Citogenetica Humana

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA
GUIA DE CITOGENETICA HUMANA CODIGO: ADx-G-G001 VERSION: 02-2011
1.
CITOGENETICA HUMANA
2.
INTRODUCCIN
La citogentica es reconocida hoy por hoy como una ciencia que va a la vanguardia en el perfeccionamiento de sus tcnicas y procedimientos, para consolidarse como la herramienta bsica en el diagnstico de las diferentes anormalidades cromosmicas. El propsito de este manual es orientar y servir de consulta a quienes trabajan en el Laboratorio de Gentica, en l se mencionan las diferentes tcnicas de cultivo de linfocitos, los componentes y su importancia para el proceso, especificaciones de la muestra y todas las etapas seguidas para obtener un diagnostico til para el medico genetista, pero sobretodo para la salud del paciente.
3.
CULTIVO DE LINFOCITOS PARA LA OBTENCIN DE METAFASES
En estos cultivos las clulas crecen libres en el medio, sin adherirse a las paredes del recipiente en que se encuentran. Las condiciones de cultivo varan de acuerdo al tipo de anomala sospechada y a las caractersticas que se deseen observar. Se pueden utilizar diferentes clases de medio, los ms apropiados incluyen: RPMI 1640, Medio Esencial Mnimo (MEM) y medio TC 199; a los cuales se les adiciona suero fetal bovino (SFB) inactivado, que proporciona enriquecimiento al medio; como estimulante mitognico se adiciona fitohemaglutinina (PHA). La PHA es una sustancia que se obtiene de las semillas del frjol ( Phaseolus vulgaris ) ; provoca la aglutinacin de los hemates y la estimulacin de los linfocitos T, de manera que estos se dividen en cultivo. En presencia de la PHA, los linfocitos pequeos se transforman en clulas indiferenciadas grandes, denominadas blasticas, que tienen ncleo redondo uno o dos nucleolos, citoplasma basofilo y entran en la primera mitosis a las 48 horas de cultivo. La PHA se une rpidamente a los linfocitos en cultivo y, despus de una hora, la estimulacin es irreversible, de manera que aunque se elimine esta sustancia del medio de cultivo, se produce la sntesis de ADN y la divisin de los linfocitos. Se utiliza como protena ( forma P ) o como mucoproteina ( forma M ); ambas tiene actividad mitogenica. La forma P tiene una capacidad de aglutinacin 40 veces mayor que la forma M.
RPMI 1640: Es mas enriquecido, sirve tambin para cultivos de tejido como el corion. MEM: Tiene los requerimientos esenciales mnimos, pH ptimo 7.0 - 7.2, tiene un alto contenido de cido flico que favorece la divisin celular. TC 199: Tiene bajo contenido de cido flico y un pH alcalino que ayuda a que se exprese mejor el sitio frgil del cromosoma X. 4. 4.1 TOMA DE MUESTRA HEPARINIZACION DE LA JERINGA
Como anticoagulante se recomienda el empleo de heparina ( Liquemine ) que es menos toxico para las clulas; ya que otros como el EDTA, Citrato que son quelantes ( que atraen iones ) pueden reducir la concentracin de Calcio del medio de cultivo, lo suficiente como para perjudicar la divisin celular, basta humedecer las paredes y el mbolo de la jeringa con la solucin anticoagulante. Despus de tomada la muestra es importante retroceder un poco el embolo y por inversin de la jeringa asegurarse que se realice una buena mezcla de la sangre con la solucin de heparina.
Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero
Revis: Dra. Yanith Piragauta G.
Valid: Dr. Fernando Anibal Pea Diaz
4.2
PUNCIN VENOSA
La asepsia completa de la regin escogida para la puncin es un paso fundamental que nos garantiza la esterilidad de la muestra. En personas adultas y aun en nios mayores de un ao, la puncin en los brazos es relativamente fcil; en recin nacidos, en los cuales esta puncin es difcil por el frecuente colapso de las venas, es necesario en ocasiones recurrir a la puncin yugular para recoger sangre suficiente, no obstante esto depende en gran parte de la habilidad de la persona que realiza la toma de la muestra.
5.
TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE LA MUESTRA
Toda muestra tomada debe ser correctamente identificada y conservada en la jeringa en nevera (5C) hasta el momento de la siembra 6-8 horas despus. En ocasiones es necesario utilizar sangres de 2448 horas de refrigeracin, sin embargo, la respuesta al mitgeno no es ptima porque se observan disminuidos el ndice de transformacin blastica y el ndice mittico. Las muestras tomadas fuera del laboratorio deben ser transportadas en las jeringas asegurando el cobertor de la aguja y el embolo con esparadrapo para evitar que se muevan y se pierda la muestra. Durante el transporte se debe evitar el sobrecalentamiento, para lo cual es ideal el uso de neveras porttiles o cajas de icopor. Muestras empacadas de esta forma pueden ser transportadas por 6-8 horas sin que se afecte significativamente la viabilidad de los linfocitos.
6.
TCNICA PARA CULTIVO Y PREPARACIN CROMOSOMICA CULTIVO DE ALTA RESOLUCIN
6.1
SIEMBRA: Cada muestra debe sembrarse por duplicado. Preparar el medio de siembra con 4 ml de medio ( MEM o RPMI 1640 ), que contenga una solucin de Antibiticos ( Penicilina y Estreptomicina ) al 2%, y 20% de Suero Fetal Bovino o 1 ml y 0,15 de Fitohemaglutinina M . Agregar de 15 18 gotas de sangre completa heparinizada segn la calidad (viscosidad) de la muestra.
RPMI
SFB
PHA
MUESTRA
CULTIVO POR DUPLICADO
Incubar a 37C durante 70 horas.
MTX
Adicionar 0.1 ml de solucin de Metotrexate 10 M (MTX), tambin llamado ametopterin; es una anlogo del cido flico que inhibe la enzima dihidrofolato reductasa, la cual es esencial para la sntesis de novo de timidilato y purinas. Si se incluye en exceso al cultivo, puede inducir muerte celular. Este paso se lleva a cabo en la cmara de flujo laminar, bajo estrictas condiciones de esterilidad. Luego se incuba de 15-17 horas a 37C. Agregar 0.1 ml de una solucin de Bromodesoxiuridina 1 mg/ml (BrdU). Esta es una sustancia anloga de la timina e induce mutaciones en el ADN. Cuando la BrdU se incorpora al ADN durante dos ciclos celulares, produce la tincin diferencial de las cromtides de los cromosomas metafasicos en el momento en el que son teidos con Hoechst 33258. Cuando se incorpora durante las ultimas horas de la Fase S del ciclo celular, produce bandas R y sirve para identificar el cromosoma X de replicacin tarda que por incorporar la BrdU, presenta fluorescencia roja, mientras que las regiones que se han replicado tempranamente, no han incorporado la BrdU, tienen fluorescencia verde brillante.
-5
BrdU
Incubar a 37C de 5 a 5
1/2
horas .
6.2
COSECHA Colocar 0.1 ml de Colchicina 0.016 %, este alcaloide soluble en agua se extrae del bulbo o de la semilla de azafrn . La colchicina se une a la tubulina e inhibe la formacin del huso acromtico por despolimerizacin de sus fibras e impide su posterior polimerizacin. Debido a que produce despolimerizacin de las fibras del huso acromtico puede inducir poliploidia y endorreduplicacin, y provoca la formacin de micronucleos cuando las clulas se incuban durante un tiempo prolongado en su presencia. Por eso debe ser 10 minutos exactos a 37C.
COLCHICINA
Pasados los 10 minutos, sacamos los tubos de la incubadora, se mezclan y entonces se unen y seguimos el proceso con un solo tubo.
Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y eliminar el sobrenadante.
Agregar lentamente 7 ml de una solucin hipotnica(KCL 0.075 M a 37C) y mezclar continuamente con pipeta Pasteur para evitar grumos. Dejar 5 minutos en incubadora a 37C. Esta solucin hipotnica (concentracin de Na menor que la intracelular) ocasiona un arrastre de agua a traves de la membrana celular hacia el citoplasma, entonces la clula se hincha y los cromosomas se dispersan. La precisin en la preparacin y el tiempo de tratamiento hipotnico son fundamentales para la obtencin de metafases optimas para su estudio: abiertas, fciles de contar y con bajo numero de cromosomas sobrepuestos. Errores en estos pasos, ocasionan rupturas celulares si la concentracin de sales es extremadamente baja o el tiempo de tratamiento prolongado; o metafases completamente cerradas, inadecuadas para el estudio, si la concentracin de sales es cercana a la isotonia. El KCL es el mas recomendado puesto que produce menos dao en la estructura cromosomica.
l KCl
Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. Eliminar el sobrenadante y al precipitado celular adicionar lentamente solucin fijadora comnmente llamada Carnoy, que esta constituida por 3 partes de Metanol y 1 parte de cido
actico 3:1 hasta completar 7 ml mezclar muy bien y dejar en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3:1
El proceso de fijacin tambin es un paso crtico en la cosecha. En el botn celular acumulado despus de aplicada la solucin hipotnica, se tienen tambin los restos de la hemlisis de los glbulos rojos, por lo tanto, si no se efecta una gil y rpida resuspensin en la fijacin, se forman grumos oscuros de hemoglobina que son difciles de disolver y producen extendidos sucios y con bajo ndice mittico; estos se observan en las preparaciones como artefactos que afectan las metafases las cuales se ven muy cerradas, con restos citoplasmticos y cromosomas poco definidos o peludos, que no responden adecuadamente a los tratamientos de bandeo.
Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante
Agregar 5 ml de una solucin de Carnoy (3:1) mezclando suavemente con pipeta Pasteur, dejar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3:1
Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante.
Agregar 5 ml de una solucin de Carnoy (1:1) para mejorar la dispersin de los cromosomas, mezclando suavemente con pipeta Pasteur, dejar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
1:1
Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante.
Agregar 5 ml de una solucin de Carnoy (6:1) para eliminar restos citoplasmticos y producir extendidos mas limpios, mezclando suavemente con pipeta Pasteur, dejar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
6:1
Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante hasta dejar la cantidad adecuada para gotear de 3-4 laminas (1ml aprox.).
SEDIMENTO 6.3 PREPARACIN DE LAS LAMINAS PARA EL GOTEO
Las lminas portaobjetos para preparaciones citogenticas deben ser de optima calidad desde el punto de vista ptico, exentas de opacidad, estras y burbujas, siempre nuevas y de aspecto translucido y ntido. Se meten en un kopling, el cual contiene Carnoy ( Metanol y cido Actico Glacial ). Se deben dejar preferiblemente de un da para otro.
KOPLING
Se sacan las laminas del kopling y se limpian: Con una gasa impregnada de Etanol Con una gasa impregnada de Metanol Se secan con una gasa limpia y se guardan en un kopling seco en el congelador, para mantenerlas fras y hmedas garantizando una mejor expansin de la suspensin celular y somete las clulas a un golpe trmico y fsico al entrar en contacto con la superficie del portaobjeto.
Etanol
Metanol
6.4
GOTEO Se sacan las lminas del congelador. Con una pipeta Pasteur se toma el sedimento celular . Con una pinza se sostiene la lmina lista para dispensar de 6 a 8 gotas de dicho sedimento.
Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero Revis: Dra. Yanith Piragauta G. Valid: Dr. Fernando Anibal Pea Diaz
Las laminas goteadas se colocan sobre un soporte que tiene debajo un mechero prendido, para quitarles un poco la humedad.
SOPORTE
MECHERO
Dejar secar a temperatura ambiente. Marcar las laminas respectivamente, (con numero consecutivo y fecha) con lpiz punta de diamante.
No. d/m/a
Guardar las laminas en caja de madera para su maduracin respectiva. NOTA: Si las metafases han resultado demasiado cerradas, es decir, con los cromosomas muy juntos o sobrepuestos, se recomienda dejar el cultivo en nevera durante toda la noche con fijador (6:1) para as mejorar el esparcimiento cromosmico al momento del goteo.
6.5
DIAGRAMA
RPMI + SFB + PHA + SANGRE TOTAL 72 HORAS A 37 C

-5
0.1ml METOTREXATE 10 M 15 17 HORAS A 37C
0.1ml BROMODESOXIURIDINA 1mg/ml 5 5 HORAS A 37C
0.1ml COLCHICINA 10 A 37C CENTRIFUGAR 7 ml HIPOTNICA (KCL) 5 A 37C CENTRIFUGAR 7 ml CARNOY (3:1) 30 CENTRIFUGAR 5 ml CARNOY (3:1) 15 CENTRIFUGAR 5 ml CARNOY (1:1) 5 CENTRIFUGAR 5 ml CARNOY (6:1) 5 CENTRIFUGAR
GOTEO (LAMINAS HMEDAS Y FRAS)
SECADO (MECHERO)
7. TCNICA DE CULTIVO CONVENCIONAL PARA LA OBTENCIN DE CROMOSOMAS EN METAFASE
7.1
SIEMBRA: Cada muestra se debe sembrar por duplicado. Preparar el medio de siembra con 4 ml de medio RPMI, ms 1 ml de SFB y 0.15 ml de PHA. Agregar de 15-18 gotas de sangre total (ver preparacin de la muestra ).
RPMI
SFB
PHA
MUESTRA
Incubar durante 69 horas a 37C.
7.2
COSECHA: Adicionar 0.1 ml de Colchicina, incubar 15 minutos exactos a 37C.
COLCHICINA
Pasados los 15 minutos, sacamos los tubos de la incubadora, se mezclan y entonces se unen y seguimos con un solo tubo.
Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante. Agregar al sedimento 7 ml de solucin hipotnica (KCL) por 10 minutos a 37C.
l KCl
Centrifugar 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante . Resuspender el botn celular con golpes suaves y adicionar 7 ml solucin fijadora (Carnoy) 3:1. Mezclar y dejar en reposo durante 30 minutos.
3:1
Centrifugar 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante . Adicionar 5 ml de Carnoy (3:1) y dejar en reposo por 15 minutos.
3:1
Centrifugar 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante . Agregar 5 ml de solucin Carnoy (1:1) dejar por 5 minutos.
1:1
Centrifugar 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante .
Adicionar 5 ml de Carnoy (6:1) y dejar reposar por 5 minutos.
6:1
Centrifugar 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante, dejando 1 ml aproximadamente para el goteo de 3-4 laminas. NOTA: La preparacin de las laminas para el goteo y el goteo, se realizan siguiendo la misma tcnica que para Cultivos de Alta Resolucin.
SEDIMENTO 7.3 DIAGRAMA
RPMI + SFB + PHA + SANGRE TOTAL 69 HORAS A 37 C 0.1ml COLCHICINA 15 A 37C CENTRIFUGAR 7 ml HIPOTNICA (KCL) 12 A 37C CENTRIFUGAR 7 ml CARNOY (3:1) 30 CENTRIFUGAR 5 ml CARNOY (3:1) 15 CENTRIFUGAR
10
5 ml CARNOY (1:1) 5 CENTRIFUGAR 5 ml CARNOY (6:1) 5 CENTRIFUGAR
GOTEO (LAMINAS HMEDAS Y FRAS)
8.
SECADO (MECHERO) TCNICA DE CULTIVO PARA EXPRESIN DEL X FRGIL
Para la deteccin del cromosoma X Frgil, es especialmente importante tener en cuenta las condiciones especiales del cultivo que incluyen: deficiencias de cido flico en el medio, por lo cual se debe emplear el medio TC 199 , pH alto (mayor de 7.3 en el momento de la siembra) y bajo contenido de SFB (solamente 0.25 ml). La metodologa de siembra y cosecha es idntica a la de un cultivo corto o convencional, solo varan algunas cantidades. Ejemplo: TC 199 SFB PHA 4.75 ml 0.25 ml 0.25 ml
M 199
SFB
PHA
MUESTRA
9.
TCNICA DE CULTIVO PARA INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS I.C.H. 0.1 ml de
Se siembra igual a los cultivos cortos o convencionales, adicionndoles Bromodesoxiuridina BrdU, y se procesan igual a los cultivos cortos o convencionales. Ejemplo: RPMI SFB PHA BrdU
4.0 ml. 1.0 ml. 0.25 ml. 0.1 ml.
RPMI
SFB
PHA
BrdU
MUESTRA
CULTIVO POR DUPLICADO 11
10.
TCNICAS DE BANDEO CROMOSMICO
En los comienzos de la Citogentica con las tcnicas de tincin homognea, un cromosoma slo poda distinguirse por su longitud y posicin del centrmero y clasificarse dentro de uno de los siete grupos nombrados de la A G, localizando el cromosoma sexual X dentro del grupo C y el cromosoma Y en el grupo G. Durante los ltimos aos de la dcada del 60 se desarrollaron tcnicas de tincin especiales ( bandeo cromosmico ) que permitieron no solo la identificacin exacta de la totalidad de pares cromosmicos, sino tambin la deteccin de la mayoria de alteraciones estructurales. Las bandas Q, G y R permiten un anlisis claro y preciso de la morfologa de los cromosomas. Las bandas G y R presentan una ventaja sobre las bandas Q y es que son preparaciones permanentes y no requieren equipos pticos y de iluminacin especial, sin embargo las bandas Q no necesitan maduracin ni procedimientos trmicos o enzimticos. Las tcnicas de tincin selectiva tien solo regiones especificas del cromosoma, por ejemplo las bandas C y N marcan los centrmeros y los satlites respectivamente y se utilizan cuando se requiere informacin adicional al respecto. 10.1 BANDAS
Aquella parte de un cromosoma, la cual es claramente distinguible de un segmento adyacente por su apariencia mas clara u oscura, con una o mas tcnicas de bandeo.
BANDAS R: (de Reverso) Formacin de un patrn de bandeo, obtenido por desnaturalizacin, que es el inverso del patrn usual de bandeo G producido por la coloracin de Giemsa.
BANDAS G: (de Giemsa) Mtodo de coloracin de cromosomas que produce patrones de bandas intensamente teidas que son separadas de si mismas por regiones dbilmente teidas.
BANDAS C: (de Centrmero) Mtodo de coloracin diferencial en el que la banda positiva muestra la localizacin de la Heterocromatina constitutiva. Corresponde a las estructuras que se tien intensamente en las regiones yuxtacentromericas, es decir, cerca al centrmero. BANDAS N: (o Regiones Organizadoras del Nucleolo-NOR) Mtodo de coloracin diferencial en la que se tien los satlites. 10.1.1 BANDAS R Utilizar laminas de, por lo menos, 4 dias de goteadas, de tal forma que los cromosomas hayan adquirido un envejecimiento adecuado, en caso de que sea urgente realizar la coloracin, las laminas se pueden envejecer colocndolas durante toda la noche entre 37 y 42 C y al da siguiente proceder a colorearlas. Colocar las laminas durante 5 minutos en un recipiente (cubierto con papel aluminio, para protegerlo de la luz), con la solucin de Hoechst 33258 a temperatura ambiente. Esta solucin se une a los pares de bases AT en el surco mayor de la doble hlice. Se utiliza para
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detectar regiones cromosomicas de replicacin tarda en cromosomas que han incorporado BrdU, as como para detectar intercambios entre cromtides hermanas.
Enjuagar con agua destilada para remover el exceso de reactivo.
Previamente preparar las cajas de Petri (caja plstica grande) colocndole papel de filtro en la base para hacer cmara hmeda con el reactivo a utilizar.
Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 6-8 gotas de solucin tampn Mcllvaine sobre cada lamina y cubrir con laminillas. Cerrar la caja de Petri .
Colocar la caja con las laminas dentro de la unidad de radiacin, o sea, exponindolas con la lmpara de mercurio o de luz negra, con una longitud de onda de 590 nm, a una distancia de 25 cm y a una temperatura de 50-53C durante una hora.
BALASTRO
LAMPARA DE Hg O LUZ NEGRA
ENCHUFE
PUERTA
CAJA DE PETRI CON LAMINAS EN PROCESO Retirar la caja de la unidad y dejar reposar por lo menos, 5 minutos a temperatura ambiente antes de retirar las laminillas.
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Quitar las laminillas cuidadosamente (sin arrastrarlas sobre la lamina, ya que esto hace que se rayen las preparaciones cromosomicas). Enjuagar suavemente con agua destilada. Previamente preparar las cajas de Petri (caja plstica grande) colocndole papel de filtro en la base para hacer cmara hmeda con el reactivo a utilizar.
Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 6-8 gotas de solucin 2xSSC ( Solucin salina citratada), sobre las laminas y cubrir con laminillas.
Llevar la caja de Petri en la estufa a un a temperatura de 50-53 C por 30 minutos.
Retirar la caja de Petri de la estufa y dejar reposar por lo menos 5 minutos. Remover cuidadosamente las laminillas, sin arrastrarlas sobre la lamina y enjuagarlas con agua destilada.
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10.1.2
COLORACIN
Buffer pH 7.2 Colorante Giemsa (filtrado)
9.5 ml 0.5 ml
Esta cantidad es para 2 l laminas, preparar segn cantidad de laminas
Colocar sobre cada lamina aproximadamente 5 ml del colorante preparado previamente, procurando dejar la lamina cubierta con el colorante durante 2-3 minutos. Lavar con agua destilada.
Flamear suavemente, teniendo cuidado de no producir emisin de vapores, hasta que se seque y luego limpiar por debajo con papel. Alistar las laminas para preparacin permanente, o sea pegar 2 laminillas una grande y una pequea con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y luego leer. 10.1.3 DIAGRAMA
LAMINA ENVEJECIDA DE 3 A 5 DAS DE GOTEADA O DEJADA DE 37-42C DURANTE TODA LA NOCHE
HOECHST 33258 5 MIN LAVAR
SOLUCIN TAMPN MACILVAINE CUBRIR CON LAMINILLAS
LMPARA DE LUZ DE MERCURIO 50 53 C 1 HORA LAVAR
2XSSC CUBRIR CON LAMINILLAS LLEVAR A LA ESTUFA 50 53 C 30 MIN LAVAR
COLORACIN ( SOLUCIN TAMPN FOSFATO pH 7.2 + GIEMSA) 2 3 min LAVAR
15
SECADO (MECHERO) MONTAJE
MICROSCOPIO
FOTOGRAFIA
ANLISIS
10.2
BANDAS G
Utilizar lminas de por lo menos 5 dias de goteadas o calentarlas durante 16 horas a 60C. Previamente preparar las cajas de Petri (caja plstica grande) colocndole papel de filtro en la base para hacer cmara hmeda con el reactivo a utilizar.
Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 6-8 gotas de solucin 2xSSC (Solucin salina citratada), sobre las laminas y cubrir con laminillas.
Retirar la caja de Petri de la estufa y dejar reposar por lo menos 5 minutos. Remover cuidadosamente las laminillas, sin arrastrarlas sobre la lamina y enjuagarlas con agua destilada.
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Sumergir la lamina en solucin de Tripsina al 1% a 9C por 9 10 segundos.
Detener la accin de la tripsina sumergiendo las laminas en etanol (alcohol).
Lavar las laminas con agua destilada.
10.2.1
COLORACIN Agua destilada Buffer pH 6.8 Colorante Giemsa (filtrado) 4.7 ml 0.2 ml 0.1 ml
Esta cantidad es para 1 l lamina, preparar segn cantidad de laminas
Colocar sobre cada lamina aproximadamente 5 ml del colorante preparado previamente, procurando dejar la lamina cubierta con el colorante durante 7-8 minutos. Lavar con agua destilada. Alistar las laminas para preparacin permanente, o sea pegar 2 laminillas una grande y una pequea con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y leer.
10.3
BANDAS C
Utilizar laminas de 4 dias de goteadas. Sumergir las laminas en cido clorhdrico ( HCL 0.2 N), durante 40 minutos a temperatura ambiente.
Lavar con agua destilada. Colocar las laminas en Hidrxido de Bario ( Ba(OH) 2 al 5%), o en Hidrxido de Sodio (NaOH 0.07 N), durante 8 minutos a 52-53C, en la estufa.
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NOTA: El hidrxido de Bario debe mezclarse fuertemente y filtrarse antes de utilizarlo.
Lavar rpidamente, ya que Hidrxido de Bario se precipita muy fcilmente y podra quedar residuos en la lamina. Previamente preparar las cajas de Petri (caja plstica grande) colocndole papel de filtro en la base para hacer cmara hmeda con el reactivo a utilizar.
Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 6-8 gotas de solucin 2xSSC (Solucin salina citratada), sobre las laminas y cubrir con laminillas.
Llevar la caja de Petri en la estufa a una temperatura de 50-53 C por 1 hora.
10.3.1 COLORACION
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Agua destilada Buffer pH 6.8 Colorante Giemsa (filtrado)
4.5 ml 0.25 ml 0.25 ml
Esta cantidad es para 1 lamina, preparar segn cantidad de laminas l
Colocar sobre cada lamina aproximadamente 5 ml del colorante preparado previamente, procurando dejar la lamina cubierta con el colorante durante 20-30 minutos. Lavar con agua destilada. Alistar las laminas para preparacin permanente, es decir, pegar 2 laminillas una grande y una pequea con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y leer.
10.4
BANDAS N
Utilizar laminas de 4 dias de goteadas. Preparar una solucin de AgNO3 al 50% P/V preparada se debe filtrar antes de utilizarla. en agua desionizada. Si no esta recin
50 gr X X= 50 x 15 100
100 ml. 15 ml. = 7.5gr + 15 ml de agua destilada
Previamente preparar las cajas de Petri (caja plstica grande) colocndole papel de filtro en la base para hacer cmara hmeda con agua destilada.
Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 2 gotas de la solucin de AgNO 3, sobre cada lamina y cubrir con laminilla completa.
Tapar la caja de Petri y sellar bien. Llevar la caja de Petri a la estufa a una temperatura de 37 C por 16 horas.
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Sacar las laminas de la caja de Petri y enjuagar con agua abundante destilada o agua de chorro hasta que escurra la laminilla. Dejar secar al aire sobre una toalla de papel.
10.4.1 COLORACIN Agua destilada Buffer pH 6.8 Colorante Giemsa (filtrado) 4.6 ml 0.2 ml 0.2 ml
Esta cantidad es para 1 lamina, preparar segn l cantidad de laminas
Colocar sobre cada lamina aproximadamente 5 ml del colorante preparado previamente, procurando dejar la lamina cubierta con el colorante durante 10 minutos. Lavar con agua destilada. Alistar las laminas para preparacin permanente, es decir, pegar 2 laminillas una grande y una pequea con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y leer.
10.5 BANDAS R MODIFICADAS PARA OBTENER INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH)
Laminas de 2-3 horas de goteadas se calientan a una temperatura de 70-80C durante 30 segundos 1 minuto. Si tienen mas de un da no se calientan.
Colocar las laminas durante 5 minutos en un recipiente (cubierto con papel aluminio, para protegerlo de la luz), con la solucin de Hoechst 33258 a temperatura ambiente.
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Enjuagar con agua destilada para remover el exceso de reactivo. Previamente preparar las cajas de Petri (caja plstica grande) colocndole papel de filtro en la base para hacer cmara hmeda con el reactivo a utilizar.
Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 8-10 gotas de solucin tampn Mcllvaine sobre cada lamina y cubrir con laminillas. Cerrar la caja de Petri .
Colocar la caja con las laminas dentro de la unidad de radiacin, o sea, exponindolas con la lmpara de mercurio o de luz negra, con una longitud de onda de 590 nm, a una distancia de 25-30 cm y a una temperatura de 50-53C durante 17 minutos. BALASTRO
LAMPARA DE Hg O LUZ NEGRA
ENCHUFE
PUERTA
CAJA DE PETRI CON LAMINAS Retirar la caja de la unidad y dejar reposar por lo menos, 5 minutos a EN temperatura ambiente PROCESO antes de retirar las laminillas.
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Quitar las laminillas cuidadosamente (sin arrastrarlas sobre la lamina, ya que esto hace que se rayen las preparaciones cromosomicas).
Enjuagar suavemente con agua destilada. Previamente preparar las cajas de Petri (caja plstica grande) colocndole papel de filtro en la base para hacer cmara hmeda con el reactivo a utilizar.
Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 8-10 gotas de solucin 2xSSC ( Solucin salina citratada), sobre las laminas y cubrir con laminillas.
Retirar la caja de Petri de la estufa y dejar reposar por lo menos 5 minutos.
Remover cuidadosamente las laminillas, sin arrastrarlas sobre la lamina y enjuagarlas con agua destilada.
10.5.1
COLORACIN Buffer pH 7.2 Colorante Giemsa (filtrado) 9.5 ml 0.5 ml
Esta cantidad es para 2 l laminas, preparar segn cantidad de laminas
Colocar sobre cada lamina aproximadamente 5 ml del colorante preparado previamente, procurando dejar la lamina cubierta con el colorante durante 3-5 minutos.
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Lavar con agua destilada.
Flamear suavemente, teniendo cuidado de no producir emisin de vapores, hasta que se seque y luego limpiar por debajo con papel. Alistar las laminas para preparacin permanente, o sea pegar 2 laminillas una grande y una pequea con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y luego leer. 10.5.2 DIAGRAMA
LAMINA ENVEJECIDA DE 3 A 5 DAS DE GOTEADA O DEJADA DE 37-42C DURANTE TODA LA NOCHE
HOECHST 33258 5 MIN LAVAR
SOLUCIN TAMPN McILVAINE CUBRIR CON LAMINILLAS
LMPARA DE LUZ DE MERCURIO 50 53 C 17 MIN LAVAR
2XSSC CUBRIR CON LAMINILLAS LLEVAR A LA ESTUFA 50 53 C 15 MIN LAVAR
COLORACIN ( SOLUCIN TAMPN FOSFATO pH 7.2 + GIEMSA) 3 5 min LAVAR
SECADO (MECHERO) MONTAJE
MICROSCOPIO
FOTOGRAFIA
ANLISIS 11. COLORACIN GIEMSA
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GIEMSA: Colorante frecuentemente utilizado para teir cromosomas, ya sea en forma uniforme o con bandas; est formado por tiacinas como el azul de metileno y sus productos de oxidacin, azur A, B y C, en combinacin con la eosina Y.
La coloracin clsica consiste en cubrir las laminas durante 8 min con solucin de colorante Giemsa preparado de la segn la tabla.
No LAMINAS BUFFER pH 6.8 AGUA DESTILADA COLORANTE GIEMSA
1 0.2 4.6 0.2
2 0.4 9.2 0.4
3 0.6 13.8 0.6
4 0.8 18.4 0.8
5 1.0 23.0 1.0
6 1.2 27.6 1.2
7 1.4 32.2 1.4
8 1.6 36.8 1.6
9 1.8 41.4 1.8
10 2.0 46.0 2.0
Dejar secar y montar las laminas para preparacin permanente.
12.
MICROSCOPIA Y FOTOGRAFIA
12.1
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE
Se utiliza para las preparaciones cromosomicas no teidas, principalmente como control del goteo, papa tratar de mejorar la fijacin o la dispersin sobre la lamina.
12.2
MICROSCOPIA DE LUZ TRANSMITIDA
Se utiliza con las preparaciones teidas con Giemsa. En la microfotografa de cromosomas se busca la obtencin de la gama de grises mas que el contraste de blanco y negro, por lo tanto una pelcula con grano fino, alto poder de resolucin y contraste moderado, es la mas adecuada. Por comodidad y economa se puede disponer de ellas en latas de 100 pies que se dispensan en rollos de 20-30 fotos. El papel fotogrfico tambin se elige de acuerdo al contraste requerido y al tipo de pelcula al copiar. El tiempo y la intensidad de la luz en la exposicin es directamente proporcional al grado del papel, sin embargo se aconseja realizar pruebas en cada caso. Las soluciones reveladoras y fijadoras se preparan y usan de acuerdo a las especificaciones del fabricante. El revelado sobre papel se puede controlar visualmente bajo luz roja o verde hasta que se adquiera la definicin deseada, en este paso puede corregirse ligeramente el contraste obtenido en el negativo variando el tiempo de exposicin y/o la apertura del diafragma. Si se aumenta cualquiera de estos, las reas iluminadas se harn mayores con respecto a las reas sombreadas, resultando en un aumento del contraste efectivo. Igualmente un revelador mas concentrado o tiempo de revelado mas largo permite obtener negativos mas contrastados y viceversa. Finalmente, es prudente anotar que la correcta alineacin del sistema de iluminacin y ptica es indispensable para una imagen de calidad.
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12.3
FOTOGRAFIA
El formato mas usado en fotografia de cromosomas es el de 35 mm ya sea por medio de fotomicroscopios automatizados ( con cmara incluida en su sistema) o de cmaras adaptadas a microscopios convencionales. Antes de iniciar el trabajo de fotografia en el laboratorio, se recomienda tomar unas fotos de prueba, con el fin de estandarizar los tiempos de exposicin y los filtros apropiados para lograr una buena calidad. Partiendo de la sensibilidad indicada de la pelcula, tomar varias fotografas exponiendo el doble del tiempo ( bajando el valor del ASA) o la mitad del tiempo (subiendo el valor del ASA) de la foto anterior. La fotografia de blanco y negro constituye el material fotogrfico de rutina en citogentica debido a que permite un mejor control de contraste, menores tiempos de exposicin y resultados mas rpidos. Para la eleccin de la pelcula deben tenerse en cuenta ciertas caractersticas como la sensibilidad al color, el contraste , la granularidad, el poder de resolucin y la velocidad.
12.4
PROCESO PARA REVELADO DE PELCULAS BLANCO Y NEGRO
PELCULA
REVELADOR DECKTOL 2:1 (2 AGUA Y 1 DECKTOL) 2 MIN DECKTOL 2:1 5 MINUTOS
LAVADO AGUA DE CHORRO 2 MINUTOS AGUA DE CHORRO 2 MINUTOS
FIJADOR SAL FIJADORA 5 MINUTOS SAL FIJADORA 5 MINUTOS
KODALITE
TIMAX
12.5
PROCESO PARA COPIADO DE PELCULAS BLANCO Y NEGRO A PAPEL
REVELADOR: DECKTOL en proporcion 2:1, 2 de agua destilada y 1 de Decktol. DETENEDOR: ACIDO ACETICO, 11ml de ac. acetico para 500 ml de agua destilada. FIJADOR: SAL FIJADORA, preparar segn instrucciones del fabricante.
Colocar el rollo en la copiadora y enfocar la imagen, ajustando el diafragma. Exponer la imagen sobre el papel con el lado brillante hacia arriba, abrir diafragma; durante 10-15 segundos (tiempo predeterminado).
Sumergir en la primera bandeja con el revelador (DECKTOL), hasta que la imagen aparezca clara y con la tonalidad deseada, sin sobrerevelar.
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Inmediatamente sumergir en la segunda bandeja con el detenedor durante 2-3 segundos aproximadamente.
(SLN AC. ACTICO),
Seguidamente, sumergir en la tercera bandeja con el fijador (SAL FIJADORA), dejar 5-10 minutos aproximadamente.
Pasar las fotos a la cubeta para el enjuague con agua de chorro y dejarlas 5-10 minutos.
Sacar las fotos de la cubeta , escurrirlas y colocarlas sobre una toalla, dejar secar a temperatura ambiente.
Recortar los cromosomas fotografiados para armar el Cariotipo respectivo, por paciente.
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13.
ANEXO A MATERIAL BSICO DE LABORATORIO DE CITOGENTICA
EQUIPO: Cmara de Flujo laminar Incubadora Centrfuga Nevera Microscopio con cmara fotogrfica Agitador magntico Potencimetro Balanza analtica Bomba de vaco Cuarto de fotografia con sus implementos VIDRIERIA Frascos esterilizables de almacenamiento Pipetas Pasteur Laminas portaobjetos Laminas cubreobjetos Probetas Vasos de precipitado Porta filtro de vidrio Embudos Kopling para coloracin OTROS Tubos de centrfuga de 15 ml graduados de polipropileno estriles Pipetas de 1,5 y 10 ml plsticas estriles Membrana de celulosa de 0.22 micras Lpiz de diamante Cinta de enmascarar Tijeras Papel de filtro Cajas de Petri plsticas grandes ANEXO B CUIDADOS ESPECIALES
14.
14.1
LIMPIEZA Y LAVADO DEL MATERIAL
Todos los elementos empleados en los cultivos celulares y en la preparacin de reactivos que en ellos intervengan, deben ser lavados, empacados y esterilizados de acuerdo con los procedimientos tradicionales para la preparacin del material estril. En especial se deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones:
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Sumergir el material usado (pipetas, frascos, etc) en una solucin jabonosa conteniendo un bactericida para evitar que residuos orgnicos o qumicos se adhieran al material. Lavar con abundante agua. Sumergir el material en bandejas con agua destilada por 12 horas efectuando recambios. Secar el material en una estufa a 30C. Empacar el material y tapar los frascos con papel para esterilizacin. Adherir al material cinta indicadora de esterilidad. Regular adecuadamente el tiempo y la presin de vapor de acuerdo con el tipo de material a esterilizar. 14.2 ESTERILIDAD DURANTE LA SIEMBRA
Por regla general los microorganismos crecen mas rpidamente que las clulas humanas, por lo que dependiendo del grado de contaminacin y del agente contaminante pueden producirse desde malas preparaciones y extendidos sucios hasta muerte celular. La contaminacin puede ser de dos tipos, la proveniente de flora bacteriana normal y que puede ser introducida durante la toma de la muestra o durante la siembra por inadecuada manipulacin del operario y la ambiental suspendida en el aire. Es necesario tener presente estos aspectos tanto en la siembra, como en la preparacin de los reactivos. Es recomendable el uso de cabinas de seguridad biolgica para reducir al mximo el riesgo de contaminacin durante los procedimientos. En caso de no disponer de un modelo comercial puede elaborarse un modelo artesanal, dotado igualmente de una lmpara germicida de luz ultravioleta que debe ser prendida por lo menos una hora antes de la siembra. Es conveniente recordar los efectos esterilizantes y destructivos de este tipo de luz por lo que se debe en lo posible evitar la exposicin directa especialmente sobre la retina. Antes y despus de cualquier procedimiento la cmara se debe desinfectar con una solucin bactericida como hipoclorito de sodio o benzal.
15. 15.1 MEDIO DE CULTIVO
APNDICE C PREPARACIN DE REACTIVOS
Comercialmente los medios de cultivo se consiguen en polvo e hidratados, la presentacin en polvo viene en frascos o sobres para la preparacin de un litro o 10 litros , de acuerdo con las necesidades de consumo individuales. Se recomienda el empleo de medios en polvo ya que son mas estables y de mas fcil almacenamiento. Las especificaciones para la rehidratacin de los diferentes medios ( MEM, RPMI, TC 199) vienen claramente definidos en las instrucciones proporcionadas por las casa productoras. Una vez rehidratado el medio, debe ser esterilizado por filtracin a travs de una membrana de celulosa de 0.22 micras y empacado en frascos de 100 o 200 ml previamente numerados para realizar el control de esterilidad, posteriormente se procede a su almacenamiento en nevera. La incorporacin de Bicarbonato de sodio al medio, puede realizarse en polvo (2.2 grs) durante la preparacin del mismo, o en solucin al 7.5 % p/v al momento del uso. Posteriormente se ajusta el pH a 6.9 si se trata de MEM o RPMI, o a 7.3 si se trata del medio TC 199, ya que la filtracin con vaco suele subir 0.1 o 0.2 unidades. El ajuste de pH se realiza con soluciones de HCl 1 N o NaOH 0.1 N estriles, segn sea el caso. 15.2 SOLUCIN DE ANTIBITICOS
Las contaminaciones mas comunes en el cultivo de linfocitos suelen producirse por una amplia gama de bacterias; loa antibiticos empleados para controlar la contaminacin consisten en una mezcla de
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Penicilina (5000 u/ml) para bacterias Gram positivas y Estreptomicina (5 mg/ml) para bacterias Gram negativas, preparado en agua destilada y adicionada al medio al 2%. La cantidad preparada debe calcularse con base en el consumo mensual, ya que no es conveniente su almacenamiento por un periodo de tiempo largo. Clculos: Penicilina ( 5000 u/ml ) 1 mg X 1670 U 5000 U
X = 2.99 mgs
PENICILINA GRS 0.00299 0.0598 0.1495 0.299 0598
VOLUMEN H2O ml 1 20 50 100 200
Estreptomicina ( 5000ug/ml ) 1 mg X 1000 ug 5000 ug
X = 5000 mg
ESTREPTOMICINA GRS 0.005 0.1 0.25 0.5 1.0
VOLUMEN H2O ml 1 20 50 100 200
Pesar cada uno por separado y mezclarlos en la cantidad de agua a preparar. Adicionar a 100 ml de medio el 2 % de los antibiticos, o a 500 ml de medio 10 ml, o 29.9 mgr de penicilina + 50 mgr de estreptomicina disuelto directamente en el medio. 15.3 FITOHEMAGLUTININA
La fitohemaglutinina M se consigue comercialmente liofilizada para rehidratar en 5 ml de agua destilada estril y usar directamente a partir de esta preparacin. La fitohemaglutinina P es mucho mas pura y concentrada, que la fitihemaglutinina M, por lo cual se debe calcular la solucin apropiada para que su concentracin final en el cultivo no sea mayor de 10 mg/ml , concentracin que corresponde al tope de su actividad mitogenica sin llegar a ser aglutinante. SOLUCIN MADRE Se rehidrata con 5 ml de agua destilada estril. SOLUCIN USO DIARIO (U.D.): 0.35 ml de Solucin Madre + 4.65 de agua destilada estril.
29
15.4
COLCHICINA
Se prepara una Solucin Madre al 0.16 % en agua destilada estril. Congelada y protegida de la luz es estable por ms de un ao. La Solucin de U.D. se prepara a partir de la Solucin Madre diluyendo 1/10 y se aplica 0.1 ml por cada 5ml de cultivo.
CLCULOS SOLUCIN MADRE 0.16 grs X 100 ml 50 ml
X = 0.08 grs
COLCHICINA GRS 0.04 0.08 0.016 0.32 SOLUCIN DE USO DIARIO 1 ml de Solucin Madre + 9 ml de agua destilada 15.5 SOLUCIN HIPOTNICA
VOLUMEN H2O ML 25 50 100 200
0.16 mg/ml
La precisin en la preparacin y el tiempo de tratamiento hipotnico son fundamentales para la obtencin de metafases optimas para su estudio: abiertas, fciles de contar y con bajo numero de cromosomas sobrepuestos. Existen varios tipos de soluciones hipotnicas que incluyen: suero diluido al 20 %, citrato de sodio al 1% o cloruro de potasio 0.075 M; el KCL es el mas recomendado.
CLCULOS KCL 0.075 M 74.56 grs X 1M 0.075 M
X = 5.592 grs
1000 ML
KCL GRS 1.118 1.398 2.796 5.592
VOLUMEN H2O ML 200 250 500 1000
El agua destilada debe permanecer a una temperatura mas o menos de 37 C antes de agregar el KCL, mezclar y guardar en la incubadora a 37C.
30
15.6
COLORANTE GIEMSA
Muchos laboratorios producen el colorante Giemsa en solucin lista para su uso, sin embargo tambin es frecuente disponer del reactivo en polvo. Para la preparacin de un litro de Giemsa se requiere: Colorante de Giemsa certificado en polvo 7.5 grs Metanol 650 ml Glicerina 350 ml Mezclar el metanol y la glicerina hasta obtener una solucin homognea, agitar constantemente y adicionar el colorante. Para homogenizar la solucin se recomienda el empleo de perlas de vidrio. Se puede agilizar la disolucin mediante un calentamiento al bao maria a 55-60C por 48 horas con agitacin ocasional. Una vez solubilizado el colorante se filtra en papel Whatman y se conserva en frasco oscuro cerrado hermticamente para evitar su deterioro. Es importante dejar el colorante en reposo por lo menos un mes antes de su uso para obtener una accin homognea en la tincin. Para su uso diario se empaca en alcuotas y se filtra nuevamente antes de usar.
15.7
TAMPN GIEMSA PH 6.8
Consiste en una mezcla a partes iguales de Na 2HPO4 0.06 M y KH2PO4 0.06M. El pH se ajusta a 6.8 agregando gotas de las mismas soluciones y se conserva en nevera. Para evitar la perdida de grandes lotes por contaminacin se aconseja empacar en alcuotas de 20 25 ml y esterilizar por calor.
CLCULOS SOLUCION A: KH2PO4 0.06M ( Potasio Fosfato monobsico ) P.M. 136.09 grs X 1M 0.06M X= 8.165 grs 1000 ML
KH2PO4 GRS 0.408 1.633 2.042 4.08 8.165
VOLUMEN H2O ML 50 200 250 500 1000
SOLUCIN B: Na2HPO4 .12 H2O P.M. 358.14 grs X X= 21.5 grs 1M 0.06 M 1000 ml
Na2HPO4 P.M. 142.0 grs X X= 8.52 grs

1M 0.06 M 1000 ml
31
Na2HPO4 .12 H2O GRS 1.08 4.3 5.38 10.75 21.5
Na2HPO4 GRS 0.43 1.70 2.13 4.26 8.52
VOLUMEN H2O ML 50 200 250 500 1000
SOLUCIN DE TRABAJO 51 ml Solucin KH2PO4 + 49 ml Solucion Na2HPO4 .12 H2O o Na2HPO4. Ajustar el pH a 6.8. Una vez preparada la solucin tampn, se debe guardar en nevera, al igual que cada una de las soluciones que hayan sobrado, pues se pueden utilizar para preparar ms de la solucin tampn posteriormente. No se debe guardar por mas de dos meses.
15.8 SOLUCIN SALINA CITRATADA ( 2 x SSC)
Es una solucin salina balanceada que se emplea en las coloraciones diferenciales. Se prepara mezclando partes iguales de NaCl 0.3 M y Citrato de Sodio 0.03 M. CLCULOS NaCL 0.3 M + CITRATO DE SODIO 0.03 M en partes iguales
NaCL P.M. 58.45 grs X 1M 0.3 M
X = 17.54 grs
1000 ml
NaCL GRS 0.88 3.51 4.39 8.77 17.54 CITRATO DE SODIO P.M. 294.091 X 1M 0.03 M
VOLUMEN H2O ML 50 200 250 500 1000
X = 8.82 grs
1000 ml
32
CITRATO DE Na GRS 0.44 1.76 2.21 4.41 8.82
VOLUMEN H2O ML 50 200 250 500 1000
EJEMPLO: Mezclar 8.77 grs + 4.41 grs + 500 ml agua destilada.
15.9
TRIPSINA
Se prepara una solucin al 0.1 % en solucin salina 0.9 % tibia (32C ) y se lleva a la estufa a 37 C por 45 min. Se filtra con papel Whatman No 1 y se empaca en alcuotas de 15 25 ml para almacenar congelada. Una misma alcuota puede usarse para 8 10 laminas, debe ser cambiado, diariamente o descartarse despus de permanecer descongelada ms de 3 horas. CALCULOS 0.1 grs Tripsina 100 ml de S:S 0.9% tibia llevar a la estufa a 37C por 45 min antes de envasar, filtrar y guardar en el congelador.
TRIPSINA GRS 0.1 0.25 0.5 1.0
VOLUMEN H2O ML 100 250 500 1000
15.10
BROMODESOXIURIDINA
Se prepara una solucin de Brdu a una concentracin de 2 mgrs por ml de agua destilada y se aplican 0.1 ml por cada 5 ml de cultivo. Esta solucin protegida de la luz y guardada a 20C permanece estable durante varios meses. CLCULOS 0.004 grs Bromodesoxiuridina 1 ml de H2O o S.S. U.D. Solucin de Uso Diario. S.M. Solucin Madre.
1 ml de S.M. + 3 ml H2O o S.S. SOLUCIN MADRE
Brdu grs 0.02 0.04

Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero Revis: Dra. Yanith Piragauta G.
VOLUMEN H2O o S.S. ML 5 10

33
0.06 0.08 SOLUCIN USO DIARIO SOLUCIN MADRE 1 2 3 4
15 20
VOLUMEN H2O o S.S. ML 3 6 9 12
METOTREXATE SOLUCIN MADRE P.M. 477.46 grs X 1 ml de S.M. + 9 ml de S.S. 1M -4 10 (0.0001)
X = 0.005 grs
100 ml
U.D. Solucin Uso Diario
SOLUCION MADRE:
METOTREXATE GRS 0.00025 0.0005 0.00075 0.001 HOECHST 33258 CLCULOS
VOLUMEN S.S. ML 5 10 15 20
Pesar 0.005 grs por cada 100 ml de agua destilada estril, filtrar, guardar protegido de la luz y en refrigeracin. Se recomienda preparar la cantidad necesaria para la solucin de Uso Diario, la cual se debe utilizar mximo de 6 a 8 veces. Si se precipita se debe filtrar de nuevo y agregarle un poquito del Reactivo en polvo.
HOECHST 33258 GRS 0.0025 0.005 0.0075 0.01
VOLUMEN H2O ML 50 100 150 200
BUFFER MACILVAINE SOLUCION A:
34
Na2HPO4 .12 H2O 0.1M P.M. 358.14 grs/ml n M= ---------n= 1.0M x 1 litro n= 0.1moles litro gr n= ------gr= 0.1x358,4 gr=35,84 en 1 litro. PM
Na2HPO4 P.M. 142.0 grs igual
gr= 14.2gr en 1 litro
35.814 grs 1000 ml x 500ml x= 17.92 ml Na2HPO4 .12 H2O GRS 1.79 7.16 8.95 17.91 35.814 SOLUCION B ACIDO CITRICO 0.1M PM: 210.15 gr/ml gr n= ---------PM
14.2grs x X= 3.55 grs Na2HPO4 GRS 0.71 2.84 3.55 7.1 14.2
1000 ml 250 ml
VOLUMEN H2O ML 50 200 250 500 1000
gr= 0.1x210.15
gr= 21.015 en 1 litro.
P.M. 21.015 grs X
1000ml 250ml
X = 5.25 grs
250ml VOLUMEN H2O ML 50 200 250 500 1000
ACIDO CTRICO GRS 1.050 4.20 5.25 10.51 21.015
A la Solucin A una vez preparada, agregarle Solucin B agitando constantemente hasta ajustar pH 7.0. Una vez preparada la solucin tampn, se debe guardar en nevera, al igual que cada una de las soluciones que hayan sobrado, pues se pueden utilizar para preparar ms de la solucin tampn posteriormente. No se debe guardar por mas de dos meses. 15.11 TAMPN GIEMSA PH 7.2
Consiste en una mezcla de Na2HPO4 .12 H2O( SOLUCIN A) y NaH2PO4 (SOLUCIN B). Ajustar PH a 7.2 agregando gotas de las mismas soluciones y se conserva en nevera. CLCULOS
35
SOLUCION A: Disolver 0.58 grs de Na2HPO4 .12 H2O Na2HPO4 .12 H2O GRS 0.58 1.16 1.74 SOLUCION B: 500 ml de H2O Na2HPO4 GRS 0.23 0.46 0.69 VOLUMEN H2O ML 500 1000 1500
Disolver 0.358 grs de Na H2PO4
500 ml de H2O VOLUMEN H2O ML 500 1000 1500
Na H2PO4 GRS 0.358 0.72 1.1
SOLUCIN DE TRABAJO A la Solucin A una vez preparada, agregarle Solucin B agitando constantemente hasta ajustar pH 7.2. Una vez preparada la solucin tampn, se debe guardar en nevera, al igual que cada una de las soluciones que hayan sobrado, pues se pueden utilizar para preparar ms de la solucin tampn posteriormente. No se debe guardar por ms de dos meses.
CIDO CLORHDRIC0 1 N (HCL) P.M. 36.46 grs Densidad 1.19gr/ml d = P/V
Pureza. 37%v/v
d=P/V
V = P/d
V = 36.46/1.19
V = 30.6 ml HCl en 100ml
Pureza
30.6 ml X
100ml 37ml
X = 11.32 ml en 100ml a 37% de pureza.
HCl 1 N ml 153 76.5

Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero Revis: Dra. Yanith Piragauta G.
VOLUMEN H2O ML 500 250

36
11.32 ACIDO CLORHDRICO 0.2 N (HCL) P.M. 36.46 grs Densidad 1.19gr/ml Pureza. 37%v/v
37
36.46 grs X
1N 0.2 N
X = 7.292 grs
d = P/V Pureza
V = P/d 6.13ml X
V = 7.292/1.19 100ml 37ml
V = 6.13 ml
X = 2.27 ml en 100ml a 0.2N, 37% de pureza
HCL 0.2 N ml 22.7 11.35 2.27
VOLUMEN H2O ML 1000 500 100
HIDRXIDO DE BARIO
Ba(OH)2. PM: 171.34, 5%
5gr de Ba(OH)2 X
100ml H2O 500ml H2O Ba(OH)2 5%gr/ml 25 12.5 5 2.5 VOLUMEN H2O ML 500 250 100 50
Ba(OH)2 5% + 8H2O. PM: 315.50
1mol Ba(OH)2 315.50 gr/mol Ba(OH)2 + 8H2O. 5gr Ba(OH)2 x ---------------------------------------- x -------------------------------------------- = 9.2 gr Ba(OH)2 171.5 gr/mol Ba(OH)2 1 mol Ba(OH)2 + 8H2O
37
Ba(OH)2+ 8H2O 5% g/ml 46 23 9.20 4.6
VOLUMEN H2O ML 500 250 100 50
16.
GLOSARIO
ABERRACIONES CROMOSOMICAS: Alteraciones numricas o estructurales en los cromosomas. ABERRACIONES CROMOSOMICAS BALANCEADAS: Las que no conllevan perdida de material gentico, sino solo reajustes de los cromosomas, por ejemplo, algunas translocaciones. ACROCENTRICOS: Aquellos cuyo centrmero esta localizado muy cerca de uno de los extremos y divide el cromosoma en dos brazos muy desiguales. ANAFASICOS: Los cromosomas que son visibles durante la anafase de la divisin celular estn formados por una sola cromatide. ANILLO: Se forman por la aparicin de dos roturas cromosomicas en un cromosoma y la reunin de los extremos rotos. BRAZOS DE UN CROMOSOMA: Cada una de las partes de un cromosoma que resultan al trazar un eje longitudinal por el centrmero. CARIOTIPO: Hacer una caracterizacin de un conjunto de cromosomas de un individuo (planta o animal) con relacin a su numero, tamao y posicin del centrmero. CENTRMERO: Regin de l cromosoma a la que se unen las fibras del huso y que es necesaria para el movimiento hacia los polos durante la anafase. CENTRMEROS LATENTES: Los existentes en los cromosomas con mas de un centrmero y que no son funcionales. CITOGENTICA: El estudio de los sistemas biolgicos mediante mtodos combinados citologa y gentica. COMPLEMENTO CROMOSMICO: Conjunto de cromosomas de una celula o de un individuo. CROMATIDE: La mitad de un cromosoma replicado que se encuentra unida a la otra cromatide en la regin del centrmero. CROMATINA DE BARR: Masa heterocromatica existente en los ncleos de las clulas de las hembras de los mamferos que corresponde al cromosoma X inactivo. Es sinnimo de cromatina sexual y cromatina X. CROMOSOMA: Cuerpos bastoniformes que aparecen durante la divisin celular; se tien intensamente con giemsa, lo que permite su visualizacin con el microscopio ptico y contienen los genes que determinan las caractersticas de cada especie. Los cromosomas pueden considerarse
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como las unidades discretas que resultan del empaquetamiento del material gentico para facilitar su separacin durante la mitosis y la meiosis. CULTIVO ASINCRNICO: Cultivo celular en el que hay una poblacin mixta de clulas en cada fase del ciclo celular. CULTIVO SINCRNICO: Cultivo celular en el que una gran proporcin de las clulas estn en la misma fase del ciclo celular. DELECION: Perdida de parte de un cromosoma o molcula de ADN del genoma. DISOMIA UNIPARENTERAL: Herencia de dos copias de un locus gnico, procedente de uno solo de los padres. DICENTRICOS: Los que tienen dos centrmeros. Se pueden constituir de dos maneras: 1) Mediante la formacin de isocromosomas o 2) mediante la reunin de las partes centromericas de dos cromosomas que tienen una rotura cromosomica cada uno. DISYUNCIN: Separacin de las cromatides durante la anafase de la mitosis y de los cromosomas o de las cromtides durante cada una de las dos divisiones meioticas. DUPLICACIN: Cambio gentico que se produce por la repeticin de un segmento de un cromosoma o de una secuencia de ADN. ENDORREDUPLICACIN: Proceso que, como consecuencia de una endomitosis, conlleva a la duplicacin del numero de cromatides. Los cromosomas al quedar constituidos por 4 cromatides, se denominan diplocromosomas. EUCROMATINA: Tipo de cromatina que contiene los genes transcripcionalmente activos. En los ncleos interfasicos, a diferencia de la heterocromatina, no se tie diferencialmente. FOTORREACTIVACION: Mecanismo de reparacin del ADN daado por la accin de la luz UV, que tiene lugar en presencia de la luz visible. FRAGMENTO ACENTRICO: Fragmento cromosmico pareado, de longitud variable, que carece de centrmero y se origina como consecuencia de roturas cromosomicas. FUSIN CNTRICA: Unin de dos cromosomas acrocentricos por los centrmeros para dar lugar a un cromosoma metacntrico o submetacentrico. GENOMA: Contenido total de ADN de una clula o de un organismo. HETEROCROMATINA: Cromatina del ncleo interfasico que puede estar condensada ya sea siempre (constitutiva ) o en algunas clulas solo en ciertas ocasiones ( facultativa ). HOMLOGOS : Los que tienen la misma morfologa, el mismo patrn de bandas, contienen los genes que codifican para las mismas caractersticas y se emparejan durante la meiosis. IDIOGRAMA: Esquema representativo del cariotipo de una especie animal o vegetal. El idiograma se elabora mediante el estudio de las particularidades de varios cariotipos, por lo que es una abstraccin de estos. NDICE MITTICO: Proporcin de clulas que estn en divisin en un momento determinado en un cultivo celular o en tejido vivo.
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INVERSIN: Aberracin cromosomica estructural consistente en el cambio de posicin de una regin cromosomica como consecuencia de dos roturas y del giro de 180 de la regin libre. En las inversiones pericentricas, el centrmero esta incluido en la regin invertida, mientras que en las paracentricas no. ISOCROMOSOMAS: Cromosomas en los que el brazo corto es idntico al brazo largo, tanto en su longitud como en su patrn de bandas. Se originan por la escisin longitudinal del centrmero y la replicacin de cada uno de los brazos. MARCADORES: Los cromosomas que tienen una morfologa diferente a la de los existentes en el cariotipo normal y se encuentran presentes en un gran porcentaje de clulas. Se han producido por reajustes cromosmicos. METACNTRICOS: Los que tienen el centrmero alrededor del centro del cromosoma y lo dividen en brazos de tamao muy similar. MONOSOMIA: Condicin de una clula o individuo que presenta una copia de un cromosoma determinado en vez de las dos copias esperadas en un estado diploide, como es el caso de las mujeres 45,X con Sndrome de Turner. MOSAICO: Se presenta cuando un cultivo celular o un individuo tienen dos o mas lneas celulares con diferentes complementos cromosmicos. NO DISYUNCIN: Separacin incorrecta de los cromosomas homlogos o de las cromatides hermanas durante la divisin nuclear, producindose clulas o individuos que poseen un numero aneuploide de cromosomas. PATRONES DE REPLICACIN: Manera secuencial de replicarse el ADN de los cromosomas de las clulas eucariticas durante la fase S del ciclo celular. POLIPLOIDIA: Situacin en la que hay mas de dos complementos cromosmicos en las clulas somticas de un individuo. PROMETAFASE: Fase anterior a la metafase y posterior a la profase en la que los cromosomas siguen condensndose y, por lo tanto, son mas cortos y gruesos que en profase, pero, menos que en metafase. REGIONES ORGANIZADORAS DEL NUCLEOLO (NOR): Regiones particulares de lo cromosomas que originan la formacin del nucleolo en la interfase y que contienen los genes ribosmicos 18S y 28S. En la especie humana, se encuentra en las constricciones secundarias de los cromosomas acrocentricos de los grupos D y G (pares 13,14,15, 21 y 22). RUPTURA CROMOSOMICA: Discontinuidad en la morfologa de un cromosoma. SUBMETACENTRICOS: Los que tienen el centrmero desplazado hacia uno de los extremos y divide el cromosoma en dos brazos de longitud desigual. TRANSLOCACIN: Reordenamiento estructural que involucra cromosomas o segmentos de cromosomas. TRISOMIA: Condicin de una clula o individuo que posee tres copias de un cromosoma particular, como es el caso de la trisomia 21 o Sndrome de Down; condicin aneuploide.
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17.
BIBLIOGRAFA
SILVA, Elizabeth. CITOGENTICA HUMANA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS. INS. Bogot. Noviembre. 1991. CRANE, Cecilia. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE TCNICAS DE ALTA RESOLUCIN CROMOSOMICA. INS. Bogot. Octubre. 1998.
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APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

GUIA DE CITOGENETICA HUMANA CODIGO: ADx-G-G001 VERSION: 02-2011

CULTIVO DE LINFOCITOS PARA LA OBTENCIN DE METAFASES

Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero

Revis: Dra. Yanith Piragauta G.

Valid: Dr. Fernando Anibal Pea Diaz

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

GUIA DE CITOGENETICA HUMANA CODIGO: ADx-G-G001 VERSION: 02-2011

TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE LA MUESTRA

TCNICA PARA CULTIVO Y PREPARACIN CROMOSOMICA CULTIVO DE ALTA RESOLUCIN

CULTIVO POR DUPLICADO

Incubar a 37C durante 70 horas.

Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero

Revis: Dra. Yanith Piragauta G.

Valid: Dr. Fernando Anibal Pea Diaz

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

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Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero

Revis: Dra. Yanith Piragauta G.

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APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

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Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y eliminar el sobrenadante.

Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero

Revis: Dra. Yanith Piragauta G.

Valid: Dr. Fernando Anibal Pea Diaz

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

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Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante

Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero

Revis: Dra. Yanith Piragauta G.

Valid: Dr. Fernando Anibal Pea Diaz

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

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SEDIMENTO 6.3 PREPARACIN DE LAS LAMINAS PARA EL GOTEO

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

GUIA DE CITOGENETICA HUMANA CODIGO: ADx-G-G001 VERSION: 02-2011

RPMI + SFB + PHA + SANGRE TOTAL 72 HORAS A 37 C

0.1ml METOTREXATE 10 M 15 17 HORAS A 37C

0.1ml BROMODESOXIURIDINA 1mg/ml 5 5 HORAS A 37C

Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero

Revis: Dra. Yanith Piragauta G.

Valid: Dr. Fernando Anibal Pea Diaz

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

GUIA DE CITOGENETICA HUMANA CODIGO: ADx-G-G001 VERSION: 02-2011

GOTEO (LAMINAS HMEDAS Y FRAS)

7. TCNICA DE CULTIVO CONVENCIONAL PARA LA OBTENCIN DE CROMOSOMAS EN METAFASE

Incubar durante 69 horas a 37C.

CULTIVO POR DUPLICADO

Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero

Revis: Dra. Yanith Piragauta G.

Valid: Dr. Fernando Anibal Pea Diaz

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

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COSECHA: Adicionar 0.1 ml de Colchicina, incubar 15 minutos exactos a 37C.

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

GUIA DE CITOGENETICA HUMANA CODIGO: ADx-G-G001 VERSION: 02-2011

Adicionar 5 ml de Carnoy (6:1) y dejar reposar por 5 minutos.

SEDIMENTO 7.3 DIAGRAMA

Elabor: Olga Lucia Gutierrez Rosa Helena Romero

Revis: Dra. Yanith Piragauta G.

Valid: Dr. Fernando Anibal Pea Diaz

APOYO DIAGNOSTICO GENETICA

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