UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA

PRCTICAS DE INMUNOLOGA CURSO 2009-2010

En este Curso Acadmico se llevaran a cabo las siguientes prcticas de laboratorio: I. Deteccin de anticuerpos frente al virus de la enfermedad de Aujeszky mediante un ELISA de competicin y un ELISA indirecto. II. Determinacin mediante la tcnica de aglutinacin rpida de grupos sanguneos y factor Rh humano. III. Deteccin de anticuerpos frente a Listeria sp. y frente a Salmonella sp. mediante microaglutinacin lenta en placa. IV. Determinacin de los anticuerpos calostrales en sueros de terneros. V. Resolucin de supuestos prcticos. I. MTODO ELISA La tcnica inmunoenzimtica ELISA (Enzyme-Llinked Immunosorbent Assay) forma parte de aquellas reacciones serolgicas que utilizan conjugados para poder visualizar la reaccin ANTIGENO-ANTICUERPO. El ELISA se basa en el uso de anticuerpos marcados con una enzima (generalmente la peroxidasa), de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) insolubilizados sobre la placa, la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y por tanto, podr ser revelada fcilmente mediante la adicin del conjugado y del sustrato, generando un color observable a simple vista y cuantificable mediante un colormetro. En la actualidad el ELISA es uno de los mtodos ms utilizados para el diagnstico serolgico de distintas enfermedades infecciosas, y es la tcnica ms recomendada para el estudio de poblaciones. Se han adaptado diferentes tipos de ELISA tanto para la deteccin de antgenos como de anticuerpos. En esta prctica utilizaremos dos tipos de ELISA para la deteccin de anticuerpos fente al virus de la Enfermedad de Aujeszky (ADV) en sueros de cerdo.

I. 1. PRINCIPIO DEL TEST de la Enfermedad de Aujeszky (ADV) La glucoprotena E (gE) no se encuentra en las cepas vacunales del virus de la enfermedad de Aujeszky utilizadas en Espaa. Por lo tanto, la deteccin de anticuerpos especficos frente a gE en muestras de sueros de cerdos permite la diferenciacin entre animales vacunados, sanos e infectados por este virus. En estas prcticas vamos a emplear dos kits comerciales basados en: ELISA de competicin (o de bloqueo): detecta slo Ac frente a gE. Los pocillos estn tapizados con la protena gE del virus. ELISA indirecto: detecta Ac totales frente a ADV. Los pocillos estn tapizados con antgeno inactivado de ADV completo.

En ambos casos si en la muestra de suero a analizar hay anticuerpos especficos stos se fijan sobre el Ag fijado a la placa, por lo que la reaccin de ELISA ser positiva. La forma de evidenciar esta unin Ag-Ac es diferente en funcin de la metodologa empleada: En el ELISA de competicin a continuacin se incorpora a los pocillos un anticuerpo monoclonal anti-gE del ADV conjugado con una enzima. En los casos en que en la muestra de suero haya anticuerpos anti-gE, este conjugado no puede unirse a la gE (Figura 1), por lo que se eliminar en los siguientes lavados. En el ELISA indirecto a continuacin se incorpora a los pocillos un anticuerpo monoclonal anti-Ig de cerdo conjugado con una enzima. En los casos en que en la muestra de suero haya anticuerpos anti-ADV, este conjugado se unir a los Ac especficos del suero, unidos a su vez al Ag fijado al pocillo (Figura 2).

En ambos casos el revelado se realiza por la adicin de un sustrato cromgeno. La presencia o ausencia de color indica diferentes resultados en funcin de la prueba: En el ELISA de competicin la ausencia de color indica la presencia de Ac anti-gE en el suero problema, que ser positivo. En el ELISA indirecto el desarrollo de color indica la presencia de Ac antiADV en el suero problema, que ser positivo.

La intensidad de color se mide con un lector de ELISA con un filtro de 450nm, y los sueros a ensayar se comparan con los sueros controles que se incluyen en el kit. 1.2. MUESTRAS Y REACTIVOS Muestras: Sueros porcinos en refrigeracin (mximo 8 das) o congelacin. Reactivos: Las placas tapizadas con el antgeno, los sueros controles, las soluciones de diluyente de muestras, de los conjugados, del sustrato y frenado se suministran con cada kit. La solucin de lavado se suministra concentrada (10x), y se debe diluir en agua destilada antes de su uso. La solucin diluyente de muestras para el ELISA indirecto tambin se debe diluir previamente a 1/3 en agua destilada.

I. 3. ELISA DE COMPETICIN. Procedimiento

Muestras: Se usa una dilucin del suero problema al 50% (1/2) en solucin diluyente 1. 2. 3. Estabilizar los reactivos a 18-25C antes de empezar la prueba. Distribucin de 50l de solucin diluyente de sueros en cada pocillo a usar. Distribucin de 50l de sueros controles (negativo, positivo; por duplicado) y muestra en cada pocillo (por duplicado). Usar una punta de micropipeta por cada muestra. Incubacin de las muestras durante 1 hora a 37C. Tapar las placas o incubar en cmara hmeda para que no se evaporen los reactivos. Lavado (lavador de placas o multicanal): Se vaca la placa, se aaden 300l de solucin de lavado por pocillo, se agita suavemente y se vaca placa. Realizar un total de 3 lavados. Distribucin del conjugado. Dispensar 100l de conjugado anti-gE. Incubar 40 minutos a 37C. Realizar 3 lavados como en el caso anterior. Dispensar 100l de solucin del sustrato. Incubar a temperatura ambiente (1825C) y en oscuridad durante 15 minutos. Frenado de la reaccin. Dispensar 100l de solucin de frenado. Agitar suavemente la microplaca.

4. 5.

6. 7. 8. 9.

10. Lectura inmediata en un lector de ELISA con un filtro de 450nm.

Cerdo vacunado con ADV gEFigura 1. ELISA de competicin Cerdo infectado o vacunado con ADV gE+ Cerdo sano no vacunado

Aadir conjugado anti-gE marcado con enzima

Aadir sustrato de la enzima

Color

No

Protena gE de ADV Anticuerpo anti-gE

Conjugado anti-gE Sustrato

Clculo de resultados: El porcentaje de inhibicin de color (% PI) de cada muestra y del control positivo (DO: densidad ptica) %PI = (DO media del control negativo DO de la muestra) x 100 (DO media del control negativo) La prueba es vlida si se cumplen estos dos criterios: * DO media del control negativo DO media del control positivo > 0,6 * El suero control positivo tiene un %PI superior a 60 (DO control negativo DO control positivo) x 100 > 60 (DO media del control negativo) Interpretacin de los resultados: MUESTRA Positiva Negativa Dudosa SUEROS INDIVIDUALES % PI > 45 % PI< 40 40 %PI 45

I. 4. ELISA INDIRECTO. Procedimiento Muestras: Se usa una dilucin del suero problema a 1/200 en solucin diluyente de muestras. 1. Estabilizar los reactivos a 18-25C antes de empezar la prueba. 2. Distribucin de 50l de controles por duplicado y 50l de las muestras diluidas 1/200 a los pocillos de la placa (por duplicado). Usar una punta de micropipeta por cada muestra. 3. Incubacin de las muestras durante 1 hora a 37C. Tapar las placas con papel adhesivo o incubar en cmara hmeda para que no se evaporen los reactivos. 4. Lavado (lavador de placas o multicanal): Se vaca la placa, se aaden 300l de solucin de lavado por pocillo, se agita suavemente y se vaca placa. Realizar un total de 3 lavados. 5. Distribucin del conjugado. Dispensar 50l de conjugado anti-Ig de cerdo. Incubar 40 minutos a 37C. 6. Realizar 3 lavados como en el caso anterior. 7. Dispensar 50l de solucin del sustrato. Incubar a temperatura ambiente (18-25C) y en oscuridad durante 15 minutos. 8. Frenado de la reaccin. Dispensar 50l de solucin de frenado. Agitar suavemente la microplaca. 9. Lectura inmediata en un lector de ELISA con un filtro de 405 nm.

Figura 2. ELISA indirecto

Cerdo infectado o vacunado

Cerdo sano no vacunado

Aadir conjugado anti-Ig de cerdo marcado con enzima

Aadir sustrato de la enzima

Color

No

ADV inactivado Anticuerpo anti-ADV

Conjugado anti-Ig de cerdo Sustrato

Clculo de resultados: Es preciso obtener el valor de IRPC (ndice relativo x 100) de cada muestra. Para ello hay que aplicar la siguiente relacin: IRPC =
(DO de la muestra - DO media del control negativo) (DO media del control positivo DO media del control negativo)

x 100

La prueba es vlida si se cumplen estos dos criterios: * La DO media del control positivo es > 0,6 * La relacin DO media del control positivo DO media del control negativo > 7,0

Interpretacin de los resultados: VALOR DE IRPC > 12,0 12,0 INTERPRETACIN Muestra POSITIVA Muestra NEGATIVA

I.5. PRECAUCIONES - Leer atentamente y seguir las instrucciones del manual. - Conservar los reactivos en refrigeracin (4C). Equilibrarlos a temperatura ambiente (atemperarlos) antes de su uso. - Manejar los reactivos con cuidado como si fueran potencialmente infecciosos. Evitar la contaminacin de los reactivos y no usarlos fuera de la fecha de caducidad. - Guardar las normas de trabajo habituales en un laboratorio, tales como no pipetear con la boca, rotular el material, etc. - Utilizar una punta de pipeta por muestra. - Incluir sistemticamente los controles positivo y negativo en cada estudio. - Manejar con especial cuidado la solucin de frenado, ya que contiene cido sulfrico y es corrosiva.

II. TEST DEL Rh y GRUPOS SANGUNEOS Se trata de una prueba de aglutinacin rpida en porta para la deteccin del antgeno D Rhesus (Rh D) y los antgenos A y B humanos en eritrocitos. II.1 Informacin general Los antgenos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos reciben el nombre de antgenos de grupo sanguneo. En algunas especies animales, como el gato, existen tres grupos sanguneos A, B y AB. En el hombre, adems de los antgenos A, B y O, uno de los antgenos eritrocitarios ms importantes es el factor Rh. La expresin e inmunogenicidad del antgeno que determina el grupo de Rh humano puede variar entre individuos como resultado de diferencias cuantitativas o cualitativas antignicas. En general, este antgeno es fuertemente inmungeno, y puede suponer un factor de riesgo en transfusiones y en algunos embarazos, donde no hay compatibilidad entre donante/receptor o madre/feto, pudiendo dar lugar a la aparicin de reacciones de hipersensibilidad de tipo II. II.2 Reactivos: Los reactivos utilizados son una mezcla de anticuerpos monoclonales humanos IgM e IgG (anti-A, anti-B y anti-D (Rh)). II.3. Procedimiento del test en porta: 1. Colocar una gota de sangre en un porta limpio y templado. 2. Aadir una gota del reactivo correspondiente. 3. Mezclar completamente con movimientos circulares. 4. Observar la aglutinacin en un tiempo no mayor de 2 minutos. II.4. Interpretacin: Una reaccin positiva (con aglutinacin) indica la presencia del antgeno correspondiente. Una reaccin negativa (sin aglutinacin) indica la ausencia del antgeno analizado.

III. MICROAGLUTINACIN EN PLACA (MAT) La tcnica de microaglutinacin en placa creada por Martn y Petit, permite detectar anticuerpos aglutinantes del tipo IgM e IgG, que aparecen en el suero al cabo de varios das post-infeccin, requiriendo varias semanas para llegar a su nivel de microaglutinacin ms elevado. La tcnica consiste en enfrentar diluciones sucesivas del suero del animal sospechoso, a un serovar o grupo de serovares seleccionados de la bacteria inactivada. Las ventajas de esta tcnica es que es muy sensible y fiable permitiendo la determinacin cualitativa y cuantitativa de los anticuerpos en el suero. El nico inconveniente es el tiempo requerido para la resolucin de la misma (24 horas). III.1. Fundamento de la tcnica MAT aplicada a: Listeriosis: La listeriosis es una enfermedad zoonsica grave, que afecta a animales y personas, que est producida por bacterias del gnero Listeria. En el hombre, la listeriosis est causada principalmente por Listeria monocytogenes y est considerada como la infeccin de origen alimentario con mayor tasa de letalidad (20 a 30% de los casos). Aunque L. monocytogenes se ha aislado de variadas especies de mamferos, aves, peces y crustceos, su principal hbitat es el suelo y la materia vegetal en descomposicin, en la cual sobrevive y crece como saprofito. Si bien parece existir gran diversidad de serovariedades (16 serovariedades de L. monocytogenes), en los casos de listeriosis humana slo hay 3 serovares implicados: 1/2a, 1/2b, 4b. En esta prctica se va a determinar la presencia de anticuerpos frente a Listeria monocytogenes en distintos sueros de animales. Salmonelosis: La salmonelosis es una enfermedad zoonsica grave, que afecta a animales y personas, que est producida por bacterias del gnero Salmonella. En el hombre, la salmonelosis est causada por numerosos serovares de Salmonella, siendo los ms frecuentes Enteritidis y Typhimurium. Est considerada como la 2 infeccin de origen alimentario con mayor tasa de prevalencia en la UE, ligeramente por debajo de la campilobacteriosis. En esta prctica se va a determinar la presencia de anticuerpos frente a dos serovares diferentes de Salmonella en distintos sueros de animales. III.2. Procedimiento de la tcnica: Listeriosis Se dispone de dos tipos de antgenos, correspondientes a los serovares 4c y 4b. Los sueros problema corresponden a estos mismos serovares. Se utilizan placas de 96 pocillos con fondo en V.

Salmonelosis Se dispone de dos tipos de antgenos, correspondientes a los serovares Typhimurium y Choleraesuis. Los sueros problema pueden corresponder a estos mismos serovares o no. Se utilizan placas de 96 pocillos con fondo en V. PROTOCOLO EN AMBOS CASOS 1. Se aaden 100l del suero problema diluido al 1/10 en el primer pocillo de cada fila de la placa. 2. En los pocillos restantes aadimos 50l de PBS-safranina (Tampn fosfato salino con colorante, que favorece la visualizacin de la reaccin). 3. A continuacin, diluir al doble el suero en los pocillos siguientes de la fila, excepto en el ltimo pocillo que servir como testigo del Ag. 4. Aadir a todos los pocillos 50l de la suspensin de antgeno (bacterias de L. monocytogenes hervidas y tripsinizadas). 5. Incubar toda la noche a 37C y una o dos horas a 4C, antes de leer el resultado. 50l de PBS-safranina 100l 50l 50l 50l Control

Suero diluido

... ...

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50l de la suspensin de antgeno III.3. Interpretacin de resultados: En caso de reaccin negativa se apreciar un botn rojo de sedimentacin en el centro del pocillo debido a la acumulacin de las clulas bacterianas que no han reaccionado (sedimentacin del Ag). As, en el pocillo control (donde slo hay antgeno), siempre deber de aparecer botn debido a la ausencia de anticuerpos. En caso de reaccin positiva, se observar una falta de depsito del Ag (ausencia de botn rojo), ya que se ha producido la aglutinacin.

........

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12 9

El ttulo srico del individuo corresponder a la dilucin ms alta del suero problema a la que se produce aglutinacin. Una reaccin negativa en una sola muestra no descarta una posible infeccin, y el resultado puede ser debido a distintas razones: a) La muestra de suero puede haber sido tomada prematuramente, antes de cumplirse al menos una semana de evolucin desde el inicio de la enfermedad. b) Ms raramente, el paciente puede estar infectado por un serovar ausente en el antgeno utilizado y la respuesta inmune no ser suficientemente intensa todava como para producir reacciones cruzadas detectables con otros serovares. En el caso de que en el pocillo control de Ag no hubiese botn de sedimentacin la prueba se invalidara debido a que indicara una reaccin de autoaglutinacin espontnea del antgeno.
SUEROS

C-

1 2 3 4 5 6 7 8

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IV. EVALUACIN DE LA TRANSFERENCIA PASIVA DE ANTICUERPOS El animal neonato es dependiente de la madre para proveerse pasivamente de anticuerpos para su proteccin durante los primeros meses de vida. La ruta por la cual el neonato adquiere estos anticuerpos vara segn el tipo de placenta de la especie animal:

Tipo de placenta Epiteliocorial

N de capas 6

Contacto maternofetal Epitelio uterino intacto- epitelio del corion fetal Tejido conjuntivo epitelio del corion fetal Endotelio de vasos maternos-epitelio del corion fetal Sangre maternaepitelio del corion fetal

Especies animales Cerda Yegua Burra Vaca Oveja Cabra Perra Gata Mujer Primates Roedores

Transferencia de Ig No

Sindesmocorial

No Parcial (5-10% de IgG) Casi total (90-100% de IgG)

Endoteliocorial

Hemocorial

Durante las ltimas semanas de gestacin en la glndula mamaria hay una acumulacin de secreciones que contienen protenas trasferidas desde el torrente sanguneo. stas son ricas en IgG e IgA. La mayor parte de los Ac en el calostro son de tipo IgG. A medida que pasa el tiempo tras el parto, la secrecin mamaria cambia de calostro a leche. En rumiantes, la IgG (IgG1) es el principal isotipo de Ac en leche, mientras que en mamferos no rumiantes lo que predominan es IgA. La absorcin del calostro es un proceso muy importante, principalmente en animales no primates, ya que en ocasiones, es la nica fuente de Ac para el neonato. Los Ac van a ser absorbidos en las clulas del intestino delgado mediante pinocitosis, pasando seguidamente a la sangre. Este fenmeno va a durar slo un periodo limitado de tiempo (24-36 horas), tras el cual no se podrn absorber ms Ac, pues el intestino deja de se permeable. Tras el nacimiento el mayor nivel de Ac se halla en el suero; sin embargo, algunas IgA permanecen en la luz del intestino para proteger la mucosa directamente. Los Ac adquiridos de modo pasivo se degradan con el tiempo dependiendo de la vida media caracterstica del isotipo de Ig. La vida media de la IgG es larga (varias semanas en la mayora de las especies), mientras que la IgE slo dura unos das. En el animal neonato normal, la produccin activa de Ac ocurre antes de la degradacin de los Ac trasferidos por la madre, de forma que hay Ac presentes continuamente.

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IV.1. Fundamento de la prctica: En especies dependientes del calostro, para su proteccin durante los primeros meses de vida, pueden existir fallos en la transferencia pasiva de las Ig debido a que la madre a veces rehsa al neonato, o a que puede haber una cantidad insuficiente de Ig en el calostro, o a que el recin nacido es incapaz de mamar. En estos casos, el nivel sanguneo de Ac es muy bajo para protegerlo de los patgenos ambientales con los que entra en contacto habitualmente en las primeras semanas de vida. Estos animales generalmente desarrollarn procesos diarreicos graves y/o septicemia, que puede ser fatal. Por tanto, es necesario determinar que el neonato ha recibido el calostro adecuado que asegure su proteccin. Si en una muestra de sangre se detecta una insuficiente cantidad de Ac, y todava puede haber absorcin de Ig va intestinal, es posible administrar calostro al recin nacido por va oral. Si, por el contrario, ya ha pasado el periodo de absorcin de las Ig, los Ac necesarios se deben administrar va intravenosa. Por tanto, es importante que el veterinario disponga de mtodos rpidos y eficaces para la determinacin de los niveles de Ig en el neonato. Una de las tcnicas ms sencillas, rpidas y baratas es la prueba de la turbidez con sulfato de zinc. IV. 2. Procedimiento de la tcnica: Se trata de una tcnica sencilla basada en la mezcla del suero problema con una solucin de sulfato de zinc. Este compuesto se utiliza para precipitar protenas, por lo que hace que las globulinas del suero se vuelvan insolubles, observndose precipitado cuando hay presencia de Ig. Se dispone de una serie de muestras de suero de terneros recin nacidos, en las cuales se pretende determinar el nivel de anticuerpos que han adquirido a travs del calostro. 1. La tcnica se lleva a cabo en tubos de vidrio, en cada uno de los cuales se mezcla: 1ml de agua destilada y 0,1ml del suero problema. Mezclar vigorosamente. 2. Se aaden 5ml de la solucin de sulfato de zinc (ZnSO4, a una concentracin de 250mg/l). 3. Esperar 1 hora a temperatura ambiente y despus leer la turbidez del tubo segn la siguiente escala:

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1500mg/dl

500mg/dl

200mg/dl

100mg/dl

precalostral

IV.3. Interpretacin de resultados: El sulfato de zinc hace que las globulinas se tornen insolubles, por lo que se observar un precipitado de intensidad variable, en funcin de la concentracin de Ig en el suero. En la falta total de transferencia (o en un suero precalostral), la mezcla de reaccin permanece clara. Cuando el suero presenta ms de 400 mg/dl de Ig, la mezcla se torna turbia. Como alternativa a la inspeccin visual, es posible leer la densidad ptica de la mezclas en una curva estndar. Teniendo en cuenta la siguiente tabla, se puede saber si el ternero est suficientemente protegido por los anticuerpos calostrales. En caso negativo, el ternero necesitara un suplemento inmunolgico para asegurar su proteccin.

< 200 mg/dl 200-400 mg/dl 400-800 mg/dl > 800 mg/dl

Falta de transferencia pasiva Falta parcial de transferencia pasiva Probables niveles adecuados de Ig Niveles adecuados de Ig

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AUTOEVALUACIN
Seala la opcin correcta en cada una de las siguientes preguntas y razona la respuesta:

Microaglutinacin ELISA En porta En placa

Evaluacin. transferencia pasiva Ac

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Cul/es de las tcnicas desarrolladas emplea anticuerpos? Cul/es de las tcnicas desarrolladas mide la inmunidad de base celular? Con cul/es de las tcnicas se puede determinar el ttulo de un suero? Cmo lo determinaras? Cul/es de las tcnicas determina la presencia de anticuerpos especficos? Cul/es de las tcnicas es/son primaria/s? Cul/es de las tcnicas es/son secundarias? En cul de las tcnicas se ve precipitacin?

En qu tcnica/s se emplean Ac monoclonales? A tu juicio qu tcnica tiene mayor 10 sensibilidad? A tu juicio qu tcnica tiene mayor 11 especificidad? 12 Qu tcnica emplea controles? Qu tcnica se puede emplear para el diagnstico de infecciones? Con qu tcnica podras diferenciar animales 14 vacunados de animales infectados? 13 15 Qu tcnica es cuantificable? 16 Cmo se te ocurre que podras determinar si se trata de IgG o de IgM?

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VI. RESOLUCIN DE SUPUESTOS PRCTICOS SUPUESTO PRCTICO N 1

Para diagnosticar si un animal tiene una inmunodeficiencia secundaria a una infeccin vrica se puede determinar el cociente entre el nmero de linfocitos colaboradores (Th) y citotxicos (Tc), ya que es un buen indicio del funcionamiento del sistema inmune tanto humoral como celular. Estas subpoblaciones de linfocitos se identifican mediante las distintas molculas de superficie que expresan (CD). Los CD se pueden analizar mediante una doble fluorescencia con anticuerpos monoclonales especficos empleando la citometra de flujo. PROTOCOLO Muestras: tres tubos de sangre-EDTA de tres gatos con sospecha de inmunodeficiencia (infecciones frecuentes, cansancio injustificado, etc.) Se aade a cada tubo de sangre una solucin salina para lisar los hemates. Tras centrifugar, el sedimento con los leucocitos se lava con una solucin de PBS y se pasa a otro tubo especial para citometra. Se aaden a cada tubo de citometra los siguientes anticuerpos monoclonales: - AntiCD3-APC - AntiCD4-RD - AntiCD8-FITC
APC: aloficocianina RD: rodamina FITC: isotiocianato de fluorescena

Se mezcla cuidadosamente, se incuba en oscuridad durante 15 minutos y se analizan las muestras en el citmetro de flujo, que determina el nmero y porcentaje de clulas marcadas con cada uno de los anticuerpos monoclonales. RESULTADOS Los datos obtenidos se suelen representar en grficos de puntos, en los que se representan en ordenadas y en abscisas la intensidad de la seal para cada uno de los marcadores empleados. En este caso se analizan dos parmetros para cada clula: CD3+CD4+ CD3+CD8+. Se muestra un ejemplo de los resultados para uno de los tubos de muestra: B2 y C2: clulas doblemente positivas B3 y C3: clulas doblemente negativas B1, B4: clulas positivas para un solo marcador C1, C4: clulas positivas para un solo marcador

CD4

CD3

CD8

CD3

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El citomtro adems cuenta el nmero de clulas marcadas y determina su porcentaje en el total de clulas analizadas. Los resultados que se obtienen en los tres tubos de sangre son los siguientes: MUESTRAS TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 PREGUNTAS 1- Explicar resumidamente la citometra de flujo 2- Qu poblacin de linfocitos vamos a identificar empleando estos anticuerpos monoclonales conjugados con un fluorocromo? i. CD3+CD4+: ii. CD3+CD8+: 3- Por qu se emplea el Ac monoclonal anti CD3? 4- Calcula e interpreta el cociente CD4/CD8. Un valor de CD4/CD8 1 indica una cierta alteracin del sistema inmune Qu muestra podramos considerar que corresponde a una inmunodeficiencia? 5- Explica cul sera el resultado si la citometra de flujo se hiciera sobre un tubo de: a) b) c) d) Sangre entera sin EDTA despus de 48 horas de su obtencin Sangre entera desuerada a 4C durante una noche: Plasma sanguneo obtenido por centrifugacin de la sangre entera: Capa blanca de la sangre separada en un gradiente de Ficoll: N Clulas (x109/l) CD3+ CD4+ 1,43 0,77 1,09 0,89 0,44 0,23 Cociente CD4/CD8

CD8 0,36 0,23 0,51

6- Para identificar clulas NK en una mezcla de linfocitos se emplean como marcadores anticuerpos monoclonales anti CD3 y anti CD16 (lo expresan todas las NK aunque aparecen en otros linfocitos), con el resultado que expresa la grfica.

En qu cuadrante se encuentran las clulas NK?

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SUPUESTO PRCTICO N 2.La figura de la siguiente hoja representa los resultados obtenidos en ELISA y Western blot (WB) en el suero de 5 vacas que han sido inoculadas con 5 variantes de BLV (Virus de la Leucosis Bovina). Todos son inculos se han realizado con extractos de clulas infectadas por BLV. El ELISA se realiz tapizando los pocillos con extractos de clulas infectadas por el virus. En las grficas de ELISA se aprecian dos curvas de resultados: lnea continua, realizada con los sueros de las vacas tal cual; en la lnea discontinua, los sueros han sido adsorbidos con las clulas sin infectar. Las lneas verticales de puntos representan los momentos en los que se ha aplicado una inoculacin de recuerdo a las vacas. En los 5 WB se han enfrentado los sueros tomados peridicamente (en el sentido de la flecha horizontal) a tiras en las que se han separado las protenas del mismo extracto celular de BLV que el ELISA. La flecha vertical representa el primer suero tras la inmunizacin, c el control positivo. Los nmeros verticales son los pesos moleculares (kDa) de las distintas protenas vricas. ELISA 1. Para qu crees que se adsorben los sueros antes del ELISA? 2. Qu diferencias ves entre los sueros adsorbidos y los no adsorbidos? 3. Describe qu pasos seguiras en la realizacin del ELISA presentado en este experimento. 4. A la vista de los resultados de ELISA, crees que todos los animales han reaccionado igual? 5. A la vista de los resultados de ELISA, qu inculo consideras que es el ms inmungeno? WESTERN BLOT 6. Describe qu pasos seguiras en la realizacin del Western Blot presentado en este experimento. 7. La flecha vertical est colocada en la segunda tira de la izquierda. Qu crees que hay en la primera tira de la izquierda? 8. A la vista de los resultados de WB, qu protenas son las ms inmungenas? 9. Qu preparado antignico crees que es el ms inmungeno? AMBAS TCNICAS 10. Crees que hay una correspondencia entre los resultados de ELISA y los de WB en cada animal? Si hay diferencias por qu crees que se dan? Cul es ms sensible? Cul es ms especfico? 11. Con cul de estas tcnicas podemos ver la evolucin secuencial de diferentes anticuerpos frente a distintos antgenos de un microorganismo durante el curso de una infeccin?

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BLV-1

BLV-2

BLV-3

BLV-4

BLV-5

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