SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI

LABORATORIO CENTRAL DE SADE PUBLICA

Dr. COSTA ALVARENGA.

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRO - POP
POP N
25.1.01.03.035
TTULO: COLORAO DE GRAM
Reviso
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ELABORADO POR: REVISADO POR: APROVADO POR
Ronaldo Costa
Diretor Tcnico
Ismnia Maria Ramalho
Farmacutica Bioqumica

Gildevane Vieira do
nascimento
Farmacutica Bioqumica

Data: _____ / _____ / ______




1. OBJETIVO

Este POP estabelece critrios e procedimentos cujo objetivo seja aplicar a tcnica de
Colorao de Gram.



2. CAMPO DE APLICAO

Este POP se aplica no auxlio do diagnstico e da avaliao da qualidade do material
clnico.


3. REFERNCIAS

3.1. Normativas

Trabulsi, L.R. & col.-Microbiologia
Oplustil, P.C.-Procedimentos bsicos em Microbiologia Clnica

3.2. Complementares

No se aplica a este documento


4. DEFINIES E SIGLAS

Para efeito deste POP, aplicam-se as seguintes definies:

4.1. Da amostra
Swab de leses ou secrees especialmente colhido para este exame;
Material clnico em frasco estril;
Lminas de material clnico sem conservante, como formol, ou sem agente fixante,
como lcool 70%;
As amostras provenientes de isolamento de cultura (colnia).

4.2. Das amostras inadequadas
- Lminas de material clnico com conservante como formol, ou com agentes fixantes,
como lcool 70%;
- Swab sem meio de transporte; colhido a mais de 4(quatro) horas.

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- Amostra de material clnico com conservante como o formol.
4.3 Dos limites de deteco
- Amostras colhidas inadequadamente podero apresentar contaminao pela
microbiota natural da regio.
- Amostras de colnias com mais de 24 horas de crescimento podem no corar
adequadamente.

4.4. SIGLAS

BACTE Bacteriologia geral
POP - Procedimento Operacional Padro
N A - No Aplicavel
D S T - Doena Sexualmente Transmissvel
C G P-Cocos Gram Positivos
B G N - Bacilos Gram Negativos
D G N - Diplococos Gram Negativos
B G P - Bacilos Gram Positivos
C G N - Cocos Gram Negativos
P M N Polimorfosnucleares

5. RESPONSABILIDADES
Farmacuticos Bioqumicos
Tcnicos de Patologia



6. PROCEDIMENTO

6.1. Sinonmia

No se aplica a este documento

6.2. Amostra
6.2.1 Foi explicado nas definies

6.3. Princpio do Mtodo
6.3.1 Baseado na impregnao pelo cristal violeta (corante primrio) na parede celular de
algumas espcies bacterianas forma um complexo com uma soluo fraca de iodo (lugol-
mordente). Estas espcies, devido natureza qumica de sua parede celular, retem o cristal
violeta mesmo aps o tratamento com descorante orgnico (lcool-acetona) e so
chamadas de gram positivas. As bactrias que perdem a colorao primria so ditas gram
negativas, sendo depois coradas pelo corante secundrio (Fuccina de Ziehl
diluda),tornando a colorao rsea.Outras estruturas(leuccitos PMN), clulas, tambm
podero tomar esta colorao. Alm da morfologia, de leuccitos(PMN) de hemcias, muco,
filamentos de fungos ou de clulas leveduriformes.


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6.4. Insumos

6.4.1 Caso no esteja disponvel no Laboratrio a Fuccina de Ziehl para gram, esta pode ser
preparada a partir da Fuccina de Ziehl para colorao de Ziehl-Neelsen (BAAR) diludo 1:20.

6.5. Equipamentos e Utenslios Reagentes

6.5.1 Equipamentos
- Microscpio tico
- Estufa Bacteriolgica aferida temperatura 35-37C
- Refrigerador
6.5.2 - Utensilios e Reagentes
- Agulha comum de nquel cromo
- Ala comum de nquel-cromo
- Lpis dermogrfico
- Bico de Bunsen
- Lminas
- Salina
- Cristal de Violeta (Violeta de Genciana)
- Lugol para Gram
- Soluo 1:3 de lcool-acetona
- Fuccina de Ziehl para Gram ( Fuccina de Ziehl diluda)
- Suporte de lmina para pia
- leo mineral
- Soluo 1:1 de lcool-ter
- Hipoclorito de sdio a 2%
- lcool 70%
- Gazes em compressas
- Papel toalha

7.0 EPI/EPC
7.1 Equipamentos de proteo individual (EPI)

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culos de segurana, mscara descartvel, jaleco, calados fechados, luvas
descartveis.
7.2 Equipamentos de proteo coletiva (EPC)
Chuveiro de emergncia, lava olhos, e extintores de incndio.
- culos de proteo
- Mscara descartvel risco 3

8.0 DESCRIO
6.7.1 (a) Antes de iniciar, limpar a bancada de trabalho com hipoclorito e lcool 70%
b) Retirar a lmina imersa no lcool e secar.
c) Numerar a lmina com o n do Laboratrio com o auxlio do lpis demogrfico. A
numerao deve ser no verso da preparao do material.
d) Sempre dentro da rea de segurana do bico de Bunsen, preparar o esfregao:
- Material de cultura (colnia): Colocar 1 gota de salina sobre a lmina. Com a
agulha comum de nquel-cromo flambada e fria, retirar o material (colnia) da placa e
realizar uma pequena emulso com a salina. Fazer um esfregao homogneo e delgado;
- Material clnico: Com o auxlio da ala comum de nquel-cromo flambada e fria ,
retirar o material do frasco e fazer um esfregao homogneo e delgado. Se necessrio,
colocar uma gota de salina.
Obs: No caso de amostra clnica de urina, homogeneizar, mas no centrifugar.
- Material de Swab: Realizar um esfregao homogneo e delgado. Realizar
movimentos rotatrios com o swab sobre a lmina.
e) Deixar secar os esfregaos temperatura ambiente
f) No final do trabalho, flambar as alas, deixar esfriar e guardar. Limpar a bancada
com hipoclorito e lcool a 70%.
g) Aps os esfregaos secos, fixar pelo calor atravs da chama do bico de Bunsen
(passar 3 vezes pela chama sem deixar queimar o material);
h) Com a lmina fria, colocar sobre o suporte para realizar a colorao;
i) Cobrir os esfregaos com violeta de genciana e deixar agir por um minuto
j) Lavar rpidamente com gua corrente (sem deixar sair o esfregao) ou escorrer o
corante;
l) Cobrir o esfregao com lugol e deixar agir por 1 minuto;

m) Lavar rpidamente com gua corrente (sem deixar sair o esfregao) ou escorrer o
corante;
n) Proceder a descolorao com a soluo de lcool-acetona at que a colorao violeta
no se despreenda mais da lmina(tempo crtico: aproximadamente 5 segundos) e
enxaguar imediatamente;

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o) Cobrir os esfregaos com fucsina de Ziehl e deixar agir entre 15 e 30 segundos;
p) Lavar rpidamente com gua corrente
q) Deixar secar os esfregaos temperatura ambiente;
r) Proceder a microscopia em objetiva em 100X(imerso) com auxlio de uma gota de leo
mineral sobre o esfregao;
s) Aps a leitura, limpar a objetiva com uma soluo de lcool-ter

9.0.VALORES DE REFERNCIA
9.1 Resultados
a) Material clnico: Observar, procura e quantificar (raras, algumas e numerosas) e
relatar a presena de bactrias intra e /ou extracelulares ( observando morfologia, estrutura
e prioridades tintoriais),leuccitos(PMN), hemcias, muco, clulas epiteliais, filamentos de
fungos ou clulas leveduriforme.
- Para a amostra com suspeita de uretrite, salpingite e outras DSTs: pesquisar DGN.
A presena de DGNs intracelulares um achado mais indicativo de uma infeco do que
colonizao, especialmente em mulheres.
- Para a amostra com suspeita de Gardnerella Sp, procurar clulas epiteliais
recobertas de cocobacillos gram positivos e gram negativos(gram-labeis). Estas estruturas
so sugestivas de infeco por G.Vaginales e se chamam clulas-chave. Outros achados
podem acompanhar a vaginose bacteriana causada por gardnerella; ausncia ou presena
escassa de bacilos de Drdelein(lactobacillus), ausncia ou presena escassa de leuccitos,
presena abundante de BGN curvos de colorao tnue.
- A presena de clulas leveduriformes pode indicar uma infeco ou colonizao por
leveduras, principalmente do gnero Cndida. Entretanto, uma quantidade elevada destas
clulas e principalmente, a presena de longos brotamentos em forma de Salsicha
(Pseudo-hifas) muito sugestivo de infeco. As leveduras costumam causar patologias em
pacientes imunolgicamente deprimidos, diabticos e crianas.
- Se no esfregao no for observada nenhuma presena de bactrias intra e/ou
extracelulares, liberar o laudo: No foram observadas forma microbianas corveis pelo
mtodo de Gram
b) Material de cultura: Observar morfologia, estrutura e prioridades tintoriais das
bactrias para o direcionamento da identificao bacteriana (Ver POP adequado para cada
identificao)

10.0 CONTROLE DE QUALIDADE
10.1 Da amostra
- Se a amostra enviada em lmina estiver seca e fixada, poder ser conservada
temperatura ambiente por at 1 semana.
- Aps colorao de uma lmina, a outra dever ser identificada e guardada em porta-
lmina apropriada. As lminas devem permanecer no setor por pelo menos uma semana
aps a realizao e liberao do exame.

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10.2 Dos corantes
- Verificar data de validade descrita no rtulo;
- Armazenamento em frasco mbar e em temperatura ambiente.

11.0 TRATAMENTO E/OU DESCARTE DE RESDUOS
Materiais perfurocortantes, restos de tubos coletores tambm podem ser desprezados
diretamente em caixas de papelo especialmente fabricadas para esta finalidade. Ao final do
dia de trabalho, essas caixas devem ser encaminhadas para autoclavao. Colocar os
materiais e resduos em sacos prprios para autoclavao e aps a esterilizao,
acondicionar em sacos plsticos de cor branca devidamente identificada com o smbolo de
risco biolgico.
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