Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Agrarias Escuela de Agronoma

Evaluacin del rol de tres sistemas enzimticos en la resistencia de Tuta absoluta (Meyrick) a spinosad

Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al ttulo de Ingeniero Agrnomo

Karen Gusela Rocha Sez

Valdivia Chile 2011

PROFESOR PATROCINANTE:

____________________________________ Maritza Reyes C. Ing. Agrnomo, Mag. Sc., Dr. Cs. Agr. Produccin y Sanidad Vegetal

PROFESORES INFORMANTES:

____________________________________ Laura Bhm S. Ingeniero Agrnomo Produccin y Sanidad Vegetal

___________________________________ Roberto Carrillo Ll. Ing. Agrnomo, Mag. Sc., Ph.D. Produccin y Sanidad Vegetal

NDICE DE MATERIAS

Captulo RESUMEN SUMMARY 1 2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.2 2.2.1 2.2.1.1 2.2.1.2 2.2.2 2.2.2.1 2.2.2.2 2.2.2.3 INTRODUCCIN REVISIN BIBLIOGRFICA Taxonoma y biogeografa de Tuta absoluta Descripcin y biologa de Tuta absoluta Importancia de la polilla del tomate Control de Tuta absoluta Resistencia a insecticidas Resistencia cruzada y mltiple Resistencia cruzada Resistencia mltiple Mecanismos de resistencia Resistencia por comportamiento Resistencia a la penetracin Insensibilidad del sitio de accin (ISA)

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2.2.2.3.1 2.2.2.3.2 2.2.2.3.3 2.2.2.4 2.2.2.4.1 2.2.2.4.2 2.2.2.4.3 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4.2

Acetilcolinesterasa Resistencia al derribo o knockdown resistance (Kdr) Insensibilidad a los ciclodienos Resistencia metablica Oxidasas de funcin mltiple (MFO) Glutatin S-transferasas (GST) Esterasas (EST) MATERIAL Y MTODO Colecta de poblaciones de larvas de Tuta absoluta Test toxicolgicos Determinacin de actividad enzimtica Preparacin de extractos enzimticos Determinacin de la actividad de las oxidasas de funcin mltiple Determinacin de la actividad de las glutatin S-transferasas Determinacin de la actividad de las esterasas Diseo experimental Anlisis estadstico PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS Efectividad de la dosis diagnstica de spinosad Actividad de oxidasas de funcin mltiple (MFO)

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4.3 4.4 4.5 4.6 5 6 7

Actividad de glutatin S-transferasas (GST) Actividad de esterasas (EST) Relacin entre mortalidad y los tres sistemas enzimticos Relacin entre mortalidad y nmero de aplicaciones de insecticidas durante la temporada del cultivo CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS

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NDICE DE CUADROS

Cuadro 1 Duracin promedio del ciclo de desarrollo de la polilla del tomate T. absoluta (Meyrick) a distintas temperaturas. 2 Registro de insecticidas a los que T. absoluta ha desarrollado resistencia. 3 Ubicacin de las poblaciones estudiadas recolectadas en cultivos de tomate en Chile y el tipo de proteccin utilizada para su control. 4 Susceptibilidad a concentracin diagnstica de spinosad de larvas de tercer estado de una poblacin de referencia y cinco poblaciones de campo de T. absoluta. 5 Actividad in vivo de enzimas oxidasas de funcin mltiple (MFO) en larvas de tercer estado de una poblacin de referencia y cinco poblaciones de campo de T. absoluta. 6 Actividad in vitro de las enzimas glutatin S-transferasas (GST) en larvas de tercer estado de una poblacin de referencia y cinco poblaciones de campo de T. absoluta. 7 Actividad in vitro de las esterasas (EST) y en larvas de tercer estado de una poblacin de referencia y cinco poblaciones de campo de T. absoluta.

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NDICE DE FIGURAS

Figura 1 Representacin de las fases del metabolismo de detoxificacin de los insecticidas que tienen lugar en el interior del insecto. 2 Representacin de la reaccin de oxidacin catalizada por las oxidasas de funcin mltiple (MFO). 3 Representacin de la reaccin de conjugacin catalizada por las glutatin S-transferasas (GST). 4 Frecuencia de larvas resistentes por poblacin, de acuerdo a la actividad de enzimas MFO (RMFO).

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NDICE DE ANEXOS

Anexo 1 Antecedentes de los distintos insecticidas aplicados en los cultivos de tomates durante la temporada de colecta de larvas de T. Absoluta 2 Anlisis Probit para determinacin de dosis diagnstica de spinosad

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RESUMEN

La herramienta de control para reducir las poblaciones de Tuta absoluta se ha basado durante aos en aplicaciones qumicas, principalmente con insecticidas del grupo de los piretroides y organofosforados, lo que ha trado como consecuencia el desarrollo de resistencia a varios de ellos. Como respuesta a lo anterior, se han incorporado nuevos productos que prometen ser eficaces, entre los que se pueden mencionar spinosad. Estudios con este insecticida han mostrado que ya existiran prdidas de susceptibilidad en poblaciones chilenas de T. absoluta, lo que estara asociado a mecanismos enzimticos detoxificadores. Con el objetivo de evaluar la participacin de tres sistemas enzimticos detoxificantes sobre la susceptibilidad de T. absoluta a spinosad se utilizaron larvas de tercer estado de cinco poblaciones de campo (Lluta, Azapa1, Azapa2, Coln, y Valdivia) de tres regiones de Chile, y una poblacin susceptible que se utiliz como referencia. Se evalu la mortalidad al ser expuestas a una dosis diagnstica de 1 mg L-1 de ingrediente activo, mediante la metodologa de la hoja sumergida. Adicionalmente, se midi la actividad de las oxidasas de funcin mltiple (MFO) y glutatin S-transferasas (GST) a travs de fluorometra, y las esterasas (EST) por absorbancia. La mortalidad larvaria frente a spinosad fue significativamente menor en las poblaciones de Lluta (39,9%), Azapa1 (44,9%), Azapa2 (45,0%) y Coln (53,5%), respecto de la poblacin de referencia (85,0%). La actividad ms alta de las MFO fue observada en las poblaciones de Lluta y Azapa2, siendo la poblacin de referencia la que present la menor actividad. La actividad de las GST no alcanz diferencias significativas en ninguna de las poblaciones a excepcin de la poblacin de Azapa1. De los dos sustratos utilizados para medir las EST, -naftil acetato mostr las mayores diferencias entre las poblaciones; con las actividades ms altas en Azapa1 y Azapa2; y la ms baja en la poblacin de referencia. De lo anterior, se deduce que los mecanismos enzimticos estudiados estaran implicados en la resistencia de poblaciones chilenas de T. absoluta a spinosad, siendo de mayor importancia las MFO, seguidas por las -esterasas y finalmente las GST.

SUMMARY

The control tool for reducing the population of Tuta absoluta has been based for years in chemical applications, mainly with insecticides from the pirethroids and

organophosphates groups. As a consequence Tuta absoluta has developed resistance to many of them. Because of this, new products which promise to be effective have been introduced, among these it is worth mentioning spinosad. Studies with this insecticide have shown that it already presents losses of susceptibility in Chilean populations of T. absoluta, which are associated with detoxification mechanisms. With the objective of evaluate the participation of the detoxification enzyme systems regarding the susceptibility of T. absoluta to spinosad, third instar larvae were used from 5 field populations (Lluta, Azapa1, Azapa2, Coln, and Valdivia) from three regions of Chile, along with one susceptible population which was used as a reference. Mortality was evaluated by exposure to a diagnostic dose of 1 mg L -1 of the active ingredient, using the methodology of dipped leaf. Additionally the activity of the mixed function oxidases (MFO) y glutathione S-transferases (GST) were measured by fluorometry, and the esterase (EST) was determined by absorbance. The larvae mortality caused by spinosad was significantly lower in the populations of Lluta (39.9%), Azapa1 (44.9%), Azapa2 (45.0%) and Coln (53.5%), compared to the reference population (85.0%). The highest activity of the MFO was observed in the populations of Lluta and Azapa2, while the reference population had the lowest activity. The activity of the GST did not demonstrate significant changes in any of the populations with the exception of the population Azapa1. Of the two substrates used to measure the EST, naftil acetate showed the greatest differences between the populations; with the highest activity en Azapa1 and Azapa2; and the lowest one in the reference population. From the above, we can deduce that the enzyme mechanisms are implicated in the resistance of Chilean populations of T. absoluta to spinosad, the MFO being the most important, followed by the -esterases and lastly the GST.

1 INTRODUCCIN

Tuta absoluta, comnmente denominada polilla del tomate, es un microlepidptero considerada plaga primaria en tomate (Solanum lycopersicum L.). Su importancia econmica radica en que la larva es capaz de minar hojas y frutos, pudiendo si no se controla generar prdidas de hasta un 100% de los rendimientos del cultivo. Esta especie, se encuentra distribuida en toda Amrica Latina, e incluso en pases europeos como Espaa y Francia, y otros de la costa del Mediterrneo. En Chile fue descubierta por primera vez en 1955 en la regin de Tarapac, y hoy en da se distribuye desde la primera a la dcima regin, afectando una superficie potencial de aproximadamente 20.000 hectreas entre cultivos bajo plstico y al aire libre. La herramienta ms utilizada para controlar T. absoluta es a travs del uso de insecticidas; lo que ha llevado a someter las poblaciones del insecto a una alta presin de seleccin, presentado a consecuencia de ello una baja efectividad de los insecticidas en el control de esta plaga. En Chile, existen registros de prdida de eficacia de varios insecticidas tradicionalmente utilizados contra T. absoluta, principalmente piretroides y organofosforados. Estudios actuales, indican tambin la presencia de resistencia a insecticidas de reciente uso como spinosad, sin embargo, no se ha precisado el mecanismo responsable de la resistencia. Dado que en otros lepidpteros existen casos de resistencia que estn asociados a mecanismos de detoxificacin, el presente trabajo plantea como hiptesis que la baja susceptibilidad a spinosad en poblaciones chilenas de T. absoluta se debe a la accin de mecanismos enzimticos involucrados en la detoxificacin de dicho insecticida. El objetivo general de este estudio, es evaluar la participacin de tres sistemas enzimticos detoxificantes sobre la susceptibilidad de T. absoluta a spinosad. Como objetivos especficos se plantea: Determinar el nivel de susceptibilidad a spinosad en larvas de tercer estado (L3) de cinco poblaciones de campo y una poblacin de laboratorio de T. absoluta.

Medir la actividad de las enzimas detoxificadoras, glutatin S-transferasas (GST), esterasas (EST) y oxidasas de funcin mltiple (MFO).

Relacionar los niveles de susceptibilidad a spinosad detectados y la actividad de las enzimas detoxificadoras analizadas.

Determinar la relacin entre susceptibilidad y presin de seleccin

2 REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1 Taxonoma y biogeografa de Tuta absoluta La polilla del tomate pertenece a la clase Insecta, y se incluye en el orden Lepidoptera, suborden Glossata, familia Gelechiidae, gnero Tuta y especie Tuta absoluta (ARTIGAS, 1994). VARGAS (1970), seala que este microlepidptero fue originalmente descrito como Phthorimaea absoluta, por el entomlogo ingls E. Meyrick en 1917, en un ejemplar macho colectado en la localidad de Huancayo, Per . Posteriormente, recibi otras cuatro denominaciones, ubicndosele finalmente en el gnero Tuta (Barrientos, 1997 citado por DELBENE, 2003). T. absoluta es considerada una plaga que afecta directamente la produccin de tomate, encontrndose en toda Amrica Latina, principalmente en zonas montaosas. En Chile se encuentra entre la primera y dcima regin, en el archipilago de Juan Fernndez e Isla de Pascua (ARTIGAS, 1994). 2.1.1 Descripcin y biologa de Tuta absoluta. En su estado adulto la polilla del tomate mide 7 mm de largo y puede llegar a alcanzar hasta 11 mm con las alas totalmente expandidas. La polilla posee un primer par de alas angostas de color gris oscuro jaspeado con manchas pardas y un segundo par de alas de un tono gris brillante (ESTAY, 2001). Las antenas son filiformes y largas, con anillos de colores caf claro y oscuros alternados. El abdomen es de color caf cremoso, siendo ms grueso en las hembras que en los machos, las que en general presentan una configuracin ms robusta (QUIROZ, 1976). Las hembras llegan a tener hasta seis cpulas durante su vida; siendo el periodo ms prolfico siete das despus del primer apareo, logrando poner el 76% de los huevos (ESTAY, 2001). ESTAY (2001), indica que el ciclo de vida de T. absoluta se inicia con la oviposicin y que en condiciones de campo, los huevos son depositados en el haz o en el envs de la hoja, cercanos a las nervaduras, depresiones y mrgenes de los tallos, y en frutos

verdes, nunca en frutos maduros. Esto ocurre principalmente en los spalos y en la superficie de stos en condicin de cultivo forzado. De acuerdo a FERNNDEZ y MONTAGNE (1990), las hembras pueden oviponer alrededor de 241,8 31,14 huevos. Inicialmente los huevos son blancos amarillentos y brillantes, de superficie irregular, elptico, con un largo promedio de 0,38 y un ancho de 0,23 mm. Posteriormente, adquieren una coloracin oscura interior, visible a travs del corin del cual la larva en gestacin se separa (VARGAS, 1970; QUIROZ, 1976). VARGAS (1970) indica que la larva tiene forma cilndrica, mide en promedio 0,85 mm de largo al eclosar y al terminar el estado alcanza 1,61 mm. Es de color blanco y cabeza oscura, la cpsula postceflica est bien marcada en el primer segmento torxico. Prximo al cambio de estado, adquiere un color verdoso que se torna blanquecino despus de la primera muda (QUIROZ, 1976). El segundo y tercer estado larval es similar al anterior con un largo promedio de 2,80 mm y 4,69 mm respectivamente (VARGAS, 1970). Al llegar al cuarto estado la larva puede alcanzar hasta 9,20 mm de longitud y se caracteriza porque presenta una mancha rojiza en la regin dorsal (VARGAS, 1970). La pupa mide entre 5 y 6 mm de largo, es de tipo obtecta, de color brillante, generalmente cubierta por un capullo sedoso blanco, poco antes de emerger se torna color caf oscuro (LARRAIN, 2001). VARGAS (1970) seala que el hospedero preferencial de T. absoluta corresponde al tomate, a su vez ARTIGAS (1994) agrega como hospederos secundarios a otras especies vegetales cultivadas como la papa (Solanum tuberosum L.), el pepino dulce (Solanum muricatum Aiton), la berenjena (Solanum melongena L.) y el tabaco (Nicotiana tabacum L.). El tiempo empleado en el desarrollo de T. absoluta se ve afectado por varios factores, entre ellos la temperatura, en el Cuadro 1 se puede apreciar que a medida que se incrementa la temperatura la duracin del ciclo de desarrollo se acorta fluctuando entre 76,4 das con 14C y 23,8 das con 27C desde huevo a adulto (ESTAY, 2001). Los requerimientos de temperatura base varan para los distintos estados de desarrollo, oscilando entre 7,0C de huevo a larva y 9,1C de pupa a adulto (ESTAY, 2001).

CUADRO 1 Duracin promedio del ciclo de desarrollo de la polilla del tomate T. absoluta (Meyrick) a distintas temperaturas. Estado de desarrollo Huevo Larva Pupa Huevo - adulto FUENTE: ESTAY (2001). 2.1.2 Importancia de la polilla del tomate. La forma de oviponer de T. absoluta incrementa el dao causado, puesto que los huevos son depositados en un gran nmero de plantas y la postura de stos se realiza en forma individual, y ocasionalmente agrupados hasta un mximo de cinco (FERNNDEZ y MONTAGNE, 1990). El potencial de dao causado se incrementa en los dos ltimos estados de desarrollo, dada la capacidad de las larvas de desplazarse para iniciar nuevas galeras en el mismo foliolo o en uno diferente (PEREYRA, 2002). La larva se introduce entre las dos epidermis de la hoja, y en su avance, consume el mesfilo, dejando zonas traslcidas denominadas galeras (QUIROZ, 1872; FERNNDEZ y MONTAGNE, 1990). En ataques intensos, todo el tejido parenquimtico de la hoja puede desaparecer, quedando slo restos de nervaduras y acumulaciones de excrementos (VARGAS, 1970). Adems comen tejidos tiernos de los retoos y pueden afectar los frutos penetrando principalmente por la base o cerca de la zona de insercin del pednculo (FERNNDEZ y MONTAGNE, 1990). Como seala ARTIGAS (1994), en el interior del fruto producen grandes espacios que secundariamente permiten la entrada de hongos y bacterias terminando por inutilizarlo. Duracin (das) 14C 14,1 38,1 24,2 76,4 Duracin (das) 20C 7,8 19,8 12,1 39,7 Duracin (das) 27C 5,1 12,2 6,5 23,8

2.1.3 Control de Tuta absoluta. El control tradicional de la polilla del tomate consiste bsicamente, en aplicaciones quincenales o semanales de algn insecticida. stas se realizan cuando aparecen los primeros adultos de la plaga o se detectan los primeros daos en las plantas (LARRAN, 1986). El uso masivo de los insecticidas para controlar la polilla del tomate han provocado ciertos desequilibrios en el ambiente, adems su uso reiterado ha ocasionado prdida de la eficacia de stos en la plaga (VARGAS, 1970; SIQUEIRA et al., 2000 y DELBENE, 2003). Como alternativa a esta problemtica se ha planteado desarrollar un manejo integrado con el fin de reducir la plaga a niveles de poblacin tales que el dao causado sea el mnimo, orientado a disminuir el uso de pesticidas, favorecer la accin de enemigos naturales, emplear tcnicas culturales y utilizar pesticidas ms amigables con el medio ambiente, de manera de obtener una produccin econmica de calidad, asegurando el medio ambiente y la salud (ESTAY, 2001; DELBENE, 2003) Con respecto al control de tipo qumico LARRAIN (1986) seala que, una forma eficiente de manejar la plaga sera realizando aplicaciones de insecticidas segn niveles de poblacin crtica. El momento oportuno de control debera estar basado en la captura diaria, promedio de tres das, de 100 machos en trampas con feromonas . Segn lo sealado por Lpez (1991), citado por DELBENE (2003), el insecticida para controlar la polilla del tomate debera ser de contacto y de accin translaminar, poseer efecto residual y actuar por ingestin, de esta manera, la larva ser controlada a medida que va consumiendo el tejido vegetal, esto debido a que las larvas permanecen la mayor parte del tiempo en el interior de las galeras, protegidas de los insecticidas (LARRAN, 1986). Spinosad cumplira con lo anteriormente sealado, este insecticida es de reciente uso para el control de T. absoluta (POZO, 2010). Spinosad corresponde a una mezcla de dos metabolitos activos (las espinosinas A y D) producidas por la bacteria Saccharopolyspora spinosa. El modo de accin de spinosad se caracteriza por la excitacin del sistema nervioso de los insectos, provocando contracciones musculares involuntarias, postracin con temblores, y parlisis. Estos efectos son producidos porque spinosad funciona alterando las uniones de la acetilcolina en los receptores nicotnicos en la clula postsinptica (THOMPSON et al., 1999). Ensayos en otros lepidpteros han demostrado que el estado ms vulnerable para el uso de spinosad es la larva neonata (LECHUGA et al., 2004). Posteriormente POZO

(2010), demostr que spinosad tendra cierta eficacia en comparacin a otros insecticidas ms antiguos dado el alto porcentaje de mortalidad registrada en una de las poblaciones tratadas, sin embargo, los resultados obtenidos en la mayora de las poblaciones indican una baja susceptibilidad.

2.2 Resistencia a insecticidas La resistencia a insecticidas es definida por INSECTICIDE RESISTANCE ACTION COMMITTEE (IRAC) (2010), como la reduccin en la sensibilidad de una poblacin que se refleja en repetidos fallos de un producto que baja sus expectativas de control al ser usado a la dosis recomendada para la plaga determinada y donde los problemas de almacenamiento del producto, aplicacin y factores climticos poco frecuentes pueden ser eliminados. Lagunes y Villanueva (1994), citados por SILVA y RODRIGUEZ (2003), definen la resistencia como la habilidad complementaria y hereditaria propia de un individuo o conjunto de ellos, que los capacita fisiolgica y etolgicamente, para bloquear la accin txica de un insecticida por medio de mecanismos metablicos y no metablicos . El hbito minador de T. absoluta, las altas densidades poblacionales y su incidencia directa sobre los frutos, han llevado a los productores a realizar hasta dos aplicaciones por semana sin resultados satisfactorios, lo que indica una disminucin en la eficacia de los insecticidas, con la consecuente aparicin de resistencia a algunos principios activos (SALAZAR y ARAYA, 1997; SIQUEIRA et al., 2000; LIETTI et al., 2005). En Chile los agricultores han incrementado la frecuencia de aplicaciones de insecticidas como lo sealan SALAZAR y ARAYA (2001), quienes vieron que los cultivos de tomate en el Valle de Azapa, reciban 15-17 aplicaciones de numerosos insecticidas en la temporada para controlar a T. absoluta, muchas veces en mezclas y con dosis mayores a las comerciales, lo que ha generado el desarrollo de resistencia. En relacin a lo anteriormente sealado SALAZAR (1996); SALAZAR y ARAYA (1997) y POZO (2010), evidenciaron resistencia y baja susceptibilidad a insecticidas del grupo qumico de los organofosforados, piretroides y posteriormente a espinosinas. En el Cuadro 2, se muestra algunos registros de baja susceptibilidad a distintos insecticidas identificada en algunas poblaciones de T. absoluta en Chile.

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CUADRO 2

Registro de insecticidas a los que T. absoluta ha desarrollado resistencia. Insecticida Deltametrina, Referencia SALAZAR (1996)

Grupo Qumico

Piretroides

Esfenvalerato, -cihalotrina Cipermetrina Mevinfos POZO (2010) SALAZAR (1996) POZO (2010) LARRAIN (1986);SALAZAR (1996) POZO (2010)

Organofosforados

Clorpirifos Metamidofos

Spinosinas

Spinosad

2.2.1. Resistencia cruzada y mltiple. SALAZAR (1996), seala que existen dos tipos de resistencia, la cruzada y la mltiple. 2.2.1.1 Resistencia cruzada. Consiste en la modificacin del sitio de accin del

insecto en donde la toxina se acopla, causando la prdida de eficacia del insecticida. Cuando esto sucede los insecticidas qumicamente relacionados o que comparten un mismo modo de accin estn ms propensos a la adquisicin de este tipo de resistencia. Se ha observado por ejemplo que la resistencia a la parlisis en insectos se debe a la resistencia cruzada entre los insecticidas DDT [1,1,1-tricloro-2,2-bis(4clorofenil)etano] y piretroides que actan en el mismo lugar del canal de sodio (VARGAS et al., 2008). 2.2.1.2 Resistencia mltiple. Se debe a varios mecanismos metablicos

inespecficos capaces de detoxificar insecticidas de diferentes grupos qumicos que poseen diversos modos de accin (VARGAS et al., 2008). Este tipo de resistencia no implica necesariamente la presencia de resistencia cruzada porque un insecto puede ser resistente a dos insecticidas o ms, y cada resistencia puede ser atribuida a

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diferentes mecanismos (BISSET, 2002). Este tipo de resistencia ha sido descrita en mosca domstica (Musca domestica L.) la cual ha presentado resistencia a plaguicidas organofosforados, carbamatos y piretroides (VARGAS et al., 2008). 2.2.2 Mecanismos de resistencia. La resistencia se manifiesta por diferentes

mecanismos los cuales corresponden a distintas maneras fisiolgicas, bioqumicas y genticas a travs de las cuales los insectos superan la intoxicacin producida por los insecticidas entre los cuales se destaca (SALAZAR, 1996): 2.2.2.1 Resistencia por comportamiento. Este es un mecanismo mediante el cual el insecto reduce o evita la exposicin a compuestos txicos, desarrollando un comportamiento que lo aleja del lugar donde se encuentra el insecticida permitiendo la supervivencia de stos (BISSET, 2002). La interrupcin de la exposicin al insecticida se puede deber a una accin irritante o repelente. En la accin irritante los insectos toman contacto con una pequea concentracin del insecticida y escapan del rea tratada. La accin repelente consiste en que la plaga detecta el insecticida antes de entrar en contacto con l (SALAZAR, 1996; VARGAS et al., 2008). 2.2.2.2 Resistencia a la penetracin. Este mecanismo consiste en una baja o lenta absorcin del plaguicida debido a la modificacin en la cutcula o en el epitelio del tracto digestivo del insecto (VARGAS et al, 2008). Este tipo de resistencia se ha descrito en Heliothis virescens (Fabricius) por una gran cantidad de protenas, lpidos y un grado de esclerotizacin mayor presente en su cutcula, lo que ha generado que el insecticida DDT penetre ms lento a diferencia de lo que pasa en insectos susceptibles (BISSET, 2002). 2.2.2.3 Insensibilidad del sitio de accin (ISA). Se debe a cambios en el sitio donde acta el insecticida. Debido a esta alteracin del sitio de accin, el insecticida no se acopla y esto hace que disminuya la sensibilidad al ataque del txico (BISSET, 2002). La insensibilidad del sitio de accin se presenta a travs de tres casos: 2.2.2.3.1 Acetilcolinesterasa. Se debe a que existen mltiples formas mutantes de la acetilcolinesterasa en la que el insecticida no puede acoplarse y no ejerce su accin dado el cambio en su conformacin. En general, este mecanismo produce un amplio

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espectro de resistencia a la mayora de los organofosforados y en mayor medida a los carbamatos (BISSET, 2002). 2.2.2.3.2 Resistencia al derribo o knockdown resistance (Kdr). Se produce por una insensibilidad de los canales de sodio a estos compuestos. Este mecanismo ha sido relacionado con alteraciones en las propiedades fisicoqumicas de los fosfolpidos y protenas de estos canales (Osborne y Pepper, 1992 citados por SILVA, 2003). Este mecanismo se presenta fundamentalmente en los insecticidas DDT y piretroides (BISSET, 2002). 2.2.2.3.3 Insensibilidad a los Ciclodienos. Este mecanismo de resistencia es el

resultado de alteraciones en el sitio activo que reconoce a estos compuestos, es decir en el componente acarreador de iones cloro del complejo del GABA (cido gama amino butrico) (Ffrench y Roush, 1992 citados por SILVA, 2003). 2.2.2.4 Resistencia metablica. Consiste en la degradacin de muchos compuestos nocivos que se encuentran en el ambiente a travs de un sistema integrado de enzimas (LOPEZ, 2008). De esta manera, los insectos que son resistentes pueden detoxificar o destruir la toxina ms rpido que los insectos susceptibles (IRAC, 2010). Los procesos mediante los cuales se metabolizan los xenobiticos se dividen en dos fases (Figura 1). En la fase I, aumenta la hidrosolubilidad del compuesto mediante la introduccin de grupos funcionales de carcter polar en la molcula por oxidacin, reduccin, hidrlisis, etc. Si el metabolito resultante es suficientemente hidroflico, ste es excretado por el organismo, de lo contrario, acta como sustrato de la fase II, donde otras enzimas catalizan su conjugacin con otros sustratos endgenos hidroflicos, incrementando su polaridad y facilitando con ello su excrecin (Bernard y Philogne, 1993 citado por LOPEZ, 2008). La adaptacin de los insectos a su medio podra estar relacionado con el fenmeno de induccin, en el cual un estmulo qumico promueve la actividad del sistema de detoxificacin mediante la produccin de enzimas adicionales; de esta manera, existiran especies de insectos que responderan a inductores mediante la sntesis de niveles incrementados de enzimas como las MFO, GST, y EST (BISSET, 2002).

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FIGURA 1 Representacin de las fases del metabolismo de detoxificacin de los insecticidas que tienen lugar en el interior del insecto. FUENTE: LOPEZ (2008). 2.2.2.4.1 Oxidasas de funcin mltiple (MFO). Son un grupo de enzimas que se encuentran en forma natural en el metabolismo del insecto debido a que, entre otras cosas, estn involucradas en los procesos de detoxificacin de aleloqumicos en las plantas (SCOTT y WEN, 2001). Las MFO se encuentran en el retculo endoplasmtico liso en la fraccin microsomal de las clulas, son no especficas y catalizan la reaccin siguiente (BISSET, 2002): un tomo de una molcula de oxgeno se incorpora al sustrato, mientras que el otro se reduce a agua (Figura 2); por ello requiere oxigeno (O2) y nicotiamida-adenina dinucletido fosfato (NADP) para su funcionamiento (LOPEZ, 2008).
MFO

S1 + O2 + NADPH
1

SO + H2O + NADP

S = insecticida Representacin de la reaccin de oxidacin catalizada por las oxidasas de funcin mltiple (MFO).

FIGURA 2

FUENTE: BISSET (2002). Est comprobado que este sistema contiene adems una flavoproteina, una ferrodoprotena y un citocromo especializado, el citocromo P450. Las P450 son una familia de homoprotenas de baja especificidad, lo que permite que sean capaces de metabolizar un nmero casi ilimitado de sustratos (BISSET, 2002). Se ha observado en algunos insectos una relacin directa entre el consumo de compuestos txicos de

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plantas y la induccin del metabolismo de las P450 dando como resultado una mayor detoxificacin del xenobitico (SNYDER y GLENDINNING, 1996). Este sistema enzimtico tambin se asocia a la detoxificacin de numerosos plaguicidas, siendo comn verlas implicadas en resistencia cruzada a ms de un tipo de insecticida (LOPEZ, 2008). Otros autores como BAUTISTA et al. (2007), sealan que ha existido un aumento de la resistencia en insectos frente a insecticidas piretroides. La resistencia de T. absoluta frente a cartap demostr, que la mayor participacin de enzimas implicadas en la detoxificacin de este insecticida est dado por las MFO (SIQUEIRA et al. 2000). 2.2.2.4.2 Glutatin S-transferasas (GST). Son un grupo de enzimas que catalizan la conjugacin de componentes hidrofbicos con el tripptido glutatin (Figura 3). En la reaccin, el grupo tiol del glutatin reacciona con un lugar electroflico del compuesto para formar el conjugado que puede ser metabolizado o excretado (Jakoby y Habig, 1980 citados por LOPEZ, 2008).

FIGURA 3 Representacin de la reaccin de conjugacin catalizada por las glutatin S-transferasas (GST). FUENTE: LOPEZ (2008) Estas enzimas participan normalmente en la metabolizacin de compuestos endgenos, pero se ha descrito que tambin pueden detoxificar varios grupos qumicos de insecticidas (Mckenzie, 1996; Souderlund, 1997; Nauen y Stumpf, 2002 citados por REYES et al., 2004). REYES et al. (2004) observaron que la actividad de las enzimas GST, en poblaciones de Cydia pomonella L. a las cuales se les haban aplicado insecticidas azinfosmetil y tebufenozide, fue significativamente mayor que en la poblacin de referencia; lo que sugiere que estas enzimas podran estar asociadas a la

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reduccin de susceptibilidad frente a estos insecticidas. Se report tambin que las enzimas GST estaban relacionadas en la resistencia de T. absoluta frente al insecticida cartap, mediante la utilizacin de sinergistas (SIQUEIRA et al., 2000). 2.2.2.4.3 Esterasas (EST). En la reaccin catalizada por las EST se produce la

hidrlisis de un amplio rango de sustratos ster en sus componentes alcohol y cido, teniendo la capacidad para metabolizar una gran variedad de insecticidas como son lo organofosforados, carbamatos y piretroides (LOPEZ, 2008). Se ha demostrado que una mayor actividad de esterasas en artrpodos sera causal de la resistencia a insecticidas, como es el caso de la resistencia a coumaphos en una poblacin de Boophilus microplus (Canestrini) (VILLARINO et al., 2000). En el lepidptero Choristoneura rosaceana (Harris) se ha descubierto una asociacin entre resistencia a insecticidas organofosforados y un aumento de la actividad de esterasas (PREE et al., 2003). Tambin se ha observado la posible implicancia de estas enzimas en la resistencia a insecticidas de tipo organofosforados en poblaciones argentinas de C. pomonella (SOLEO et al., 2008). Asimismo se ha visto diferencias en esterasas en algunas de las poblaciones de T. absoluta brasileas frente a la metabolizacin del insecticida abamectina (SIQUEIRA et al., 2001).

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3 MATERIAL Y MTODO

3.1 Colecta de poblaciones de larvas de Tuta absoluta Se recolectaron cinco poblaciones de larvas de T. absoluta, provenientes de cultivos de tomate de las regiones de Arica y Parinacota, del Maule y de Los Ros, sometidas a presiones variables de seleccin con insecticidas (Cuadro 3) (Anexo 1). Adems, se incluy una poblacin de referencia, originaria de un cultivo no tratado en la temporada de colecta y mantenida en laboratorio sin exposicin a insecticidas por ms de 15 generaciones. Cuadro 3 Ubicacin de las poblaciones estudiadas recolectadas en cultivos de tomate en Chile y el tipo de proteccin utilizada para su control. Regin Coordenadas Poblacin Tipo de proteccin qumica
N de aplicaciones

Arica y Parinacota Arica y Parinacota Arica y Parinacota Maule

1826'49.6" S 7003'05.1" O 1832'26.2" S 7008'45.2" O 1832'30.2" S 7008'47.2" O 3528'53.5" S 7145'34.4" O

Valle de Lluta

12

Azapa1

qumica

12

Azapa2

qumica

12

Coln

qumica

Maule

3510'42.2"S 7115'17.8"O

Referencia*

no tratada

Los Ros

3948'17.1"S 7315'11.2"O

Valdivia

qumica

* Poblacin de referencia proveniente de Peaflor Nuevo y fue mantenida en laboratorio, sin exposicin a insecticidas por ms de 15 generaciones al momento de la realizacin del ensayo

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3.2 Test toxicolgicos Para los bioensayos se utiliz el mtodo de la hoja sumergida (NIEDMANN y MEZABASSO, 2006; IRAC, 2010). Para ello, se seleccionaron hojas de tomate, sin previa exposicin a pesticidas y de una edad fenolgica similar. Se utilizo la poblacin de referencia para la determinacin de la dosis discriminante, para ellos se probaron seis diluciones del insecticida spinosad (Success 48), en base a la dosis recomendada por el fabricante (10-15 mL 100 L-1) (SANTIAGO, ASOCIACIN NACIONAL DE FABRICANTES E IMPORTADORES DE PRODUCTOS FITOSANITARIOS AGRCOLAS (AFIPA), 2006), incluyndose un control con agua destilada. Cada hoja fue sumergida durante cinco segundos en la concentracin a probar. Posteriormente, stas se dejaron secar por 1 hora sobre una superficie no absorbente a temperatura ambiente y fueron transferidas a una placa Petri de 9 cm de dimetro. Para evitar la deshidratacin de las hojas, se dispuso un algodn humedecido con agua destilada en el pecolo de cada una de ellas. Grupos de 10 larvas (L3) fueron dispuestos en cada placa, siendo incubadas a 25 2 C y fotoperiodo largo (16:8; luz: oscuridad). Para la seleccin de las larvas (L3) se observ el color (blanco a cremoso en el trax y abdomen, y su cabeza negra), y su tamao entre 4 y 5 mm de longitud (VARGAS, 1970). La mortalidad fue registrada a las 72 horas despus de la exposicin de las larvas a los tratamientos (IRAC, 2010). Una larva fue considerada muerta cuando no fue capaz de volver a su posicin original, una vez volteada mediante un pincel. Se utiliz como concentracin discriminante el doble de la concentracin letal del 90% (CL90) (Anexo 2) (REYES y SAUPHANOR, 2008). El efecto de la dosis diagnstica de 1 mg L-1 de spinosad, fue evaluado en todas las poblaciones utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente (IRAC, 2010). 3.3 Determinacin de actividad enzimtica La actividad de GST, MFO y EST se evalu en larvas de tercer estado de cada una de las poblaciones estudiadas. Las mediciones de la actividad de GST y MFO se

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efectuaron mediante fluorometria, y la de EST por cambios de absorbancia. En ambos casos, se utiliz un lector de microplacas (Thermo Scientific). 3.4 Preparacin de extractos enzimticos Para los anlisis de actividad de las enzimas GST y EST, se seleccionaron cuatro grupos de tres larvas (L3) por cada una de las poblaciones estudiadas; stas fueron posteriormente homogenizadas en 50 L de buffer HEPES 50 mM (pH 7,0) en un tubo Eppendorf (NAUEN y STUMPF, 2002). Luego, se centrifugaron por 15 min a 4C y 15.000 tr min-1, usando el sobrenadante como fuente de enzima (BOUVIER et al., 2002). La concentracin de protena en las suspensiones se estim a travs del mtodo de BRADFORD (1976). 3.5 Determinacin de la actividad de las oxidasas de funcin mltiple La actividad de MFO se determin a travs de la actividad de 7-etoxicumarina-Odesetilacin (ECOD) (DE SOUSA et al., 1995). Se prepar una solucin (7-EC) de 200 L de etoxicumarina 20 mM en 10 mL de tampn HEPES 50 mM (pH 7). Veinte larvas de tercer estado de cada poblacin, fueron disectadas y depositadas individualmente en cada una de las celdas de las microplacas negras, en 100 L de la solucin 7-EC. En los controles, adems de los 100 L de 7-EC, se agreg 100 L de tampn

glicina/etanol (pH 10,3), para evitar la reaccin enzimtica (REYES et al., 2004). Despus de cuatro horas de incubacin a 30C, se detuvo la reaccin agregando 100 L del mismo tampn al resto de la placa. Finalmente, se midi la fluorescencia de la muestra a 380 nm de excitacin y 465 nm de emisin (BOUVIER et al., 1998). El resultado fue expresado en picogramos de 7OH insecto-1minuto-1. 3.6 Determinacin de la actividad de las glutatin S-transferasas La actividad de GST se determin usando monoclorobimano (MCB) como sustrato en microplacas negras de 96 celdillas, de acuerdo a NAUEN y STUMPF (2002), con modificaciones en los volmenes de extracto utilizado. En cada celda se incluyeron 30 L de extracto enzimtico, 168 L de glutatin reducido 100 mM (GSH) en buffer HEPES 50 mM y 2 L de MCB 30 mM. Para los controles se utiliz buffer en lugar de extracto enzimtico. La placa se incub a 22C por 20 min, luego de los cuales se midi la fluorescencia a 380 nm de excitacin y 465 de emisin. Como el complejo

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GSH- bimano no est disponible comercialmente, los resultados fueron expresados en unidades de fluorescencia mg protena-1 min-1. 3.7 Determinacin de la actividad de las esterasas. La actividad de esterasas se midi en microplacas usando 2 sustratos: y -naftil acetato (BUSH et al., 1993; BOUVIER et al., 2002, REYES et al., 2011). Para ambos sustratos, en cada celdilla con tampn HEPES 50 mM (pH 7) ms 0,1 mM de o naftil acetato (BOUVIER et al., 2002), se agregaron 0,5 L de extracto enzimtico ms 89,5 L de tampn HEPES 50 mM (pH 7,0). Esta reaccin se incub a 30C por 15 min, luego de los cuales se detuvo la reaccin agregando 20 L de una solucin reactiva compuesta por 3 g L-1 de 1-naftilamina (Fast Garnet) y 35 g L-1 de sodio dodecil sulfato. Doce celdas con buffer de extraccin, en lugar de enzimas, se usaron como control. La absorbancia del complejo Naftol-Fast Garnet, se midi despus de 15 min a 490 nm (BOUVIER et al., 1998, 2002). La determinacin de producto final formado fue definida mediante una curva de calibracin. 3.8 Diseo experimental Para evaluar la susceptibilidad frente a la dosis diagnostica de 1mg L -1 de spinosad en las seis poblaciones estudiadas se utiliz un diseo completamente al azar, con al menos dos repeticiones. Cada repeticin estaba constituida por 10 larvas. Para la preparacin de extractos enzimticos se utiliz un diseo completamente al azar con cuatro repeticiones de tres larvas cada una. En el anlisis in vivo de MFO se utiliz un diseo completamente al azar con 20 repeticiones de una larva por celdilla. 3.9 Anlisis estadstico La dosis discriminante, fue determinada mediante un anlisis Probit (Anexo 2) Las mortalidades de las poblaciones de campo fueron corregidas a travs de la frmula de ABBOTT (1925):

Mortalidad corregida = (((M/T)*100)-%MC) (100-%MC)*100

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Donde M= nmero de larvas muertas con el insecticida. T= nmero total de larvas tratadas con insecticida. %MC= porcentaje de mortalidad de larvas tratadas slo con el solvente. Las mortalidades corregidas fueron comparadas entre las distintas poblaciones a travs de la prueba G (P<0,05) (SOKAL y ROHLF, 1995). Debido a que las actividades enzimticas (GST, MFO y EST) no cumplieron los supuestos del anlisis de varianza, fueron sometidas a la prueba no paramtrica de Kruskal-Wallis con significacin del 5% (SOKAL y ROHLF, 1995). Las relaciones mortalidad-actividad enzimtica; y mortalidad-nmero de aplicaciones de insecticidas, fueron determinadas mediante un anlisis de correlacin. La frecuencia relativa de los individuos resistentes para las MFO (RMFO), fue determinado usando como umbral el valor de actividad inmediatamente superior al presentado por el 90% de los individuos de la poblacin de referencia (REYES et al., 2009; RODRIGUEZ et al., 2011). El valor umbral correspondi a 43 pg de 7OH formado por insecto por minuto. Las frecuencias de individuos RMFO de las poblaciones de campo, fueron comparadas con la poblacin de referencia, mediante el test de 2. Los datos fueron analizados mediante el programa Statistica version 7.0 (STAT SOFT INC., 2004).

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4 PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS

4.1 Efectividad de la dosis diagnstica de spinosad En el Cuadro 4 se presentan los resultados de mortalidad de las poblaciones de T. absoluta sometidas a la aplicacin de la dosis diagnstica de spinosad (1 mg L-1). Los valores registrados muestran diferencias significativas de mortalidad entre las poblaciones. Las poblaciones de Coln (53,5%), Azapa1 (44,9%), Azapa2 (45,0%) y Lluta (39,9%) presentaron susceptibilidades menores respecto a la poblacin de referencia; mientras que la poblacin de Valdivia (62,5%) mostr una susceptibilidad que no alcanz a ser significativamente diferente. CUADRO 4 Susceptibilidad a concentracin diagnstica de spinosad en larvas de tercer estado de una poblacin de referencia y cinco poblaciones de campo de T. absoluta. Poblacin Referencia Lluta Azapa1 Azapa 2 Coln Valdivia
1

N 20 20 20 20 28 40

Mortalidad corregida 1 (%) 85,0 a2 39,9 ab 44,9 ab 45,0 ab 53,5 ab 62,5 ab

Mortalidad corregida por frmula de ABBOTT (1925). Letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas segn prueba de G (p<0,05).

Como se ve en el Cuadro 4, la poblacin de referencia no alcanz a tener una mortalidad superior al 90% como se esperara, segn THOMPSON et al. (1999) en condiciones de campo, la actividad de spinosad debiera detener la alimentacin y

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causar parlisis de los insectos expuestos en pocos minutos, y como las larvas pueden continuar en la planta hasta por dos das, se debera esperar un mnimo de dos o tres das para evaluar el control. Sin embargo, LECHUGA et al. (2004) observaron que la mayora de las larvas de Spodoptera littoralis (Boisduval) y Helicoverpa armigera (Hubner) moran en un intervalo de 1 a 6 das despus de la ingestin con spinosad, lo que sugiere que sera recomendable en ensayos posteriores alargar el tiempo de evaluacin de la mortalidad de las larvas de T. absoluta. Las distintas susceptibilidades de las poblaciones de campo a spinosad se explicaran por el nmero de aplicaciones de insecticidas a las que fueron sometidos los insectos en el lugar de colecta. Estudios previos, han detectado una relacin entre la presin de seleccin y la susceptibilidad de los insectos (SALAZAR y ARAYA, 2001; AYDIN y GURKAN, 2005 y MARQUES, 2009). De acuerdo a SALAZAR y ARAYA (2001), los cultivos de tomate del valle de Azapa reciben numerosas aplicaciones de distintos insecticidas generando una prdida en la eficacia de stos. Adicionalmente, la disminucin en la eficacia de los insecticidas en T. absoluta podra potenciarse debido a las migraciones de la plaga en la misma zona, favoreciendo el desarrollo de resistencia (LIETTI et al., 2005). En el Valle de Azapa, donde se colectaron las poblaciones Azapa1 y Azapa2, as como la comuna de Maule, de donde proviene la poblacin Coln, se caracterizan por producir tomate prcticamente durante todo el ao, por lo que la presin de seleccin es casi constante. La baja susceptibilidad a spinosad en las poblaciones de campo de Lluta y Azapa1 podra adems estar relacionada con el historial de aplicaciones de insecticidas para controlar la plaga, ya que dentro del manejo qumico de stas se habra incluido anteriormente spinosad (Anexo 1). Resultados similares fueron obtenidos con otro lepidptero quien con anterioridad habra sido tratado en campo con spinetoram (spinosinas J y L) y luego en laboratorio con spinosad (MARQUES, 2009). En el caso de Valdivia, la poblacin fue colectada de un cultivo en invernadero, que se encuentra aislado, por lo que la probabilidad de migracin es muy baja. Por otra parte, por las menores temperaturas respecto a la zona centro y norte, la plaga completara un menor nmero de generaciones en la temporada debido a las temperaturas. Es conocido, que la fase de larva, por ejemplo puede variar de 76 das a 14C y 24 das a 27C (ESTAY, 2001). Como seala VARGAS et al. (2008), usualmente a menor

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nmero de generaciones menor es el riesgo de aumentar la velocidad de desarrollo de resistencia. 4.2 Actividad de oxidasas de funcin mltiple (MFO) Las actividades de MFO en las poblaciones de campo variaron entre 47,5 y 123,4 pg 7OH formado por insecto por minuto, para Coln y Lluta, respectivamente. Las poblaciones de Valdivia, Azapa2 y Lluta, mostraron actividades medias de MFO significativamente mayores a la poblacin de referencia (H (5,118) = 52,8; p<-0,001), con valores 3,1 a 4,6 veces superiores (Cuadro 5). La poblacin de referencia mostr tener la actividad MFO ms baja de todas las estudiadas, lo que justifica su utilizacin como susceptible (REYES et al., 2004). Para los casos de Azapa2 y Lluta, los resultados de alta actividad son coincidentes con la baja mortalidad frente a spinosad. Cuadro 5 Actividad in vivo de enzimas oxidasas de funcin mltiple (MFO) en larvas de tercer estado de una poblacin de referencia y cinco poblaciones de campo de T. absoluta. Poblacin Picogramos de 7OH insecto-1minuto-1 Actividad media total Referencia Lluta Azapa1 Azapa2 Coln Valdivia 26,6 abc 123,4 ac 50,5 abc 92,5 abc 47,5 abc 84,1 abc Rango de actividad R/S1

4,8 - 69,8 43,6 - 180,1 16,2 - 96,3 16,3 - 168,6 10,9 - 117,2 4,8 - 180,1

1 4,6 1,9 3,5 1,8 3,1

Promedios con letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas segn prueba de Kruskal Wallis (p<0,05).
1

R/S (resistencia/susceptibilidad): Tasa de actividad de poblacin analizada y poblacin susceptible.

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Los promedios de actividad de la enzima MFO en las poblaciones de Coln, Azapa1 y Valdivia, no concuerdan con la mortalidad alcanzada con spinosad. Sin embargo, al observar la frecuencia de individuos resistentes en dos de estas poblaciones, stos son significativamente superiores a los de la poblacin de referencia, lo que indica que los promedios fueron afectados por unos pocos individuos con baja actividad (Figura 4).

** Frecuencia de larvas resistentes de acuerdo a su actividad MFO (RMFO) * * * *

Referencia

Lluta

Azapa1

Azapa2

Coln

Valdivia

Poblacin

Los asteriscos sobre las barras indican diferencias significativa respecto a la poblacin de referencia segn prueba de 2 (*= p<0,05; **= p<0,01).

FIGURA 4

Frecuencia de larvas resistentes por poblacin, de acuerdo a la actividad de MFO (RMFO).

Segn los antecedentes recopilados en terreno, estas poblaciones no habran incluido dentro de su manejo qumico insecticidas con ingrediente activo spinosad (Anexo 1) sin embargo, los resultados obtenidos concuerdan con lo mencionado por algunos autores, quienes sealan que estas enzimas, pueden metabolizar diferentes sustratos y llevar a cabo mltiples reacciones oxidativas, debido a la gran cantidad de isoformas que stas presentan, pudiendo influir en la efectividad de varias clases de insecticidas (SCOTT y WEN, 2001). La detoxificacin por la misma enzima para distintas clases de

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insecticidas sugiere que se estara frente a un caso de resistencia mltiple a spinosad (BISSET, 2002). La poblacin de Lluta habra tenido una seleccin previa de individuos debido a las aplicaciones del insecticida Success 48 (spinosinas A y D) en terreno (Anexo 1), lo que justificara la menor susceptibilidad obtenida en laboratorio a spinosad y sumado a la alta actividad media de MFO. La actividad media presente en esta poblacin mostr ser la ms alta debido a la ausencia de larvas con actividad media menor a 40 pg 7OH formado por insecto por minuto (Figura 4). De acuerdo a los resultados obtenidos, este sistema enzimtico podra estar asociado a la baja susceptibilidad de las poblaciones de campo a spinosad. Estudios similares en otras especies de lepidpteros, tambin han encontrado esta asociacin (WANG et al., 2009). SIQUEIRA et al. (2000) observaron que el mecanismo responsable en la resistencia de poblaciones de campo brasileas de T. absoluta frente al insecticida cartap es principalmente este grupo. 4.3 Actividad de glutatin S-transferasas (GST) Las tasas de actividad de las poblaciones de campo para las GST, respecto a la poblacin de referencia, fueron menores a las observadas para las MFO, con varios valores cercanos a uno (Cuadro 6). Los resultados obtenidos en las poblaciones de Lluta, Azapa2, Coln y Valdivia no fueron significativamente diferentes respecto a la poblacin de referencia. Slo la poblacin de Azapa1 mostr tener diferencia significativa respecto a la poblacin de referencia (H (5,35) = 12,6; p =-0,027), siendo 2,7 veces superior a sta (Cuadro 6). Los resultados obtenidos sugieren que la actividad de las enzimas GST no son preponderantes en los procesos de detoxificacin de spinosad en las poblaciones de Lluta, Azapa2, Coln y Valdivia (Cuadro 6). Sin embargo, la actividad media de la poblacin de Azapa1 sugiere que estas enzimas s podran estar asociadas a la reduccin de susceptibilidad frente a este insecticida, pero en menor medida que las MFO. Esto concuerda con lo observado por SIQUEIRA et al. (2001), quienes sealan que en general las enzimas GST tendran un rol secundario en la detoxificacin del insecticida abamectina, en la misma polilla.

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De acuerdo a BISSET, (2002) y REYES et al. (2011), ms de un mecanismo de resistencia puede estar implicado en la disminucin de la eficacia de un producto determinado, y un mismo mecanismo puede generar resistencia a ms de un producto. La importancia relativa de cada uno de ellos, depender del producto considerado, de la poblacin analizada y de otros posibles factores. CUADRO 6 Actividad in vitro de las enzimas glutatin S-transferasas (GST) en larvas de tercer estado de una poblacin de referencia y cinco poblaciones de campo de T. absoluta. Glutatin S-transferasas Unidades fluorescencia mg proteina -1 minuto-1 Poblacin Actividad media total 406,2 abc 452,1 abc 1090,1 abc 337,7 abc 448,1 abc 204,5 abc Rango de Actividad R/S1

Referencia Lluta Azapa1 Azapa2 Coln Valdivia

79,5 - 741,5 226,9 - 704,3 227,8 - 1998,3 147,5 - 649,7 196,9 - 563,1 161,7 - 272,8

1 1,1 2,7 0,8 1,1 0,5

Letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas segn prueba de Kruskal Wallis (p<0,05).
1

R/S (resistencia/susceptibilidad): Tasa de actividad de poblacin analizada y poblacin de referencia.

4.4 Actividad de esterasas (EST) En general se observa una elevada actividad media de las enzimas EST en la mayora de las poblaciones estudiadas, sin embargo, para las -esterasas no se observaron diferencias significativas de las poblaciones de campo respecto a la poblacin de referencia. Slo se observaron diferencias al comparar Coln con Azapa1, Azapa2 y Valdivia (H (5,44) = 19,1; p =-0,002) (Cuadro 7).

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Al analizar los valores de actividad media de las -esterasas se observan diferencias significativas respecto a la poblacin de referencia en Azapa1 y Azapa2, con tasas de actividad de 14,7 y 12,7 veces mayores, respectivamente. Pese a las altas tasas de actividad en las poblaciones de Lluta y Valdivia (4 y 6,9 veces), stas no fueron significativas, y la poblacin de Coln nuevamente mostr la actividad ms baja, siendo en este caso 1,7 veces superior a la poblacin de referencia (Cuadro 7). CUADRO 7 Actividad in vitro de las esterasas (EST) y en larvas de tercer estado de una poblacin de referencia y cinco poblaciones de campo de T. absoluta. Poblacin Esterasas (EST) nmol -naftol mg protena-1 min-1 Actividad media total Referencia Lluta Azapa 1 Azapa 2 Colin Valdivia 25,3 abc 41,8 abc 125,0 ab 68,7 ab 17,0 abc 63,7 ab Rango de Actividad R/S2 Esterasas (EST) nmol -naftol mg protena-1 min-1 Actividad media total 25,0 a 100,0 ab 367,5 b 317,3 b 41,4 a 172,5 ab Rango de Actividad R/S2

14,8 - 61,6 14,7 - 107,2 11,2 - 346,4 29,9 - 171,2 9,2 - 26,1 32,9 - 84,8

1 1,7 4,9 2,7 0,7 2,5

8,5 - 67,1 39,5 - 234,9 165,7 - 827,5 108,8 - 514,0 21,1 - 52,2 137,9 - 210,9

1 4,0 14,7 12,7 1,7 6,9

Letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas segn prueba de Kruskal Wallis (p<0,05).
2

R/S (resistencia/susceptibilidad): Tasa de actividad de poblacin analizada y poblacin susceptible.

Las EST se clasifican dependiendo de su capacidad para hidrolizar distintos sustratos, por ejemplo las -esterasas hidrolizan preferentemente el -naftil acetato y las esterasas hidrolizan parcialmente el -naftil acetato y stas pueden estar presentes individualmente en los insectos o en conjunto (BISSET, 2002). DIAZ et al. (2006), observ en Blattella germanica (L.) que poblaciones resistentes a cipermetrina obtuvieron valores elevados de actividad enzimtica de -esterasas a diferencia de las

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-esterasas. Similares resultados se obtuvieron en este estudio, el Cuadro 7 muestra que las tasas de actividad de las poblaciones de campo, varan dependiendo del sustrato. Esto, confirma la importancia de usar ms de un sustrato al analizar este grupo de enzimas. A partir de los resultados obtenidos considerando -naftil acetato como sustrato, se puede inferir que la actividad de las EST estara involucrada en la resistencia a spinosad en las poblaciones estudiadas, sin embargo, su participacin en la detoxificacion, se encuentra por debajo de la accin de las MFO. Se observa una relacin entre la actividad de las -esterasas respecto a la susceptibilidad a spinosad en las poblaciones de referencia, Valdivia, Azapa1 y Azapa2, lo que podra sugerir que estas enzimas tienen cierta participacin en la detoxificacin de spinosad. Estudios previos de SIQUEIRA et al. (2001) tambin observaron diferencias en la importancia de las esterasas en algunas de las poblaciones de T. absoluta brasileas frente a la metabolizacin del insecticida abamectina. Del mismo modo, la actividad de las EST jugaran un papel secundario en la resistencia de este insecto al insecticida cartap (SIQUEIRA et al., 2000). Por otra parte, WANG et al. (2009), sealan que las enzimas EST podran no ser importante o ser menos importante como mecanismo que confiere resistencia a spinosad de H. armigera.

4.5 Relacin entre mortalidad y los tres sistemas enzimticos No se observ relacin entre mortalidad de las poblaciones tratadas con spinosad y la actividad media de los tres sistemas enzimticos analizados: MFO (r = 0,68; p = 0,14), GST (r = 0,33; p = 0,52) y EST (-esterasas, r = 0,21; p = 0,69; -esterasas, r = 0,40; p = 0,43). Esto tiende a contradecir lo propuesto por POZO (2010), quien sugiere que la resistencia a este insecticida en poblaciones de T. absoluta tiene relacin con la existencia de un mecanismo de tipo metablico involucrado. Sin embargo, al observar individualmente cada poblacin es posible encontrar una asociacin entre actividad enzimtica media y susceptibilidad a spinosad, como ocurre en las poblaciones de referencia, Azapa2, Lluta y actividad media de MFO. La respuesta variable entre actividad enzimtica y susceptibilidad obtenida en las seis poblaciones puede deberse a la distribucin geogrfica particular de cada una, como

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tambin a las condiciones ambientales en cada zona dando caractersticas de adaptacin especficas para cada poblacin. Esta variacin entre las poblaciones tambin se ha constatado en otras especies, como en Aedes aegypti (L.) donde algunas poblaciones provenientes de distintas reas de Mxico presentaron niveles elevados de esterasas, mientras que otras poblaciones aledaas presentaron altos niveles de MFO (FLORES et al., 2006). Asimismo, es posible encontrar ms de un sistema enzimtico involucrado en la baja susceptibilidad de un insecticida como ocurri en la poblacin de azapa2, encontrando valores significativos de actividad de MFO, GST y -esterasas. Resultados similares se han constatado en otros artrpodos como es el caso del mosquito Anopheles marajoara Galvao & Damasceno, presentando altos niveles de actividad tanto de MFO como de esterasas (MOLINA et al., 2007).

4.6 Relacin entre mortalidad y nmero de aplicaciones de insecticidas durante la temporada del cultivo Se observ una relacin estrecha entre, el nmero de aplicaciones totales de insecticidas realizadas durante la temporada del cultivo y la mortalidad de las poblaciones tratadas con spinosad (r = 0,986; p = 0,00026). Esto coincide con lo sealado por diferentes autores quienes indican que los factores operacionales asociados a la aplicacin de insecticidas sera una de las principales causas para el desarrollo de resistencia (BISSET, 2002; AYDIN y GURKAN, 2005). Estudios previos han demostrado que mientras mayor sea la presin de seleccin en poblaciones tratadas frecuentemente con insecticidas, ms rpida es la probabilidad que la plaga desarrolle resistencia, y poblaciones de cultivos con aplicaciones poco frecuentes de insecticidas son ms susceptibles (SIQUEIRA et al., 2000; ARAYA, 2001 y LIETTI et al., 2005). Adems de este factor operacional existen caractersticas peculiares de esta especie que tendera a favorecer el desarrollo de resistencia como por ejemplo varias generaciones por ao (ms de cinco) y fecundidad relativamente alta (promedio 40 a 50 huevos por hembra por cpula aproximadamente) (LIETTI et al., 2005).

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5 CONCLUSIONES

Las poblaciones con baja susceptibilidad a spinosad presentaron elevada actividad de MFO y -esterasas; al mismo tiempo, ambos sistemas enzimticos presentaron los niveles ms bajos de actividad en la poblacin de referencia. De acuerdo a ello, la baja susceptibilidad a spinosad en algunas de las poblaciones estudiadas se debera a la accin de mecanismos enzimticos involucrados en la detoxificacin del insecticida, por lo que se aprueba la hiptesis planteada. La susceptibilidad de larvas L3 de las seis poblaciones evaluadas frente a la dosis diagnstica de spinosad fue variable, siendo la poblacin de referencia la ms susceptible. Las poblaciones provenientes de la regin de Arica y Parinacota mostraron los niveles ms bajos de susceptibilidad con mortalidades inferiores al 45%. La actividad media de las MFO fue significativamente mayor en las poblaciones de Lluta, Azapa2 y Valdivia; mientras las poblaciones Azapa1 y Coln, no alcanzaron diferenciarse respecto de la poblacin de referencia. La actividad media de las GST no mostr diferencias significativas con respecto de la poblacin de referencia a excepcin de la poblacin de Azapa1, en la que sta alcanz 2,7 veces su valor. La actividad de las -esterasas en las poblaciones estudiadas fue mayor a la de las -esterasas. La actividad de las -esterasas fue significativamente diferente respecto a la poblacin de referencia en las poblaciones de Azapa1 y Azapa2. De acuerdo a las condiciones de ensayo las MFO tendran una mayor participacin en la detoxificacin de spinosad y en segundo lugar estaran implicadas las esterasas, mientras que las GST no tendran un papel importante. La susceptibilidad de las poblaciones estudiadas, mostraron una estrecha relacin con la presin de seleccin a la que fueron sometidas durante la

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temporada de colecta, lo que confirma la importancia de los programas de manejo en el desarrollo de la resistencia.

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7 ANEXOS

ANEXO 1 Antecedentes de los distintos insecticidas aplicados en los cultivos de tomates durante la temporada de colecta de larvas de T. Absoluta Poblacin Lluta Azapa1 Azapa2 Nombre comercial insecticida Success 48 Success 48 Proclaim05 SG Lorsban Plus Coln Valdivia Ampligo 150 ZC Arrivo20/25 EC Metamidofs60SL Grupo qumico spinosad spinosad avermectinas rganofosforado + piretroide. diamida antranilica + piretroide. piretroide organofosforado

ANEXO 2 Anlisis Probit para determinacin de dosis diagnstica de spinosad. El anlisis probit-log de la mortalidad de la poblacin de referencia medida a las 72 horas luego de haberla expuesto a distintas concentraciones de spinosad obtuvo valores de CL50 (95% |CI|) = 0.07 (0.05-0.1), y CL90 (95% |CI|) = 0.48 (0.32-0.93) (2 = 4.9, df = 4, p = 0.29). Se utiliz el doble de la CL90 equivalente a 1 mg L-1 del ingrediente activo de spinosad.