantes, foram
investigados na presente Tese com o objetivo de avaliar a presena e a localizao da
quitosana nas estruturas micromtricas. A bicamada fosfolipdica semelhante em qualquer
lipossoma, sendo que a mesma apresenta apenas alguns nanmetros de espessura. No
entanto, lipossomas gigantes permitem a observao microscpica direta das propriedades
dinmicas da membrana atravs de Microscopia ptica. As modificaes causadas pela
variao de condies fsico-qumicas do meio e a presena de diferentes molculas na sua
composio, podem ser estudadas. Atravs da Microscopia ptica de Fluorescncia tambm
possvel identificar espcies especficas que contenham marcadores fluorescentes e assim,
seu comportamento frente membrana das vesculas pode ser monitorado.
155
A formao de lipossomas gigantes contendo quitosana foi desenvolvida pela
primeira vez na presente Tese. Por meio de anlises pticas quantitativas, a localizao do
polmero pde ser visualmente e quantitativamente determinada, bem como a estabilidade
estrutural avaliada. A produo bem sucedida de quitossomas gigantes estveis sugere forte
interao molecular entre os fosfolipdios e a quitosana.

3.2.1. Avaliao da Eletroformao a partir da Fase Reversa

A modificao da Eletroformao clssica para a produo de vesculas gigantes foi
procedida para a produo dos quitossomas gigantes na presente Tese. A observao por
Microscopia ptica da clula de formao das vesculas contendo quitosana em comparao
com a clula em que foi feita a eletroformao tradicional, sem polmero, no mostrou
diferenas microscpicas entre os dois processos.
Como pode ser observado na Figura 3.24, tanto na clula de eletroformao onde
foi efetuado o procedimento descrito por Angelova e colaboradores
34
(Figura 3.24a) quanto
na clula em que foi aplicada a emulso contendo a quitosana (Figura 3.24b), vesculas
gigantes foram produzidas sob iguais condies de tempo, tenso aplicada, temperatura e
presso osmtica da soluo de sacarose.
a b

Figura 3.24. Imagens de Microscopia ptica do interior das clulas de eletroformao na
produo de vesculas gigantes pelo mtodo tradicional (a) e pelo mtodo modificado com a
adio de quitosana (b) aps trs horas sob ao de campo eltrico constante (1,5 V e 10 Hz)
em soluo de sacarose (0,095 M) na temperatura ambiente (20 C). A barra expande 10
micrmetros.
156
Em ambos os casos as vesculas gigantes apresentaram um crescimento equivalente
em funo do tempo, ou seja, nenhuma das clulas mostrou uma formao de estruturas
significativamente mais acelerada em relao outra. De forma semelhante, o rendimento de
produo de vesculas tambm pareceu qualitativamente comparvel nos dois processos,
embora nenhuma anlise quantitativa tenha sido feita nesse sentido.
Nos dois processos, vesculas gigantes com dimetros variando entre alguns
micrmetros e algumas centenas de micrmetros foram obtidas. As mesmas puderam ser
igualmente transferidas para clulas de observao em soluo de glicose de presso
osmtica conhecida para a sua avaliao de forma isolada (Figura 3.25).

a b

Figura 3.25. Imagens de Microscopia ptica de Contraste de Fase de lipossomas gigantes (a)
e quitossomas gigantes (b) dispersos em soluo de glicose (0,099 M). A barra expande 20
micrmetros.

Variveis pertinentes tambm foram avaliadas. A preparao a partir da fase reversa
foi procedida sem adio de polmero, ou seja, a emulso precursora foi preparada apenas
com a adio da soluo tampo de acetato (pH 4,5). Os resultados foram comparveis aos
acima descritos.
Os resultados obtidos evidenciam que a modificao da Eletroformao pela
introduo da emulso contendo micelas reversas formadas pela soluo tampo contendo ou
no quitosana e pelas molculas de DOPC, produz vesculas gigantes comparveis ao
processo original. Apesar do uso de uma suspenso aquosa, que poderia alterar
significativamente o processo de organizao molecular das bicamadas de fosfolipdio que
157
formam a membrana das vesculas, reduzindo ou mesmo impedindo o crescimento das
estruturas, foi demonstrado que a modificao no prejudica a produo de lipossomas
gigantes. Mesmo com a presena de quitosana na emulso precursora, a formao de
vesculas no foi prejudicada.
No que concerne poro aquosa presente na primeira etapa, pode-se considerar
que aps a secagem da emulso depositada sobre a lmina condutora em dessecador sob
vcuo, poucas molculas de gua devem restar no sistema. Possivelmente um grau de
hidratao mnimo da DOPC deve-se manter incorporado, j que as molculas de
fosfolipdios so higroscpicas. De qualquer forma, a deposio na lmina de eletroformao
de uma suspenso de micelas, em substituio a uma soluo de fosfolipdio, poderia ser
prejudicial subseqente Eletroformao. A deposio da emulso contendo fase aquosa
deve proporcionar a formao de um filme de fosfolipdios, aps a secagem, onde as
molculas esto distribudas de forma menos homognea do que na situao onde no existe
fase aquosa. Mesmo assim, tanto a presena de molculas de gua quanto essa diferenciao
organizacional do filme, no prejudicou a formao das vesculas.
Mais alm, a presena de quitosana deve ser encarada como um fator ainda mais
relevante do que a gua. A macromolcula poderia perfeitamente impedir a auto-associao
das molculas de DOPC por razes das mais diversas, como interaes entre as cadeias
polimricas com a regio apolar dos fosfolipdios, que poderia prevenir a formao da
bicamada das vesculas. A simples presena da quitosana significa que o sistema est merc
das conseqncias termodinmicas diferenciadas, resultantes quando da ao do campo
eltrico aplicado na clula. A agitao molecular do polmero, a dissipao da energia ao
longo das suas cadeias, impedimentos estricos gerados pelo seu volume espacial e tipos de
interao e organizao so variveis de significativa relevncia.
Porm, nenhuma das alteraes provocadas no sistema pela presena da quitosana
parece ter prejudicado o processo de formao das vesculas gigantes. Portanto, pode-se
concluir que a modificao da Eletroformao pela introduo da emulso precursora foi
bem sucedida. A mesma capaz de produzir vesculas gigantes unilamelares, esfricas, em
quantidades considerveis e adequadas para pesquisas cientficas desenvolvidas com tais
estruturas.
Os resultados do processo sugerem inclusive que outras molculas hidroflicas, no
apenas polmeros, mas tambm frmacos ou protenas, possam ser adicionadas na formao
158
da emulso a fim de proporcionar a produo de lipossomas gigantes diferenciados,
designados para uma larga gama de pesquisas relacionadas.

3.2.2. Localizao da Quitosana nos Lipossomas Gigantes

A modificao da Eletroformao com a utilizao de uma emulso precursora
possibilitou a produo de lipossomas gigantes da mesma forma que a Eletroformao
tradicional, a partir de um filme de fosfolipdios. Por outro lado, a presena da quitosana na
emulso precursora depositada na lmina condutora, pode no garantir a sua presena efetiva
nas vesculas, aps a completa estruturao das mesmas.
As molculas de DOPC podem se auto-associar nas bicamadas que formam a
membrana dos lipossomas, sob ao da energia eltrica fornecida clula. Esse processo de
auto-associao pode perfeitamente ocorrer independente da presena da quitosana se
exitistirem condies energticas que desfavoream qualquer interao que permita levar
formao das vesculas contendo o polmero na sua estrutura.
A presena da quitosana poderia, portanto, prejudicar a formao das vesculas
gigantes e consequentemente as vesculas observadas no conteriam o polmero em sua
estrutura. Assim as vesculas formadas pela Eletroformao modificada seriam idnticas
quanto sua composio s vesculas obtidas pelo processo convencional.
Uma outra possibilidade seria a formao de vesculas contendo quitosana
encapsulada no ncleo aquoso das estruturas. Neste caso teramos a ausncia de interao
positiva entre as molculas de DOPC e as cadeias da quitosana e o polmero poderia estar
disperso em forma de agregados, j que as condies de pH das solues de sacarose e
glicose no favorecem a sua dissoluo. Agregados de quitosana tambm poderiam ser
encontrados fora das vesculas, ou seja, nas prprias solues de formao e disperso das
vesculas.
A grande vantagem da vescula gigante o seu tamanho micromtrico, o qual
permite a observao direta no microscpio ptico. Nenhum procedimento especial de
preparao necessrio para essa observao, sendo que as estruturas podem ser vistas
diretamente na clula de eletroformao, dispersas na soluo de origem (sacarose) ou em
soluo de caractersticas semelhantes (glicose).
159
A observao microscpica permite, portanto, a anlise direta da estrutura das
vesculas, bem como a verificao de caractersticas da membrana. No caso da avaliao da
presena de molculas estranhas na estrutura das vesculas ou mesmo no meio de disperso,
essa localizao pode ser facilmente procedida se as molculas em questo apresentarem
marcadores de fluorescncia. Assim, atravs da Microcopia ptica de Fluorescncia, essas
molculas podem ser especificamente observadas no sistema.
Com a inteno de localizar a quitosana no sistema de vesculas gigantes formadas
pela modificao da Eletroformao, foi utilizada quitosana fluorescente na emulso
precursora. Aps a formao das vesculas, as mesmas foram normalmente isoladas na clula
de observao e analisadas no microscpio ptico, primeiramente com luz direta, em
contraste de fase, e logo aps com fonte luminosa para a excitao da fluorescncia (Figura
3.26).

a b

Figura 3.26. Imagens de Microscopia ptica de Contraste de Fase (a) e de Fluorescncia (b)
para um quitossoma gigante contendo quitosana fluorescente. A barra expande 10
micrmetros.

Como evidenciado na Figura 3.26, a mesma vescula preparada com adio de
quitosana e observada sob luz direta apresentou-se totalmente fluorescente quando observada
no modo de fluorescncia. Esse resultado mostra que a quitosana encontra-se incorporada nas
vesculas gigantes, j que a mesma constitui a espcie fluorescente do sistema. Sendo assim,
quitossomas gigantes foram efetivamente obtidos pela modificao da Eletroformao.
160
Dentro dos limites de observao da Microcopia ptica, boa parte das vesculas
obtidas no apresentaram poros ou defeitos na membrana, como o caso da vescula
apresentada na Figura 3.26. Da mesma forma como no processo de eletroformao
convencional, uma poro de estruturas mal formadas foi produzida, porm, apenas as
vesculas sem defeitos aparentes foram analisadas, conforme deve ser procedido nos estudos
de lipossomas gigantes.
A distribuio da fluorescncia nas vesculas foi homognea na maioria das
estruturas, como mostrado na Figura 3.26b. Nenhum foco de fluorescncia livre foi
encontrado nas solues de glicose contendo as vesculas. Isso demonstra que a soluo
realmente no representa um meio favorvel dissoluo do polmero, j que a mesma
possui um pH de 5,8.
Em algumas preparaes, uma poro das vesculas apresentou a mesma
fluorescncia bem distribuda e mais alguns pequenos pontos de fluorescncia muito intensa
na membrana. O fato sugere que nesta situao houve a formao de alguns agregados
polimricos que se apresentaram interagindo com a membrana das estruturas. Porm, como
essa situao no foi reprodutivel em todas as preparaes, independente das concentraes
polimricas utilizadas, pode-se considerar que a formao de agregados aleatria dentro das
condies de preparao procedidas. A formao de agregados , portanto, uma imperfeio
no processo de eletroformao modificado.
Sendo assim, seguindo-se ento a recomendao de anlise de vesculas bem
formadas, as imagens individuais de cada vescula obtidas em contraste de fase e
fluorescncia, foram comparadas conforme apresentado na Figura 3.27. A Figura 3.27c
mostra uma co-localizao de imagens, ou seja, a vescula em contraste de fase pode ser
sobreposta com a vescula em fluorescncia. A anlise, ao longo da linha equatorial (Figura
3.27c), do perfil de fluorescncia na imagem fluorescente (grfico superior) e do perfil de
distribuio da intensidade de cinza na imagem de contraste de fase (grfico inferior),
fornece picos de alta intensidade exatamente na mesma regio: nos pontos correspondentes
membrana da vescula. Essa co-localizao da intensidade mxima de fluorescncia com a
membrana mostra que a localizao da quitosana predominantemente junto membrana
nos quitossomas gigantes. Sendo assim, no foi encontrado polmero livre ou encapsulado no
interior das vesculas.
O perfil de intensidade de fluorescncia apresentado na Figura 3.27 (grfico
superior) simtrico em relao ao centro da vescula. esquerda do grfico observa-se a
161
fluorescncia do fundo, que apresenta rudos relacionados com defeitos de pixels da imagem
coletada. Um pico de fluorescncia aparece na superfcie da vescula. Em seguida, sobre a
regio interna, a intensidade decresce novamente at um valor mnimo, porm maior do que a
intensidade de fundo.

Figura 3.27. Imagem de Microscopia ptica de Fluorescncia (a) e de Microscopia ptica de
Contraste de Fase (b) de um quitossoma gigante fluorescente em soluo de glicose (0,099
M). A sobreposio das imagens (c) mostra a co-localizao da quitosana fluorescente com a
membrana da estrutura pela comparao do perfil de intensidade de fluorescncia (grfico
superior) com o perfil da variao de intensidade de cinza (grfico inferior) de uma linha
equatorial sobre ambas as imagens. Nos grficos, em y medida a intensidade de cinza e em
x o nmero de pixels. A barra expande 10 micrmetros.

De forma comparativa, so apresentadas na Figura 3.28 imagens de fluorescncia
de vesculas gigantes sem quitosana. Na Figura 3.28a apresentada uma vescula formada
162
com a adio de NBDPC, o fosfolipdio fluorescente que necessariamente est localizado
somente na membrana da estrutura. Pode-se observar que o perfil de distribuio de
fluorescncia sobre o equador da vescula bastante semelhante ao apresentado pelo
quitossoma gigante fluorescente (Figura 3.27).

Figura 3.28. Imagens de Microscopia ptica de Fluorescncia de uma vescula gigante
contendo 1% de NBDPC na membrana (a) e de uma vescula gigante contendo fluorescena
encapsulada no volume do ncleo aquoso (c) e o correspondente perfil de distribuio da
intensidade de fluorescncia sobre uma linha equatorial de cada imagem (b e d). Os pontos
nos grficos representam os resultados experimentais e as linhas cheias os clculos tericos
obtidos pela convoluo da funo de propagao pontual do microscpio e a intensidade de
fluorescncia emitida unicamente pela membrana (b) ou unicamente pelo volume (d) de cada
vescula.

A Figura 3.28c apresenta uma vescula gigante onde uma substncia fluorescente
(fluorescena) foi exclusivamente encapsulada no ncleo aquoso da estrutura. Neste caso, o
perfil de distribuio de intensidade de fluorescncia mostra uma curva extendida sobre toda
regio interna da estrutura, com uma intensidade crescente em direo ao centro, onde o
volume da substncia fluorescente maior considerando a maior rea na diagonal da
estrutura.
163
Essas distribuies de fluorescncia tambm foram analisadas a partir do clculo
terico da intensidade pela convoluo da funo de propagao pontual (FPP) do
microscpio e a fluorescncia distribuda sobre a superfcie de uma esfera de raio equivalente
ao da vescula da Figura 3.28a. O resultado do clculo mostrou um perfil de distribuio
igual ao obtido na medida experimental (Figura 3.28b). Da mesma forma, foi calculado o
perfil considerando uma fluorescncia distribuda no volume da esfera de raio igual ao da
vescula da Figura 3.28c. Mais uma vez o resultado do perfil terico pde ser comparado ao
resultado experimental (Figura 3.28d). Estes resultados mostram a alta acuracidade na
avaliao quantitativa da intensidade de fluorescncia procedida nestes estudos.
Comparando-se o perfil de fluorescncia da vescula de NBDPC (Figura 3.28b)
com o perfil do quitossoma (Figura 3.27c), pode-se afirmar que h uma equivalncia nos
resultados e que, portanto, a quitosana, assim como o NBDPC, encontra-se somente na
membrana da vescula.
Uma anlise quantitativa das intensidades de fluorescncia, relacionadas com as
concentraes de quitosana utilizada, tambm foi procedida para a investigao da
localizao da quitosana nas vesculas gigantes. A intensidade total de fluorescncia F
emitida por uma vescula de rea S foi calculada para diversas vesculas de variados
dimetros, em funo de trs diferentes concentraes de quitosana adicionada na emulso
precursora. A Figura 3.29 apresenta a dependncia da fluorescncia em relao rea dos
quitossomas gigantes. As barras de erro consideram as variaes na obteno da intensidade
de fundo e a preciso na integrao da intensidade de fluorescncia total.
A relao entre a intensidade de fluorescncia F e a rea superficial S para cada
concentrao de quitosana fluorescente, segue uma tendncia aproximadamente linear,
crescente e caracterstica de cada concentrao. A quantidade de polmero por unidade de
superfcie proporcional intensidade de fluorescncia. A relao linear entre F e S
confirma, portanto, que a quitosana est localizada na membrana das vesculas.
A extrapolao de cada reta a zero forneceu a declividade individual para cada
concentrao. A Figura 3.30 mostra a declividade = F/S resultante das extrapolaes em
funo das diferentes concentraes relativas de quitosana. O parmetro proporcional
concentrao. Esse resultado mostra que a quantidade de polmero na membrana da vescula
pode ser controlada pelas concentraes adicionadas na emulso precursora, depositada sobre
a lmina da clula de eletroformao. Perceba-se que cada um dos pontos apresentados na
164
Figura 3.30 representa um valor absoluto que foi obtido a partir da extrapolao de mais de
oito pontos individuais, sendo que a linearidade resultante reprodutvel.

Figura 3.29. Intensidade de fluorescncia em funo da rea de superfcie de quitossomas
gigantes para concentraes relativas de 3 (), 6 () e 12 % () de quitosana fluorescente
adicionada na produo das estruturas.

Salientado que S representa a rea de superfcie da vescula e no o volume, temos
fluorescncia por unidade de superfcie. No caso de haver contribuies de fluorescncia
provenientes do ncleo, a relao entre F e S no seria linear. Vesculas maiores, de volume
superior, conteriam uma quantidade de quitosana maior, a qual forneceria um crescimento de
F mais significativo em relao S do que na situao observada neste caso.
Consequentemente, no caso de polmero no ncleo aquoso das vesculas, teramos uma curva
ascendente para a relao entre F e S.
Deve-se levar em conta que a condio de pH do meio (pH 5,8), tanto na soluo de
disperso como na soluo do ncleo das vesculas, no favorece uma condio de
dissoluo para a quitosana. Assim, no caso da presena de quitosana no associada
0 2 4 6 8 10 12
F

(
u
.
a
.
)
S (10
3
m
2
)
165
membrana, teramos agregados polimricos dispersos no ncleo. Esses agregados, por sua
vez, emitiriam uma alta intensidade de fluorescncia. A mesma seria detectada, no perfil de
distribuio da fluorescncia, como um pico destacado acima da intensidade mnima da
regio interna da vescula. Ou seja, a intensidade mnima da regio interna da vescula no
seria aproximadamente linear, mas sim, altamente oscilante.

Figure 3.30. Fluorescncia por unidade de superfcie ( = F/S) obtida a partir da extrapolao
das contribuies de quitossomas gigantes de variados dimetros em funo da concentrao
relativa de quitosana (f) adicionada na produo das estruturas.

Uma varredura da anlise do perfil de fluorescncia foi feita sobre linhas
horizontais em diversas regies de um quitossoma gigante (Figura 3.31). Pode ser percebido
que a intensidade mnima da regio interna no apresenta grandes variaes de alto a baixo
da vescula, mostrando que no existe nenhum agregado de quitosana no seu ncleo ou sobre
a membrana. Esta situao corresponde ao tipo de vesculas analisadas na obteno dos
dados quantitativos.

0 2 4 6 8 10 12 14
0
2
4
6
8
10
12
14
f (%)

(
u
.
a
.
/
m
2
)

166

Figura 3.31. Imagem de Microscopia ptica de Fluorescncia de um quitossoma gigante com
as anlises do perfil de distribuio da intensidade de fluorescncia sobre a linha horizontal
em cinco diferentes regies de alto a baixo da vescula. Nos grficos, em y medida a
intensidade de cinza e em x o nmero de pixels. A linha expande 50 micrmetros.

Conforme mencionado anteriormente, algumas preparaes de quitossomas
gigantes apresentaram aleatoriamente agregados polimricos fluorescentes nas vesculas.
Neste caso, a intensidade mnima de fluorescncia sobre a regio interna da vescula
realmente no homognea, sendo que o agregado fornece um pico de alta intensidade na
regio do agregado (Figura 3.32). Esta situao representa um tipo de vesculas que no
foram consideradas nos estudos da presente Tese.
Assim, como concluso principal, pode-se afirmar que foi determinada tanto pelas
evidncias qualitativas como pelos dados quantitativos, a localizao da quitosana na
membrana dos quitossomas gigantes preparados pela modificao da Eletroformao.
A localizao da quitosana junto membrana sugere mais uma vez as interaes
eletrostticas entre os grupos amino ionizados do polmero e as extremidades polares dos
fosfolipdios. No processo de Eletroformao modificado primeiramente obtido um filme a
partir da emulso precursora, onde a quitosana esta contida em micelas reversas.
Considerando que a quitosana encontra-se no ncleo aquoso das micelas reversas, a interao
eletrosttica mais favorecida, j que o ncleo aquoso cercado pelas extremidades polares
da DOPC, enquanto que as cadeias apolares da DOPC interagem com o solvente orgnico na
regio externa das micelas. Portanto, a interao eletrosttica mais estimulada na emulso
precursora.
167

Figura 3.32. Imagens de Microscopia ptica de Fluorescncia de dois quitossomas gigantes
com as respectivas anlises do perfil de distribuio da intensidade de fluorescncia sobre as
linhas horizontais. As setas indicam agregados de quitosana fluorescente. Nos grficos, em y
medida a intensidade de cinza e em x o nmero de pixels. As linhas expandem 100
micrmetros.

Por outro lado, na etapa seguinte, a emulso depositada sobre a lmina condutora
de eletroformao e secada. Com a eliminao da gua e do solvente orgnico obtm-se um
filme basicamente de DOPC e quitosana. Neste filme de elevado contato molecular, outras
interaes podem ser estimuladas, embora as interaes eletrostticas, previamente
estabelecidas, devam predominar.
Aps, a soluo aquosa de sacarose introduzida no sistema e a energia eltrica
aplicada. A prpria energia dissipada na clula de eletroformao pode estimular interaes
de outra natureza entre DOPC e quitosana. Interaes de apolaridade entre as cadeias
apolares dos fosfolipdios e a regio hidrofbica das cadeias do polmero, podem ser
favorecidas no processo de Eletroformao.
Portanto, a localizao da quitosana na membrana das vesculas gigantes pode
significar, alm de interaes eletrostticas, tambm interaes apolares. Sendo assim, as
cadeias de quitosana podem estar tanto sobre a membrana, revestindo a bicamada
168
fosfolipdica internamente e externamente por interao eletrosttica, quanto no interior na
membrana, ou seja, dentro da bicamada sob a influncia de interaes de carter apolar.

3.2.3. Avaliao da Concentrao de Quitosana

A quitosana representa um polmero de baixa solubilidade, sendo que as
concentraes crticas determinadas na presente Tese foram de 0,59 e 0,78 mg/mL
respectivamente para a quitosana comercial e a obtida pela hidrlise da quitina.
13
Essa reduzida solubilidade significa um fator limitante na produo de vesculas
onde uma maior concentrao do polmero desejada de forma controlada. Os
procedimentos adotados aqui priorizaram o uso da filtrao da quitosana atravs de
membranas de 0,45 e 0,22 m. Essa metodologia tem como objetivo o controle maior sobre
as solues polimricas onde a formao de agregados e a presena de impurezas
minimizada.
Por outro lado, a filtrao, principalmente para as concentraes acima da
concentrao crtica, pode levar a uma perda de parte do polmero na soluo. Considerando
tambm uma alta distribuio de massa molecular, as macromolculas de elevada massa
podem estar sendo excludas durante a filtrao.
Alm disso, durante o processo de Eletroformao, o grau de transferncia de
material do filme depositado sobre a lmina para a formao das vesculas gigantes, pode no
ser o mesmo para as diferentes molculas. Ou seja, como se trata de um sistema composto de
fosfolipdios e polmero, durante a formao das vesculas gigantes pode ocorrer uma
alterao nas propores de concentrao do material adicionado no incio do processo.
Assim, nos quitossomas gigantes a proporo de concentrao entre os componentes pode ser
diferente da proporo aplicada na clula de eletroformao.
De forma a considerar os pontos discutidos acima, a avaliao da concentrao da
quitosana foi procedida primeiramente para a soluo filtrada, a qual foi utilizada nas
solues aplicadas para os estudos das vesculas gigantes. Atravs da calibrao pela
fluorescncia (Sesso 2.9.4), a perda de polmero resultante da filtrao foi avaliada. Os
comprimentos de onda caractersticos de absoro e emisso da quitosana fluorescente na
soluo tampo foram respectivamente 470 e 515 nm.
169
Para as preparaes de quitossomas gigantes, a quitosana comercial foi dissolvida a
uma concentrao de 2,5 mg/mL na soluo tampo. A partir dessa soluo, foram
preparadas as emulses precursoras de micelas reversas para a formao do filme sobre a
lmina de eletroformao. Essa concentrao significa aproximadamente cinco vezes a
concentrao crtica determinada para a quitosana comercial. Assim, deve-se considerar a
possiblidade de formao de agregados e conseqente perda de quitosana durante a filtrao.
A Figura 3.33 exemplifica uma calibrao de fluorescncia caracterstica para a avaliao de
diferentes concentraes de quitosana em soluo.

Figura 3.33. Intensidade de fluorescncia (I) em funo da concentrao de quitosana
fluorescente em soluo tampo (filtrada a 0,22 m) a 515 () e 533 nm ().

A calibrao pela fluorescncia a 515 nm da soluo de 2,5 mg/mL no filtrada
mostrou igualmente um comportamento linear de intensidade em funo da concentrao, da
mesma forma como a soluo filtrada. Porm, as intensidades foram significativamente
maiores para as mesmas diluies medidas para a soluo no filtrada. Assim, pela
extrapolao das retas, foi possvel determinar que o processo de filtrao da soluo de 2,5
mg/mL de quitosana fluorescente leva a uma perda de aproximademente dois teros do
polmero na soluo. Portanto, a concentrao real da soluo filtrada de 0,8 mg/mL.
0,0026 0,00521 0,00782

quitosana (mg/mL)
I

(
u
.
a
.
)
170
Com esse resultado tambm foram calculadas as concentraes reais de quitosana
depositadas sobre a lmina de eletroformao. Da maior para a menor, em percentual de
massa em relao ao fosfolipdio, temos 3,75%, 1,88% e 0,94%.
Com o conhecimento deste dado, tambm foi avaliada a concentrao da quitosana
nos quitossomas gigantes, igualmente pelo mtodo da calibrao pela fluorescncia. A Figura
3.34 mostra o resultado obtido para as medidas de fluorescncia dos lipossomas
nanomtricos, contendo NBDPC, nos dois comprimentos de onda analisados. Lembrando
que o comprimento de onda de 533 nm corresponde emisso mxima da NBDPC.

Figura 3.34. Intensidade de fluorescncia (I) em funo da concentrao de NBDPC contida
em lipossomas namomtricos em suspenso aquosa a 515 () e 533 nm ().

Neste caso a intensidade tambm varia linearmente com a concentrao da espcie
fluorescente para os dois comprimentos de onda. As intensidades de fluorescncia medidas
para quitossomas gigantes, em suspenso na soluo de sacarose, contendo quitosana
fluorescente (preparados com a maior concentrao de quitosana) e 1% de NBDPC foram de
I
1 = 1,103 a 515 nm e I
2 = 1,199 a 533 nm.

0,0
2,0x10
-4
4,0x10
-4
NBDPC (mg/mL)
I

(
u
.
a
.
)

171
A partir destas intensidades e das extrapolaes das calibraes das Figuras 3.33 e
3.34, foram calculadas as concentraes de transferncia efetiva de massa de fosfolipdio e
de quitosana do filme formado sobre a lmina de eletroformao para as vesculas gigantes
(Sesso 2.9.4). As concentraes
NB
c = 2,65.10
-5
e
Q
c = 1,65.10
-4
mg foram determinadas e
as mesmas representam percentuais de transferncia de 31% e 48% respectivamente para
fosfolipdios e quitosana, evidenciado uma transferncia diferenciada para as duas espcies.
De maneira geral, o resultado mostra que menos da metade do material de origem
transferido para a produo das vesculas gigantes, pelo menos durante o tempo de trs horas
despendido para o processo. Um tempo mais prolongado pode ser cogitado para uma menor
perda de material. Mas o fato mais importante consiste na maior transferncia de quitosana
em relao ao fosfolipdio. Considerando a concentrao mais elevada de quitosana na
emulso precursora como 3,75%, descontada a perda pela filtrao, a proporo encontrada
para os quitossomas gigantes a partir do resultado acima foi de 5,70% em massa. Isso
significa que o processo de Eletroformao modificado possui uma eficcia considervel
para um enriquecimento de quitosana na composio das vesculas gigantes.
Com este resultado quantitativo, torna-se possvel estimar um outro parmetro
importante dos quitossomas gigantes. Esse parmetro consiste na quantidade de polmero por
rea de superfcie das vesculas, j que foi determinado que a quitosana est localizada na
membrana das estruturas. Empregando-se uma rea mdia ocupada de 0,725 nm
2
por
molcula de fosfolipdio,
35
o clculo fornece 0,1 mg de quitosana por metro quadrado de
fosfolipdios. Este resultado consiste num valor tipicamente encontrado para polmeros
absorvidos em superfcies moderadamente atrativas.
36
Considerando os dois lados da bicamada tem-se, portanto, 0,2 mg de quitosana por
metro quadrado de rea de superfcie nos quitossomas gigantes com a maior concentrao de
quitosana utilizada.
Lembrando a relao linear de intensidade de fluorescncia por unidade de
superfcie em funo da concentrao de quitosana, juntamente com os resultados da
calibrao pela fluorescncia, pode-se concluir que vesculas gigantes foram preparadas com
a adio de 0,94, 1,88 e 3,75% de quitosana na emulso precursora, o que resultou em
quitossomas gigantes contendo respectivamente 0,03, 0,05 e 0,10 mg de polmero por metro
quadrado de fosfolipdios, ou seja, 0,06, 0,10 e 0,20 mg de quitosana por metro quadrado de
superfcie vesicular.
172
3.2.4. Estabilidade

Vesculas gigantes apresentam graus de estabilidade variadados e dependentes de
uma srie de fatores estruturais, composicionais e ambientais. A presso osmtica consiste
num fator ambiental de grande influncia principalmente na estabilidade estrutural das
vesculas gigantes. Especialmente na metodologia aplicada nesta Tese, em que na
composio final as vesculas apresentam soluo de sacarose no ncleo aquoso e soluo de
glicose no meio externo, a questo da presso osmtica deve ser avaliada e controlada para a
optimizao de uma condio favorvel de estudo.
No caso particular dos quitossomas gigantes, a presena de polmero na membrana
das vesculas representa um fator composicional capaz de proporcionar estabilidades
diferenciadas s estruturas. Apesar da modificao do mtodo da Eletroformao
proporcionar a formao de quitossomas gigantes com uma concentrao maior de quitosana
em relao ao fosfolipdio do que a concentrao depositada na clula de eletroformao, o
resultado obtido no significa que as estruturas formadas apresentem igualmente uma boa
estabilidade estrutural e composicional. A quitosana pode, aps algum tempo, dissociar-se da
membrana das vesculas, especialmente se as interaes entre os fosfolipdios e o polmero
forem de natureza fraca. Uma perda de quitosana, mesmo que parcial, pode provocar
alteraes estruturais no sistema dependentes do fator tempo. A permanncia da quitosana na
membrana das estruturas constitui, portanto, um fator de avaliao de estabilidade
composicional e estrutural.
Nos estudos da presente Tese foram avaliados os parmetros de presso osmtica
para que se pudesse estabelecer uma condio ideal de observao das vesculas gigantes
sem a ocorrncia de variaes estruturais significativas, decorrentes de uma condio
osmtica desfavorvel.
Normalmente, uma presso osmtica interna igual ou maior do que a do meio
externo leva desestruturao das vesculas com freqentes rompimentos da membrana. Por
outro lado, uma presso osmtica externa muito maior tambm no adequada, pois
proporciona grandes flutuaes da membrana e o fenmeno de pearling, onde as vesculas se
desestruturam formando vesculas bem menores ligadas umas as outras como um colar de
prolas.
37,38
173
Sendo a presso osmtica interna 0,095 0,003, j que as estruturas foram
formadas na soluo de sacarose e portanto incorporaram a soluo no seu interior, e a
presso osmtica externa 0,099 0,003, proporcionada pela disperso das vesculas na
soluo de glicose, um valor ligeiramente menor para o ambiente interno foi caracterizado
como sendo bastante adequado para a preservao estrutural das vesculas gigantes com
baixa flutuao da membrana. Estes valores de presso osmtica mostraram-se eficientes
tanto para lipossomas gigantes, independente do mtodo de preparao tradicional ou
modificado, como para os quitossomas gigantes. As vesculas permaneceram
microscopicamente inalteradas e com reduzidas flutuaes da membrana durante o perodo
necessrio para a sua observao. Sendo assim, foram estabelecidas as condies de presso
osmtica consideradas ideais e constantemente aplicadas nos estudos das vesculas gigantes,
j que as mesmas proporcionaram um ambiente de estabilidade estrutural satisfatrio.
A estabilidade composicional referente permanncia da quitosana na membrana
das vesculas gigantes foi avaliada durante um perodo de dez dias para as mesmas amostras
das trs concentraes de quitosana estudadas. A intensidade de fluorescncia foi medida
para diversas vesculas de variados dimetros e a relao de intensidade por rea de
superfcie foi obtida conforme discutido na Sesso 3.2.1.
O comportamento da intensidade de fluorescncia tambm se mostrou linearmente
crescente com a rea de superfcie dos quitossomas e proporcionalmente dependente da
concentrao de quitosana para todos os dias observados. Assim, foi possvel calcular a
intensidade de fluorescncia por unidade de superfcie de cada concentrao para cada dia
avaliado, durante o perodo de dez dias (Figura 3.35).
Os resultados evidenciam que a intensidade de fluorescncia dos quitossomas
gigantes, preparados com as trs diferentes concentraes de quitosana, mantm-se
praticamente constante durante dez dias. Consequentemente pode ser concludo que a
quitosana permanece na membrana das vesculas durante pelo menos dez dias.
Sendo assim, a estabilidade composicional do sistema vesicular formado pelos
quitossomas gigantes pode ser considerada alta. Esse resultado mostra tambm que as
interaes moleculares entre fosfolipdios e quitosana so fortes, sugerindo mais uma vez
interaes eletrostticas nas regies polares, sem descartar a possiblidade da presena de
quitosana tambm no interior da bicamada fosfolipdica, na regio apolar, sob interaes
apolares.
174

Figura 3.35. Variao temporal da intensidade de fluorescncia por unidade de superfcie ()
para quitossomas gigantes preparados com trs diferentes concentraes de quitosana
fluorescente: 0,94 (), 1,88 () e 3,75% () (m/m). As linhas horizontais pontilhadas
mostram os valores mdios para cada .

3.3. Aspectos Aplicativos do Sistema Desenvolvido

O sistema compsito vesicular formado pela associao da fosfatidilcolina e da
quitosana na presente Tese apresenta potenciais aplicativos que vem sendo explorados em
trabalhos de outros grupos de pesquisa.
Recentemente, um trabalho de colaborao com o Laboratrio de Microesferas e
Lipossomas do Instituto Butantan, coordenado pela Professora Maria Helena Bueno da
Costa, mostrou pela primeira vez a viabilidade de aplicao dos quitossomas nanomtricos
compsitos como veculos para administrao de vacina.
39
Os estudos in vitro e in vivo
mostraram vantagens dos quitossomas em relao aos lipossomas como reteno prolongada
da vacina encapsulada e respostas de memria imunolgica e de seletividade muito
superiores. Devido s propriedades de biocompatibilidade da quitosana e de versatilidade da
0 2 4 6 8 10
2
4
6
8
10
12
14

(
u
.
a
.
/
m
2
)
dias

175
preparao do sistema compsito pela evaporao em fase reversa, mais os resultados
positivos encontrados nos estudos in vitro e in vivo, os quitossomas representam um veculo
bastante adequado para a administrao intravenosa de vacina.
39
Em um outro trabalho de colaborao recentemente iniciado com a Faculdade de
Farmcia da UFRGS, coordenado pela Professora Slvia Stanisuaski Guterres, tem mostrado
potenciais de aplicao dos quitossomas como um veculo de administrao de frmacos pela
via cutnea.
40
Testes de estabilidade de tamanho em perodos prolongados de armazenamento
e estudos in vivo mostraram vantagens para os quitossomas. Os mesmos ainda encontram-se
em fase de investigao, porm os resultados preliminares tm mostrado boas perspectivas.
Trabalhos da literatura tambm tm citado o sistema compsito desenvolvido nesta
Tese, especialmente no que concerne parmetros estruturais e de interao da quitosana com
fosfolipdios.
41-44
Quemeneur e colaboradores, em dois trabalhos sobre lipossomas
unilamelares e vesculas gigantes revestidos com quitosana, mencionam a metodologia de
preparao desenvolvida na presente Tese, que proporciona a formao de quitossomas
contendo polmero em ambos os lados da membrana das vesculas, ou seja, no exterior e no
interior da estrutura.
41,42
No trabalho mais recente tambm mencionada a vantagem da
interao de cargas positivas dos grupos amino ionizados da quitosana com cargas negativas
presentes na regio polar dos fosfolipdios.
41
Caseli e colaboradores mencionam a
importncia da interao efetiva entre a quitosana e os fosfolipdios na produo das
vesculas compsitas em dois trabalhos com filmes de Langmuir, na investigao das
interaes entre as duas entidades.
43,44
Por fim, o sistema compsito formado pelos quitossomas representa um sistema de
larga investigao cientfica e apresenta possibilidades reais de aplicao como veculo de
administrao de frmacos, podendo ser usado como insumo farmacutico na produo de
medicamentos.

176
3.4. Referncias

2006, 6, 2425.
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44. Pavinatto, F.J.; Caseli, L.; Pavinatto, A.; Santos, D.S.; Nobre, T.M.; Zaniquelli, M.E.D.; Silva, H.S.;
Miranda, P.B.; Oliveira, O.N. Langmuir. 2007, 23, 7666.

178
Captulo 4. Concluses

4. Concluses

A avaliao estrutural comparativa entre lipossomas e quitossomas nanomtricos
mostrou uma srie de diferenciaes geradas no sistema compsito pela presena da
quitosana. A macromolcula modificou a morfologia, a estabilidade e a organizao
molecular no sistema vesicular. Os quitossomas nanomtricos apresentaram tamanhos
mdios maiores, com conseqentes menores coeficientes de difuso, do que os lipossomas e
essa caracterstica foi igualmente dependente da concentrao polimrica. A alta
polidisperso de partculas pde ser significativamente reduzida atravs da filtrao das
nanovesculas por membrana porosa de 0,45 m.
A morfologia das vesculas mostrou-se variada. Apesar da predominncia de
estruturas esfricas, vesculas de formatos no esfricos foram identificadas. A padronizao
morfolgica em estruturas esfricas tambm foi efetivada pela filtrao das estruturas a 0,45
m. Atravs da filtrao ocorreu uma re-estruturao morfolgica para um sistema com
predominncia de estruturas esfricas de energia livre mais favorecida. A filtrao no
preveniu os efeitos da quitosana sobre o sistema, ou seja, o aumento dimensional das
vesculas em funo da concentrao polimrica permaneceu mesmo aps a filtrao.
A gua utilizada como lquido de suspenso das partculas foi considerada adequada
para a manuteno estrutural do sistema no sentido de que as interaes entre partculas e
gua so fracas. Desta forma a gua atua efetivamente como um lquido de suspenso e no
como um solvente e assim a integridade estrutural das vesculas foi preservada durante os
procedimentos investigativos em suspenso aquosa. Essa interao entre partculas e gua
tambm foi menor com a presena da quitosana, bem como com o aumento da sua
concentrao.
A ultrasonicao, empregada como um ps-tratamento alternativo filtrao,
apresentou resultados globais semelhantes proporcionando uma considervel reduo de
tamanhos e polidisperso das vesculas. Porm, neste caso foi possvel reduzir os tamanhos
mdios dos quitossomas a valores inferiores aos dos lipossomas.
179
Os aspectos estruturais em nvel supramolecular tambm mostraram propriedades
interessantes para quitossomas. A presena da quitosana proporcionou uma maior
organizao molecular da bicamada fosfolipdica das vesculas nanomtricas, o que resultou
de forma direta na reduo da distncia de repetio da bicamada. A formao de estruturas
multilamelares foi constatada, apesar de o mtodo de preparao levar formao
predominante de estruturas unilamelares, e a produo de estruturas compsitas apresentando
uma maior rigidez na sua membrana foi sugerida. Esses efeitos puderam ser bem
relacionados com o gradativo aumento da concentrao de quitosana.
A filtrao a 0,45 m tambm atuou em nvel supramolecular, reduzindo as
distncias de repetio e o nmero de bicamadas nas estruturas multilamelares. O ps-
tratamento mostrou-se vantajoso para favorecer a homogeneizao estrutural sem, no
entanto, eliminar os efeitos proporcionados pela presena do polissacardeo.
Atravs da relao de dados obtidos por Espalhamento de Luz e Espalhamento de
Raios-X a Baixo ngulo foram determinados novos parmetros estruturais: o dimetro e o
volume do ncleo aquoso encapsulado nas vesculas. Desta forma foi demonstrado que as
nanovesculas possuem uma capacidade de ncleo aquoso adequada para a incorporao de
molculas hidroflicas.
As inter-relaes procedidas a partir dos dados de Espalhamento de Luz Dinmico,
Espalhamento de Luz Esttico e Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo forneceram
interpretaes importantes e mostraram que as tcnicas atuam de forma complementar na
avaliao estrutural dos lipossomas e quitossomas.
Em nvel microscpico tambm foram evidenciadas diferenas entre lipossomas e
quitossomas. A presena da quitosana favoreceu a formao de agregados micromtricos no
sistema compsito. A Microscopia ptica tambm mostrou diferenas entre sistemas
filtrados e no filtrados, comprovando de forma micromtrica a maior homogeneizao do
sistema atravs da filtrao. A Microscopia Eletrnica de Transmisso evidenciou o mesmo
efeito resultante da ultrasonicao, com a confirmao da reduo de tamanhos e
polidisperso para as estruturas sonicadas. Igualmente, a identificao pela Microscopia
Eletrnica de Transmisso de estruturas multilamelares, multivesiculares e no esfricas
confirmou os resultados estruturais a partir da interpretao dos dados de Espalhamento de
Luz e Espalhamento de Raios-X a Baixo ngulo. A necessidade de aplicao de um ps-
tratamento para a obteno de uma maior homogeneizao estrutural ficou evidenciada
tambm pelas anlises de microscopia.
180
A avaliao da transio de fase da bicamada fosfolipdica das nanovesculas
mostrou um comportamento absolutamente peculiar para quitossomas. As estruturas
compsitas foram menos influenciadas pela energia trmica em nvel de flutuaes da
bicamada, o que remete novamente a uma vescula de maior rigidez estrutural.
A transio de fase da bicamada fosfolipdica foi retardada com a presena da
quitosana e a distncia de repetio das bicamadas sofreu alterao bem mais gradativa do
que no sistema isento de quitosana com o aumento da temperatura. Portanto, pode-se
concluir que os quitossomas tambm apresentam uma estabilidade trmica maior, onde a
presena da quitosana atua de forma a dissipar os efeitos da energia trmica.
As medidas de Potencial Zeta mostraram um aumento progressivo concomitante
com o aumento da concentrao de quitosana. Assim, a carga externa do sistema compsito
foi alterada para valores que podem favorecer processos de agregao em suspenso aquosa.
Por outro lado, a mesma alterao de carga mostrou a presena de quitosana na superfcie
externa das nanovesculas.
Os tempos de recuperao de fluorescncia obtidos pela Recuperao de
Fluorescncia Aps Foto-Branqueamento para os quitossomas contendo quitosana
fluorescente foram caractersticos e distintos aos tempos da quitosana em soluo. Desta
forma pde ser concludo que todo polmero adicionado no sistema encontra-se incorporado
nas vesculas. O polmero manteve-se associado mesmo aps a ultrasonicao, o que sugere
fortes interaes entre a macromolcula e a membrana das estruturas.
A mobilidade espacial do grupo fosfato presente na extremidade polar dos
fosfolipdios foi reduzida com a presena da quitosana. Atravs da Ressonncia Magntica
Nuclear de Fsforo foi demonstrada uma interao molecular efetiva entre a quitosana e a
regio polar da bicamada fosfolipdica. Mesmo sob significativo aquecimento o sistema
compsito no sofreu modificaes considerveis de ressonncia, o que confirma a relativa
estabilidade termodinmica determinada por Espalhamento de Luz e Espalhamento de Raios-
X a Baixo ngulo.
A modificao da Eletroformao clssica para a produo de vesculas gigantes foi
realizada a partir do uso de uma emulso precursora formada no mtodo da evaporao em
fase reversa. A metodologia permitiu pela primeira vez a produo de quitossomas gigantes
esfricos contendo quitosana incorporada na membrana formada pela bicamada fosfolipdica.
181
Por meio da Microscopia ptica de Fluorescncia a quitosana fluorescente foi
localizada na membrana e pela relao de intensidade de fluorescncia e rea superficial de
vesculas a distribuio do polmero sobre a membrana da vescula foi quantificada. A
quantidade de polmero sobre a membrana das vesculas gigantes pde ser relacionada com a
concentrao polimrica aplicada no mtodo da Eletroformao modificada nesta Tese.
Pela metodologia de Calibrao da Fluorescncia foi possvel concluir que o
processo de Eletroformao proposto tambm enriquece as vesculas com quitosana, sendo
que a partir da emulso precursora at a formao das vesculas o percentual de transferncia
da quitosana foi relativamente maior do que de fosfolipdios. A quantidade de quitosana por
rea de superfcie foi determinada como 0,2 mg de quitosana por metro quadrado de rea de
superfcie, considerando os dois lados da membrana fosfolipdica.
Os parmetros de presso osmtica foram optimizados para condies ideais e
assim as vesculas apresentaram estabilidade estrutural adequada para os estudos realizados.
As quantidades de quitosana incorporadas na membrana das vesculas gigantes
permaneceram inalteradas durante dez dias, mostrando estabilidade composicional.
A partir das concluses obtidas pela anlise dos dados produzidos pela variada
gama de tcnicas utilizadas nos estudos fsico-qumicos e estruturais dos lipossomas
compsitos de fosfatidilcolina e quitosana e as interpretaes a partir das inter-relaes dos
mesmos dados, considerando ainda a forma de produo das estruturas, possvel propor que
o sistema compsito formado representa uma vescula cuja membrana fosfolipdica apresenta
um revestimento de quitosana na superfcie externa e na superfcie interna. A interao entre
o fosfolipdio e a quitosana mostrou-se como uma interao forte e consequentemente a
mesma deve ser de natureza eletrosttica entre os grupos amino positivamente ionizados da
quitosana e as cargas negativas presentes na extremidade polar dos fosfolipdios.
Considerando os resultados j obtidos e os estudos em andamento, possvel
concluir tambm que o sistema compsito quitossoma apresenta potencial de aplicao como
veculo para administrao de frmacos e vacina.

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a viscosidade intrnseca na fora inica , []

de um padro, como benzeno ou tolueno. Ento a

so respectivamente os contrastes logo aps e um tempo infinitamente depois

e um ombro estendido em campo baixo definido

fornece o deslocamento qumico de

) em campo alto e a curva anisotrpica de intensidade

). Por outro lado, para quitossomas a sua intensidade consideravelmente

2 = 1,199 a 533 nm.

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