LA BIORREMEDIACION: UNA SALIDA AMBIENTAL A LOS PROBLEMAS DE CONTAMINACIN

Caso: Use of spent substrate after Pleurotus pulmonarius cultivation for the treatment of chlorothalonil containing wastewater Rosa A. Crdova Jurez, Lilliam L. Gordillo Dorry , Ricardo Bello-Mendoza , Jos E. Snchez

BIOQUIMICA

GARCA BERROCAL CAMILO ALBBERTO KERGUELEN SANCHEZ MARIA CLAUDIA TORRES AGAMEZ ANTONIO JOSE

MIGUEL SEGUNDO GUZMAN QUIMICO

UNIVERSIDAD DE CORDOBA FACULTAD DE INGENIERIAS PROGRAMA DE INGENIERA AMBIETAL

MONTERIA CORDOBA

2012 1

TABLA DE CONTENIDO
1.INTRODUCCION ...........................................................................................................................3 2. OBJETIVOS ..................................................................................................................................4 2.1GENERAL ................................................................................................................................4 2.2 ESPECIFICOS ..........................................................................................................................4 3. LA BIORREMEDIACION: UNA SALIDA A LOS PROBLEMAS DE CONTAMINACION .................... 5-6 4. MATERIALES Y METODOS ...........................................................................................................6 5. SUSTRATO ENZIMATICO .............................................................................................................7 5.1 Siringaldazina .......................................................................................................................7 5.2 Catecol ..................................................................................................................................7 5.3 ABTS .....................................................................................................................................7 5.4 Alcohol Veratryl ....................................................................................................................7 6. EXTRACTO ENZIMATICO .............................................................................................................7 7. ACTIVIDAD ENZIMATICA.............................................................................................................7 7.1Sustrato oxidado ...................................................................................................................8 8.REACCION, EXTRACCION Y CUANTIFICACION DEL ENSAYO .........................................................9 9. TRATAMIENTOS ..........................................................................................................................9 9.1 El efecto del tiempo del almacenamiento de los SMS sobre la actividad ..............................9 9.2 El efecto de la refrigeracin y congelacin de los SMS sobre la actividad ....................... 9-10 10. RESULTADOS ..........................................................................................................................10 10.1 Segn el tiempo de almacenamiento ................................................................................10 10.2 Segn el tiempo de refrigeracin y congelacin ...............................................................10 10.3 Actividad enzimtica .........................................................................................................11 10.4 Influencia del pH ..........................................................................................................11-12 11.DISCUSION .........................................................................................................................12-13 12. CONCLUSION ..........................................................................................................................14 13.BIBLIOGRAFIA ..........................................................................................................................15

1. INTRODUCCION Las setas de Pleourotus son un grupo de varias especies de hongos comestibles cultivadas en todo el mundo. EL sustrato gastado (SMS) de setas de Pleourotus se puede utilizar en la tierra, la produccin de cultivos o para muchos otros propsitos. Sin embargo, en esta poca de escasez de recursos naturales y grandes preocupaciones sobre la salud humana y el medio ambiente, los usos adicionales y alternativas estn siendo investigados, entre ellos, los relacionados con la utilizacin de la capacidad enzimtica de hongos para la biorremediacin. Las setas se clasifican como hongos de pudricin blanca, ya que son capaces de degradar la lignina, celulosa y hemicelulosa. Ellos producen varios tipos de oxidasas fenol y algunas enzimas de este grupo son consideradas responsables de la degradacin de la lignina. El uso de hongos de pudricin blanca para fines de biorremediacin es de gran inters debido a los sistemas ligninoltico que tienen lo que los hace capaces de degradar un amplio grupo de contaminantes ambientales. En la siguiente investigacin los autores pretenden determinar la eficiencia de la degradacin de clorotalonil, como estrategia de biorremediacion para dicho plaguicida contenido en las aguas residuales.

2. OBJETIVOS 2.1 GENERAL Determinar la viabilidad tcnica de utilizar Pleourotus Pulmonarius para la degradacin de clorotalonil

2.2 ESPECIFICOS Determinar el efecto que tiene el tiempo de almacenamiento en la degradacin del clorotalonil Comprobar el efecto que posee tipo de tratamiento en la degradacin de clorotalonil.

3. LA BIORREMEDIACION: UNA SALIDA AMBIENTAL A LOS PROBLEMAS DE CONTAMINACIN El creciente desarrollo de las naciones ligado al aumento poblacional ha comprometido la seguridad alimentaria de los pases. Por tal motivo, ha sido necesaria la optimizacin de la produccin agrcola lo cual ha conllevado a la utilizacin de productos qumicos que maximicen dichos procesos, generando alteraciones en recursos los naturales (agua, el suelo, la fauna y la flora). Algunos de los impactos ambientales ms importantes en la fase de produccin agrcola se relacionan con la intensidad del cultivo y con determinadas practicas culturales. La obtencin de altos rendimientos por hectrea requiere, adems de buen material gentico, del uso intensivo de agroqumicos (Fertilizantes, pesticidas) y agua. El uso de pesticidas tambin est asociado con la contaminacin del suelo, el agua y la biota en procesos de bioacumulacin. Las concentraciones altas pueden provocar daos importantes a la salud. El impacto ambiental de los agroqumicos depende de factores como la capacidad de asimilacin del suelo, as como de la existencia y cumplimiento a la normativa sobre el uso de agroqumicos.1 En Colombia la normativa vigente se encuentra reglamentada en la Ley 822 de 2003 por la cual se dictan normas relacionadas con los agroqumicos genricos. Uno de los agroqumicos que permite la optimizacin de los procesos productivos, es el plaguicida conocido como clorotalonil, que es un fungicida aromtico-Benceno sustituido (C8Cl4N2) de peso molecular 265.9 g/mol este se caracteriza por ser insoluble en agua (0.81 mg/L), es un slido, cristales de color blanco y olor suave2. Al contacto directo con los seres humanos produce irritaciones en la piel, en la nariz y en los pulmones, mientras que las fuentes de agua superficiales es insoluble se adhiere a la partculas en suspensin dificultando los procesos de potabilizacin de agua. En el suelo, es degradado por la actividad de los microorganismos de 5 a 8 horas, produciendo dixido de carbono. 3 Una de las posibles soluciones a esta problemtica, desde el punto de vista ambiental, se encuentra arraigada a la biorremediacion. Esta es una tcnica de descontaminacin muy utilizada actualmente; se basa en el uso de diferentes organismos (plantas, levaduras, hongos y bacterias) para neutralizar sustancias toxicas, bien sea transformndola en sustancias de carcter menos toxico o bien convirtindolas en sustancias inocuas para el medio ambiente y la salud humana. Este tipo de tratamiento puede ser efectivo en la eliminacin de compuestos orgnicos txicos y biodegradables en suelos y aguas residuales.
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GUZMAN ALCALA, Marta C. La contaminacin de suelos y aguas, su prevencin con nuevas sustancias naturales. Espaa: Secretariado de Publicaciones de la Universidad de Sevilla, 2007. 2 BARPEN. Ficha tcnica CLORTOCAFFARO 500 SC y 75WP. (En lnea)< http://www.bam.com.co/admin_internas/fichas/BARPEN/C/CLORTOCAFFAROS.pdf>
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MINISTERIO DE AMBIENTE, VIVIENDA Y DESARROLLO TERRITORIAL. Resolucin nmero (1210) 23 de Junio de 2009. (En lnea)< http://www.minambiente.gov.co/documentos/res_1210_230609.pdf>

Una de las investigaciones que sustenta esta concepcin es la realizada por Rosa Crdova, Lilliam Dorry, Ricardo Bello, Jos Snchez en su articulo El uso de sustrato gastado despus del cultivo Pleurotus pulmonarius para el tratamiento de aguas residuales que contienen clorotalonil 4. El objetivo de esta investigacin consiste en determinar la viabilidad tcnica de utilizar sustrato gastado de Pleourotus Pulmonarius. Este es un tipo de hongo comestible que se cultiva alrededor del mundo, pero su utilidad no solo esta enmarcada en la industria alimenticia sino tambin en la produccin de cultivo, y actualmente en la biorremediacion. La especie Pulmonarius se caracteriza por degradar la lignina, al ocurrir este proceso se produce un complejo lignonilitico que contiene ciertas enzimas capaces de degradar una amplia gama de compuestos aromticos y fenlicos que se encuentran dentro de los constituyentes de los plaguicidas, fungicidas, pesticidas, etc. 4. MATERIALES Y MTODOS Cepas y medio de cultivo: La cepa utilizada fue la de Pleourotus Pulmonarius. El sustrato fue elaborado con granos de sorgo esterilizados 30 min a una temperatura de 121C y pasto Pangola. El cultivo de setas y sustrato gastado por los hongos: Este se llev a cao mediante tres procesos. El primero consista en tomar 200 g de pasto Pangola con una humedad del 60 %, luego sta era esterilizada durante 30 minutos bajo una temperatura de 121 C. En el segundo procedimiento la mezcla se coloc en bolsas de poli-etileno que fueron incubaron por un tiempo de 15 das a una temperatura de 25 C. Finalmente, el sustrato colonizado se fij en condiciones de fructificacin a una temperatura de 23 C, con una humedad 85% a 90% y la ventilacin fue de 800 ppm para mantener la concentracin del CO2. Luego de 35 das el sustrato gastado se almacen nuevamente. Productos qumicos: Para llevar a cabo los ensayos de degradacin, se utiliza una solucin de clorotalonil con una concentracin de 2 mg/L de ingrediente activo y sustratos enzimticos (alcohol veratryl, ABTS, rojo fenol, catecol y siringaldazina). 5. SUSTRATOS ENZIMTICOS

ELSEVIER. Use of spent substrate after Pleourotus pulmonarius cultivation for the treatment of chlorothalonil containing wastewater.(En lnea)< http://www.elservier.com/locate/jenvman>

5.1 Alcohol veratryl: Alcohol veratryl: 3,4-dimetoxifenol, un compuesto derivado de la descomposicin de la lignina. Es un sustrato para la peroxidasa de lignina, convirtindose oxidado a un catin radical que ataca a la estructura de la lignina. 5.2 ABTS: Es un compuesto qumico utilizado para observar la cintica de reaccin de las enzimas especficas, se utiliza comnmente como un sustrato con perxido de hidrgeno para una enzima peroxidasa o para cuantificar la cantidad de perxido de hidrgeno en una muestra. 5.3 Catecol: Es un compuesto qumico derivado del fenol, es el metabolito ms importante de la dopamina. Se produce por accin de la mono-amino-oxidasa (MAO) sobre la dopamina en las terminales nerviosas de las clulas dopaminrgicas. 5.4 Siringaldazina: Sustrato de los hongos de pudricin blanca dentro del que se produce el complejo enzimtico que contiene a las lacasas que es una enzima capaz de catalizar las reacciones con compuestos xenobiticos (bifenilos policlorados, hidrocarburos poliaromaticos, colorantes industriales y pesticidas) 6. EXTRACTO ENZIMTICO Se maceran 10 g de SMS (sustrato gastado de P. Pulmonarius) en una solucin de 20 ml de acetato de sodio con una concentracin de 0,1 M (pH 7,4 a 27 C). Luego se procede a Filtrar con papel y se lleva a centrifugado a 5000 rpm durante 5 minutos para filtrar nuevamente. 7. ACTIVIDAD ENZIMTICA
ACTIVIDAD ENZIMATICA Lacasa

Siringaldazina

ABTS

Espectrofotmetro para medir la absorbancia de la muestra a diferentes longitudes Longitud de onda: 530 nm Longitud de onda: 436 nm

Tiempo: cada minuto durante 6 min

Tiempo: cada 30 s durante 2 minutos

En una mezcla

3 ml de fosfato (0,1 M, pH 6,6) + 0,5 ml siringaldazina + 1,5 ml de extracto enzimtico

ajuste pH de 4 a 7 se utilizan 3ml (1 M) + 0,5 ml de extracto enzimtico

ACTIVIDAD ENZIMATICA
Mn-peroxidasa Aril alcohol oxidasa (AAO) Fenol oxidasa

La mezcla
Rojo fenol + lactato + MnSO4+albmina de huevo+H2O2 Alcohol veratryl solucin de catecol+0,5 ml de enzima

Las condiciones
610 nm Todos los ensayos se realizaron a 27C 420 nm

7.1 Sustrato oxidado La estimacin del sustrato oxidado fue (mM/cm-1): Siringaldazina: 65 ABTS: 29.3 Catecol: 3,45 Rojo fenol:8,45

8. REACCION, EXTRACCION Y CUANTIFICACION DEL ENSAYO

Reaccin de la mezcla

6 ml de solucin de pesticida (2 m/L)+3 ml de extracto enzimtico de carpforos t=1 h con muestreo a los 0, 15, 30, 45 y 60 min, T= 27 C y pH 7,4.
1,875 ml de ter de petrleo (15% en hexano) aadidos a la mezcla de reaccin t de agitacin=2 min y se deja reposar. Separacin del extracto orgnico, se mezcla con 2 g de Na2SO4, se separa la capa acuosa y mezcla con 1.25 ml de ter de petrleo

Extraccin de residuos de pesticidas

Cuantificacin de clorotalonil

Cromatografo de gases inici a 150 C (1 minuto), se incrementa hasta 210 C (durante 3 min), y finalmente se incrementa hasta 290 C (durante 1 min)

9. TRATAMIENTOS Estos tratamientos se llevaron a cabo a travs de dos procedimientos: 9.1 El efecto del tiempo de almacenamiento de los SMS sobre la actividad : Aqu se tomaron dos kilogramos del extracto enzimtico (SMS) y se sometieron a una temperatura de 24C con una humedad del 80% y en ausencia de luz, durante tres semanas. Luego, un da a la semana se tom una muestra de 50 gr con el fin de estudiar la actividad del extracto enzimtico en la degradacin del clorotalonil. En este tratamiento se emple para el anlisis estadstico un diseo bifactorial 4X5 con tres repeticiones la cual estaba compuesta por dos factores, el facto A que indicaba el tiempo se almacenamiento (0, 1, 2,3 semanas), y un factor B que indicaba el tiempo de reaccin (0, 15, 30, 45 y 60 min). 9.2 Efecto de la refrigeracin y la congelacin del SMS sobre la actividad: Se tom una muestra del SMS, el cual se coloc a una temperatura de 5 C buscando as la temperatura de refrigeracin y congelacin respectivamente; es importante estudiar la actividad del extracto 9

enzimtico a temperatura ambiente antes y despus de aplicar la temperatura de tratamiento (5C). El anlisis estadstico empleado es un diseo bifactorial 3X4 con tres repeticiones donde el factor A es el tratamiento (Fresco, refrigerado y congelado) y el factor B es el tiempo de reaccin (15, 30, 45 y 60 min). 10. RESULTADOS Esta investigacin estuvo enmarcada por los siguientes resultados: 10.1Segn el tiempo de almacenamiento : Despus de la reaccin que ocurre a los 45 minutos, el contenido clorotalonil se redujo a niveles indetectables sugiriendo 100% de degradacin. Al extraer el carpoforo de P. pulmonarius fue utilizado, el contenido residual de clorotalonil fue del 10,1% del valor inicial despus de un contacto de 60 minutos. En el control, luego de 60 min el clorotalonil residual fue del 98,8%..

Fig. 1. Variacin del tiempo respecto al contenido de clorotalonil en una mezcla de reaccin que contiene el extracto enzimtico de SMS (tringulo) y extraccin de los carpforos de P. pulmonarius (rombo). De control sin extracto enzimtico (cuadrado). Las condiciones de reaccin: concentracin inicial CTN 2 mg / l, temperatura 27 C y pH 7,4. Las barras verticales indican el error estndar. 10.2 Segn el tiempo de refrigeracin y congelacin: En este ensayo, el porcentaje ms alto de eliminacin (100%) se obtuvo despus de la reaccin de 45 minutos cuando el extracto fresco SMS fue utilizado (control sin tratamiento). Cuando un extracto previamente congelado y descongelado fue utilizado en la mezcla de reaccin, la concentracin fungicida disminuy 46,9% despus de 1 h, y cuando un extracto se enfri a 5 C y de nuevo se utilizan a temperatura templada, la concentracin se redujo CTN 36,2%. El anlisis estadstico no mostr diferencias significativas entre los tratamientos, pero una diferencia significativa entre los dos tratamientos y el control (p <0,05).

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Fig. 2. Efecto de la refrigeracin (cuadrado) y congelacin (tringulo) del extracto enzimtico de los SMS de P. pulmonarius en la eliminacin de clorotalonil en solucin acuosa, en comparacin con el control (extracto fresco, con un crculo). Condiciones de reaccin: concentracin inicial CTN 2 mg /l, temperatura 27 C y pH 7,4. Las barras verticales indican el error estndar. 10.3 Actividad enzimtica: Las pruebas realizadas para detectar la actividad enzimtica en el extracto de SMS indican la presencia de lacasa, MnP, y oxidasa fenol.

Actividad de varias enzimas ligninolticas en un extracto crudo de sustrato de setas gastado para Pleourotus pulmonarius. Temperatura de reaccin 27 C. 10.4 INFLUENCIA DEL Ph:La prueba para detectar la actividad de la AAO indica la ausencia de esta enzima en los extractos SMS de P. pulmonarius ECS-0190. La influencia del pH sobre la actividad de las tres enzimas se muestra en la fig. 3 Como puede verse, la actividad ptima fue de alrededor de pH 4,5 para lacasa y MnP y entre 5 y 6 para la oxidasa fenol. A pH 7, el extracto mostr 40% de actividad de lacasa y MnP, y slo 20% de actividad con fenol-oxidasa. Dado que la actividad ptima de estas enzimas se observ a un pH ms bien baja (4.5 a 5), se realiz un ensayo para determinar la degradacin CTN por el extracto de SMS a pH 4,5, sin embargo, no se detect ninguna degradacin a este pH.

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Fig. 3. Influencia del pH sobre varias enzimas ligninolticas de un extracto de sustrato agotado de champin Pleourotus cultivo pulmonarius despus de tres oleadas. MnP en lacasa de fenol rojo (rombo), el ABTS (cuadrado), polifenol oxidasa en catecol (tringulo). Temperatura de reaccin 27C.

11. DISCUSION La capacidad ligninoltica del gnero Pleourotus se ha demostrado por varios autores y se ha considerado capaz de degradar muchos compuestos fenlicos relacionados con los contaminantes, entre ellos se encuentran algunos de los plaguicidas clorados como el endosulfn. El hecho de que siringaldazina, ABTS, rojo fenol y catecol se oxida por el extracto enzimtico indica la presencia de lacasa, MnP y actividades fenol oxidasa en el extracto SMS y apoya la idea general de que estas enzimas se encuentran entre los responsables de la degradacin de dichos pesticidas. De acuerdo a otros estudios se reportaron la degradacin del 70.1% pentaclorofenol (concentracin inicial: 2 mg / l) en medio acuoso por el extracto de SMS de P. pulmonarius, donde se llev a cabo la biodegradacin de compuesto principalmente por las enzimas inmovilizadas ligninolticas secretadas por el hongo presente en el SMS. De hecho, la cepa que se usa aqu tambin se ha informado que degrada el insecticida endosulfn. La pregunta sobre qu enzima est contribuyendo a la degradacin del pesticida debe estudiarse ms a fondo, ya que la actividad AAO no se detect en el SMS. Por lo tanto, es posible que otro complejo enzimtico o enzima sea responsable de la degradacin de Clorotalonil. Adems, la presencia de un sistema complejo que implica mediadores que permiten que la oxidasa lacasa y fenol degraden CTN (clorotalonil) podra ser posible. En este estudio, se ha demostrado que un extracto acuoso de P. carpforos pulmonarius es capaz de reducir la concentracin de clorotalonil en un 89,8% para un tiempo de reaccin de 1 hora. El hecho de que esta tasa de degradacin fue inferior a la observada con el SMS (100% en 45 min), puede indicar que los microorganismos y enzimas que no eran P. pulmonarius presentes en el sustrato gastado han contribuido a degradar el insecticida ms rpido. No se inform de evidencia 12

de que los pesticidas pueden ser degradados durante las diversas etapas del proceso de cultivo de hongos comestibles. Chaves et al. (2008) y Putnam et al. (2003) menciona varios compuestos en forma de metabolitos de la degradacin de clorotalonil, entre ellos 1,3-dicarbamoyl-2 ,4,5,6-tetraclorobenceno; 2,5,6tricloro-4-methoxyisophthalonitrile; 1-carbamoil-3-ciano- 4 -hidroxi-2 ,5,6-triclorobenceno; 2,4,5trichloroisophthalonitrile; 2,5,6-tricloro-4-methylisophthalonitrile; y isoftalonitrilo. Aunque la concentracin de CTN disminuy durante el estudio, no se procedi a identificar los productos de degradacin. Este hecho pudo plantear la cuestin de si otros mecanismos de degradacin, tales como lavado de despegue o volatilizacin, podran ser responsables de la disminucin de la concentracin CTN durante la reaccin. Sin embargo, el hecho de que el extracto inactivado se utilizado como control mostr una disminucin mucho menor de CTN en cada ensayo que el extracto tratado que sugiere que tanto el lavado de despegue y la volatilizacin tiene un bajo impacto en la prdida de CTN. Segn los resultados, el almacenamiento de SMS disminuy la eficiencia de CTN degradado. El anlisis estadstico seal 45 y 60 minutos en el tiempo de reaccin a 0 semanas de almacenamiento en las mejores condiciones para la degradacin de CTN . Cuanto ms tiempo el SMS se almacenan, menor ser la degradacin de CTN. Despus de tres semanas de almacenamiento, no se hizo eliminacin de CTN, lo que indica una alta sensibilidad de la actividad biolgica de las condiciones de almacenamiento. Con respecto al enfriamiento y congelacin del extracto enzimtico de SMS , se observ que ambas operaciones afectan negativamente la capacidad de degradar el fungicida. Despus de 1 h de reaccin, la reduccin de la concentracin CTN fue menor y significativamente diferente en los extractos tratados que en el control esto sugiere un proceso de desnaturalizacin / inhibicin de la enzima debido a la disminucin de la temperatura. Los lmites de actividad para la mayora de las enzimas se encuentran entre 10 C y 50 C, as que probablemente la estructura cuaternaria de la enzima implicada en la degradacin de la CTN fue modificada durante el enfriamiento o congelacin, obstaculizando la actividad biolgica del extracto 5 Los SMS pueden contribuir a la limpieza de efluentes contaminados y proteger a las comunidades acuticas, ya que se ha demostrado en este estudio que una concentracin inicial de CTN de 2 mg / l es 100% degradado (<0,1 mg / l) en 45 minutos cuando se utiliza un extracto de SMS.

Mathews, C., Holde van, K.. Bioqumica, second ed. Espaa: McGraw Hill. Interamericana, 1998.

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12. CONCLUSION Recin obtenido el extracto gastado del cultivo del sustrato de P. pulmonarius fue capaz de reducir el 100% de la concentracin inicial de clorotalonil (2 mg / l) despus de 45 minutos de reaccin a 27 C y pH 7,4. Esto abre la posibilidad de utilizar tales productos de la industria del champin para la limpieza de efluentes contaminados por los pesticidas organoclorados. Sin embargo, los investigadores recomiendan que se deba hacer ms investigacin con el fin de optimizar el uso de SMS para degradar clorotalonil, ya que nuestros resultados indican una alta sensibilidad de la actividad biolgica de las condiciones de almacenamiento.

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13. BIBLIOGRAFIA

GUZMAN ALCALA, Marta C. La contaminacin de suelos y aguas, su prevencin con nuevas sustancias naturales. Espaa: Secretariado de Publicaciones de la Universidad de Sevilla, 2007. BARPEN. Ficha tcnica CLORTOCAFFARO 500 SC y 75WP. (En lnea)< http://www.bam.com.co/admin_internas/fichas/BARPEN/C/CLORTOCAFFAROS.pd f>
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MINISTERIO DE AMBIENTE, VIVIENDA Y DESARROLLO TERRITORIAL. Resolucin nmero (1210) 23 de Junio de 2009. (En lnea)< http://www.minambiente.gov.co/documentos/res_1210_230609.pdf> ELSEVIER. Use of spent substrate after Pleourotus pulmonarius cultivation for the treatment of chlorothalonil containing wastewater.(En lnea)< http://www.elservier.com/locate/jenvman> Mathews, C., Holde van, K.. Bioqumica, second ed. Espaa: McGraw Hill. Interamericana, 1998.

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