1988

REG. No. 81550336

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
ESTUDIO COMPARATIVO DEL RENDIMIENTO DE PRODUCCION
DE ALCOHOL DE Zymomonas mobilis y Saccharomyces cerevisiae
A PARTIR DE MELADURA.
TESIS PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
LICENCIADO EN BIOLOGIA
P R E S E N T A
NORMA ANGELICA FLORES MERCADO
GUADALAJARA, JALISCO 1991
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOOICAS
C. NORMA ANGELICA FLORES MERCADO
P R E S E N T E.
Seccin ............... .
Expediente ...........
Nmero ............... .
Manifestamos a usted que con esta fecha ha sido aprobado el
tema de tesis "ESTUDIO COMPARATIVO DEL RENDIMIENTO DE PRODUCCION DE ALCOHOL
DE Zymomonas mobilis! Saccharomyces cerevisiae A PARTIR DE MELADURA", para
obtener la Licenciatura en Biologa.
Al mismo tiempo le informamos que ha sido aceptado como Di
rector de dicha tesis al M. en C. Fernando A. Peraza Luna.
EL SECRETARIO
A T E N T A M E N T E
"PIENSA Y TRABAJA"
Guadalajara, Jal., 7 de Febrero de 1991
EL DIRECTOR.
M.
!ft1JateC4 de le. FMHlt@tdl
c.c.p.- Al M. en C. Fernando A. Peraza Luna.-
c.c.p.- El expediente del alumno.
Pte. . g;ie 'ptenctM,
,
CBZ/MTM/vsg'
Boulevard General Man:ellno Oalda Barragn y Corregidora. S.R. Tels. 19-80-54 y fax (36) 50-:5251 Jal
CENTRO DE INVESTIGACION Y ASISTENCIA EN TECNOLOGIA
Y DISEO DEL ESTADO DE JALISCO, A.C.
M. en C. CARLOS BEAS ZARATE.
DIRECTOR DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS.
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA.
P R E S E N T E.
Estimado M. en C. Beas Zrate:
Ref. M.F. 043/91.
20 de Marzo de 1991.
Por este medio le comunico a Usted que la Pasante de la Licenciatura en Biologa
NORMA ANGELICA FLORES MERCADO, ha conclu.do satisfactoriamente el Proyecto de la
Tesis Titulada: "ESTUDIO COMPARATIVO DEL RENDIMIENTO DE PRODUCCION DE ALCOHOL DE
Z. mobilis y Saccharomyces cerevisiae A PARTIR DE MELADURA", realizado en el Cen
tro de Investigacin y Asistencia en Tecnologa y Diseo del Estado de Jalisco,
A.C.
Asimismo le informo que he revisado el manuscrito de la tesis y considero que -
cumple con los requisitos establecidos por la Facultad y lo presentamos a su con
sideracin.
Sin ms por el momento, aprovecho la ocasin para enviarle un cordial saludo.
/
:ir.'.ZA L"'A.
JEFE DEL DEPTO. DE MICROBIOLOGIA Y
FERMENTACIONES.
CIATEJ, A.C.
FAPL/'nzk.
de la Facultad
de Oencias,
AV. NORMALISTAS 800 S.H. APDO. P. 2-191 C.P. 44270 TELEX CIATME 0684256
TEL.: C36l 240034 243366 243314 243812 233620 238336 FAXC36J 24 11 30
GUAOALA.JARA, .JALISCO. MEXICD
Dedicada especialmente a mi madre:
Por su constante esfuerzo para mi formacin personal,
por haberme dado tanto amor y proteccin
GRAC AS
Que Dios te bendiga
AGRADECIMIENTOS:
Biol Mario Prado: Por haberme dado un gran motivo
paPa ser- felfz.
Mi m<.\s sincero agadecimiento a:
M en C Fernando Antonio Peraza luna.
M en C Martin p. Tena Meza.
Q.F.B. Rosa MaPfa Domlnguez A.
Ing. Jaime Miguel
M en C Ma del Refugio Mora.
Francisco Mercado Camarena
Biol Fernando Chiprout Lizr-raga.
Biol Alejandro Mora Ruelas.
Biol Virginia Negrete Ibarra.
Psicol. Silvia GonzAlez
Biol Arturo Manzo Fontes.
Biol. Araceli Villalpando.
lng. Carlos Castrillo Sandino.
Ing. Javier Oliva Aguayo.
Q. Garcia Landeros.
Al CIATEJ
A empresa Tequila Sauza SA de c.v.
Por su amistad y apoyo que tan enoPmemente
sblo en mi formacibn sino
humana.
contribuyer-on no
en mi calidad
El presente trabajo realizado en el Departamento
de Microbiolog1a y Fermentaciones, de la de
Biotecnolog1a del Centro de Investigacibn y
Asistencia Tecnolgica y del Estado de Jalisco
A.c., bajo la direccin del M en c. Fernando Antonio
Peraza Luna
I, INTRODUCCIOt-1
En ltimas la Biotecnologfa como disciplina
producto de la fusin de la bioqufmica, la gentica, la
ingenierfa qufmica y la microbiologfa aplicadas a la produccin
Y utilizacin de los microorganismos y de sus productos, ha
venido ofreciendo nuevas y mejores alternativas para las
industrias como la alimenticia, farmacetica, agrfcola, minera Y
de alcohol, entre otras.
Es especfficamente en la industria del alcohol en donde la
Biotecnologfa ha desarrollado procesos novedosos a los ya
ex i en materia de fermentaciones, haciendo que
aumenten su productividad, eficiencia y rentabilidad.
La produccin de etanol ha cobrado gran importancia en los
l timos al"ios, sobre todo en pafses donde sus recursos
ene-rgticos han Brasil >' Estados Unido:. de
Norteamrica, son un ejemplo, donde utilizan el etanol como
e-n algunc<E cascs mezclado con gasolina y e-n otros.
en forma pura.
Tradicionalme-nte, para la produccin de- alcohol a partir de
sac.arosa mediante fermentacin de levaduras entre ellas una de
1 as m<E. ut i 1 i zada<E- e:. Saccharcmyces cere-v i <:-i ae, aunque al
biotecnlogos sienten que en el futuro la importancia industrial
de ste grupo de microorganismos porque ellos
producen pocos met.abolitos secund.3.rios de inters comercial. Por
otro lado, recie-ntemente se ha observado una mayor produccin de
etanol por parte de .Jna bacteria del gnero Zymomonas, la cual
utiliza nicame-nte su:.tratos puros de glucosa, fructo:.a y
sacarosa. Asi mismo, en la industria de las bebidas alcohlicas,
se ha estado _inve-stigando la posibilidad de sustratos
comercial es, que permitan aumentar 1 a calidad del producto asf
como mejores rendimientos. Debido a esto es muy importanh la'
investigacin de las fermentaciones de Zymomona y de
c<?re-visia' 'n l-as cual<?s se utilicen sustrato<:. comerciales para
su aplicacin a nivel industrial.
I I
La p<o.l.:.bra e:. de origen ].:.tino y en :entido
escrito se ha usado para designar la transformacin del jugo de
uva en vino. La palabra latina "fervere" significa "hervir" y se
us.,.. pa.r.:. des:ribir el aspecto efervescente del jugo de 'J' . .Ja en
ferrnentac i r.
En ].;o.. actu.:.lid.;o.d seo leo llama ferrnentacin a.l:chlic.;o .. :.. 1.:..
fcrrn.;o.cin deo alcohol etflico <C2 H5 OH) a p.:o.rtir d? g1u:osa Y
otros. a:zcare::. l.;c. S-3.C-3.ros .. 3., pc,r J \ i n de: ! c.=.
de leovadura, la cual puedeo ser representada
C.: Hl2 06
Gl U!:C,S-3
( i :30)
2 C2 H5 OH + 2 C02
Et.o.nol Bi>:ido
(92)
de
c.:.rbono
(88)
L.:. ecuacin descr i t.:<. puede ;;.er a.p 1 i ca.d.:;.. t.=-.n te par.:;,
ferrnentos de como de bacterias, 1.;, cu.;,l rn.Hc.:o. lo:o
:.igJiente: Un rendimiento de 51 g de et.;,ncol puede -:.er obtenido
de .la fermentacin de 100 g de gluco:.a . L.;, prdida se .;o.trib!J>'e
al crecimiento del microorganismo y la formacin de subproducto:
<Kirk & Othmer, 19.S2; Kirl< & Ott-.rner, 1'?81; cTones et a.l, 1'?:31!.
1.- FACTOF:E::; Y COMPONENTES CARACTERISTICOS, t-!ECE::;ARIO::; PARA
LA REALI Z:'-1CI ON DEL DE PRODUCCI ON DE ALCOHOL POR
FERHENTACION.
cc,mc todc1 :.eres. vi.}c:., lo-:. microorga.ni-:.mo-:. crecen, -=e
reproducen y :.egregan alguneos compuestos bioqtJ!micos de
importa.nci.:. p.;o.ra el hombre. E';da e-:. un.;, de 1.;,:. Garacter!stica:.
pr i mord i a 1 es pa.r.;, 1 a u ti 1 i zac i n. de 1 os mi croorg.:in i smos en 1 o::
prccesos ferrnentativc:., le que de algun.:. rnanera :.e
puede represen t.:o.r corno 1 o muestra 1 a f i gur.;, 1. Es deo::.i r, que
para que una fermentacin se real ice son necesarios los
s i g u i en tes r e q u i s i tos : tener un m i ero o r g .:. n i srn o de
caracterfsticas idneas para el proceso y/o producto particular,
prcveer un medio de cultivo a.decu.;,'do (que conteng.;;, todos lcs
nutrirneontos en las proporciones y cantidades ptimas
de produccin) y finalmente, establecer y controlar las.
co::ondiciones. fi<:.icoqu!mica-:. nece:.arias pa.ra el desarrollo de la
ferrneontacin. Corno resultado se obtendr una cantidad de
m j cr;)Organ i ':-ITIOS
J:ll"'incipalmenteo
mayo::or que la inicial y diversos !productos,
etanol <KirK & Othmer, 1962; Presscot
Dunn, 1976; f(irk e, Othrner-, 1981; .Jone:;, et :o.l, 1'?81; Quintero,
1'?:37; 1'?88).
A ' t1I CF:OORGAN 1 3t10.
La :.eleccin del rnicrccrg&.nis.rnc n: -;;.o::olo -:.e limita a qJe pueda
:;. cabo 1.;;. r-e.ccin sine el qJe pueda efectu.::o.r el
cambio bioqufmico nec'-:.ar-io en peoco tiE'mpc, qJe pr-::oduzc el
rendimiento pcrs.ible con un mfnimo de .;;.tencin y que
mantenga sus car-acter-fsticas de gener-acin en genE-r-acin.
Actu.3.lmente se conor:en 3'7' gner-os de 1 e . ..oadur.;;.:. con 400
es.pecie:., dE' cu&.le:. la-:. m-:. utili::.;;.das. p.?,r.;;. l.;.. produccirr de
e =.on c1:;.pa.: S-3.cch::-.romrce-:. i -= i -3.1? y
carberaen::.i;:. (t1ur-iller, E't, al, 1'7'84; Cocheiro, 1985; ...Jart,
19:35).
Por- otr-a par-te, en los ltimos 10 anos ha tomado una enor-me
i mpeor- tan e i .;;. una bac ter- i .;;. de 1 gnero ZYmcmr::on;;.:.. E-:. un
micr-crcrrg;;.ni:.mo ccn un pctenci.=-.1 de rpid.;;. prr::odrJccin de alcchol
par-a aplicaciones industr-iales. Las Ztmeomonas ha sido utilizadas
en .tr.re.:o.s. tropical':. d'1 mundo, como un agentE' fE<rmentativc
n.3.tur-.;;.l par-a bebi d.;.: .. ;.1 cohl i :&.s obten i d.;;.s de l.;. s.;.v i a de 1 as
pl.:o.nta:.; rJn E'jE'mplcr mu;.- conocidc E<:. el pulqJE', bE-bida
nac i eon.a 1 Ztmomon&.:. se ha 1 to un mi croorg.;.n i smc popul.;.r-,
pr-incipalmente par-a estudios E'n ingE<nier-fa bieoqufmica y gentica
(8rJch.:o.n.:o.n & Gibbon:, 19:34; 1'1onteneceour-, 1985; 1'?86;
Bu.chhcrlz, et al, 1987).
8). NUTRIHENTOS.
En t::odo proce:.cr ferment&.t i vo,
consider-.3. un a.specto de import.;.ncia
v i s t a e e eon m i : e.
el medio de pr-cduccin
vital el punto
-:.e
de
Los nutr-imentos son ceompuestos del sustratr::o o mater-ia prima
asimilables por el microorganismo. La materia pr-ima contiene a
menudo suficientes sustancias nutritivas, aunque E-n eocasionE's es
necesario agr-egar compuE-stos que juegan un papel esencial. Para
la mayor-fa dE' las matE-r-ias pr-imas utilizadas par-a fer-mE-ntacin
alcohlica., utiliza.ndc cepas de... cerevis.i.;>.e y;_. mobilis, los
suplE-mentos ms necesarios seon los compuesteos fuentes de
nitrgeno y fsforeo, asf ceomo pequenas cantidades de vitaminas,
E-lementos tr-aza, E-tc.
El nitrgeno s.-, sum in i s.tra en forma
urea, aminocidos, etc. El sulfato de
ampl i.amE<nt.-, uti 1 iz.;r.dcr -,n. fE<rmentacieone-:.
limitacin de iones de amonio en el medio
de :.a 1 e-s de- arnon i e,
amonio es el ms
indus.triales . Una
de nutrie-ntes caus.a
una repentina transicin de la fase de crecimiento exponencial a
la fase de crecimiento 1 ineal.
El fsforo se aftade en forma de fosfatos el ms uti 1 izado
es el fosf.ato de amonio. La concentracin de fcs.f.at:Js
la slntesis de llpidos y carbohidratos y mantiene la
de 1 a mernt:r .an "'-.
L.3.s .itaminas. regularr el metabolismo del microcrganis.m:o :.u
fr.Jncin es enzirntica. Los requerimientos de las Jit.3.minas
esenciales para los rangos de fermentacin depende de la cepa.
Biotina y pantotenato son '!itaminas esenciales pa.ro>. t:Jd.as la::;
cepa:. dP. Sa.cch.:.rom;.-ce: >' Z'/mcmon.a: . El in:J:.i teol es un f.acteor
es.enc i al de 1 crP.c imi ento p.ar.a mi croorga.n i smos, el cual en forma.
de fos.fatidilirro:.itol juega un pa.pel clave P.n el
de la integridad de la membrana celular.
Loo:. elementos. traza come t.-J,;;, Fe, Co, Ca., Ni, Zn, Cu :on
de necesarios en !.:. sfntesis de enzimas y son factores
crec imi ento.
C). CONDICIONES AMBIENTALES.
Para que un proceso se desarrolle eficientementE> , tambin
es de considerable import.ancia. que :e ;. C()ntrolen
la:. condici:nes. ambientales, p.ara que el micrcocrgani;mc
transforme las sustancias nutritivas al producto deseado con un
m;<imc de P.ficiencia. Entre la-:. condiciones bsicas. :.e
encrJentran el pH, C:Jncentracin de azrjc.ar, temper:;;.tur.3. y
co:; 1 geno.
El efecto del pH es. muy importante en el :ontrol de J.:..
cont-3-minacin, en el efecto del :recimiento del microorg.:..ni?mo y
en la formacin de subproductos.
importante debido
el re-ndimiento de
de a.zrjcar de 1
cl.3.ves pa.ra 1-3.
La concentracin de azrjcar es otro factor
a que el contenido de carbohidratos determina
ferment.:;..ciCm, la. efi:iencia de- conversin
micr:Jorga.nismo los cu.3.1es son dos p.3.rmetros
valoracin de la ferment-3-cin como tal.
Por otro lado, la temperatura se
lo-:. intervalos ptimcs, t-3-nto para el
accin enzimtica. Se ha obse-rvado que
de la tempe-ratura mxima se reduce la
como tambin se nota decremento rpido
debe mentener siempre en
crecimiento como para la
ope-rando cerca del rango
tolerancia al etanol asf
de 1 a v i -3.b i 1 i dad e e 1 u 1 ar
El oxigeno es. necesaric
fermentacin, particularmente
en le:. primeros momento:. de 1.;..
para 1 a reproduce i n de 1 as
clulas en condiciones ptimas.
2.- SIOLOGIA DE ZYMOMONAS.
Z:rmomonas
Zyme = fermentacin y monas= una unidad, o sea, una clufa con
capacidad fermentativa.
Zymomor,.;;.s. fu des.crit.:>. primeor.a.mente- por BaYer Hiller en
1912; fu e-ncontrada como un age-nte causante- de la enfermedad de
la sidra <putrefaccin).
Sin emba.rgc, el deo;:.cubrirniento de esta bacteria le
a.tribu/e a. Lidner en 1928, Q'Jien aisl. este microor.;_,.anismo del
pulque y lo llam Thermobacterium mobiles. Esta bacteria se ha
y se .ahora como mobi 1 i ::. SIJbes.pec i e
rnctil i;:. (ATCC 1098::::;> (8uchana.n & Gibbcns, 1984; nontene:cur,
1985; lawford, 1986; Buchholz, 198?).
A.- TAXON0t1!A.
El .;nero 2Ymomonas comprende una sola e-spe-cie l mobilis Y
dcs subespecie: 2Ymomonas mobilis rnobilis y Ztmomonas mobilis
pcm.aci s, Gibbcr,;;., 1'7'84; t1ontenecour, 1'?85).
8.- t-10RFOLOG I A
colonial :Ztmomonas forma colonias con bordes enteros,
desteollantes; de color blanco cremoso; de 1.5 mm de dimetr-o
para ].a sube:.pE<cie mcbilis. y 1.0 par.;.. l.a ,..ube!:.pecie pom.acii
deospues de 7 dia.s de incubacin .;.. 30C. 3u elevacin ser
convexa o umbonada.
Fcrm.;.. celular: L.;..s. clul.a:. tienE-n fcrm.:. dE< b-a.:ilo:. con
puni:a.s. redondead.:.=-; oc.as.i cmalrnen te el i psoi d-O<.l es. Se encuentl'an
genera.lmente en p.;..re:.; :epas fcrm.:.n en
forma de roset.;..:., c.adena..s. o clul-"'s fila.mE<ntos.:,:=, de 2.6 mm de
lcngit,Jd y de 1.0 a 1.4 mm de dimetrc. Nc espxa:. ni
cpsulas (8uchanan & Gibbons, 1984; Montenecour, 1985).
C.- Fl'::JOLOGIA
es. una b-"'ctE<ri-"' Gr.;;.m neg."'tiva, g.;.neralment'
movimiento; cuando lo posee tiene de 1 a 4 flagE-los polares. la
moti 1 i dad pJedE< p.;.rder .. :.f? e:.pcntnE<amen ti?. :3on cornnmen teo
f.:..cult;;.tiva.-=., a.unq,Je algunas ceop.;;.s son anaerobias.
obl i g<o.d.;._: .
Su temperatura ptima de crecimiento es de 30 C ; el pH do;.
cre-cimiento ptimo es deo 3.5 a 7.5. Ztmomonas toler."'
concentraciones de etanol de 5.5 a 7.7 %, y concentraciones de
glucosa de 20 a 40 :.--;.Requiere vit-3.min.O\s corno biotina. y
pantotE<nato, adems de de lE-vadura y peptona.
----
ZYmomon-3.S e:. resi -:.ten te -3-ntibiticcs
( ; <: n t arn i : i n a. , 1< " n a m i e i na. , n e crn i e i n .,. , p e n i e i 1 i n " , e :. t r e p t cm i e i n
Y es sen-:.ibl<:' a. cl::.r.3.fenicol : tetr.;..ciclin.,.. En el ca:.o d'2
ampicilina y eritromicin.;.. 1.;.. re:.i:.ten:i-3. e:. \!a.ri-3-ble <E:uch.o..n.:..n
Gibbons, 1984; Motenecour, 1985).
La membrana celuJ.;,r de Z:-momona.:. e:.t compue:.ta por
ipin.a, fo:.fatidi Jet.anol.amina., fosf.;,tidigl icer.::>l ;.-
fcs.f.;.. ti di 1 ccd i na, adems de o;;ras.o:. corno e- J c ideo
vaccnico, mirfsticeo, palmftico y palmi toleico. La sacarosa y el
et.3.nol p.;,re:en nc tener efectos. perjJdi e i .':\1 es. :.cobre 1.;, rnembran.;..
celula.r, >'"- que se h.;.. eobs.er . .Jado que la. toler.3.nci.oo. .:o. a.Jt.;..-:.
:cmcentr.3.ci:ne:. de esto:. s.e dete princip.;..lmente .a 1-3. pre:.en:ia
del cido J.;o.ccnico que representa un 75 :;; o ms del CQntenido
di? en 1-:r. (Cart?y In9ram, 1'?:33;
HontenecoJr, 19:35; Doelle t< Greenfield, 1985; 8ens.chc:er &
1 no;;ram, ;;::=.:.; E:uchhcl z, Dcol e/ 8< E.Je 1 e- i gh, 1 '?S7). A:. i mi :.mo, 1.3.
tolerancia a altas tempe-raturas e-s otro factor importante,
puesto que a temperaturas mayores de- 41 e la proporcin de cido
.Ja.ccnico disminuye, el cidc mirf-:;tico. La.
prcpcrc i n de- fc:.f.:.t i di 1 colina ;' cardi ol i pi n.;.. :.e- i ncrement.an
disminuyendo la fo:fatidiletanolamina >' fo:.fatidilgli:e-r-cd
Ingram, 1986).
Dur.;,nte un cicle de fe-rment.acin, el porcenta.je- do? a9u.a
intracelula.r declina y este efecto:; e-s rn:. ma.rcl.do a alt ....
con:<?ntr.acin de s.ustratc inicial. E:.tudico:. rnicreo:.cpico:. con
reJela.n una a.trofia. celul.u rel.;..cionad;.. con l-3. c.afda
del contenido de agua intrace-lular el cual no se ve en Zymomeonas
(Laudrin, Sei ller, Torrijos, Uribelarrea & Goma, 19B4).
Z).rnom.:n-3.-:. de di.Jer: .. :..:. enzima-:. iz:t.r
].;.. gluclisis; principalmente la.s fosfogluc:oquina.-:.a. ZYmomon.;..:.
utiliza l-':1. Jfa Entner DC<udoroff para la. degrad.':\cin de
ca.rbohidrato:. en un 100 (figJra. 2). Zymornon.3. utiliza slo tres.
ca.rbohidr-3-tc:.: glucos.a, frJc:to:.a >' s;.acaros.a. La h.;..bi 1 idad de-
utiliza.r sacaros.a e-s presumiblE" debidc a la presenci.':\ de
inve-rta::: .. ':\. Z'momcon.3.s no es. c;tpa;: de- rne-t.':\bol iz-3.r otr.3.:. fue-ntes di?
carbono: rafinosa, xilosa, ramnosa, galactosa, manosa, sorbitol,
a.rabino:::.a, ,juJcitol y lacte: .. :. .
Zrmomcona.s. fermenta. gl.Jco:::.a a. 1. 8 a. 1. 7' mol es. de etanol y
0.2 moles de lactato por mol de glucosa utilizada. Slo del 2.0
al de glJco:.a ccns.Jmij.3. e-s con . .Jer-tid.':\ a biom.':\s.;... L.;..:.
enzim.,.:. relev.3.nte-:. p-3ra mantene-r una C>(idoreduccin b-3-la.ncead.':\
en l.a fl?rmentacin s.eon: glucQ:.a-6-fc:o:.fateo de-:.hidrcgenas .. ,
gl icl?raldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa y etanol deshidrogenasa.
ZYmcmcnas e-s. un.':\ de 1 a:. pc .. :-3.:. ba.c ter i as. qJe pQ:.e-en un.,.
piruvato decarboxilasa tipo levadura y por lo tanto puede
producir e-tanc,J por reduccin de- acetaldehfdc <Da\'-Je:., Ribbcns e<
L-arge, 1'7'6).
Leos pr-incip.:o.l>?s productco-:. pcr ZYmcmon.;o.-:. ;;.on >?1
eb;>.nol >' C02. E:.;,.jo C::!ndiciones aerbicas lo:. productos fina.les
for-mados pr-incipalmente son acetaldehido, acetato, lactato,
aceti lmetilcar-binol >'glicerol. Por- otro lado, algunos alcoholes
-:.upericre-:., princip.?,lrno?nt<: n-prcop.:o.ncl ;.' alcchcol i-:.ca.milic:, -:.on
detectables en algunas cepas. El levano, un pol !mero de
fructco-:.a, .;.;;. un producto impcortant.;. formadc pcr ZvmcrrtCn-:o.s
durante el crecimiento en sacarosa. El 10% de la sacarosa en el
medio es conver-tida a levano el resto
Y glucosa. La formacin de levano est
e i ert.;o.;;. cepa-:. nc prcducen 1 eJa.no
1985).
3.- 8JOLOGIA DE SACCHAROMYCES.
es convertida a fructosa
1 igado a la temper-atura;
.;.. .;o.l t a:. t emp er a tur a:.
L-3.: son cu.:o.nti t.:o.ti.,oamente y ecQnm.icamente el
grupo ms de comercialmente
explotados por el hombre. La importancia de estos reside en su
apl io:.:o.:in indu:.trial, pa.r.:o. 1.3. cbtencin de prcoductc-= tile-:.,
debido a propied.:o.de-:. ferment.3.ti..J.;..s y cxida.ntes que
desar-r-ollan sobr-e determinados sustratos. Su contribucin al
progreso de 1 hombre h.;.. s.i do b.:o.sa.d.:o. muy amp 1 i .;,.mente en su
cap.:o.:idad P.r.:oo. producir un-3. rpida )' eficiE-nte ccnuer-:.in de
azc.21res en alcchol y C02 (Pelcza.r S., Re id, 1978).
En 1838 J. F. V. Meyen dt-nomin


en
dur.:t.n te mue he:.
1.;.. t 1 n Sac:h.:o.romyces,
os. e cmo n Cmbr e
unicelul-:o.res que se
que eran capaces de producir en
fermentac:in a.lcohlic.;; . 1'1-: t-3.rde
a estos vegetales
denom i n.::o.<: i n que
''hongo::.
perdur
ge-nofr i cc de todc= 1 o:.
r-eprodJc>:n por gem.::o.c i n ;'
mayor o menor grado la
se subdividi >::.te nombre
en varios (Jorgense & Hansen, 1978).
A). TA><ON01'1IA.
:=;a.ccharcmYce-:. ce-re- . .J i ;..;..e e;;. urr.;o. 1 e.,o.:o.dura.
( c l 'J la. C-3.p.;.z de forrn.ar a.-=.co-:.pora.-: en :.u a. sea.) que se encuero tr.;..
err el o;;rupo d., l C-:. Errdeornycet<:<.l e-:., f.:o.mi 1 i .;.. S.;;.cch.3.rcomyce-ta.ceae,
subfami 1 ia. Saccharomycoide-ae-.
8) t-10PFOLOGJA
La mcr-folo:oo;;f.3. ce-lul.;o.r depende- en alteo o;;radc de la-:.
C:)ndiciones b.::o.jeo crJ.:o.le-s cre-cen y se corrse-r..J.;..n la.s clul.:o.s.
Las clula.s de . cerevisiae normalmente son redondas o
elipsoidales, oscilan de- 1.0 a 9.0 micr-as de dimetro; >'de 2.0
a 20.0 micras de longitud <Prescot & Gordon, 1962)

C) FISIOLOGIA
Las levaduras poseen dos formas de reproduccin: sexual Y
asexu.3.1. En contraposicin .;, la m-'>.::,.,orf.a. de lcr:. hongos
la reproduccin asexual no se efecta por medio de
rganos especialmente form.ados. L.=-. repro:duo:o:in e
as.exJal oo:Jrre peor tQrmao:in de bl.;.:.tQs.p.:.rcos. (gem.;.o:in), por
medio de la f6rmacin de conidios (fision binaria o fisiparidad)
o por combinacin de los dos prQo:esos (gemaparidad).
En el pro:es.o de repro:Juccir: s.extl-3.1, t:.d.c,.: l.as le-.!.adur.;:,.s
11
Verdadt'2r.,.s" produce-n a.-: .. :ospor.:r_: .. Por es.t' mcti
1
...'0 inr:lu)'E>n
las levaduras verdaderas en el grupo de ascomicetos u hongos con
receptcJlo e .as.c.a. El as.ca contiene, por le genera.l, de 1 a 4
esporas pero a .Jeces .su nmero es. de 8 o La.s. espor.;,s. :.e
pcr di . .-tisicnl?s del nr.Jcle-o; nclec
f::.rm.ado se rode.a de ma.teri.al cit.:plsmi:c, y despu;;, por 1.;:,.
p:..red celJl.;:..r.
L-as. 1 e...'adur.a.:. s.on :.rga.n i :.n-..:s he terotrf i co:o:. que pueden usar
azcares y una variedad de compuestos orgnicos como fuentes de
nJ tr i : i n. De e:.tcs. compues.tos. e 1 1 a:. cbt i en en 1 cs. e:.que 1 e to:. :JE<
c.arbono neces.a.rios para re.aliz.3.r sus diferentes reaccione:; de
bi:.s.fntes.i;;. <F:os.e e, Harri:.:.n, 1971). :. cere...'i-;:.iaE< ti<?ne- l.a
h-'l.bi 1 id-3.d de f"'rmenta.r Jn .amplio r.;o.no;;o de .?,zcares. por ejemplo:):
glucosa, fructosa, galactosa, mal mal totriosa.
El primer pas.o en la utiliza.cin de- cu.a.lquier .az,:a.r por S.
es usualmente siguiente:
1.- Paso intacto a travs de la membrana o
2.- Una hidrlisis inicial fuera de la membrana,
seguida por la entrada a la clula de uno o
todo:= le= pro:odJcto::= ,j" l.;., hidrli:.;; .
El tr.;:,.ns.porte de :.tos <o.zc.;.,res. es. por difusin
faci 1 i tada.
3.- En cuanto estos azcares entran a la clula
1
la glucosa
se fosforila a la respectiva glucosa-6-monofosfato con la ayuda
de un.a enzima. o:::.mr:in, la hexoqJin;..:a >' ATP Des.pus. 1.:..
glucosa-6-fosfato es convertida a fructosa-6-fosfato y otra
e-nzim.a fosforil.a s.ta rjJtima en fructeos .. ;.. 1..5 difo:.f.ato ccm e-l
gasto de una molcula de ATP. A estas reacciones le siguen una
de p.;;..s.eo:., vfa Embden- 1'1eyerhcf eo glucli-:.is <f'i9ur.a 3 ).
El resultado total de la degradacin de una molcula de glucosa
e-:. de:. molcJlas. de C02 y dos. molculas. de eta.nol con un.a
ganan e i .a neta de do:. mol es de ATP. Est-3. form.a de energf .3. <ATP)
e:. u:.ada para suplir lo=. reqJerimientcs energtico=. el
crecimiento celular y 1.;., sfntesis de productos de .;,lmacena.miento
<Phaff, et al, 1978).
La.s 1 e.Jaduras, como l.;,s bac ter i as y otr.;.,s. form.as de vi da,
requieren deo ciertos. materi.;.les a.l imentico:. >' condi:iones en el
m>:-dio para un .apropi.ado cre-cimi<?nto y r<?prcducci<::m.
elementos son bsicamente necesarios, como por ejemplo el
hidrgeno, oxfgeno, ni trgen, fsforo, potasio, azfre,
c.alci::., hierr::< y m.agnesic. Un s.uminis.tro adecu.ado de agu.3
l?s.encial po-.ra que puedan lle.Jo-.r .a c.abo -".:tividades. .,oib.l<?::.
(Prescott & Gordon, 1'7'62).
cJ?r.;r ... i:::.iae requiere de vitamin-:.-:. para realiz.:tr un.:..
funcin c2d.alftic.a vital, las vit.amin.:>.s deben por le menos ser
suministradas <?ro el medio o sintetizadas por la misma levadura.
Al;un.as de vitaminas esencia.les son: bictina., Y
ribofl?,)ina, :.:n ccmpcne-ni:&:. de coenzim,;o.::. ccmo NAD y FAD; acido
pantotnico, componente de coenzima A y en reacciones de
aceti lacin; ti ami na, funciona como pirofosfato de ti ami na en la
descarboxilacin de acta en reacciones de
.. ;.mi i .:,n; .;.e i d:, fl i ce, fiJnc i ::-n.:t. come te trah i drc,fcl-;.. ter.
biotin.a p.;.rec<? ser la m.?.:; comnmente requerida (Jones, et al,
1 -;:::: 1 )
L::.s. lfmite-;: .. ;.b:.olutcs. de-l pH pa.ro-. :;:;. ce-re,,i::.i.a>? ;:.or, de 2.t:
.3. B.t., perc el cr<?cimient::. ptimo e= normalrnente entre el r3.ng::.
de pH 4.5 a 6.5. La temp<?ratura de crecimiento oscila entre 25C
y 30 C, un a. mayor t emp 2 r tu r e a. u :: .. a de =-es bl.b i l i z .3.C i n de 1 :;.
>'un rpidc decrementc E-n la .,<i.:.bilid.s.d celul.:.r
e-t al, 1'?7:3; Jone:. et al, 19:31).
4.- DIFEF.:HJCIA::; H!PORTANTE::;; ENTRE 2ymmnon.;..:. mobilis:. Y
SaccharomYces cerevisiae
Z:'ITIC<rnon.s. mobilis. es r:inica porque pcs'>? la vi.:.
Entner - Duodoroff para catabol isrno de glucosa y fructosa. Esto
e:. de inters. p.:.rticular porque e-s.ta vfa de d>?::.ccmpcs.icirr de
3.Z:ar es. difer<?nte a 1.>. vf.a Embden- t"le;.'erhcff que utilizan l.O<.:.
1 e.J.adura:..
El rendimiento del producto (ca.ntidad de et.3.ncd por
glucosa) es el mismo para ambos organismos. El punto de atencin
es sobre la relacin entre el proceso do? suministro de energfa y
la demandad<? energa.
En 1 evaduras. existe un acop 1 amiento en tre 1 o;:. preoces.c'::
i cos (dema.nda de energf a) y cata.bol i ::.mo (prcducc i n d;;
E-nergfa). Debido a es.te o.ccplamientc ;:.on necesari.as
concetraciones muy altas de levaduras para lograr una aceptable
velccidad de ferment.3.cin. Este es. un contraste directo o-. la
situ.:o.cin e>:is.tente con Zymornonas mobilis, donde el suministro
de energ!.;.. no es cxrtrolado por la derrr.arrda de- enE-rg!a d' la
biosfntesis del organismo y procesos anablicos.
El rendimiE-nto dE-l crecimiento molar anaerbico respecto a
ATP es constante y el rendimiento molar neto de ATP es dos para
S. cer-e.)i:.i-:te y -:.cdo un ATP par-.;,. z. rnobili;., pcr le t.;,.r,tc, el
rendimi;;.nto de crecimiento par.'>. :;:;, cerevi:.iae e:; dos veces ms
que de Z. mobilis .. Sin La . .Je1ccidad e::.pt?:ffic.:c. de
crecimiento para S. cerevisiae y Z. mobil is es muy similar, por
1: que :.e prediceque la. . .Jelc .. :idadde utiliz.;..cin de .;..::rJc3.r pcr
Z. mobil is debe ser dos. veces m.t..s. rpido que pc:w S. cero?: ... i::.i.:..e.
A la mi:.m.:., concentra.cin dt? t:iom-B.;.a, z.,mCtmon.=-.= es. der
con:.umir glucosa cincc vece::, ms que S.
cer.)i:.iaE-. E-:.tet -:.e relacic.n.:.. dirt?ctamente- ccn

de y es un parmetro clave en estudios comparativos
con levaduras y bacteri;..s fermentativas.
L-3. produccin de eta.nol por S. cere11i:.i ;..e norm.;o.lmE-nt,:;; un
proceso asociado al crecimiento. El mantenimiento del
metabolismo se controla por un no crecimiento de la levadura ya
av.'>.r.;:.;..d.;.. la ferme-ntacin, cua.ndc J.a. :cncentracin de e-t.;..nol e-:.
relativamente alta.
En el tie-mpc pre-:.erde, ].;.. m-:;. :.eri;o. de:.ve-nta.,ia. de Jtil iz.;.r
z. mobili::, e-n Jug.;..r de lE-..oadura::, est.t.. "' un.;.. mu>'
1 is.t.;.. d' -:.u-:.tratcs de azc.;_r Diferente
de:=;, C'rE."-'i"'.i-'l.E' que es c .. p.'l.:: de prcducio' etanol de Jn amplio
espectro de- sustratos CLawford, 1986).
5.- F:Et'.JColt",1I Et--lTOS DE ETANOL POR S.;..cch.'l.romtce:: o:er'?' . .J i :. i _.,
Ztmornor,.;..s. mob i 1 i :. A PARTIR DE DI FEF.:ENTE:O; SU::::TF.:ATO:O;:
En tr-3-b.;_jos. re.;_l iz.;_dos. par.,.. la obtencin de .:o.lo:chcl
1 e.J.;..dur.;_-;., :.e t,.;_ ob=.e-rva.do quE- 1 a. pr::oduc: i n de et.;..ncl ;.E- 1 c";r.'l.
en un tiempo no menor de 36 horas. SaccharomYces la
levadura comnme-nte- empleada, puede dar rendimientos dE- 0.43 a
.p.;.rtir de 100 g/1 de glucos.3. en 3.:!0. hor.:o.s <Rose, 1'?7.:5!, Jn
rendimientc de 0.40 a p.;_rtir de 200 g/1 dE- s.:o.c.:o.rc:.e. E-n 72 h:<r3.s.
(Ro:.e, 17'76) ;.- un rendimiento:. de 0.46 o. p-artir de mel.azas de
c.:o.!'i.;.. dilufda a 23 E:x (f'inal, 17''>'0).
Por otro J.:o.do, l.:o. b.:o.cteri.:o. Z. mobilis. puede alc-'>-nzar
rendimiento:= del 0.47 a p.:o.rtir de 100 g/1 en 36 hcra-: <L:o.\.,fcrd,
1986>, un rendimiento de 0.47 a pariir de 200 g/1 de sacarosa e-n
32 horas CDoe-lle & Gree-nfie-ld, 1985) y un rendimie-nto de 0.50 a
p.3.r ti r dE- 121 g/1 de sacaros.:o. de jugo de cai'i.:o. en 29 hora-:.
CDoelle & Greenfield, 1985).
6.- MELADURA O t'IELAZAS RICAS INVERTIDAS.
E-:. un producto que :.e> obtiene- de- la c.:o.!'ia .j,. .;..zc;o.r; :.u
produccin fu desarrollada durante los ltimos 25 a!'ios en. Cuba
/Puerto Rico. La meladura se- fabric;.. en lugar de azcar, nunca
simultneamente <Meade, 1967).
L.;.. c:.:d"i.;.. de :,zrjc:.;..r representa Jn el ernE>ntc:> rnu-,.- irnp:rtante
dE>ntrc dE> ].;.. E>.:onomfa de nuestro E;; un.;;.- hE>rb.fo..:e.;. que
perte-nece .:r.l gr!Jpo je que :.e c.:r.r::.ctJ:?riza por
presenta.r part? de su ccmstibJcin un recto, cilfnd1ico,
nudcs.c f ba.:.t.;..nte firmE> quE> le prcpcrcio::>na. gr.;..n re:.i:.tenci.;.. /
l.;..s. ho._ias planas. estn inserta.da.s en c.;..d.;.. uno d?
le>;:. nudo;: .. Crece- P::>r lo ge-nE>ral E>n clima:. Y
subtrc:>picales y es producida aproximdamente en cien pafses. Su
princip-:t.l deri-..'-3. de :.u a.li:o conternido de =--:tc-:.<.rc':-.:C.,
cual puede alcanzar hasta un 11 % en peso, aunque su composicin
E-st-tc. er1 funcin do:- la:. condi:ione:. dt-1 su'1: que- le di ori;E-n,
a.:;f ccmc:> de].;.. .,oaried.:,.d de 1-=< cai'i.=< (Enciclc:>pedi.;.. t1c:>nitor, 1979).
L.:.. es. un .j.3.rabe in..Jeortidc.
Debido a. :.u -9.!-tc cc:>ntenido de a:;:rjc.:;.r, :;e us.:;.. princip<o.Jmente en
Estadc:>s Unidc:>s e Ingleterra para la produccin de alcc:>hc:>l
i ndJ:.tr i al. Dur.3.nte ].,. segJnd-3. guerr.,. rnundi .;,.] :;;o. ut i 1 iz un.".
ccn:.iderablJ? c.:tntid.:t.d corr11:' al irnentc y come :..dulcorante
ccmercial, e--:;p.s-cialmente en Inglaterr.:,. 1'? . .:57; Honin9,
1'?77; kirk Othmer, 1'7'f:::l; ::;turin, 1'?f:::f:::).
A> PROCESO (Figura 4):
Extraccin del jugo <guarapo)
::.e rea.l iza. rnedi.;..nt;o. la C:::>mpr;::.i.:n de 1.:<. c.:<.ri-?-. entr;
e i 1 i ndros de t.3Jn.:d"io
11
fn.::..za.s
11
Par.::.. i n
p r E! p a r a I a e r -3. , t1 .:.. e i e n d ol .;.. p a= a r b ,j o e u e h i 1 1 -?.. ::. g i r- -:t. t r i a.-::.
que cortan los tallos y las convierten en astillas. Los mejc:>res
prccedirnientc:>:. de mc,J ienda 1-:.gr-.;o.n e:,<traer en forrna dE' .jJ;:jC, rn:.
de- 95% de azrjcar que contiene la cai'ia.
El b-3.:;!"'-Z::> fin.al qu-o- del ltimo molinc: contiene el
azcar nc:> la fibra lei'iosa >'de 40 -50% de agua.
Purificacin del jugo (clarificacin)
El jugc:> que trae los molinos. es cido, turbi::> y d;o. .:ol::>r
.)e-rdE> o:.b:.curo. En el prccE>;:.o de cl=<rific:<.cin, ide.;o . jc. par.;..
elimin.=<r t-=<nto 1.=<::. impurez.:;.s ::.oluble::. c::>mQ la::. in::.::>luble:::., es
univer::.;o.J el u:;.Q de].;,. cal/ e-i c.:o.lor.
La lechada de cal, preparada con aproximdamente de- 5 a 10g
de hidrxidc de c.;..lcio pcr kil::>9r.;;.mc de a.zrjc.;o.r, neutraliza. !.;..
a.cidez natur.;..T del Jugo (;:.e .;..leal iniz.;o. "'- pH .5) el
tiene entre 5 .:, 5.5. Despus. de izacin, el -:.e
dej.:<, :.edimentc:<.r.
t"lediante !.:<. :.ediment;o.cn, se lo9ra 1.;.. :.eparacin de lo::.
l::>dos del ju9o. El .jugc:> cl-"<.rificadc:> de cc:>lor c.;,.f obscuro,
cc:>ntiene un f:::5 X de agua f se re-circula a Jos e-vaporadc:>res sin
sufrir trat.:o.miento adicic:>nal. L.;;.s jos t'erc<?ra::. partes de sta.
a9u-=< SE> e.,oapor.;.. en Jn quintuple <?f<?cto al vace. El
entra de 15 8:< y sale entre 45 a 55 8x. Del qJintuple efecto
de al tacho <evapcrador abierto) en donde se
concentra a 77 8x <Meade,. 1967).
Es neces.ari.:. la inversin parcial de la mel.:.dur.;.. p,:..ra
prevenir la cristalizacin de la sacarosa durante el
almacenamientc y el transpcrte. Anti.;:uamente la :.e
hacia mediante la adicin de cido inorgnico <sulfrico o
clorhldrico). Para evitar la corrosin y prdida de azcares que
destrulan la inversin con cido, entre los aNos de 1938 y 1941
se comenz a adicionar levaduras en invertasa as! c::>mo
enzimas comerciales.
La inversin biolgica parcial de las. meoladuras eos.H
relacionad.:. con la formacin de not.:.bles deo
ol igosacridos sintetizados por la invertasa. Esto incluye
principalmente la cestona <que est. constitufda por dos
molculas de fructosa y una de glucosa) y es
(Honing, 1977).
Experimeontos hechos para optimizar la fermentacin
alcohOl ica de la meladura uti 1 izando levaduras, demostr3ron
deficiencias de nitrgeno y otros factores que afectan el
crecimiento de la leouadura y la eoficieoncia fermentativa
utilizarodo mieol. Estudics reoalizados. para ccrreogir
deficieoncias indican que 1.:. meladur.;o. contiene la m<J.yorla de
eos.tc-= inclusive vitamina-:. >' dem-:. factore:. de
crecimiento, excepto el nitrgeno (tabla 1).
La rapidez mxima de
se consiguieron a"adiendo
ni trgeno <l"'hJrphy, 1984).
fer-mentacin
sulfato de
y pro:odiJCC i n
amonio como
deo 1 e ch o 1
fJen te de
Peor otr.a parte, en fermentaciones realizada:. a nivel
pi loto para la produccin de ron en las cuales se uti 1 iz
meJ.:.dura ccmo materia prima analiz.:orcn los. ccmponentes. del
producto obtenido. Como resultdo se obtuOJo un destilado con
proporcin de steres y menor prcporc i n de fu se 1 ,
uentajas favorecieron a la industria del ron obtenidas por
fermentacin deo meladura <Martlnez & Murphy, 1984J.
7. - I F I CAC ION DEL PRESB'ITE ESTUDIO.
De 1 o an ter i cr, >' tomando en ba<;;.e 1 as exper i ene i as de 1 a
produccin de alcohol por Zymomonas mobil is, puede destacarse lo
siguiente:
a) La bacteria Zymomonas mcobili<;;. pJede prcducir alcohol
ueoces ms rpido que la levadura Saccharomyces cereOJisiae.
b) La posible produccin industrial de etanol por este
microorganismo ha estado restringido en debido a que los
nicos sus.tratos que puede uti 1 izar son glucoo;.a, fructosa y
s a e a r o s a
e) Con el presente estudio se pretende proporcionar una nueva
alternativa biotecnolgica de produccin de alcohol empleando
e--::.ta bacte-ria, y utilizando como nica fue-nte- de carbono 1.;.
me 1 adura, pr i nc i pa 1m en te porque ti ene u'n costo por K i 1 ogr.amo de
un 55 % menor con respecto a la sacarosa.
d) La meladura es una materia prima producida en
e-n esta zona geogrfica, la cual se- ha visto a nivel
qJe es I.Jna fJente ex i"tosa ut i 1 i za.ndo S.accharomyc:es
par.a la produccin de alcohc.J.
abundancia
i ndJs.tr i a 1

111. HIPOTESIS
Emplo?ando condicicno?<: do? fo?rmentacin o?n la<:. cuales
comnmente se utilizan levaduP.::>.s, Zymomonas mobilis, present.ar
mP.,icP capacidad dP. pPcoduccin de alcohol a paPtir de meladura,
que la leuaduPa SacchaPomyces cePo?visiae.
I '.J. OBJET I O S .
1. OBJETIVO GENERAL:
El otjetivo de- P.sta te:.is es el de- compal'ar la capacidad d&
pl'oducc i n de alcohol de dos cep<o.s de Sa.cchal'omyces cePev i si ae,
una dP. colo?ccin y otra do? uso industrial y una co?pa bacto?riana
de coleccir, ZYmomonas mobilis, al emple-ar meladura comercial
CCmCo :.u:.trato.
Con base a Jos l'esultados obtP.nidos se propon'? seleccionar
la cepa que prese-nte el mejor Pendimiento de produccin dE-
alcohol a partir' do? meladuPa.
2. OBJETIVOS ESPECIFICOS:
A. Estandarizacin do? inculo.
a) Determinacin de poblacin celular y popcentaje de
viabi 1 idad de las cepas en cultivos en medio slido.
b) Deter.minacin de poblacion cEdular y porcentaje de
viabilidad de la:. cepas en cultivos en medio lfquido.
B. Fermentacin a nivel laboPatorio en volumen de 5
1 i trcs.
a) DetePminacin del Pendimiento de produccin de
etanol de las tres cepas empleadas con base al
sus tra tC<.
b> Clculo de la velocidad de produccin de etanol.
C. FePmentacin a nivel laboratopio en volumen de 10
1 i tro-: ..
a) Determinacin del rendimiento de produccin de
etanol de las tPes cepas empleadas con base al
sustrato.
b) Clculo de la velocidad de produccin de etanol.
V. t1ATERIAL Y METODOS
1 .MICROORGANISMOS:
- Zrmomona mobili<;;. mobilis NRRL B-15'.50, (cepa Zm> alta
productora de etanol (donada por el Dr. Cletus Kurtzman).
S ~ c eh .;.r omvc es
productora de etanol
cer-visiae BCGC L-024, (ce-pa
a partir de melaza.
Saccharomvces cerevr5iae, (cepa S)
etanol, proporcionada por 1.:. empresa Tequ 1 a.
e .t.!.
2. REACTIVOS:
productor,i>.
S.3.1.Jza, S. A.
u
de
de
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analftico y
obtenidos de fuentes comerciales conocidas.
3.EQUIPO:
Agitador magntico Felisa, balar,za granataria SartoriJ:.
GMBH, balanza analftica E. Mettler Pe 4400
1
b.:"io de
temperaura con5.tante Buch 011, e5.pectrofotmetro e5.pectronic 20
Bausch & Lomb, estufa de incubacin Felisa 131, hem.;.tocitmetro
Biotecna, micro:.copio compuesto Ccl leogiateo 400, micropipeta5.
Gilson, potencimetro Hanna instruments HI 8424.
4.MEDIOS:
A.- Medio.de mantenimiento:
El medio de mantenimiento <Nt-tZ> para la cepa Zymcmcna5.
mobil is, fu sugerido por el Dr. Cletus Kurtzman:
Extracto de levadura
Peptona
GlJcosa
Agar
pH 4.5
10.0 g/1
5.0 g/1
20 .o g/1
15-20 g/1
El medio se esteriliz por calor hmedo, 15 minutos a 121
t-le,dio de, mante-nimiento (t-lt-IL) par-a de
cerev i si ae L y S:
Me 1 adura a
Extr-acto de levadur-a
<NH4)2 S04
kH2 P04
Mg Seo4
agar-
pH 4.5
1 2
0
8 X ITI S.:
2.0 g/1
2.0 g/1
2.0 g/1
1 o g/1
30.0 g/1
El medio se-ester-iliz por- calor hmedo, 15 minutos a 121
t-1 e di o de
t-lel.:o.dJra a
Extracto de levadura
(NH4/2 S04
KH2 P04
l'lg S04
pH 4.5
ferrnentac n
1 4
2.0 g/1
2.0 g/1
2.0 g/1
1 .o g/1
Esteri 1 iz.;<.r por calcr hmedc, 15 minJtos a 121 C.
5.TECNICAS:
B.-
< M F) :

A.- Tcnica conteo directo de clulas por el mtodo de zul
de meti leno <Bradsahw, 1985).
Los reactivos utilizados son:
Azul de metileno
Citrato de sodio
a) Procedimiento:
10 .o g/1
50.0 g/1
En un matraz aforado de 50 mi, poner 5 ml de muestr-a, 2.5
de azul de metileno y aforar con agua destilada.
Tomar- con une.. micropipeta de 20 ul un<. muestr-a y con ayuda de
Cmara de Newbawer, contar la poblacin tot.al. Esta tcnica nos
permite ccnocer tambin la viabilidad ya que- la par-ed celular de
las levaduras mJertas absorbe el colorante-; y de esta forma e>s
fcil id<:ntificar las clulas. muertas de- vivas .
8.- Tcnica para deote:-rminar azcares r'?ductore:-s 1 ibre:-s por el
mtodo de:- DNS <Mille:-r, 1959; Marsdts 1t al, 1982; Ottro, 1986).
Los reactivos utl izados son:
Hidrxido deo sodio
3.5 Dinitrosalicflico
Tartrato d1 Na y K
Metabisultito de Na
Fe:-nol
1 o. o
1 o. o
200.0
0.5
2.0
g/1
g/1
g/1
g/1
g/1
Mezclar uno a uno y aforar en matraz de 1,000 ml.
a) Procedimiento:
A 0.5 ml. de mue:.tra se adicicn.:.n 1.5 ml. de:- -:.olucin de
DNS, se agita, y se pone en ba'lo marfa a punto de eb1.Jllici6n
durante:- 10 minuto: . Se- deja enfriar a te:-mpe:-ratura ambienb:,
agregan 8 ml. de agua y se agita.
Leer absorbancia a 550 nm.
C.- Tcnica para de-te-rminar azcare--:. reductores. tot.;,.le:. pcr e-1
mtodo de fenol -sulfrico <DJbois et al, 1956).
Los rtactivos utilizados son:
Acido sulfrico concentrado
Fe-raed al 5/; (v/v).
a) Procedimiento:
A 1 ml de la solucin proble-ma se le adiciona 1 ml de:- fe-nol
al 5 %, enseguida se agregan 5 mi de cido sulfrico concentrado
e:-n forma trusca para cons-e-guir el efe-cto de:- la hidrlisis. Se
deja enfriar durante 5 minutos a temperatura ambiente, se agita
y enseguida se pone a de agua fria durante 10 minutos.
Finalmente se lee absorbancia a 490 nm.
D.- Tcnica para determinar e:-tanol por el mtodo de
dicl"omato de potasio & Ough, 1976).
Los reactivos utilizados son:
Di Cl"oma to potasio
Acido sulfrico 325 mi
33.768 g/1
Se diluye el cido sulfrico e-n aprcximadame:-nte- 400 mi de- agua
destilada, se deja e-nfriar Y se agrega el dicromato diluido e-n
aproximadamentf! 200 mi de agua y s.-afora en matraz a
1,000 ml.
a) Procedimiento:
A ml de mue:-tra se le agre-gan
dicromato y se agita, se deja reposar
po:.te-r i orme-n te- se agregan 5 mi de
finalmente agitar.
Leer absorbancia a 585 nm.
6.METODOLOGIA:
A. E:-tar,darizacin del inculc.
2 ml
durante
de
10
:.cducin de
minutos Y
agua de:.t i lada, par a
a) Dete-rminacin de poblacin celular y porcentaje de
viabilidad de las cepas en cultivos en medio slido:
Se crec i e ron 1 as cepas en una serie de h1bo con agar
inclinado <un tubo para cada tiernpc de rnuE<:.tr.;.) quE< ccntE<r.lan el
medio de manten i mi en te t11"'1L) para c.::tda una de 1 as
Estos tubos SE<rnbraron por estrfas, a partir dE< un cultivo en
tubo de conser-1a: i n; se i a una tempera tur.;,. de 30 C
por un perlado de 48 horas, sacando muestras a diferentes
ti<?mpo;; de crecimiento, para re-al izar el cont"'o de poblacin
total y el porcentaJe de viabilidad. Posteriormente, a partir de
es tos tubos, se- prepar una suspensin ce l u 1 ar ad i e i onando a
cada tubo 50 ml de solucin fisiolgica e-stril.
b) Determinacin de poblacin cE<lular y porce-ntaje de
viabilidad de- J.;,s ce-p.;,:. en cultivo en medio liquide y
propagacin de inculo:
Para las ce-pas L y S, a partir de un tubo de conservacin
en medio s61 ido <MML>, se tom una asada para inocular una serie
de- 13 tubcs, cada ur,o con 10 mi deo medio liquido de
mantenimiento <MML). Los tubos se incubaron a 30 C "-!n
condicion;:os esttica:., tomndos.e un tubo para cada mue-:.treo, en
un perfodo de O a 72 horas de incubacin.
Para la c;:opa Zrn el inculo se tom de ur. cultive fr;:o:.co er.
un tubo con 10 rnl, el cual se emple par."'- inocular 100 mi de-
medio liquido t1t1Z. A partir de ste volme-n, se inocularon 12
tubos con 10 ml de medio Jfquido MMZ. Para cada caso, el volumen
de inculo fu de lO;-: <v/u), se incubaron a 30 C eor.
condiciones estticas. Se- tom un tubo-para cada mue-streo, un
periodo de O a 72 horas de incubacin y poder real izar el conte-o
de poblacin celular por espectrofotometrfa a 650 nm a
partir de- una di lucin
a 1 ,
1 : 25 ( Man i a t i s e- t a 1 ,
1 9 8 4 )
19:::2; LaJdr in et
A partir de- le<:. re-<:.ultados obte-nido<:., e-n la edad del
inOculo para cada una de- las cepas, se- real iz la propagacin de-
inOculo a nive-l matraz, mediante pasos suce-sivos en una relacin
del 10 /. (u/u), h.asta obtener el volJmen nece-sario de inculo
para cada una de- las. fermentaciones. de 5 Y 10 litrc=
mantenindose- las mismas condiciones de operacin.
8. Fe-rmentacin a nive-l laboratorio en volume-n de 51 itros
Se utilizaron matraces Erle-nme-;.er de 6,000 mi., dos
m&.traces que- ccrrte-rrfan :.,ooo ml. de me-die de- fe-rmt>ntacin; lo:.
cual es fueron inoculados al 10 /. (</u) e i ncJbados a 35 C por
un periodo de 72 horas. Cada corrida de fe-rme-ntacin se hizo por
duplicado. Se- real izaron mue-streos pe-ridicos p.ar.a. medir
pcblacin, .azucare:. 1 ibre-:. >' tot.ales. y produccin de e-tanol.
A p.3.rtir de los resultados obtenidos en Jo5 an.lisis, se
dete-rmin el re-ndimientc de- produccin de <?tarro! '?n bas.e- al
sustrato, l-3. eficiencia de fermentacin, .asf como Jelocidad
de produccin de etanol.
C. a nivel laboratorio e-n vclumerr de 10 litre:.
Se utiliz.aron garrafones de plstico de 19.0 litros que
ccntenlan 10 1 itr-c:. de mo:dio (MF) c.;..da corrid&.
se hizo por duplicado.
Para la preparacin de-l me-dio de- fe-rme-ntacin
se ajust la meladJr.a a 13 8x se hervi por un tiempo de 10
minutos. Posteriormente, se enfriar a temperatura ambiento:
para ajustar la mel.adura a 14 8)( y al"iadir los nutrientes. Las
condiciones de- ope-racin fueron las siguiente-s: volume-n de-
inOculo de- tempe-ratura 35C por 72 horas. Se- re-alizaron
muestreos peridicC<:. para me-dir poblacin, azc.3.re-s 1 )'
totale-s y produccin de- e-tanol.
A par ti r de- 1 e:. re-su 1 tados obte-nido:. en 1 Q:.
determin el rendimie-nto de produccin de etanol
sustrato, la e-ficie-nci&. de fE-rmentacU:n, asi como
de produccin de etanol.
anl i s s, -:.e
en base al
1 &. v"' l oc i dad
'JI. TADOS
A. Estandarizacin de inculo.
a) Determinacin de poblacin celular y porcentaJe de
viabi 1 idad de las cepas en cultivos en medio slido:
En la figur;;.. 5 s.e- cbs.erv.:.. el ere-cimiente y el porcentaje
de viabil id.ad de la cep-3. L dur.ante 48 hor.:..s. Como se puede
apreciar, e-sta curva de crecimiento no presenta fase de
adaptacin, empezando la fase logarftmica en las primeras horas
la cual se mantiene hasta las 48 horas de incubacin. Se decidi
tom.9.r como ed.ad de 1 i ncu 1 o un ti emp::. di? 32 horas, con un-3.
poblacin de 300 E6 ce-1/ml y una viabilidad di? 100 %.
El crecimiento:. de T.a cepa S s.l? m.Jestra en 1-3. figur.a 6 en
la cual seo observa que no hay fase de adaptacin, empl?zando la
fase logarltmica en las primeras horas y mantenindose hasta las
48 horas. No se observa fase- estacionaria. Se decidi tomar como
edad del inculo un tiempo de 32 horas, C::>n una. pcbl-9.cin de 300
E6 ce-1 .. /ml y un.O\ viabilidad de- 100 %.
b) Determinacin de poblacin celular y porcentaJe de
.Ji;..bilid.:..d do? l.;,s. cep.:..s. e-n cultiv::>S e-n medie liquido:
En la figura 7 se obse-rva el crecimiento en medio liquido
de la cepa Zm. No SE' pre-sE-nta la fase de- adaptacin, empe-zando
la. f.as<? loga.ritmi:a e-n !.as prime-r-:<.s hQras y termina a las 18
hcr.;..-:., inicio de l.a f.;..: . .,. es.taci::onaria. Se tcm ccmC tiempc d'
i ncu 1 o 12 horas con un.". pobl.ac i.n de 200 E6 ce 1 /ml.
Para la cepa L, se muE-stra e-1 trecimiento 'n la figura 8,
en la cual no se observa fase de adaptacin, la fase logarftmica
s.e pres.ent.;.. e-n las primeras hora-:. has.ta J.;..s. 12 hora.s
obser_.9.ndose despus de es.te tiempo la fase est-3.ciona.ri.;.., se
tom ccmo ed.;..d del inOculo la:. 12 hcr.as., ccn un.:<. poblacin de-
150 E6 cel/ml y un.a viabi 1 id.ad de 100 ::.--:.
En la figura 9 se muestra e-1 cre-cimiento de- la cepa S, ero
1. cual no se observ.;.. f-3.Se de adaptacin, la fase loga.rftmica
empieza en las primeras horas llegando a su fin a las 12 horas
para empezar la fase estacionaria. Se tom como edad de inOculo
las 12 hQras, con una poblacin ce-lular de 200 E6 cel/ml y una
viabi 1 idad de 100 %.
8. Ferment.;..cirr a nivel laboratoric en volumen de 51 itr-o:.:
La. figura 10 nos muestr.;_ el crecimiento ce-lular de J.;..
cepa Zm en volumen de 5 fitros. Se observ una posible fase de
de las. O a l.'is 3 horas apro:<imd.,.mente y la fase
e-xpcn.nci.'il en el rango de- las 3 a las. 24 hora:., ccntandeo
una poblacin fin.;.! de 400 E cel/ml.
La figura 11 nc= mues.tr.a el cNr:.umQ de- a.zr.Jcares. r-ductQn:.
tota 1 e-:., a.sf como 1 a prodJcc i n dE" et.::o.nol por 1 a ce-pa Zm e-n 1.;..
fermerrtacirr de 5 litreos. Ccmo =e pJede Clbser,.a.r, prctic.;..rnente
el consumo de azcares y la produccin de etanol se estabilizan
a l.a:. 24 hcr>.s. L.;.. concentracin fin.::o.l de fu<!- de 5:0:.07
g/1, alcanzndose un consumo del 86% de los del medio.
L<:<. figura 12 neos. mues.tra el crecimi.:nto co:lul<:<.r y el
porcent.:c>.je- de vi.,.bilidad de l.;.. cepa Len l.;.. ferment.;..cin de 5
l i trcs . lk se- ob'E.erv fas.e de i rr, empezando 1 a f.a:.e
exponenci.;..l de-sde las. primeras hor.;..s de la fermentacin, h.;..sta.
las 12 'hcr.;..s, A partir de entoces., =e obser.,. Jn rpijo
decremento de la viabilidad hasta 1 legar a 1.7% a las 72 hor!s,
aunque la pcblacin = mantu.Jc ccnst.;..nte <a.lrededcr de 70 E
cel/ml). L.;.. figur.;_ 1:3 nos presenta el con::;wno de azc.:.re-s
tct.;..l e-=- >' 1 a prcducc i n de e tancl de l.a cepa L. Se cb:.erv 1 o
mismo que- para la cepa Zm, con respecto al consumo de azcares y
la producin de etanol. Se alcanz una producin de 59.84 g de
etanol/! y un consumo del 93% de los azcares del medio.
En la figur.;.. 14 s.e pre<:.errta la pobl.;..cin celular y el
por-cent.3.je de via.bilidad de la cep.;_ S en fer-mentacin de 5
litros. No se observ fase de adaptacin; la fase- exponencial se
inici en las primeras horas hasta las 9 horas, en la cual se
alcanza una poblacin de 125 E cel/ml. La viabilidad se- mantuvo
en un 100 % hasta las 12 horas, y fu disminuyendo hasta un 5 %
a las ?2 horas de fermentacin.
En la figJra 15 <:.e pr<;-:.enta
reductores teta les y 1 a produce i n de
fermentacin de 5 litros. El consumo de
de et-:c>.nol se estabillizan a las 24
prcducc i n de et.;..ne<l de 60 g/1 >' urr
azcares originalmente presentes en el
e 1 e on sume< de az e .:.r"' s
eta.nol de 1 a cep.3. S en
azcares y la produccin
horas, alcanzndose una
e on =-u me< de 1 $'3 % de 1 os.
medio.
En la t."bl-" 2 se ce<mpara el rendimJ;-nte< del productc, 1-"
eficiencia de fermentacin, ao;,f como La. velocidad de
f"'rmentacin de l.:.s tres cepas en la fermentacin de 5 litros.
Como se puede observar, con 1 a.s cepas L y S se obtuvieron
rendimientos y velocidades de fermentacin semeJantes <0.49, 97
% y 2.49, respectivamente), los cualf?s fueron rnayorE<s a los
obtenido=- :e<n la cepa Zm (0.43, 83 /;y 1.86, respectivamente).
C. Ferment.:;.cin J.abc.ratorio en !olumen d<? 10 litros:
En la f<?rmentacin en volumen de- 10 litre'= las tigur.a;:. 16
y 17 nos presentan el crecimiento C<?lul.ar y produccin de
e-t.ancol y e-1 con;:.umo de- azcare-;:. de- l.a ce-p.a Zm, re-;;.pectivamente-.
L<o. prQd.Jcc i n de e t.ancol , e 1 consumo de azc.;).res, asf CQmo e 1
crecimient:, :.e e:.tabiliz.an .a l.a;. 20 hcr.a: . Se- alc.anz un.a
concentra.cin celul.ar de 437 E6 cel/ml >' un.;. c::.ncentracin de
e-tancol de 5'7'.:3::: g/1. Hubo .Jn con:.umo de-l 88 :1: de lcs azcare':.
originalmente en el medio.
En la figura 18 :.E' m.Je-;:.tr.a ;;1 crecimiE-ntc celular '/ e-1
porcentaje dE' Jiabilid."'-d de la ce).a. Len J.a fermenta.cin de 10
litrc-= Se otse-r.Ja que- a la:. 12 h::.ra:. se- tiene l.a conce-ntracin
cel.Jl.ar ms alta 130 E6 CE-1/ml >' l.a viabilida.d a un 100
DE-:.pu;:. de- stE- tie-mpo, e-1 pcr-:e-rda.je- dE' >Jiabilidad de-clina muy
rpid.;.mente hasta un la.s 72 hor.oo.s, notndose que la.
poblacin celular tambin baja hasta 104 E6 cel/ml.
En 1.:;. figura 1'7' se muestr:l. l.a pr::.dJccin de et.anol y ;;1
ccn-:.umc de reduc tcrE-:. tot.a 1 es de- J.a cepa L en 1 a
ferment.ac i n de 10 1 i tros. Se ob:.erva que .:;,mbos se est.abi 1 i ::an
a las 20 h::.ra':. de ferment.;..:in, .alcanzndo:.e un.a concE-ntracin
final de etanol de 59.6 g/1 y un consumo de azcares de un 97%
de los or-iginalmente en e-1 medio.
En la figJr.;.. 20 de muestr-a el crecimient::. cE>lular y
pcr-c<?nta.je dE' vi."-bilid.ad de 1.?. ce-pa S eon 1.?. fe-rme-ntacin de 10
1 itros. A las 20 horas se presenta la concentracin ce-lular- ms
alta de 13E: E6 cE-1/ml y un por-c<?nt.ajE- deo }iabilijad de- ,
de':.pu:. deo ste tie-mpo ambos empiez.:.n a de-el in.ar lentamente,
t",.:;,:.t.a 11 egar a 1 a.:. 72 hora:. ccn Jna pcbl acin de 1 o:::: E6 ce 1 /rnl y
una viabilidad de 37 %.
La f i gur.a 21 neo:. mue-:.tra 1 a pr-oduce i n de etanol y eo 1
consumo de .=.zca.r-es total es de 1.:. cepa S en 1 a fermentacin de
10 1 itros. A las 20 hcor-as de fer-mentacin SE' estabil ilzan ambas,
alcanzndose una concentra.cin de eta.nol de 0.4:3 g/1 y un
consume de azcar e-:. de 1 $' ;,: de 1 os azcar-e:. preosentes
or-iginalmente en el medio.
La t.:.bla ::: se compar-a el r-endimientc de-l pr::.ducto, la
eficiencia de fermentacin y la velocidad de fer-mentacin de las
tr-e':. cep.=.s en la fermentacin de 10 litr-e'= Come ':.e puedeo
obser>Jar las tres cepas pr-e-sentaron la misma velocidad deo
fermentacin, los >Jalor-es mas altos de rendimiento y eficiencia
los obtuvo la cepa L <0.49 >' 97 /,, respectivamente),
po:.tericormer.te la ceop.a Zm obtu.o 0.48 y 94 respectiJarnente y
finalmente la cepa S obtuJo 0.47 de. rendimiento y 92 /; de
eficiencia.
1
)II. DISCU::;ION
A. Estandarizacin de inculo.
Con el cbjetc de C:nccer el tiJ?rnpc en que 1.;.. clJla e:.t.!<.
co:ondiciones p.;o.r.;, llev.:r .3. 1.;, tr.;o.nsfeorm.;,o:in de le=
azrjo:ares .. ;o. et.;..nctl, :.e reodiz ].;.. del inculo, /=
que al conccer las. f.01.:;es de cr-ecimiento y 1.3. .}iabilida.d se
refleja el J?stado fisiolgico del microorganismo.
Se pruebas de crecirnientc en me-dio
-::.l i de l.:c. Zm, per-c en ni n;un-B. -:.e- c:btu.)o un re::.ul t.3.do
pos.iti..Jo, la. cep.3. solamente creci en el rni:rno t11"12. Al p.;,recer,
la tacteri.;o. s.ufr!.;o. de inhibicin por :a.us .. ;o. de a.lo;;lin c:mpcnente
presente en las fuentes de azcar probadas (meladura,
mascabado, azcar refinada) CRhee, 1984).
Se obtuvo buen crecimiento de la cepa Zrn en medio liquido
1"1t1L, s.lo qJe no :.e pudo determinar el pcr:ent?...je de .}i.3.bilid.?..d,
ya. q.Je ste s.lo se pod!a por crecimiento en pl.;,ca /
-:.t.:c. :epa. nc creci en medio ido, l qtJI? slc :.e .-?.:c.l iz
conte:> de peoblacin pcr .
Al Cbs.er.}ar el cornport.O<miento e-n me-di:> l!qJidco de 1.3.: tre:.
cep.3.s, el tiempo: de inculco re-come-ndado de 12 hora.:; reo;.ul\
adecuado para nuestro trabaJo, pudindose comparar con los
tiempo:> de incul:> emple.O<ojQs en los prccesos. comercia.les, que
u: . .:t.n una ed.:r.d de i ncu 1 o no menc1r de 24 hor B.: . Stur i n
tiempo de inculo de 24 a 28 horas para la produccin de alcohol
a partir de melazas y rnel01dura; Pre-sscot reporta un tiempo de 24
h or = e omo e d.:..d de 1 i n o: u l o 01. p a.r t i r de me 1 .0\z a. s.
B. Ferment.;o.cin 1-:r.boratorio en
1
-)olumen de
"' 1
-' 1
i tros
En 1.=-. ferment.O<o:in de 5 litrcs, cepa. 2m f.J l.;, que
cbt.Jvo lo:. . o:ro?s. b.O< . .i:>:. de 1 ;,s tres cep.01.s, tanto
rendimiento, .. corno en l-3. '.lelo:io:hd de fermentao:in, sin
embargo, los valores obtenidos estan dentro del rango que se han
manejado en otros trabajos real izados con I mobil is.
Doelle & Greenfield reportan un rendimiento de 0.33 para la
cep-3. z. mobilis UQt1 2716, a p.01.rtir de 400 g/1 :5.;o.ca.ro" .. " y de
0.3'? a pa.rtir de azrjc.3.r refina.d.O< a un;.. ccnentrO<cin inici.;o.l de
11 o g/1 .
Los. v.alores. obtenidos. por la.s. cepas. L y::; es.tan entre le=
val ores m.;..s al t:>s. que se repcrt.=-.n en otros tr.:..ba.Jos, Pina.l en
1990 reporta un rendimiento de 0.46 a partir de melazas de cafta
para la cepa L. Por lo que tod.OI.J!a resulta un.a buena.
altern.;o.tiv.=-. p.O<ra la pro:>d.Jccin de alc:>hcol .3. partir de rneladur;o.,
C. F<?rm-=nt.:o.cin a nivel de 10 litros.
En f.Ev::.e, =' intent '.Jerific.:c.r le,:. re:.ultadc's
anteriorment<? obtenidos, logrndose re:.ultadQ:. m:.
al tos (en rendimiento , efici?ncia y velocidad de fermentacin )
que los encontrados en 5 litrcs. 1.;.. Zrn, rnientr;;.s que
l.:o.s. cep.;..s. L y S :.e m.:o.n tJ'J i eron 1 o:. rrd :.me= re:.u 1 ta.dc:..
Este cambio pudo deberse a que las corridas de fermentacin
en 10 1 i trcs. :.o? re;;.l iz.:o.rcn con un lote nuo?.!o d!? mela.dJr.:o., detoidc
" que o?l lote utiliz;;.do pa.r.;.. estand.:o.riz.:o.cin d? inOculo,
de cep-B.s y di? :-, litrc1s. :.e
t::rmin(:, y quiz-=:. en :.te lct.:- ms. 1.:.. pres:?nci.:.. de
algn inhibidor para la cepa Zrn.
Leos. re-:.u 1
me ].;..dura ceon re:.pec to
prim.:.., contenido de
producc i n
obtenidos. apo;.-.:o.n l.:o. po:.ibi 1 id.;..d de us.:o.r
.;.. lQ menciQn.;..dQ: cos.to de la m.ateria
ntJtr i .;.nte:., buenc= rendimi.entcos. de
'. ...' I I I . COt-!CLUS l Of'.fE::: Y F:ECONENDAC I ONE3
1.- :3e obtuvo un.;. ed.'i.d de in:::culo de 12 . 1.;. :u3.1 e:.
mejor que las usadas en la industria alcoholera. Se
considera, sin embargo, necesario hacer algunos experimentos
po:.teriQres par3. su aplicacin a es.cal.9. indu:.tri.;,J,
2.- L;.s ceoncentraciones de alcohol alca.nzadas, t.:<ntc p.,r.;;. 1.;..
cepa Zm (59.::::3 g/1) come pcr la levadura L (5$',,:) g,/]) ::-' 1.3.
levadura S (60.48 g/1) son ms al tas.que las reportadas en
trabB.jc= e-rnplJ?B.ndo (57.2 9./1). Por 1o
cu.:t1, se factibl--= l-3. dso mel.:r.dur3. como
una buena alternativa para la produccin de alcohol.
3.- De las dos levaduras, la le adura L fu mejor que la
levadura S, la primera logr alcanzar un rendimianto de
0.49 ::--un.;;. ;;fi:iencia de o se.a, pre:.nt.:< mejores
probabi 1 idades para la produccin de alcohol a partir de
aunqu@ esto filta comprobarse a esta! a
4.- La f. mobil i:. r;;.:.ult.=-. mene= ;;.ficient;;. qu;;. la J;;.).;;.dur.?.
SaccharomYces cerevisiae para la produccin de alcohol
a P"-rtir de m;;.ladura, alc3.nzndose solamente una eficiencia
de mientras que la levadura obtuvo un de eficiencia.
5.- Un.;:., .:.:;,u:.,;.. pro:oboo.ble, por 1.3. cual ].a z. mo:obili:. re:.ult
menos eficiente, fu que el sustrato contenfa algunos
inhibidetrJ2-:., por lCI cual s.e rE-ccrni'nda quE< en . ..ic=
pos. ter i xes:
(!) s.e re.al izen p.ara detectar la influ<?ncia de
.alo;;n elE-m>?nteo que pued.a result.ar inhibitorio;
(2) . .a.rroll.::..r rntod:) eliminar es-te inhitidc,r,
e::) llevar a c.=-.bc al;:n mejeor.amientc gentico de:.
mobil i:., p.3.r.;, que la presenci.;;. de este elemento no la.
i nh i b.;..
TABLA 1. COMPOSICION QUIMICA DE LA MELADURA
CONSTITUYENTES PRINCIPALES (%)
CONSTITUYENTES DATOS DE
UNDERKOFLER
Y HICKEY
AGUA 14 - 19
MATERIA SECA 81 - 86
. AZUCAR TOTAL INVERTIDO 72 - 79
N TOTAL 0.07 - 0.20
CARBONO
CENIZAS TOTALES 2 - 3
P205
0.2 - 0.6
Ca O 0.03 - 0.30
MgO 0.01 - 0.03
K
2
o 0.7-1.4
CONSTITUYENTES MENORES (Y /100g)
CONSTITUYENTES
VITAMINA B
1
VITAMINA B
2
VITAMINA B
6
FACTOR PP
AC. PANTOTENICO
AC. FOLICO
BIOTINA
INOSITOL
FUENTE: Honing P., 1967.
DATOS DE
ROGERS Y
MICKELSON
160
62
160
240
270
1.5
32
DATOS DE
WHITE
8 - 14
86 - 92
70 - 86
0.05 - 0.25
28 - 36
1.8- 3.6
0.03 - 0.22
0.15 - 0.35
o .12 - 0.25
0.2 - 0.7
DATOS DE
WHITE
250
30 - 40
85 - lOO
--------------------------------------------------------
TABLA 2. COMPARACION DE RESULTADOS DE LAS TRES CEPAS EN LA
FERMENTACION DE 5 LITROS.
CEPA Y P/S EFICIENCIA DE VELOCIDAD DE
FERMENTACION FERMENTACION
(%) (g/l.h)
Zm 44.55-3.19
0.43 83 1.86
124.44-27.06
L 60.06-3.53
0.49 97 2.50
120.47-5.69
S 59.84-4.58
"' 0.49 97 2.50
117.82-5.62
Y P/S (rendimiento del producto en base al sustrato).
TABLA 3. COMPARACION DE LOS RESULTADOS DE LAS TRES CEPAS EN LA
DE 10 LITROS.
CEPA Y P/S E-FICIENCIA DE VELOCIDAD DE
FERMENTACION FERMENTACION
(%) (g/l.h)
.Zm
59.60-2.24 48
134.68-14.98 = o.
94 2.48
L 59.60-3.80
0.47 92 2.48
124.76-6.36
S 59.60-3.71
= 0.49 97 2.48
119. 72-6.36
Y P/S (rendimiento del producto en base al sustrato).
MICROORGANISMO
+ NUTRIMENTOS
bacterias, C,N,H,S,P,
levaduras, metales,
hongos, vitaminas,
tejido ce- etc.
celular,
etc.
+ CONDICIONES
AMBIENTALES
ADECUADAS
pH, azcar,
temperatura,
viscocidad,
02
disuelto,
etc.
F E R M E N T A C I O N
Microorg. + co
2
+ Productos
(intra y
extracelulares)
FIGURA l. FACTORES Y COMPONENTES CARACTERISTICOS, NECESARIOS PARA LA REALIZACION DEL PROCESO DE PRODUCCION DE
ALCOHOL POR FERMENTACION.
glucosa
l

j,NAD+
gluconato-6-fosfato
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o fosfogluconato
1

fructosa
l
fructosa-5-fosfato
2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato
1
gliceraldehdo
Pi
3-fooMo l
NAD
gliceraldehdo
1
co
2
piruvato __ .._T _ acetaldehido
j
ETANOL
1,3 difosfoglicerato
ATP RO
-2-fosfoglicerato- 2
ATP
______--7fosfoenolpiruvato
FIGURA 2. VIA METABOLICA ENTNER DOUDOROFF
G L U C O S A
ATP __J
ADP ~
glucosa-6-fosfato
1
fructosa-6-fosfato
ATP --i
ADP 1
fructosa-1,6-difosfato
1
gliceraldehdo-3-fosfato
1
3-fosfogliceril fosfato
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3-fosfoglicerato
l
2-fosfoglicerato
l
fosfoenolpiruvato
l--- 2ADP
J---.,.. 2/l. TP
piruvato
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2
acetaldehdo
FIGURA 3. VIA METABOLICA EMBDEM-MEYER-HOFF
ETANOL
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de lo cario
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FIGURA 4. PROCESO DE PRODUCCION DE MELADURA.
fuente: Meade, 1967.
Mezclador de
Centrifugas de C
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Me loza
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FIGURA 5. CRECIMIENTO CELULAR Y PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LA CEPA
Sacharomyces cerevisiae (L) EN MEDIO SOLIDO (MML).
CONDICIONES: 30 C, 48 h.
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FIGURA 6. CRECIMIENTO CELULAR Y PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LA CEPA
Saccharomyces cerevisiae (S) EN MEDIO SOLIDO. (MML)
CONDICIONES: 30 C, 48 h.
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FIGURA 7. CRECIMIENTO CELULAR DE LA CEPA Zymomona mobilis (Zm)
EN MEDIO LIQUIDO (MML).
CONDICIONES: Inculo 10 % (v/v), 30 C, 72 hs.
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FIGURA 8. CRECIMIENTO CELULAR Y PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LA CEPA
Saccharomyces cerevisiae (L) EN MEDIO LIQUIDO (MML).
CONDICIONES: In6culo 10% (v/v), 30 C, 72 h.
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FIGURA 9. CRECIMIENTO CELULAR Y PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LA CEPA
Saccharomyces cerevisiae (S) EN MEDIO (MML).
CONDICIONES: Inculo 10% (v/v), 30 C, 72 h.
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FIGURA 10. CRECIMIENTO CELULAR DE Zymomonas mobilis (Zm) EN FERMEN-
TACION DE 5 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 5 litros, inculo 10% (v/v), 35 C,
72 h.
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FIGURA 11. CONSUMO DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES Y PRODUCCION DE
ALCOHOL DE LA CEPA Zymomonas mobilis (Zm) EN FERMENTACION
DE 5 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 5 litros, inculo 10 % (v/v), 35 C,
72 h.
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FIGURA 12. CRECIMIENTO CELULAR Y PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LA CEPA
Saccharomyces cerevisiae (L) EN FERMENTACION DE 5 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 5 litros, in6culo 10% (v/v), 35 C,
72 h.
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FIGURA 13. CONSUMO DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES Y PRODUCCION DE
ALCOHOL DE LA CEPA Saccharomyces cerevisiae (L) EN FERMEN-
TACION DE 5 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 5 litros, in6culo 10% (v/v), 35 C,
72 h.

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FIGURA 14. CRECIMIENTO CELULAR Y PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LA CEPA
Saccharomyces cerevisiae {S) EN FERMENTACION DE 5 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 5 litros, inculo 10% {v/v), 35 C,
72 h.
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FIGURA 15. CONSUMO DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES Y PRODUCCION PE
ALCOHOL DE LA CEPA Saccharomyces cerevisiae (S) EN FERMEN
TACION DE 5 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 5 litros, in6culo 10% {v/v), 35 C,
72 h.
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FIGURA 16. CRECIMIENTO CELULAR DE LA CEPA Zymomonas mobilis (Zm)
EN FERMENTACION DE 10 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 10 litros, inculo 10% (v/v), 35 C,
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FIGURA 17. CONSUMO DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES Y PRODUCCION DE
ALCOHOL DE LA CEPA Zymomonas mobilis (Zm) EN FERMENTACION
DE 10 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 10 litros, inculo 10% (v/v), 35 C,
72 h.
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FIGURA 18. CRECIMIENTO CELULAR Y PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LA CEPA
Saccharomyces cerevisiae (L) EN FERMENTACION DE 10 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 10 litros, inculo 10% (v/v), 35 C,
72 h.
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FIGURA 19. CONSUMO DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES Y PRODUCCION DE
ALCOHOL DE LA CEPA Saccharomyces cerevisiae (L) EN FERMEN-
TACION DE 10 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 10 litros, inculo 10% (v/v), 35 C,
72 h.
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FIGURA 20. CRECIMIENTO CELULAR Y PORCENTAJE DE VIABILIDAD DE LA CEPA
Saccharomyces cerevisiae (S) EN FERMErHACION DE 10 LLTROS.
CONDICIONES: Vol. 10 litros, in6culo lO% (v/v), 35 C,
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FIGURA 21. CONSUMO DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES Y PRODUCCION DE
ALCOHOL DE LA CEPA Saccharomyces cerevisiae (S) EN FERMEN-
TACION DE 10 LITROS.
CONDICIONES: Vol. 10 litros, inculo 10% (v/v), 35 C,
72 h.
ANEXO 1.
1.- El rendimiento (Yp/s): Son los gramos del metabolito en
cuestidn entre los gramos de sustrato consumido.
Y(p/s) = g de etanol (final) - g etanol (inicial)
g ART (final) - g ART (inicial)
2.- La eficiencia de se calcula en base al
mlximo por una regla de tres.
C6H1206
PM=180-16
Y(p/s) mlximo
0-51
Y(p/s)
2 C2H50H + 2 C02 + ATP + 12015 cal
PM=2(46-07)
92-14 = 0-51
186.16
100 % eficiencia
X
3-- La velocidad de fermentacidn: se calcula dividiendo la
concentracidn mlxima de alcohol entre el tiempo de
fermentacidn requerido para alcanzarla.
V = g de etanol
tiempo h
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