APLICACIONES DE LA INTELIGENCIA ARTIFICIAL

EN LOS SENSORES Y BIOSENSORES

RED TEMTICA DOCENTE
AGENCIA ESPAOLA DE COOPERACIN INTERNACIONAL

SENSORES
ELECTROQUMICOS
INTRODUCCIN A LOS QUIMIOSENSORES Y BIOSENSORES

SALVADOR ALEGRET MANEL del VALLE
UNIVERSITAT AUTNOMA DE BARCELONA
Bellaterra, 2003
AIASYB:
APLICACIONES DE LA INTELIGENCIA ARTIFICIAL
EN LOS SENSORES Y BIOSENSORES

Red Temtica de Docencia
Programa de Cooperacin Interuniversitaria Espaa-
Amrica Latina 2002
Agencia Espaola de Cooperacin Internacional,
Ministerio de Asuntos Exteriores, Madrid.

Mdulo 2: Sensores Qumicos

1 imparticin: Departamento de Qumica, Universitat
Autnoma de Barcelona, Bellaterra Junio 2003

2 imparticin: Seccin de Bioelectrnica, Centro de
Investigaciones y Estudios Avanzados (CINVESTAV),
Mxico DF Julio 2003

Salvador Alegret (salegret@gsb.uab.es)
Manel el Valle (mdelvalle@gsb.uab.es)
Grup de Sensors i Biosensors, Departament de Qumica,
Universitat Autnoma de Barcelona, 08193 Bellaterra.
1
Sensores electroqumicos

Objetivos

El presente texto es una introduccin general a los sensores electroqumicos en el
contexto de los sensores qumicos y de los sistemas analticos integrados. Clasifica y
describe los sistemas sensores electroqumicos en base a los sistemas de transduccin
principales: potenciomtrica y amperomtrica. Hace nfasis en las ventajas que aporta la
modificacin qumica o biolgica de los sensores potenciomtricos y amperomtricos,
y de los dispositivos de estado slido constituidos por los transistores de efecto de
campo sensibles qumicamente. Insiste tambin en que la inmovilizacin qumica o
biolgica es un aspecto determinante en el desarrollo de los sensores electroqumicos.
Finalmente destaca que con los biosensores enzimticos, inmunosensores y
genosensores electroqumicos se ha consolidado un campo bioelectroqumico de gran
inters analtico.

1 Sensores qumicos

En electroanlisis, el concepto de sensor qumico representa un redescubrimiento de un
tipo de instrumentacin muy habitual en este campo. Los sensores qumicos tienen
actualmente un inters renovado debido a las perentorias necesidades actuales de
disponer ms y mejor informacin analtica en unas condiciones no convencionales. En
efecto, unas veces en complementariedad, otras en oposicin al diseo o concepto que
representan los grandes equipos analticos de elevado coste, de manipulacin
especializada y confinados en recintos acondicionados, los sensores qumicos
representan una nueva clase de instrumentacin analtica, caracterizada por unas
pequeas dimensiones, un bajo coste, una utilizacin amigable y una generacin de la
informacin (idealmente) en tiempo real.

En electroanlisis, atendindonos a las caractersticas acabadas de mencionar, se utilizan
sensores qumicos desde principios del siglo pasado. Son muy bien conocidos, por
ejemplo, los electrodos redox, los electrodos selectivos de iones, especialmente el
electrodo de vidrio para medir el pH, y, en cierta forma, los distintos detectores
2
electroqumicos asociados a la instrumentacin analtica. Lo que ha acontecido ahora es
que, desde la irrupcin y popularizacin de los ordenadores en los laboratorios, se ha
impulsado de forma sistemtica I + D en sensores, tanto fsicos como qumicos, debido
a la extraordinaria innovacin que representa el seguimiento en continuo por
microprocesadores de parmetros fsicos y qumicos de un proceso complejo (por
ejemplo, biomdico, ambiental o industrial) y, en consecuencia, mediante actuadores,
poderlo controlar y actuar sobre l de forma provechosa (ver Cuadro 1).

Idealmente, un sensor qumico est formado por dos partes bien diferenciadas. Un
elemento de reconocimiento molecular o inico (receptor) (ver Cuadro 2), que
interacciona selectivamente con un determinado componente de la muestra (analito), y
un elemento instrumental (transductor) que traduce la interaccin en una seal
procesable (ver Figura 1). Ambas partes pueden encontrarse ms o menos integradas,
pero en todo caso conectadas, ya que la seal primaria generada en la reaccin de
reconocimiento (de tipo electroqumico, ptico, trmico o msico) ser convertida por el
transductor en una seal secundaria, en ltimo trmino, del dominio elctrico (ver
Cuadro 3). La conexin entre el elemento receptor y el transductor se materializa
mediante los procesos conocidos como inmovilizacin, que se discutirn ms adelante.

Figura 1. Diagrama esquemtico del funcionamiento de un sensor qumico.
Solamente un componente de la muestra es reconocido por el receptor (R).
La seal asociada al proceso de reconocimiento es convertida en una seal
elctrica por el transductor (T). Esta seal es posteriormente amplificada,
acondicionada, procesada y presentada en formato de dato (A). El receptor
puede reconocer al analito mediante mecanismos fsicos, qumicos o
biolgicos.

As pues, esta configuracin tan simple de reconocimiento + transduccin, que
integra el proceso analtico convencional (ver Cuadro 4), ha permitido un diseo de una
nueva instrumentacin, de caractersticas muy innovadoras dentro de la qumica
analtica, especialmente indicada para las medidas in situ, fuera del laboratorio, en
3
situaciones hasta ahora no habituales, por ejemplo, el control de parmetros clnicos por
parte de personal no especializado (sensores de glucosa, de alcohol, de colesterol, etc.),
la seguridad y el confort domsticos (sensores de humos, de fugas de gas, etc.) o el
control de la calidad y del estado de los alimentos.

1.1 Sensores electroqumicos

Bajo la denominacin de sensores electroqumicos se agrupan tres tipos especficos de
sensores: en primer lugar los sensores potenciomtricos, especialmente los electrodos
selectivos de iones, ESIs, tambin conocidos en sus siglas inglesas ISE (ion-selective
electrodes); a continuacin, los transistores de efecto de campo sensibles a iones, ms
conocidos tambin por sus siglas inglesas ISFET (ion-sensitive field-effect transistors),
donde el origen de la seal tambin es potenciomtrico; por ltimo, tenemos un tercer
grupo que es el de los sensores amperomtricos, en su forma de electrodos modificados
qumicamente. La modificacin de las superficies electroactivas de estos dispositivos
con materiales biolgicos de reconocimiento molecular son los conocidos biosensores
electroqumicos, que constituyen el rea ms avanzada de los sensores electroqumicos
(ver 4).
Los sensores electroqumicos son una clase de sensores qumicos que goza de una
posicin preeminente en el mercado de la instrumentacin analtica. Si los comparamos
con las otras clases de sensores qumicos (ver cuadro 3), son unos dispositivos muy
simples, que no necesitan de equipos de medida sofisticados; utilizan instrumentacin
muy comn en los laboratorios (potencimetros y potenciostatos). La seal transducida
es elctrica, fcilmente procesable por mtodos electrnicos. Son dispositivos
fcilmente miniaturizables, lo que permite hacer medidas en pequeos volmenes de
muestra o en zonas de dimensiones reducida. Presentan unos lmites de deteccin
suficientes para una gran mayora de muestras de inters analtico, y un intervalo de
respuesta ms amplio que la mayora de sensores qumicos basados en otros principios.
Finalmente, un dispositivo sensor electroqumico, especialmente si se puede fabricar en
tcnicas de produccin en serie, tiene un coste muy bajo, pudindose comercializar
como dispositivo desechable.

4
CUADRO 1. ORDENADORES, INFORMACIN, SENSORES Y ACTUADORES

La irrupcin de los ordenadores en multitud de mbitos de nuestra sociedad, tan vitales como son los de
orden econmico, social, poltico, cultural, artstico y, sobre todo, los de tipo cientfico y tcnico, ha sido
vista como una verdadera revolucin, y hay quien aventura que tendr un impacto mayor al que supuso
la Revolucin Industrial.
El ordenador se ha convertido en un centro neural, una especie de cerebro, que regula, ayuda, calcula,
coordina, controla, evala, informa, comunica o decide, cada vez ms, desde aspectos puntuales
cotidianos hasta otros de repercusin y alcance mundiales. De hecho, el ordenador no tan solo asiste al
hombre en multitud de tareas con gran rapidez, fiabilidad, integridad, seguridad o privacidad, sino que
lo sustituye en un gran nmero de actividades, que hasta hace muy poco eran inimaginables. Los
ordenadores empiezan a ser unos ingenios ubicuos.
Uno de los usos ms generalizados de los ordenadores en las sociedades desarrolladas es la gestin de
la informacin, de naturaleza muy diversa, la cual se almacena de forma jerarquizada en base de datos,
de fcil acceso y diseminacin a travs de redes telemticas de alcance mundial. Nunca antes de ahora,
gracias a los cerebros ordenadores y computadores, no haba habido tanta informacin disponible,
fcilmente accesible y bien gestionada. Y tambin nunca antes de ahora, a su vez, no haba habido la
necesidad de generar datos de forma continua para que los cerebros electrnicos puedan construir sus
propios sistemas de informacin y de conocimiento, y puedan intervenir en un sistema exterior de forma
inmediata y eficiente. Debido a la alta velocidad en el procesamiento de los datos que permiten los
ordenadores actuales, uno de los pasos limitantes, para que dichos instrumentos puedan tomar
decisiones oportunas, ms o menos rpidamente, es la forma en que el ordenador adquiere los datos o
las seales desde el exterior, que le permitirn reaccionar. Si, por ejemplo, la adquisicin de datos se
efecta fsicamente de la mano del hombre, de forma ms bien lenta, esto imposibilita efectuar
reacciones de forma inmediata.
En este contexto, hay una demanda creciente de dispositivos que sean capaces de suministrar de forma
continua a los cerebros electrnicos informacin del mundo exterior. Es decir, de dotar a los
ordenadores de una especie de sentidos, de unos anlogos de la vista, el odo, el tacto, el gusto y el
olfato. Dispositivos de este tipo se les conoce con el nombre de sensores. Son muy habituales los
sensores de temperatura, presin, aceleracin, nivel, caudal, sonido, radiactividad, luz, color, etc.
(sensores fsicos). Son menos habituales sensores de componentes (slidos, lquidos o gaseosos) de los
sistemas materiales de inters biomdico, ambiental o industrial (sensores qumicos), y por esto se estn
haciendo actualmente muchos esfuerzos de I+D en esta direccin.

Sistema simple de control de un proceso a partir de sensores y actuadores
gobernados por un ordenador, con indicacin de distintas categoras de
actividades informticas realizadas y de su analoga antropomrfica.
Sin dejar este contexto, el retrato no quedara completo si no tuvisemos en cuenta que la informacin
percibida de forma continua por el ordenador mediante los distintos tipos de sensores, debidamente
procesada, eventualmente con algoritmos de inteligencia artificial, sirve para construir conocimiento, el
cual permitir intervenir en los sistemas materiales de una forma racional, mediante los actuadores
(vlvulas, motores, bombas, pinzas, articulaciones, brazos, dispensadores, etc.) que, haciendo el papel
de unas extremidades, permiten al ordenador intervenir en su entorno exterior (ver tambin Cuadro 7).

5
CUADRO 2. RECONOCIMIENTO QUMICO, BIOLGICO Y BIOMIMTICO
El componente receptor de un sensor qumico transforma selectivamente determinada informacin
qumica contenida en la muestra en una forma de energa adecuada para ser medida por el transductor
(ver 1 y Cuadro 3). Es conocida la selectividad limitada de la mayora de las reacciones utilizadas en el
anlisis qumico, lo cual obliga a efectuar unos tratamientos previos a la muestra para separar las
posibles interferencias. Por esto slo han encontrado aplicacin un nmero muy reducido de reacciones
analticas tradicionales como sistemas receptores de los sensores qumicos, ya que stos estn
diseados para funcionar en medidas directas, sin tratamiento de la muestra.
A partir de los trabajos de Pedersen, Cram y Lehn, que recibieron el premio Nobel en 1988, se abrieron
unas grandes expectativas a la qumica analtica para poder disponer de una gran variedad de reactivos
de reconocimiento inico y molecular. De una forma muy elegante, con procedimiento de arquitectura
molecular, se han ido sintetizando reactivos formadores de complejos receptor-analito (host-guest), en
donde las especies implicadas se complementan a la vez en forma y dimensiones (geometra) y en
grupos enlazantes (energa). Esta complementariedad geomtrica y energtica es la base del
reconocimiento ms o menos selectivo de iones y molculas. Se han sintetizado una gran variedad de
molculas receptoras de cationes (iones metlicos, alcalinos y alcalino-trreos; amonio, bipiridinio, etc.)
y, en menor extensin, de aniones (iones haluro, sulfato, fosfato, carboxilato, etc.) o de algunas
molculas neutras (dixidos de azufre y de carbono, halometanos, hidrocarburos aromticos, etc.). Estas
molculas receptoras tienen unas topologas muy especiales, con unas cavidades hidroflicas
bidimensionales (como los politeres macrocclicos) o tridimensionales (ligandos macrobicclicos como
los criptandos o los esferandos) o con una cavidades hidrofbicas (como los ciclofanos, los calixarenos,
los cavitandos, los criptofanos o las ciclodextrinas); en definitiva, molculas que, con el mnimo de
cambios en la conformacin del receptor, del analito y del solvente, permiten la interaccin con el analito
a la vez que proporcionan unas barreras estricas, hidrofbicas, quirales, etc. que se traducen en una
mejora de la selectividad hacia los iones interferentes. Con todo, todo este ingente esfuerzo slo ha
encontrado una aplicacin muy parcial aun en el desarrollo y fabricacin de sensores qumicos. Quiz
donde ms repercusin ha tenido es en los sensores potenciomtricos, en donde la incorporacin de
molculas receptoras (ionforos, se denominan en este campo) como las acabadas de comentar ha
permitido la bsqueda de membranas selectivas de iones con mejores prestaciones que las actuales (ver
2.3.4). A pesar de que se dispone de muchos inoforos sintticos para analitos particulares, en algunos
casos las mejores membranas selectivas de iones incorporan inoforos naturales, como es el caso del
antibitico valinomicina, un excelente receptor selectivo de ion potasio, o de algunos derivados lipoflicos
de la vitamina B12, buenos reconocedores del ion nitrito.
Por otro lado, es conocido que el reconocimiento molecular es la base de la organizacin y de la
comunicacin biolgicas. La comunicacin qumica entre clulas y rganos, mediante sistemas
moleculares complementarios, es un proceso de vital importancia, responsable de la organizacin y la
proteccin de los organismos y de la regulacin de su metabolismo. Este tipo de biorreconocimiento (ver
Cuadro 6), optimizado por la evolucin biolgica, se ha utilizado para desarrollar los biosensores. En
efecto, interacciones entre enzimas y substratos o inhibidores, entre anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos y antgenos, entre protenas receptoras y hormonas o frmacos, entre lectinas y
carbohidratos, entre avidina o estreptavidina (protenas tetramricas) y la biotina (vitamina B6), entre
DNA y DNA complemetario, RNA o protenas, etc., han dado lugar a distintos sistemas biosensores,
algunos de ellos ya implementados comercialmente, especialmente los biosensores enzimticos y, en
menor extensin, los inmunosensores y genosensores (ver Cuadro 6).
ltimamente se han sintetizado polmeros que presentan una capacidad de reconocimiento molecular
bastante selectivo, y que pueden ser la base de un nuevo tipo de quimiosensores. Para la preparacin de
dichos polmeros, los procesos de grabado molecular (molecular imprinting) son conceptualmente muy
atractivos. Durante el crecimiento polimrico por entrecruzamiento de unos monmeros funcionalizados
se generan, con la ayuda de unas molculas molde, unas microcavidades de dimensiones y forma
especficas , y con una disposicin determinada de grupos funcionales en su interior, que reconocen
selectivamente al analito (a las molculas moldes de forma complementaria). Por esto, por su analoga al
biorreconocimiento anticuerpo-antgeno, a estos polmeros se les ha denominado anticuerpos de
plstico. Los polmeros grabados molecularmente (en ingls MIP, molecularly imprinted polymers)
presentan una serie de ventajas potenciales respecto a los receptores biolgicos. Poseen ms
estabilidad trmica y mecnica. Se pueden esterilizar, y prcticamente no se deterioran con el uso
continuado. Su mtodo de preparacin permite la obtencin de materiales reconocedores biomimticos
de una gran diversidad de estructuras. Adems, se pueden fabricar con propiedades pticas y
electroqumicas reproducibles, se pueden procesar en capas delgadas sobre soportes, en forma de
membranas o de microesferas porosas. Evidentemente aun presentan importantes limitaciones estos
materiales. La principal es su limitada selectividad, lo que de momento hace que solamente tengan una
aplicacin competitiva como materiales cromatogrficos, y que tambin presentan adsorcin inespecfica.
Sensores qumicos basados en materiales, en procesos de adquisicin o de tratamiento de datos o en
conceptos inspirados en el mundo biolgico, se les conoce con el nombre de sensores biomimticos (ver
Cuadro 5).
6
CUADRO 3. TRANSDUCTORES Y SENSORES QUMICOS
Dejando de lado la parte receptora del sensor qumico, de naturaleza qumica o biolgica, los
quimiosensores y los biosensores se acostumbra a clasificarlos segn el principio de funcionamiento del
su componente transductor. El transductor puede ser ms o menos selectivo hacia las seales que
provienen de la parte receptora, pero si el receptor es realmente selectivo el transductor no es imperativo
que lo sea. En algunos casos las partes receptora y transductora estn integradas, formando un mismo
componente, por lo que el dispositivo transductor se le considera por s un sensor qumico. En otros
casos, para prevenir que lleguen especies interferentes (distintas de las generadas en el proceso de
reconocimiento, que son las que transportan informacin analtica) hacia el transductor, se separa ste
del receptor mediante una membrana (separador). Finalmente, el trmino transductor concierne tanto a
un material con unas propiedades determinadas de transduccin (por ejemplo, un cristal piezoelctrico)
como a un dispositivo que facilita un tipo de transduccin determinada (por ejemplo, un dispositivo de
ondas acsticas superficiales).
Atendindonos, pues, a los principios de transduccin, podemos clasificar a los sensores qumicos en los
siguientes grupos:

Sensores electroqumicos. Transforman el efecto de la interaccin electroqumica entre el analito y el
electrodo en una seal elctrica til. Dicho efecto puede estar estimulado elctricamente o puede ser el
resultado de la interaccin espontanea (en condiciones de corriente nula). Dispositivos basados en estos
principios son los sensores voltamperomtricos (electrodos slidos inertes y electrodos modificados
qumicamente) o los sensores potenciomtricos (electrodos redox, pero especialmente los electrodos
selectivos de iones [ver 2.3 ] y ChemFET (ver 2.3.8).

Sensores pticos. Transforman cambios de fenmenos pticos, resultantes de la interaccin del analito y
el receptor, en seales optoelectrnicas tiles. Las magnitudes ms habituales medidas son
absorbancia, reflectancia, luminiscencia, fluorescencia, ndice de refraccin, etc. La aplicacin de
muchos de estos fenmenos a los sensores qumicos pticos (a veces llamados sensores optoqumicos)
se realiza con fibras pticas en distintas configuraciones. Estos dispositivos tambin se les denomina
algunas veces ptodos. Las fibras pticas o las guas de onda planas de los dispositivos pticos
integrados son medios transportadores de la radiacin y no intervienen en la transduccin, que se realiza
en la parte modificada de dichas estructuras.

Sensores msicos. Transforman un cambio de masa sobre una superficie modificada en un cambio de
una propiedad del material transductor piezoelctrico de soporte. El cambio de masa es causado por la
acumulacin selectiva del analito. El transductor puede basarse en la propagacin de ondas acusticas de
volumen o de superficie (dispositivos BAW o SAW, bulk acoustic waves or surface acoustic wave
devices).

Sensores trmicos. Transforman el efecto calorfico de la interaccin entre el analito y el receptor en una
seal elctrica til. En los sensores catalticos, el calor de una reaccin de combustin o de una reaccin
enzimtica se transduce en una seal elctrica gracias a un termistor.

7
CUADRO 4. INTEGRACIN EN CIENCIA Y TECNOLOGA
Integracin, segn el diccionario, es la accin o el efecto de juntar partes para formar un todo con
nuevas propiedades y funciones diferentes a las de las partes constituyentes. La integracin es un
concepto de gran repercusin en el campo tecnolgico. Slo hace falta recordar lo que ha representado
para la Microelectrnica los transistores, los circuitos integrados (IC) i los ordenadores digitales, como
paradigma de la integracin y de los diferentes niveles jerrquicos que dicha integracin produce.
De forma anloga pueden ser vistos los sistemas biolgicos, en donde sistemas bioqumicos integrados
generan les clulas, las cuales son los bloques de unas estructuras ms complejas (los tejidos) que
permiten construir unos edificios de una gran variedad formal y funcional (los organismos).
El concepto de integracin ha sido poco utilizado en Qumica; quiz ms en Ciencia de Materiales. As,
los compsitos son un claro ejemplo de integracin de materiales, los cuales, sin perder sus propiedades
originales, conforman un material resultante con nuevas propiedades diferentes de los materiales
constituyentes por separado. O los sistemas fotoelectroqumicos, en donde la conversin de la energa
radiante (la luz solar) en energa elctrica, mediante un material semiconductor, se aprovecha para
provocar simultneamente reacciones redox que nos permitirn generar productos determinados, por
ejemplo, convertir txicos ambientales en productos inocuos. Estos dos ejemplos, los compsitos y los
sistemas fotoelectroqumicos, son conocidos en ingls como ICS (Integrated Chemical Systems); en este
caso, de un nivel bajo de integracin.
En cambio, un ICS de un nivel alto de integracin es una pelcula fotogrfica en color instantnea.
Pensemos en la distancia conceptual y metodolgica existente entre los procesos de revelado fotogrfico
modernos, usuales en nuestras ciudades, los cuales se llevan a cabo, en un corto espacio de tiempo,
mediante grandes y sofisticados aparatos automatizados, basados en procesos qumicos hmedos,
controlados por personal especializado, y el revelado de la pelcula instantnea, basada en procesos
qumicos secos, hecho in situ por el propio usuario. La pelcula instantnea posee un gran nmero de
interfcies y de componentes integrados.

Sistemas analticos integrados

Los sistemas analticos son sistemas qumicos que generan informacin. Esta informacin se obtiene
siguiendo una secuencia de pasos bien establecida, conocida como proceso analtico. Los pasos
principales, tanto en la medicin como en la calibracin, son los siguientes: toma de muestra, transporte,
procesamiento de la muestra, separacin, reaccin, transduccin, adquisicin y procesamiento de la
seal; y en base a dicha secuencia, parcial o completa, se disean la mayora de procedimientos e
instrumentacin analtica.
La integracin del proceso analtico es una tendencia constante y un nuevo paradigma de la Qumica
Analtica. Gracias a la integracin se pueden implementar nuevos procedimientos e instrumentos
analticos que aportan nuevas perspectivas, por ejemplo, en trminos de simplificacin, miniaturizacin,
automacin, informacin, rapidez, movilidad y coste de los anlisis qumicos. Los sistemas analticos
integrados (en ingls, IAS, Integrated Analytical System) son de tipologa muy diversa y de diferente nivel
de integracin. Abarcan desde un sistema analizador de inyeccin en flujo, que es un aparato de
sobremesa que consigue la integracin del proceso analtico mediante la supresin de las soluciones de
continuidad entre los distintos pasos del mismo, por medio de conexiones a travs de flujos continuos no
segmentados; hasta los sensores qumicos, que son unos pequeos dispositivos que integran
esencialmente un material de reconocimiento altamente selectivo con un material transductor, sin solucin
de continuidad, como es el caso de los biosensores basados en enzimas, anticuerpos o cidos nucleicos.
Sobre este tema el lector puede consultar a S. Alegret, ed., Integrated Analytical Systems, Elsevier,
Amsterdam, 2003.

8
2 Sensores potenciomtricos

Este apartado presenta las bases en que se fundamentan los sensores potenciomtricos,
como se les designa ahora, aunque desde hace dcadas a algunos se les conoce por
electrodos selectivos de iones, ESIs. Tomando como punto de partida los principios de
la qumica electroanaltica, se hace un recordatorio de las tcnicas potenciomtricas para
presentar la amplia versatilidad de esta familia de sensores electroqumicos. Se
presentan y clasifican los diversos modelos de funcionamiento as como las variantes
ms actuales, como son las basadas en transistores de efecto de campo (FETs). Se
introducen las metodologas habituales de trabajo con sensores potenciomtricos, junto
con las expresiones y relaciones fundamentales.

2.1 Electroqumica de los sensores potenciomtricos

El sensor potenciomtrico es aquel en el cual la seal primaria, fruto de la interaccin
entre analito y elemento de reconocimiento, es un potencial elctrico. Normalmente, la
transduccin y medida de este potencial de equilibrio se realiza a intensidad nula y
frente a un elemento adicional, el electrodo de referencia. Ms recientemente se han
desarrollado dispositivos relacionados, como los basados en transistores de efecto de
campo (FETs), para los que la transduccin es diferente.

Para que los sensores potenciomtricos tengan una correcta aceptacin necesitan un
tiempo de respuesta reducido, una selectividad suficiente en medios con diferentes
especies y un lmite de deteccin suficientemente bajo. A cambio posibilitan un proceso
de medida rpido y simple, en un amplio rango de actividad y no influenciado por el
color o turbidez de la muestra. De hecho, la medicin efectuada con los sensores
potenciomtricos se relaciona directamente con la actividad de las especies en
disolucin, no con la concentracin, aunque haya maneras de relacionar ambas. Por
ejemplo, para soluciones suficientemente diluidas, es costumbre aproximar actividad
con concentracin.

El primer electrodo selectivo de iones (ESI), descrito hace aproximadamente un siglo,
fue el electrodo de vidrio, hoy en da utilizado universalmente para la medida del pH en
mltiples tipos de muestra. Actualmente, los modernos ESIs aprovechan lo que fue la
revolucin de los electrodos selectivos de membrana polimrica, desarrollados a partir
de 1970. En los ltimos 20 aos, el campo de los ESIs ha consolidado el de los sensores
potenciomtricos, incorporando elementos de tecnologas emergentes, como nuevos
9
materiales, elementos biolgicos para formar el biosensor, la microelectrnica o nuevos
principios de transduccin.

Paralelamente, la evolucin en la qumica ha aportado mejoras notables en el elemento
de reconocimiento, primera etapa funcional del sensor genrico, y de extrema relevancia
en la selectividad de ste. Concretamente han sido las aportaciones de la qumica
supramolecular, y los principios de las interacciones receptor/substrato (host/guest) (ver
Cuadro 2) lo que ha posibilitado prestaciones todava no superadas, y una aceptacin
universal de algunos de los dispositivos desarrollados, como es el caso de la medida de
electrolitos en el laboratorio clnico. Por todo ello resulta ste un campo maduro aunque
especialmente activo, con aportaciones continuas en cuanto a nuevos materiales
selectivos, nuevas aplicaciones y nuevas tcnicas, en aproximadamente 200
contribuciones por ao en la literatura cientfica.

Desde el punto de vista de la electroqumica, la potenciometra se acostumbra a estudiar
a partir de la fuerza electromotriz (fem) generada en una celda galvnica donde una
reaccin qumica tiene lugar de forma espontnea, y donde una energa en forma
qumica se interconvierte a una forma elctrica. La tcnica potenciomtrica de anlisis
aprovecha la medida de la fem en una celda potenciomtrica para deducir la
concentracin de especies qumicas en una muestra.

Para exponer los principios bsicos del funcionamiento del sensor potenciomtrico,
resulta necesario retroceder hasta los conceptos de la celda electroqumica.

Estos parten de la situacin en que se dispone una barra del metal M o electrodo
sumergido en una disolucin que contiene los propios iones del metal, M
n+
. En esta
situacin, se establece un equilibrio o reaccin qumica, la cual escrita como una
reduccin es:

M
n+
+ ne
-
M
En estas condiciones, se establece un potencial de electrodo en la interfase
metal/disolucin, que la termodinmica nos define como:

+ +
= =
n n
M
o
M
M o
a nF
RT
E
a
a
nF
RT
E E
1
ln ln ( 1)

siendo E el potencial (en V), R la constante del gas ideal, T la temperatura absoluta, F
la constante de Faraday, a
M
n+

la actividad de los iones del metal en disolucin, n el
nmero de electrones involucrados en el proceso, y E
o
el potencial normal de electrodo,
que es el potencial que corresponde a las condiciones estndar. Para llegar a la forma
final se toma a
M
como la unidad, por tratarse de un slido. La expresin anterior es una
ecuacin fundamental en electroqumica, y se conoce como la ecuacin de Nernst. Otras
10
derivaciones importantes de estas relaciones son, por ejemplo, los fenmenos de
corrosin.

Si se supone una temperatura de 25C, y se realiza la conversin de logaritmo natural a
logaritmo decimal, la ecuacin (1) se convierte en:

+
=
n
M
o
a n
E E
1
log
05916 . 0
( 2)
Dos semiceldas como las anteriores pueden interconectarse para construir lo que se
conoce como celda electroqumica (o pila), la cual se esquematiza en la Figura 2. En
estas condiciones ya es posible observar la diferencia de tensin entre ambos electrodos,
que depender en esencia de los materiales electrdicos utilizados y tambin de la
actividad de las especies que intervienen. Esto se transcribe algebraicamente en:
1
2
2 1 2 1
log
05916 . 0
M
M o o
a
a
n
E E E E V = = A ( 3)

Figura 2. Celda electroqumica (o pila) construida a partir de dos semiceldas
metal/ion metlico.

Los principios anteriores no se aplican nicamente a electrodos metlicos en presencia
de sus iones. Cualquier par redox electroactivo (y soluble) es capaz de interaccionar con
un electrodo metlico inerte, que puede estar construido con un metal noble como puede
ser el platino. En estas condiciones, el potencial de semicelda recogido por este
electrodo queda definido por:
A
A o
a
a
n
E E
'
log
05916 . 0
= ( 4)
11
para una reaccin electroqumica:

A + ne
-
A

Por ejemplo, una mezcla de iones de hierro en estado de oxidacin 2+ y 3+ definen la
semireaccin:

+ +
+
2 3
Fe e Fe
a la que le corresponde un potencial redox de electrodo:

+
+
=
3
2
1 1
log 05916 . 0
Fe
Fe o
a
a
E E ( 5)
que se recoge a travs de un electrodo de Pt para formar la semicelda correspondiente,
como se esquematiza en la Figura 3.

Figura 3. Una semicelda formada por un metal inerte y el par redox
Fe(II)/Fe(III).

Para esta semireaccin, el potencial de semicelda permite deducir la relacin de
actividades de las especies que intervienen en la semireaccin redox. Para que estos
principios tengan una utilidad prctica, todava es necesario hacer que la medida
dependa nicamente de una de las semiceldas, de donde ser posible deducir la
actividad de una de las especies, o la relacin de actividades de las dos formas del par
redox segn el caso. Esto se ver enseguida. Antes interesa completar las diferentes
posibilidades de construccin de una semicelda, tal y como se resume en la Tabla 1.

12
Tabla 1. Ejemplos de diferentes alternativas en la construccin de semiceldas
electroqumicas.
Tipos de electrodos redox
metal inerte primera especie segunda especie tercera especie
Pt en contacto con un
par redox soluble
Ag en contacto con
iones plata, Ag/Ag
+
Ag recubierta de AgCl
en contacto con iones
cloruro, Ag/AgCl/Cl
-
Hg/HgY
2-
/CaY
2-
/Ca
2+

Las dos variantes expuestas anteriormente con detalle son conocidas como electrodo de
primera especie y como electrodo de metal inerte. A continuacin encontramos lo que
se conoce como electrodo de segunda especie. Un electrodo de segunda especie est
formado por un metal, una sal insoluble del metal, y una disolucin que contenga una
sal del anin que forma la sal insoluble. Los ms habituales son los tiles electrodos de
referencia:

(i) el electrodo de Ag/AgCl y
(ii) el electrodo de calomelanos, formado por Hg/Hg
2
Cl
2
,
ambos necesitando la presencia de iones Cl
-
.
La reaccin electroqumica involucra especies slidas o insolubles mayoritariamente.
Por ejemplo, para el caso del Ag/AgCl, en su ecuacin de Nernst nicamente interviene
la actividad del in Cl
-
:

+ + Cl Ag e AgCl
s s ) ( ) (

=
Cl
o
AgCl Ag
a E E log 05916 . 0
/
( 6)
y el potencial de la semicelda queda definido nicamente a partir de la actividad del
anin en la disolucin.

El electrodo de tercera especie, que utilizara dos equilibrios de complejacin
combinados, actualmente ha perdido cualquier utilidad prctica.

Una adaptacin ingeniosa del electrodo de segunda especie es la que permite obtener las
actividades de las especie de la otra semicelda a partir del potencial de pila. Esta
adaptacin consiste en utilizar al electrodo de segunda especie como una de las
semiceldas, y a utilizarlo en unas condiciones tales que el potencial de semicelda sea
constante. As, el potencial medido depende nicamente de las especies en la primera
semicelda. Una condicin tpica que permite tomar como constante el potencial de
semicelda corresponde al limite de solubilidad de la sal utilizada, valor que depender
13
de un nico factor externo, la temperatura. Por tanto, un electrodo de Ag/AgCl o un
electrodo de calomelanos, utilizado con una disolucin de KCl en saturacin (aprox. 3M
a 25C) constituye una semicelda con potencial constante, o electrodo de referencia.

Figura 4. Electrodo de referencia de Ag/AgCl.

As pues, segn lo especificado, la celda electroqumica se adapta para construir la celda
potenciomtrica, que es la que permitir deducir la actividad del in principal de la
segunda semicelda (por ejemplo, de primera especie), y por tanto formar el antecedente
del sensor qumico.

+
+
+ = = = A
n
n
M
REF
M
o
REF
a
n
K E
a n
E E E V log
05916 . 0 1
log
05916 . 0
1 1
( 7)

Figura 5. La celda potenciomtrica que utiliza un electrodo de referencia y
un electrodo metlico permite deducir la relacin de actividades que
intervienen en la semireaccin.
14
2.1.1 Puente salino

En las mediciones potenciomtricas existe un problema fundamental que tiene como
origen los elementos de contacto entre las semiceldas que forman la celda
potenciomtrica. Resulta que en la interfase entre cada semicelda y el puente salino (que
se encuentra de momento incorporado en el electrodo de referencia) se establece una
pequea diferencia de potencial (que puede alcanzar varias decenas de mV), el potencial
de unin lquida, E
ul
, que se adiciona al potencial de celda:

ul REF
E E E V + = A
1
( 8)
El valor del potencial de unin lquida no es posible predecirlo con exactitud, aunque es
posible trabajar en condiciones en que su valor sea pequeo y constante. Para justificar
cuales son dichas condiciones se puede considerar el caso simplificado del contacto
entre una disolucin de una sal, por ejemplo NaCl, y agua destilada. En esta situacin se
produce una difusin de los iones hacia el agua destilada, pero por la naturaleza fsica
de cada in, su velocidad de difusin ser diferente. Cada in, Na
+
o Cl
-
, se difundir en
proporcin a su movilidad caracterstica en el interior del puente salino. Y es esta
diferencia de velocidad la que causa una separacin de cargas a lo largo del trayecto de
difusin, la cual se traduce en una diferencia de potencial, el potencial de unin lquida.
Las recomendaciones para hacer que este fenmeno tenga un efecto mnimo son de dos
tipos. Por una parte conviene utilizar sales en las que las especies inicas tengan una
movilidad lo ms parecida posible. Este es el motivo de que determinadas sales, por
ejemplo KCl, K
2
SO
4
, NH
4
NO
3
, o acetato de litio, sean de uso frecuente en estudios
electroqumicos. El segundo factor es el de las caractersticas geomtricas de la unin
lquida, donde cada usuario o fabricante aporta su experiencia, y donde es importante
que un (muy) pequeo flujo de electrolito est asegurado.

Para un clculo terico de la magnitud del potencial de unin lquida es posible utilizar
la ecuacin de Henderson, cuya derivacin se encuentra en los tratados de
electroqumica. Esta ecuacin establece, asumiendo actividades iguales a concentracin:

) (
) (
log
) ( ) (
) ( ) (
05916 . 0
'
2
'
2
'
1
'
1
'
2
'
2
'
1
'
1
2 2 1 1
V U
V U
V U V U
V U V U
E
ul
+
+
+ +

= ( 9)
y en sta:

) ( ) (
) ( ) (
'
1
'
1
1 1
+ + +
+ +
E = E =
E = E =
u z C V u z C U
u C V u C U
( 10)

donde C indica concentracin, u la movilidad inica, z la carga del in, el subndice + y
al catin y anin respectivamente y los subndices 1 y 2 se refieren a las dos regiones
diferenciadas entre las cuales se establece la unin lquida.

15
2.2 Potencial de membrana

El sensor potenciomtrico por excelencia basa su funcionamiento en una derivacin de
los principios expuestos en el apartado anterior, que parte del fenmeno conocido como
pila de concentracin. Resulta que dos semiceldas idnticas, pero en las que haya
diferencias en la actividad de los iones que intervienen en la ecuacin de Nernst,
presentarn una diferencia de potencial, traduccin de la tendencia a igualar las
actividades en ambos compartimentos.

La modificacin adicional resulta de utilizar como puente salino un material, la
membrana permselectiva, que es permeable nicamente a una de las especies que se
encuentran en el medio inico. En estas condiciones, el hecho de que no se pueda
alcanzar la neutralidad elctrica por el hecho de que se difunde un in pero no el de
carga contraria, hace aparecer un potencial estable, el potencial de membrana, que
depende nicamente de la carga del in implicado (z) y de la diferencia de actividades a
ambos lados de la membrana:
1
2
log
05916 . 0
a
a
z
V = A ( 11)

Figura 6. Ejemplo de potencial de membrana, fruto de interconectar dos
semiceldas Ag/AgCl con actividades diferentes de in principal (a
1
y a
2
) a
ambos lados de una membrana selectiva.

Para visualizar como el sensor potenciomtrico moderno se construye a partir del
montaje anterior, slo es necesario especificar que la disolucin de la izquierda, con
actividad a
1
de la especie en cuestin, sea la muestra, y que el conjunto de membrana
permselectiva, disolucin con actividad a
2
constante y segundo electrodo Ag/AgCl
forma el electrodo selectivo de iones (ESI), y que el primer electrodo Ag/AgCl ser el
electrodo de referencia.

16
En las condiciones especificadas, el potencial medido depende bsicamente de la
actividad a
1
que presente el in involucrado en la muestra problema,

1
log
05916 . 0
a
z
K V + = A ( 12)
Por lo que se dispone ya de un montaje experimental capaz de suministrar la actividad
de una especie analito en una muestra.

El electrodo selectivo de iones (ESI) o sensor potenciomtrico puede tomar ahora un
diseo ms prctico, como esquematiza la Figura 7. Generalizando a un ESI modelo, en
ste distinguiremos las partes siguientes:

(i) membrana selectiva, a un nico in, que se conoce por in principal, o en
su defecto, a un grupo de iones similares;
(ii) electrodo de referencia interna, por ejemplo de Ag/AgCl; y
(iii) solucin de referencia interna, la cual contiene el in necesario para
establecer el potencial del electrodo de referencia interna, normalmente
Cl
-
, junto con el in en cuestin para establecer el valor de actividad a
2
de la membrana permselectiva.

Figura 7. Electrodo selectivo de iones (ESI), donde se resalta el electrodo de
referencia interna, la solucin de referencia interna y la membrana
permselectiva.

Un ejemplo comn de ESI o sensor potenciomtrico es el electrodo de vidrio,
comnmente utilizado para la medida del pH. En l, la membrana selectiva es una fina
pared de vidrio hidratado, que separa dos disoluciones a distinto pH: la interna con
actividad constante y la de la muestra de actividad desconocida.

Desde el punto de vista conceptual del sensor, el ESI tiene su elemento de
reconocimiento implementado en la qumica selectiva que logra hacer permselectiva la
17
membrana. Es decir, ser una reaccin qumica de reconocimiento, que normalmente
implica un reactivo inmovilizado e integrado en la membrana, la que consigue la
selectividad. El lugar fsico donde ocurre este reconocimiento es en la interfase
muestra/membrana. La transduccin no resulta ser tan clara, ya que se reparte en
diferentes puntos. El potencial inicial, el potencial de membrana, aparece simultneo al
reconocimiento, y fsicamente se adscribe a la membrana permselectiva. As pues, en el
mismo punto fsico tienen lugar los dos procesos, reconocimiento y transduccin. Este
potencial de membrana es trasladado al exterior interponiendo una semicelda en serie,
como es el electrodo de referencia interna, y una vez recogido en el terminal metlico ya
est disponible para la medida. Con otras palabras, el electrodo de referencia interna
viene a ser un contacto lquido que nos une termodinmicamente la membrana
(conductor inico) con el electrodo metlico (conductor electrnico):

membrana | solucin interna | electrodo

Existe tambin la posibilidad de conectar la membrana con el electrodo o transductor
interno sin solucin de continuidad:

membrana | electrodo

Esta configuracin se la denomina all-solid-state o de contacto interno slido. Este es el
caso de los conocidos electrodos de hilo recubierto y tambin de los ChemFETs (ver
2.3.8)

Una precaucin habitual es la de utilizar el electrodo de referencia con una disolucin
de su in a saturacin, para lo que slo es necesario interponer un puente salino entre
sta y la muestra problema. La celda potenciomtrica queda ahora en la configuracin
habitual de la tcnica potenciomtrica de anlisis, que se esquematiza en la Figura 8.

Figura 8. Celda potenciomtrica preparada para la determinacin de una
actividad problema en una muestra.
18
2.3 Los diferentes sensores potenciomtricos

2.3.1 Una primera clasificacin

Segn los principios expuestos anteriormente, un moderno sensor potenciomtrico tiene
como elemento clave una membrana selectiva a un in, que interesa que muestre la
mayor selectividad posible para la especie que se mide. Esta membrana formar parte de
una celda electroqumica junto con la muestra en el momento de la medida, y presupone
que utiliza en la cara interna una segunda disolucin con una actividad constante de la
especie de inters. Como veremos, hay simplificaciones que permiten prescindir de este
ltimo condicionante experimental.

A lo largo de la evolucin de los sensores potenciomtricos (que tienen una edad
cercana al siglo) se ha producido una notable actividad en la bsqueda de materiales de
los que explotar su selectividad en diferentes formatos y matrices, de materiales
potencialmente utilizables como membranas potenciomtricas. En este apartado
tomaremos la clasificacin que realiza la International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC) de los electrodos selectivos de iones, que los distingue en funcin
de la naturaleza de la membrana selectiva, tal y como recoge la Tabla 2. En los
siguientes apartados se presentarn y discutirn los diferentes tipos as como ejemplos
significativos de cada uno.

Tabla 2. Clasificacin IUPAC de los electrodos selectivos de iones segn el
tipo de membrana que utilizan.
Electrodos selectivos de iones (ESIs)
Primarios
Cristalinos No cristalinos
Compuestos
membrana
homognea
membrana
heterognea
matriz rgida portador mvil sensibles a
gases
de substrato
enzimtico
2.3.2 Electrodos cristalinos

Los electrodos cristalinos contienen unos sitios fijos cargados de un signo, e iones
mviles de carga opuesta. El material que permite esta funcionalidad es el de formas
cristalinas de ciertas sales inorgnicas, que tienen la propiedad de ser conductores
inicos a temperatura ambiente. Las membranas basadas en elementos cristalinos
pueden utilizar un nico compuesto, por ejemplo el LaF
3
o Ag
2
S, o mezclas
19
homogneas de diversos componentes. Algunos ejemplos de stas se resumen en la
Tabla 3.

Estas formas cristalinas pueden ser incorporadas junto con un elemento aglutinante o
cemento inerte, y en ese caso reciben la clasificacin de membranas cristalinas
heterogneas. Un ejemplo corriente es la incorporacin de sulfuros metlicos en
matrices polimricas.

El fenmeno responsable del reconocimiento se debe al intercambio entre la disolucin
y la superficie del cristal inico. El transporte de carga a lo largo del cristal es posible
gracias a la movilidad de los defectos de la estructura cristalina, de forma anloga a los
huecos en un semiconductor.

Tabla 3. Ejemplos de membranas cristalinas homogneas
Membranas cristalinas homogneas
Ion primario Material Interferencias
F
-
Ag
+
, S
2-

I
-
Cu
2+

LaF3 dopado con EuF2
Ag2S
AgI
Ag2S+CuS
OH
-
Hg
2+

CN
-
, S
2-
Pb
2+
, Hg
2+

Figura 9. El electrodo selectivo a in fluoruro, que encuentra aplicacin en
la potabilizacin de aguas, donde es usual la fluoracin.

El ESI de mayor aceptacin ha sido el de in fluoruro, que utiliza como membrana un
monocristal de LaF
3
, como se esquematiza en la Figura 9. Para mejorar la
conductividad inica se utiliza un cristal de LaF
3
dopado con EuF
2
que incorpora
defectos de fluoruro en la red cristalina. Este monocristal, en forma de un disco fino, se
20
utiliza como membrana que separa la muestra de una solucin interna que es mezcla de
NaF (para definir la actividad a
2
del in principal) y NaCl (para definir el potencial del
electrodo interno de Ag/AgCl). La nica limitacin en el uso de este sensor es restringir
el valor de pH de la muestra a valores no muy cidos, para evitar la formacin de HF, ni
muy bsicos, que alteren el monocristal de fluoruro de lantano.

Otro ejemplo importante de sal inorgnica con propiedades de conductor inico es el
sulfuro de plata (Ag
2
S). Este material puede formar un monocristal, pero es posible
utilizarlo en una forma especialmente conveniente, como es la de disco sinterizado. El
Ag
2
S en polvo finamente dividido funde en un disco fino al ser presionado en una
prensa hidrulica como las utilizadas en espectroscopia IR (aprox. a 25.000 kg/cm
2
).
Este tipo de sensores se pueden construir con una configuracin especialmente robusta
como es la que sustituye al electrodo de referencia interna por un contacto hmico
interno, tal y como esquematiza la Figura 10. De esta manera se consiguen dispositivos
especialmente compactos y robustos, tambin llamados sensores all-solid-state. Una
propiedad adicional significativa de esta variante, es que los discos preparados con
mezclas de Ag
2
S y otras sales presentan respuesta a los nuevos iones incorporados.
Debido a la baja conductividad de sales como AgBr, AgCl o CuS, las membranas
respectivas se preparan como mezclas junto con Ag
2
S. De esta manera se obtienen
sensores para Cl
-
a partir de mezclas Ag
2
S y AgCl, o sensores para iones metlicos,
como Cu
2+
, incorporando el nuevo sulfuro metlico en la mezcla que sinteriza.

Figura 10. ESI de membrana de estado slido con contacto hmico interno
formado por una resina epoxdica conductora con base de Ag.
Esta misma familia de materiales puede ser incorporada, en forma finamente dividida,
en una matriz plstica inerte que ejerza una funcin aglutinante o de cemento (en
proporcin aproximada del 50%) como puede ser silicona o resina epoxdica. En este
caso se consigue una membrana heterognea, como las resumidas a modo de ejemplo en
la Tabla 4. Los sensores as construidos presentan como ventaja una gran robustez y
flexibilidad en el diseo.
21

Tabla 4. Ejemplos de membranas cristalinas heterogneas
Membranas cristalinas heterogneas
Ion primario Material
CN
-
Cl
-
Ag2S + AgI en matriz de PVC
Ag2S + AgCl en resina epoxdica
2.3.3 Electrodos no cristalinos

El sensor potenciomtrico no cristalino implica el uso de una membrana selectiva
formada a partir de una matriz de soporte que aloja sitios activos capaces de coordinar
con el analito de la muestra en la interfase membrana/disolucin. Hay mltiples
soportes que pueden ser utilizados, pero pueden clasificarse en los macroporosos (un
filtro de nylon) y en los no porosos (un vidrio o un material polimrico inerte como
pueda ser el PVC). Esta clasificacin da lugar a dos tipos muy diferentes de sensores,
los de matriz rgida, cuyo ejemplo es el que utiliza membrana de vidrio, y los de
portador mvil, donde se incluyen los modernos sensores de membrana polimrica, que
se tratan en el apartado 2.3.4.

Electrodos de matriz rgida Electrodo de vidrio

El electrodo de vidrio, comnmente utilizado para la medida del pH, es el ejemplo ms
exitoso de sensor potenciomtrico, el cual es disponible comercialmente desde la dcada
de 1930. En realidad fue el primer ESI desarrollado, y las primeras observaciones de su
respuesta en relacin con el pH datan de 1906. El principio de funcionamiento
aprovecha las propiedades de permselectividad de una fina membrana (< 1 mm) de
vidrio. El vidrio es en realidad un slido amorfo formado por una red de silicatos
cristalinos subenfriados, que muestran permeabilidad a H
+
, Na
+
y K
+
por interaccin
con los sitios fijos SiO
-
del vidrio. El principio de funcionamiento se basa en el
intercambio de protones e iones sodio por parte de una capa hidratada de silicato, capa
que tiene un grosor de unos 100 nm.

R-SiO
-
Na
+
(vidrio)
+ H
+
R-SiO
-
H
+
(vidrio)
+ Na
+
Este intercambio de iones Na
+
en la matriz del vidrio depende del pH de la disolucin, y
es esta la propiedad ms interesante, aunque todo electrodo de vidrio posee una
respuesta residual a sodio, conocido como error de sodio, que se manifiesta
especialmente para los valores ms altos de pH. Otra caracterstica de las membranas de
vidrio es su alta resistencia, en el rango de los MO, lo cual impone condiciones
22
especiales en la medicin de su potencial de membrana. Formulando vidrios con
diferentes proporciones de SiO
2
, Al
2
O
3
y Na
2
O se consiguen electrodos de vidrio
selectivos a Na
+
, K
+
o Li
+
.
Actualmente, la forma comercial ms corriente de este dispositivo es la de dos
electrodos combinados en un mismo cuerpo, el ESI de pH y el electrodo de referencia,
el cual se le conoce como electrodo combinado para la medida del pH y se
esquematiza en la Figura 11.
Figura 11. Un diseo tpico de un electrodo combinado de vidrio para la
medida de pH.

2.3.4 Electrodos de portador mvil

Aunque esta es una subdivisin de los electrodos no cristalinos, representa una familia
de sensores muy significativa en la actualidad y que ha permitido al sensor
potenciomtrico una aplicacin casi universal. Esto se debe a que utiliza unos principios
generales aplicables a multitud de especies, a diferencia de las familias anteriores donde
fenmenos especficos son los que permiten disponer de membranas selectivas, tal y
como ya ha sido expuesto.

El electrodo de portador mvil extrae sus principios de funcionamiento a partir de las
reacciones de complejacin en dos fases. En stas se utiliza un disolvente orgnico
inmiscible con agua que disuelve un agente capaz de interaccionar con el in principal,
normalmente mediante una reaccin de formacin de complejos. Es esta reaccin la que
otorga las propiedades de conduccin inica, y la que permite lograr una elevada
selectividad.

En su diseo original, que no el que se utiliza actualmente, traslada los principios
citados a un cuerpo de electrodo, utilizando un material poroso que acte de soporte del
reactivo disuelto en un disolvente orgnico de viscosidad apropiada. Este diseo se
muestra en la Figura 12.

23
Figura 12. El concepto de ESI de membrana lquida, antecesor del electrodo
de membrana polimrica.

El diseo anterior fue adaptado hacia 1970 en el Pas de Gales por J.D.R.Thomas,
donde utiliz un soporte polimrico de PVC plastificado con el mismo disolvente
orgnico que contiene al portador mvil, tambin conocido como ionforo. Esta
configuracin utiliza la reaccin de intercambio citada pero inmovilizada en una
membrana plstica, homognea, elstica pero consistente, que da unas perfectas
caractersticas de robustez y estabilidad de respuesta. Como razn de xito hay que
mencionar que se mantienen las caractersticas de respuesta del ESI de membrana
lquida, y que sus principios generales son extrapolables a multitud de reacciones
qumicas diferentes para el reconocimiento. La composicin tpica de una de estas
membranas polimricas de matriz de PVC se basa en una pequea cantidad de ionforo
disuelto en el disolvente orgnico (o plastificante), y stos embebidos en una cantidad
de polmero que suministra unas mnimas prestaciones mecnicas. La composicin
tpica de la formulacin de una de estas membranas polimricas de portador mvil se
muestran en la Figura 13. En situaciones especiales se incorpora a la composicin una
pequea proporcin de aditivos que tienen por objeto mejorar las caractersticas de
respuesta.

El procedimiento general para preparar una de estas membranas consiste en disolver el
elemento electroactivo junto con el plastificante, y mezclar estos con prepolmero de
PVC y un diluyente voltil, como el tetrahidrofurano. Una vez se logra una disolucin
homognea, o cctel sensor, se prepara una membrana por vaciado en un molde,
donde tiene lugar la evaporacin del componente voltil (el tetrahidrofurano) y como
resultado se obtiene una fina pelcula de polmero. Este proceso puede realizarse sobre
lo que ser el propio sensor potenciomtrico, o bien, puede separarse una seccin
circular (membrana) de la pelcula evaporada, que a continuacin se monta sobre un
soporte cilndrico para formar el ESI. La Figura 14 muestra el diseo de un ESI de
membrana polimrica as construido.

24

Figura 13. Tpica distribucin de componentes en una membrana polimrica
de PVC de portador mvil.

Figura 14. Esquema de un sensor potenciomtrico que utiliza una membrana
polimrica con portador mvil (a) con contacto interno lquido la
configuracin convencional y (b) con contacto interno slido
(configuracin all-solid-state).
En la descripcin de los ESIs de membrana polimrica falta por describir la naturaleza
de los elementos portadores, que sern los que suministren la interaccin con el in
principal presente en la muestra. Normalmente se trata de elementos hidrofbicos, que
son solubles en la fase membrana y que se transfieren a la fase acuosa. En su
presentacin se sigue la recomendacin establecida por la IUPAC (Tabla 5), que
distingue la carga del portador, segn posea ste carga positiva e interaccione con
aniones, carga negativa e interaccione con cationes, se trate de un portador neutro, o un
par inico de dos elementos lipoflicos, que puede interaccionar con ambos.

25
Tabla 5. Diferentes posibilidades en el elemento electroactivo en ESIs de
portador mvil.
Electrodos de portador mvil
cargado
positivamente
cargado
negativamente
neutro par inico
hidrofbico
Membranas selectivas de portador mvil cargado

Portador catinico: membranas selectivas a aniones

En este caso, el elemento electroactivo es un intercambiador inico (por ejemplo, in
amonio cuaternario) y un anin, orgnico o inorgnico. En esta situacin se da la
reaccin de intercambio mostrada a continuacin, en lo que seria un reconocimiento de
la especie Y
-
.
R
4
N
+
X
-
(membrana)
+ Y
-
R
4
N
+
Y
-
(membrana)
+ X
-
La selectividad de un sistema de membrana de esta naturaleza est determinada por las
propiedades del disolvente utilizado en la membrana, para el cual se establece una
relacin que depende de la lipofilicidad del anin considerado. As pues, el sistema
anterior muestra un patrn de selectividad fijado, conocido como serie de Hofmeister:

R
-
> ClO
4
-
> I
-
> NO
3
-
> Br
-
> Cl
-
> HCO
3
-
> CH
3
COO
-
> SO
4
2-

De esta manera, los ESIs construidos con estos elementos mostraran una respuesta
preferente por aniones orgnicos voluminosos (por ejemplo salicilato), o lo que es
equivalente, ser prcticamente imposible disponer de sensores suficientemente
selectivos para especies del final de la serie (por ejemplo sulfato).

Algunos elementos electroactivos diferentes son los que se basan en aniones complejos
metlicos, como los complejos de nquel, que se utilizan como portadores para in
nitrato.

Portador aninico: membranas selectivas a cationes

El mismo principio del agente intercambiador se puede utilizar para interaccionar con
cationes, por ejemplo de una misma familia. Un intercambiador aninico hidrofbico,
por ejemplo con un grupo sulfnico, o el anin tetrafenilborato, presentar un patrn de
selectividad tambin fijado por la relacin de volumen del catin, que por ejemplo para
la familia de los iones alcalinos es:
26

R
4
N
+
> Cs
+
> Rb
+
> K
+
> Na
+
> Li
+
Algunos reactivos concretos han encontrado utilidad para iones especficos, como
sucede con esteres orgnicos del cido fosfrico. As pues, una formulacin optimizada
para detectar calcio utiliza bis(p-tetrametilbutil)fenilfosfato de calcio como ionforo, y
dioctilfenilfosfonato como plastificante.

Par inico hidrofbico

Una situacin singular utiliza como elemento electroactivo un par inico cuyos catin y
anin son ambos hidrofbicos. En este caso, el sensor resultante presenta respuesta,
tanto al anin, como al catin. Este principio se utiliza para construir sensores para
detergentes, por ejemplo a partir de dodecilsulfato de cetiltrimetilamonio, o para
principios farmacuticos, formando par inico con el anin tetrafenilborato. Estos
dispositivos, dado que el in principal es voluminoso y altamente lipoflico, permitirn
la determinacin de los iones principales an en presencia de altos niveles de iones
inorgnicos. La Tabla 6 resume algunas aplicaciones del uso de portador mvil cargado
en la construccin de ESIs de membrana polimrica.
Tabla 6. Algunos ejemplos de electrodos de portador mvil cargado
Variantes en electrodos de portador mvil cargado
In principal Elemento de reconocimiento
Portador catinico
Cl
-
NO3
-
Portador aninico
Ca
2+

Zn
2+

Par inico
detergentes aninicos
efedrina
cloruro de hexadeciltrimetilamonio
nitrato de tris(difenil-1,10-fenantrolina) nquel(II)
bis(p-tetrametilbutil)fenilfosfato de calcio
di-n-octil-fenilfosfato de zinc
par inico dodecilsulfato de cetiltrimetilamonio
par inico tetrafenilborato de efedrina
27
Membranas selectivas de portador mvil neutro

La variante que ha permitido una mayor versatilidad en la formulacin de membranas
polimricas es la que utiliza portadores mviles no cargados. Estas membranas usan
agentes formadores de complejos como teres corona, compuestos macrocclicos o
antibiticos ionofricos, y para aniones, agentes formadores de aductos, como algunos
compuestos organoestnnicos o algunas porfirinas. En el poder de reconocimiento para
iones especficos intervienen los principios de la qumica supramolecular
receptor/substrato (host/guest), en los que se necesita una disposicin espacial o
geometra predeterminada junto con una complementariedad dimensional con la especie
principal (ver cuadro 2). Estos principios logran romper el patrn de selectividad
marcado por las series de Hofmeister, un objetivo largamente ansiado en el desarrollo
de elementos para el reconocimiento de iones. La Tabla 7 resume algunos ejemplos
significativos del uso de portadores neutros en membranas potenciomtricas.

Una de las formulaciones mas estudiadas es la que utiliza el antibitico natural
valinomicina para construir sensores para potasio, base de prcticamente la totalidad de
las medidas de este in que se realizan actualmente en los laboratorios clnicos. El
complejo que resulta de dicha interaccin se muestra en la Figura 15 e ilustra el origen
etimolgico del nombre que recibe, por su capacidad de enmascarar al in cargado y as
permitir su paso a travs de las membranas celulares, que son esencialmente lipfilas.

O
O
H
N
O
NH
O
O
O
O
O
N
H
NH
O
O
O
N
H
O
N
H
O O
O
O
O
O
K
+
Figura 15. Complejo de inclusin formado por la valinomicina con el in
potasio. La estructura 3D real se repliega sobre el in, ocultndolo del medio
en que se encuentre.

Es conveniente representar en forma de reaccin qumica los procesos que tienen lugar
durante el reconocimiento del in potasio en solucin acuosa:

V
(membrana)
+ K
+
VK
+
(membrana)

siendo V el portador neutro (o ionforo) valinomicina. Al reparar en el balance elctrico
se detecta un desequilibrio de ste, ya que se estaran incorporando cargas al interior de
la fase membrana. Este fenmeno tiene que quedar compensado con los contraiones
correspondientes, que pueden ser impurezas aninicas en el polmero, aunque
28
frecuentemente se incorporan aditivos en la formulacin de la membrana para
compensarlo. Estos aditivos son especies lipoflicas aninicas, normalmente derivados
del tetrafenilborato, siendo el ms utilizado el tetrakis(p-clorofenil)borato potsico y se
utilizan en una proporcin entre el 10/50% en fraccin molar respecto al ionforo.

Actualmente se disponen de portadores neutros para numerosos cationes, y tambin para
algunos aniones. Algunos de los plastificantes utilizados en estas membranas son el
sebacato de dioctilo, fosfato de dioctilo, ftalato de dioctilo, adipato de bis(1-
butilpentilo) o 2-nitrofeniloctilter. La firma Fluka (Buchs, Suiza) dispone de un
completo catlogo comercial de componentes para formulacin de membranas de
portador mvil. Muchos de estos, etiquetados con un nmero precedido de ETH, han
sido desarrollados en el instituto Eidgenssische Technische Hochschule (ETH) de
Zrich, donde W.Simon fue pionero en el uso de los portadores mviles neutros.

Tabla 7. Algunos ESI de membrana polimrica basados en portador mvil
neutro.
Ejemplos de electrodos de membrana con ionforos neutros
In principal Ionforo
pH
K
+
NH4
+
Na
+
Li
+
Ca
2+

Cl
-
tri-n-dodecilamina
valinomicina
nonactina
clix[4]:tetrametoxietil ster
derivado del 12-corona-4
ionforo ETH1001
trioctilestao
2.3.5 Electrodos selectivos miniaturizados

Con relacin a la seccin anterior, dedicada a los sensores que utilizan membrana
polimrica, es necesario mencionar los esfuerzos y la posibilidad de miniaturizar dichos
dispositivos, lo que les faculta para ser utilizados en estudios in vitro del campo
microbiolgico o celular.

La primera estrategia reemplaza la solucin interna de referencia por un contacto
hmico interno. Una variante interesante es la configuracin de hilo recubierto (coated
wire), aunque ha sido cuestionada en cuanto a la reproducibilidad que se consigue con
ella. En esta configuracin se aplica el material de la membrana (cctel sensor)
directamente sobre un alambre o hilo conductor, que puede ser de Pt, Ag, o
simplemente Cu (Figura 16). Esta configuracin no utiliza electrodo de referencia
interna, lo que posibilita aplicaciones especialmente simples y econmicas, como las de
29
usar y tirar. El mayor impedimento, es que al faltar la disolucin de referencia, el
potencial no est termodinmicamente definido. Como ventaja importante se tiene la
posibilidad de fabricarlos en cualquier diseo y tamao.
Una segunda estrategia de acceder a espacios reducidos simplemente miniaturiza el
electrodo de membrana polimrica (o incluso el de membrana lquida) hasta el lmite
practicable, logrndose puntas sensoras inferiores a 10 \m, como muestra la Figura 17.
Con dispositivos de este tipo se posibilita el estudio de procesos biolgicos a nivel
tisular o incluso celular.

Figura 16. Un electrodo de hilo
recubierto, que deposita la
membrana polimrica sobre un
contacto metlico.
Figura 17. Esquema de un micro-
electrodo de membrana polimrica.
2.3.6 Electrodos sensibles a gases

Los electrodos sensibles a gases son ejemplos de ESI compuesto o modificado, ya que
utiliza dos membranas, una la selectiva, y otra permeable a gases pero capaz de contener
lquidos. Este tipo de ESI conviene introducirlo ahora por su interrelacin con el
electrodo de vidrio. Otro tipo significativo de ESI compuesto es el biosensor
potenciomtrico, que ser expuesto en el apartado siguiente y ms adelante en 4.1.1.

En esencia, los electrodos sensibles a gases utilizan un diseo comn, conocido como
configuracin Severinghaus. Un electrodo convencional est en contacto con una
disolucin apropiada, que a su vez se encuentra en contacto con la muestra a travs de
una membrana permeable a gases. Estos dispositivos responden a especies que tengan
una forma gaseosa, y que por tanto, puedan difundirse desde la muestra al
compartimiento separado, donde son detectados de forma indirecta por el electrodo
interno. A modo de ejemplo, la Figura 18 muestra el electrodo de NH
3,
el cual funciona
30
segn el principio expuesto. Para la medida, se alcaliniza la muestra, de forma que se
consigue la formacin de NH
3
gas a partir del in NH
4
+
presente. Este gas NH
3
puede
atravesar ahora la membrana permeable a gases, y equilibrarse en la disolucin interna.
El gas NH
3
, debido a sus propiedades de base, alcaliniza la disolucin de recogida,
fenmeno que es detectado por el electrodo de vidrio interno. De esta manera se logra
una respuesta que est relacionada con la actividad amoniacal inicial en la muestra.

Con este mismo principio es posible la deteccin de otras especies que tengan una
forma gaseosa con propiedades cido-base, como pueden ser el CO
2
y SO
2
. Tambin es
posible utilizar electrodos internos de diferente naturaleza, segn la aplicacin final
buscada. Algunas de estas aplicaciones se han resumido en la Tabla 8.

Figura 18. Un electrodo de amonaco como muestra de electrodo sensible a
gases.
Tabla 8. Algunos ejemplos de electrodos sensibles a gases
Electrodos sensibles a gases (configuracin Severinghaus)
Sensible al Gas Reaccin interna Electrodo interno
CO2
SO2
NH3
H2S
HCN
CO2 + H2O HCO3
-
+ H
+
SO2 + H2O HSO3
-
+ H
+
NH3 + H2O NH4
+
+ OH
-
H2S S
2-
+ 2H
+
Ag(CN)2
-
Ag
+
+ 2 CN
-
pH
pH
pH
Ag2S
Ag/Ag
+
31
2.3.7 Biosensores potenciomtricos

Es posible adaptar el sensor potenciomtrico como biosensor, simplemente aportando la
especificidad de una enzima para el reconocimiento del in principal. Normalmente,
una enzima no ser un buen elemento electroactivo potenciomtrico, es decir no acta
como portador. La manera de acoplar los dos principios es combinando la reaccin
enzimtica con la deteccin potenciomtrica, en un dispositivo compuesto, o en etapas.
En este diseo se determina un substrato enzimtico, que reacciona con la enzima en
una primera etapa, y en una segunda, los productos de la reaccin enzimtica son
detectados gracias al uso de un sensor potenciomtrico. La Figura 19 esquematiza
como disponer de un montaje para conseguir este objetivo, si el resultado de la reaccin
enzimtica es un producto con propiedades cido-base, ya que el sensor utilizado es un
electrodo de vidrio. Para la inmovilizacin de la capa enzimtica existen diversas
posibilidades, como el uso de una membrana de dilisis, o tambin la formacin de una
capa de gel que contenga a la enzima, por ejemplo, utilizando poliacrilamida. Estos
sensores muestran una gran selectividad aportada por la reaccin enzimtica, pero con
el defecto de una velocidad de respuesta reducida, que est causada por las necesidades
de difusin de substrato y producto.

Figura 19. Un biosensor potenciomtrico de substrato enzimtico.

Como ejemplo de esta combinacin se puede mencionar un biosensor de penicilina, que
utiliza penicilinasa y un sencillo seguimiento de variaciones de pH:

+ H
+
N
S
COO
-
CNH
O
RCH
2
O
+ H
2
O
penicilinasa
N
S
COO
-
CNH RCH
2
O
OOC
H
penicilina acido peniciloico
32
Otras reacciones enzimticas pueden utilizar la medida de otras especies, como por
ejemplo la medida de NH
4
+
para un biosensor de urea que utilice ureasa. Aunque los
productos de la hidrlisis enzimtica presentan propiedades cido-base, es mucho ms
conveniente un funcionamiento en el pH ptimo de la enzima y la deteccin de
productos especficos resultantes, que pueden ser tanto el in amonio como el carbonato
(o tambin CO
2
).

+ 2-
ureasa
C
O
NH
2
H
2
N
+ 2H
2
O 2 NH
4
+ CO
3
Estas posibilidades, junto con ejemplos adicionales, se muestran en la Tabla 9. Un caso
singular es el sensor de amigdalina. sta es un carbohidrato cianognico, capaz de
producir cido cianhdrico txico durante su hidrlisis, y se presenta en variedades de
determinados vegetales o semillas de frutas, como en el caso de las almendras amargas.
El biosensor de amigdalina incorpora una capa enzimtica basada en |-glucosidasa
capaz de realizar la hidrlisis mencionada, y un simple sensor potenciomtrico de
cianuro, como los especificados en 2.3.2 para una deteccin rpida de las variedades
mencionadas.

Alternativamente, tambin existe la posibilidad de utilizar sensores potenciomtricos
recubiertos de una enzima determinada para detectar un inhibidor. Entre diversos
ejemplos destaca la deteccin de metales pesados a muy bajos niveles de concentracin
por interaccin con diversas enzimas, uno de ellas la ureasa.

Tabla 9. Algunos ejemplos de biosensores enzimticos potenciomtricos
Electrodos de substrato enzimtico
Especie Enzima Electrodo interno
Urea
Penicilina
Glucosa
Amigdalina
L-Arginina
Ureasa
Penicilinasa
Glucosa Oxidasa
|-Glucosidasa
Arginina descarboxilasa
NH4
+
pH
I
-
CN
-
CO2
Una ampliacin de lo comentado hasta ahora sobre los biosensores potenciomtricos se
encuentra en el captulo 4, dedicado especficamente a los biosensores electroqumicos
(ver 4.1.1)

33
2.3.8 Sensores potenciomtricos basados en FETs

Estos dispositivos se obtienen a partir de la tecnologa de estado slido, en una
adaptacin del transistor de efecto de campo (FET) para la obtencin de un sensor
qumico. Sus ventajas residen en sus reducidas dimensiones y en la posibilidad de ser
fabricados en paralelo por millares, utilizando las tcnicas fotolitogrficas planares de la
industria de los semiconductores.

Un transistor de efecto de campo metal-xido-semiconductor (MOSFET) tiene un
funcionamiento que se esquematiza en la Figura 20. Su operacin implica la aplicacin
de una tensin, tensin de drenaje, entre los terminales drenaje y fuente. Como esta
tensin encuentra uniones p-n polarizadas inversamente, no se establece paso de
corriente. Este dispositivo dispone de un tercer terminal, el terminal de puerta, el cual se
encuentra aislado del semiconductor. Cuando se aplica un potencial suficientemente
positivo a travs este terminal de puerta, ocurre el efecto de campo, en el que los
portadores de carga positivos del semiconductor p son repelidos por el campo aplicado,
de forma que llega a establecerse un canal de conduccin entre los terminales
principales y una corriente fluye entre drenaje y fuente. De forma esquemtica, la
intensidad que circula (i
D
) crece con el potencial de puerta (V
P
) una vez superado un
valor mnimo o tensin umbral, V
U
2
1
) (
U P D
V V K i =
( 13)
El sensor ISFET (acrnimo de transistor de efecto de campo sensible a iones, en
expresin inglesa) elimina la puerta metlica del MOSFET y situa en esa regin una
membrana selectiva. sta puede ser el propio dielctrico (SiO
2
) sensible a H
+
, o bien
una membrana potenciomtrica de naturaleza similar a las expuestas anteriormente y,
para la medida, pone en la zona de puerta con los iones en una disolucin. De esta
manera es ahora el potencial de membrana, el cual a su vez depende de la actividad de
los iones en la disolucin, el que modula la intensidad del circuito principal.

La forma de explicitar este efecto recae sobre el potencial umbral, V
U
, que ahora es
variable y depende de la actividad de los iones (de carga z) en disolucin segn una
expresin anloga a la del potencial de membrana:
1 2
log
05916 . 0
a
z
K V
U
+ = ( 14)
Ahora bien, para su utilizacin prctica, estos dispositivos se emplean de forma que se
mantenga constante la intensidad de drenaje, para lo cual se interpone en serie con el
potencial de membrana un potencial adecuado a travs de un electrodo de referencia
(V
P
), tal y como muestra la Figura 21. De esta manera, el potencial V
P
aplicado es la
medida final que se relaciona con la actividad de la especie principal de la membrana
depositada en la puerta.

34
La expresin de trabajo se obtiene directamente combinando las expresiones (10) y
(11):
1 3 1 2
1
log
05916 . 0
log
05916 . 0
a
z
K a
z
K
K
i
V
D
P
= = ( 15)
De donde se observa que las expresiones de trabajo para el sensor ISFET son
equivalentes a las del potencial de membrana para un ESI, slo que la dependencia con
la actividad presenta el signo opuesto.

El sensor ISFET es un tipo especial de sensor potenciomtrico, en el que ocurre una
repetida interconversin de seales. Aunque la seal primaria del reconocimiento es un
potencial, el potencial de membrana, sta se manifiesta en forma de una intensidad,
aunque en las condiciones habituales de medida se reconvierte al potencial de puerta
contrapuesto para mantener la intensidad en un valor prefijado.

Figura 20. Un transistor de
efecto de campo (MOSFET). Figura 21. Un sensor ChemFET
obtenido a partir de un transistor FET.
La misma variedad de principios que se utilizan para la obtencin de membranas
selectivas en ESIs pueden emplearse como elemento de puerta en los dispositivos
ISFET, bien como capa nica, o en capas mltiples, tal y como se recoge en la Tabla 10.
El ISFET ms difundido es el que se prepara para responder a pH, lo que se logra con
materiales en la zona de puerta como almina o nitruro de silicio (Si
3
N
4
). As, se habla
genricamente de ISFET para las diferentes variantes de este sensor semiconductor,
ChemFET cuando se utiliza una membrana cristalina o polimrica, EnFET para el
biosensor enzimtico, e incluso InmunoFET cuando se aprovechan interacciones entre
antgeno y anticuerpo para generar el efecto de campo.

35
Es necesario mencionar que, desde un punto de vista estrictamente termodinmico, las
membranas depositadas sobre dispositivos ISFET presentan un inconveniente similar al
de las depositadas sobre electrodos de hilo recubierto. Resulta que al no estar baadas
simtricamente, ya que adolecen del contacto de una disolucin por la cara de la
referencia, pueden presentar derivas y falta de reproducibilidad en sus medidas.

Tabla 10. Algunos ChemFETs desarrollados segn las diferentes variantes
ya presentadas con ESIs
Ejemplos de diferentes modificaciones para ChemFETs
Variante Implementacin Analito
ISFET de membrana de
almina
ChemFET de membrana
cristalina
ChemFET de membrana
polimrica
ISFET sensible a gases
EnFET
xido aislante
recubrimiento de haluro de plata
ionforo en matriz de silicona
membrana permeable a gases
membrana conteniendo ureasa
pH
Cl
-
Ca
2+

NH3
Urea
36
2.4 Aspectos prcticos en el trabajo con sensores
potenciomtricos
2.4.1 Expresiones de trabajo

La ecuacin fundamental de trabajo de un sensor potenciomtrico, que relaciona la
medida con la especie qumica medida es la expresin de Nernst:
1 1
log log
05916 . 0
a s K a
z
K V + = + = A ( 16)
siendo z la carga del in (con su signo) y a
1
la actividad que presenta en la disolucin.
Un sensor potenciomtrico tiene pues la sensibilidad (s) fijada. Para un catin
monovalente, la respuesta se incrementa en 59,16 mV por dcada de actividad (29,58
para un in divalente), mientras que para un anin el potencial decrece en la proporcin
especificada. Cuando un sensor presenta una respuesta que se ajusta a dicho modelo se
dice que tiene un comportamiento nernstiano.

Un sensor potenciomtrico responde idealmente a una nica especie, el in principal,
pero el hecho que reciba el calificativo de selectivo y no de especifico, ya nos previene
que puede presentar respuesta a iones adicionales llamados iones interferentes, que
puedan interaccionar con la membrana selectiva. Para tener en cuenta este hecho, se
ampla la ecuacin de Nernst, en lo que se llama la ecuacin de Nicolsky-Eisenman, la
cual recoge la contribucin de posibles iones interferentes presentes en la misma
disolucin de trabajo:
) log(
05916 . 0 /
,
j x
z z
j
x j
pot
j x x
x
a K a
z
K V

=
+ + = A ( 17)
donde a
x
es la actividad del in principal, a
j
la actividad del in interferente, z
x
y z
j
las
cargas de los iones principal e interferente respectivamente, y
pot
j x
K
,
, que recibe el
nombre de coeficiente de selectividad potenciomtrica, la medida de la influencia del
in interferente en la respuesta final. Valores muy pequeos de
pot
j x
K
,
son propios de
sensores que muestran una elevada selectividad por el in principal. Representando esta
ecuacin para unas condiciones donde slo se vara la actividad del in principal se
obtiene un comportamiento como el que se muestra en la Figura 22. En la ecuacin
(17) el trmino que suma a la derecha del logaritmo cuantifica la contribucin de las
especies interferentes. Su valor relativo respecto a la del in principal determina tres
zonas, que se muestran en el grfico.

(i) ZONA A. La zona nernstiana, donde no hay ninguna discrepancia respecto
al comportamiento terico. Corresponde a una situacin en la que la
contribucin de los iones interferentes es despreciable. Esto sucede bien por
37
estar presentes a mucha mayor dilucin que el in principal, o bien por
poseer el sensor unos coeficientes de selectividad de valor muy reducido. En
esta zona se deduce la actividad del in principal en una muestra por
comparacin con patrones adecuados y ajuste de la ecuacin de Nernst:
s K V
a
/ ) (
1
10
A
= ( 18)
(ii) ZONA B, o zona plana. En esta zona no hay respuesta respecto del in
principal, y la medida est determinada por la contribucin de los iones
interferentes.

(iii) ZONA C, corresponde a una situacin en que la contribucin de iones
interferentes e in principal es similar. Esta zona presenta una respuesta
residual al in principal, por lo que recibe el nombre de zona sub-nernstiana.
El punto en que se igualan los dos comportamientos, que grficamente
corresponde a la interseccin de las dos asntotas, tiene un significado
especial, ya que por convencin representa el lmite de deteccin de la
tcnica potenciomtrica. El lmite de deteccin, a*, no representa el lmite de
determinacin y es posible utilizar sensores potenciomtricos para realizar
medidas en la zona sub-nernstiana si se emplean tcnicas de calibracin no
lineal, siempre que el componente sumatorio de interferentes se mantenga
constante.

Figura 22. Ejemplo de respuesta de una membrana potenciomtrica ideal.
Las zonas A, B y C se explican en el texto.
38
2.4.2 Caracterizacin de la selectividad

Un ESI ideal presenta respuesta nicamente al in principal en disoluciones con
cualquier in presente. En la prctica, esta situacin se da slo ocasionalmente, y es
habitual que el ESI responda a iones de caractersticas parecidas, como es el caso de los
halgenos. Como se ha visto (ecuacin 17), la forma de tener en cuenta esta respuesta
interferente es mediante el coeficiente de selectividad potenciomtrica,
pot
j x
K
,
, que mide
en que grado se distorsiona la medida debida al in principal, x, en presencia del in
interferente, j. La caracterizacin exhaustiva de los coeficientes de selectividad
constituye uno de los esfuerzos experimentales ms extensos en la caracterizacin de un
nuevo sensor potenciomtrico.

Para ello existen diferentes procedimientos, aunque el recomendado es el llamado
Mtodo de las disoluciones mezcladas. En l, se prepara un conjunto de disoluciones
con un nivel de interferencia fija y en el que varia la actividad del in principal. El
comportamiento que se obtiene es el equivalente al de la Figura 22. Del valor del lmite
de deteccin para el in principal obtenido en esas condiciones , a*, que corresponde a
igual peso entre in principal e interferente, se deduce fcilmente el coeficiente de
selectividad potenciomtrica, ya que el nivel de interferencia es conocido:
j x
z z
j
pot
j x
a
a
K
/ ,
*
= ( 19)

log K
K
+
,Y
-4
-3
-2
-1
0
pot
K
+
Na
+
Rb
+
Cs
+
NH
4
+
Li
+
Ca
2+
Mg
2+
Ba
2+

Figura 23. Representacin grfica de los parmetros de selectividad de un
ionforo neutro para potasio en desarrollo. Se observa una correcta
discriminacin de los iones alcalinotrreos frente a los iones alcalinos.

La Figura 23 resume los resultados de uno de estos estudios de caracterizacin,
presentando de forma grfica los valores obtenidos para una rpida visualizacin del
comportamiento de selectividad. Para especies poco interferentes se da log
pot
j x
K
,
< -3,
39
mientras que valores prximos a 0 significa una respuesta similar para in principal e
in interferente. Valores logartmicos positivos implican una preferencia del sensor por
el in preferente y por tanto una distorsin importante en la respuesta debida al in
principal.

2.4.3 Actividad y concentracin

Una primera limitacin que es necesario resolver est relacionada con la dependencia de
la respuesta de los sensores potenciomtricos con la actividad de los iones en
disolucin, y no con la cantidad presente, su concentracin. En ocasiones singulares,
como por ejemplo en estudios con fluidos biolgicos o en el campo medioambiental es
importante conocer la actividad real antes que la cantidad total presente. No obstante, en
la mayora de casos se necesita conocer el valor de concentracin. Para resolver esta
necesidad se hace uso de la teora de los electrolitos en disolucin, que permiten
relacionar su concentracin con la actividad que presentan en disolucin. Dicha relacin
se establece a partir del coeficiente de actividad (
x
) segn:
x x x
C a = ( 20)
El valor del coeficiente de actividad es posible calcularlo a partir de la fuerza inica de
la disolucin, segn las expresiones derivadas de la teora de Debye-Hckel, como la
ecuacin de Davies:
I C
I B
I z z A
-
- +
-
=
+

'
1
| |
log
2 / 1
2 / 1
( 21)
donde A es una constante que para agua a 25C vale 0,5108. Los parmetros B y C se
encuentran tabulados para cada especie inica para poder ajustar el modelo terico. Por
ultimo, I es la medida de la fuerza inica de la disolucin, calculada segn:
2
2
1
i i
z c I

= ( 22)
Una aproximacin habitual es tomar valores promedio para los diferentes iones, y as:
I
I
I z
-
+
=

15 . 0
1
51 . 0
log
2
( 23)
Esta expresin es costumbre usarla con la simplificacin de menospreciar el trmino
que resta siempre que la fuerza inica sea inferior a 0,01 M.

40
Si el coeficiente de selectividad puede ser considerado constante, el potencial medido
con un sensor potenciomtrico se relaciona con la concentracin del in principal segn:
x x x
C
z
K C
z
K V log
05916 . 0
log
05916 . 0
+ ' = + = A ( 24)
La aparente contradiccin de que el sistema es irresoluble, ya que para conocer el
coeficiente de actividad hay que conocer la fuerza inica total, en la que interviene a su
vez el in cuya concentracin se busca, se resuelve con el ardid de que su influencia sea
despreciable. De este modo para concentraciones diluidas no se efecta ninguna
correccin, ya que se presupone
x
= 1. Para concentraciones mayores se utiliza una
disolucin de iones no interferentes, que definan el valor de la fuerza inica y permitan
el clculo de los coeficientes de actividad que tendrn un valor casi constante. Una
costumbre habitual es el empleo de un exceso aadido de sal inerte, cuyo objeto es ser
la fuente determinante de la fuerza inica. Cuando los protocolos en el uso de sensores
hacen referencia a esta prctica, se le refiere como disolucin ajustadora de la fuerza
inica total (TISAB en la terminologa inglesa).

2.4.4 Procedimientos y aplicaciones

Se dispone de un nmero de diferentes tcnicas para el uso de los sensores
potenciomtricos que varan en complejidad y en prestaciones. Brevemente se presenta
una somera descripcin de las principales.

Potenciometria directa

Tras una calibracin con patrones adecuados, que se asemejen a las muestras, la
potenciometra directa implica poner en contacto la muestra con el sensor ms electrodo
de referencia, y deducir la actividad por interpolacin directa. Con esta tcnica,
cualquier presencia de interferentes causar un error en el resultado. Para determinar la
relacin entre actividad y concentracin, es corriente el uso de una solucin ajustadora
de la fuerza inica, que debe estar presente en patrones y muestras. El rango de trabajo
de esta metodologa puede estar entre 10
-5
y 10
-1
M, lo que sita la escala de trabajo
entre los mg/L y los g/L.

Para los casos en los que la difusin de iones K
+
o Cl
-
provenientes de la solucin
interna del electrodo de referencia puedan ser una interferencia significativa, se dispone
de electrodos de referencia que interponen un segundo puente salino que puede contener
una sal escogida para minimizar este efecto. A estos se les conoce como electrodos de
referencia de doble unin lquida (Figura 24).

41
Figura 24. Electrodo comercial de referencia con doble unin lquida

Adicin patrn

Esta variante es la preferida cuando la matriz de la muestra tiene un efecto no
cuantificable pero significativo en la medida. Para ejecutar la tcnica, primero se realiza
una medida de la muestra y a continuacin se realizan k adiciones conocidas de la
especie buscada. Es conveniente realizar pequeas adiciones de una solucin
concentrada para minimizar los efectos de la dilucin. En esta situacin la respuesta se
incrementa (para un catin) segn la cantidad aadida. Extrapolando esta relacin para
la adicin nula, se deduce el analito inicialmente presente en la muestra, tal y como se
deduce de la vieta correspondiente en la Figura 25.

+
+
+ = A
k o
k o o
V V
V c V C
s K V

log ( 25)
Figura 25. Ilustracin que resume tres tcnicas habituales cuando se trabaja
con sensores potenciomtricos, potenciometra directa (A), adicin patrn (B)
y valoracin (C).
42

Valoracin

Un sensor potenciomtrico puede ser un detector adecuado del punto final en
valoraciones, tanto cido-base, como redox, de precipitacin, de formacin de
complejos o de formacin de par inico. La disponibilidad de un potencial de electrodo
que sigue el volumen de valorante utilizado suministra una informacin til para la
realimentacin del proceso, lo que posibilita la realizacin de valoraciones
automatizadas. Un anlisis posterior del registro completo de valoracin permite
identificar los puntos de inflexin con los volmenes de equivalencia de las diferentes
reacciones que hayan podido suceder en sucesin.

Con las tcnicas mencionadas, junto con otras, como el uso de analizadores en lnea,
analizadores por inyeccin en flujo (FIA) es posible desarrollar y optimizar
aplicaciones en diferentes campos de aplicacin, que varan desde los anlisis clnicos
de electrolitos, la monitorizacin de vertidos contaminantes mediante redes
automatizadas de analizadores o el seguimiento de procesos industriales. La Tabla 11
resume algunas aplicaciones significativas en diferentes campos de aplicacin. En
cuanto a cuales son las lneas de avance representativas para esta familia de sensores, el
Cuadro 5 intenta dar una idea de su utilizacin en forma de matrices o de arreglos (en
ingls : arrays).

Tabla 11. Algunas aplicaciones consolidadas de los sensores
potenciomtricos en la obtencin de informacin qumica
Procesos que utilizan sensores potenciomtricos
Campo de aplicacin Determinacin
Fundamental Constantes de estabilidad
Estudios cinticos de procesos enzimticos
Industrial Control de biorreactores
Anlisis farmacutico
Plantas potabilizadoras de agua
Ambiental Monitorizacin de lluvia cida
Anlisis de efluentes
Nutrientes en aguas superficiales
Contaminantes especficos en agua residual
Anlisis de suelos
Clnico Anlisis de electrolitos en sangre
Anlisis de CO2
43

CUADRO 5. MATRICES DE SENSORES Y APROXIMACIONES BIOMIMTICAS
El desarrollo de nuevas estrategias que emplean sensores sigue siendo un rea muy dinmica de
investigacin, donde confluyen los campos de la qumica, bioqumica, fsica, y ms recientemente la
electrnica e informtica. Una de las lneas de avance que combina conocimientos de los campos citados
es la de las matrices de sensores. sta es una aproximacin complementaria a la de la bsqueda del
sensor ideal, prcticamente especfico para una especie determinada. La situacin tradicional depende en
extremo de la disponibilidad de un sensor suficientemente sensible y selectivo para la especie problema.
En la nueva orientacin, se propone la utilizacin de matrices de sensores, y de procesar en su conjunto
la informacin obtenida. De esta manera se consiguen unas prestaciones no alcanzables con el uso de un
sensor nico. Entre las prestaciones descritas se pueden mencionar tres tendencias diferenciadas, la
bsqueda de indicadores para el diagnstico de la medida, la utilizacin de matrices de sensores
selectivos, y la utilizacin de matrices de sensores poco selectivos. Veamos que posibilidades se deducen
de cada una de ellas.

Un primer uso de las matrices de sensores busca la obtencin de informacin en exceso, que
calificaramos redundante. El objetivo es extraer de ella indicaciones que sirvan para el diagnstico o la
deteccin de averas. Se han descrito por ejemplo aplicaciones, donde el uso de la matriz de sensores es
lo que permite dar robustez al sistema. Otro ejemplo significativo es el que ha permitido la compensacin
de derivas en sistemas donde la recalibracin peridica no es factible, como por ejemplo en sondas
submarinas. En esta situacin, se emplean potentes herramientas de anlisis multivariable para extraer y
separar los componentes significativos de los que constituyen nicamente la deriva.

En segundo lugar, la aplicacin de tecnologas compatibles con una fabricacin masiva de sensores ha
supuesto un abaratamiento de los dispositivos, abriendo la posibilidad de un solo uso. En estas
condiciones, el sobrecoste que supone disponer de un conjunto de sensores donde antes teniamos uno
solo ya no es significativo. De esta manera se plantea el uso de matrices de sensores especficos
idnticos, que permitan un mapeado de concentracin de la especie en cuestin. De igual manera, se
puede disponer de un conjunto de sensores diferentes, que lleven al multianlisis. Cuando esta
posibilidad coincide con el uso de biosensores, y con la miniaturizacin, que probablemente utiliza
tecnologas microfotolitogrficas y/o microelectrnicas, todo esto nos lleva al biochip. A ste, aunque
acabe de llegar, se le pronostica ya una difusin exponencial, slo en lo que representar el diagnstico
clnico a partir de la identificacin de genes especficos. Y el significado aadido que se aporta es el de la
mltiple obtencin de informacin en una nica operacin.

Por ltimo tenemos la posibilidad de utilizar sensores no selectivos y con respuesta cruzada, para la
aplicacin en muestras complejas. Esta aproximacin est inspirada en el mundo de los sentidos
animales, pues es de esta manera como se procesa la informacin en los sentidos del olfato y del gusto.
En stos, se dispone de un numero limitado de receptores para aromas y gustos primarios, y es la
respuesta compleja al conjunto la que define un olor/sabor nico entre millares. Estos sistemas
claramente bioinspirados han recibido el nombre de nariz electrnica cuando est formado por sensores
de gases y de lengua electrnica cuando emplean sensores para lquidos. Un primer objetivo es obtener
simultneamente la media de las especies principales junto con las especies interferentes. Esta
desconvolucin de las contribuciones de las diferentes especies aporta mejoras en la exactitud de las
medidas. Pero adicionalmente, esta aproximacin permite abordar problemas mas complejos, donde el
objetivo no es la medida de una(s) especie(s) concreta(s) sino la adquisicin de informacin compleja,
como pueda ser una planta de tratamiento despide mal olor, o determinada bebida refrescante va a
causar rechazo en el consumidor. Este tipo de informacin slo era posible obtenerla hasta ahora
mediante la intervencin humana, que poda ser mediante un experto o mediante paneles sensoriales.
Con la nueva aproximacin y un proceso de aprendizaje logrado mediante elementos de inteligencia
artificial se abre la posibilidad de la deteccin automatizada.

As pues la combinacin de sensores con las herramientas quimiomtricas y de inteligencia artificial abre
la puerta hacia los sistemas de sensores inteligentes, que en un futuro van a poder monitorizar e
interpretar cambios en su entorno, as como corregir posibles defectos de operacin. Esta rea est
siendo estimulada por la posibilidad de utilizar elementos de procesamiento informtico muy simples,
econmicos y asequibles, que pueden llegar a tener un enorme poder de clculo, como lo son los
modernos procesadores digitales de seal (DSPs).

44

3 Sensores amperomtricos

Con este nombre, actualmente, la bibliografa especializada se refiere a los electrodos
slidos de materiales conductores relativamente inertes, como es el caso del platino, oro
y carbono, en el modo de operacin voltamperomtrico de medida de intensidad de
corriente imponiendo un potencial determinado al electrodo (i = 0, E= const.). Estos
materiales operan en unas ventanas de potencial andico anchas, permitiendo la
determinacin de una amplia gama de compuestos oxidables, en comparacin con el
clsico electrodo de gotas de mercurio. Plata, nquel y cobre tambin se utilizan en
aplicaciones ms especficas.

Un factor importante a tener en cuenta cuando se usan estos electrodos es la
dependencia de la respuesta con el estado de sus superfcie. A menudo presentan una
superfcie heterognea, desde el punto de vista de la actividad electroqumica, y rugosa
a escala microscpica. Necesitan muchas veces un determinado pretratamiento previo
(mediante procedimientos qumicos, electroqumicos, trmicos o mecnicos) para
activar la superfcie y as obtener unos resultados reproducibles.

Por otra parte, el electrodo de gotas de mercurio, por sus caractersticas funcionales,
escapa de la consideracin de sensor, al ser bsicamente un dispositivo de laboratorio.
Por consideraciones anlogas, no es habitual incluir a los electrodos de disco rotatorio
dentro de la familia de los sensores.

Distintos factores afectan a la velocidad de reaccin en el electrodo -intensidad de
corriente- entre ellos podemos considerar: a) transferencia heterognea de electrones; b)
transporte de las especies electroactivas hacia el electrodo (difusin, conveccin y
migracin); c) reacciones qumicas que se producen antes o despus de la transferencia
electrnica (protonacin, dimerizacin, catlisis, etc); y d) Efectos de superficie, como
adsorcin o desorcin.

Recordemos que amperometra es el nombre habitual de la aplicacin analtica de la
tcnica cronoamperomtrica. En una configuracin electrdica determinada, en un
proceso reversible controlado por la difusin y en soluciones quiescentes (en reposo) , y
normalmente con un potencial aplicado sobre el electrodo que obliga a que
concentracin de la sustancia electroactiva (que se oxida o se reduce , segn el caso)
sobre ste sea nula [C(x=0) = 0], el flujo de sustancia electroactiva que llega al
electrodo es paulatinamente menor [el espesor de la capa de difusin de Nernst (x = o )
va aumentando], y la corriente medida decae (i = k t

), hasta llegar en un tiempo

breve a un estado prcticamente estacionario, hacindose finalmente la corriente
independiente del tiempo (ecuacin de Cotrell). Aunque el valor de la corriente haya
45
decado considerablemente, su medida a un tiempo prefijado tiene inters analtico, ya
que es proporcional a la concentracin (C) de la especie electroactiva en el seno de la
solucin.

De todas formas, el mismo sistema en rgimen de conveccin forzada (agitacin
regular) [el espesor de la capa de difusin de Nernst (x = o ) es constante y pequeo],
permite una corriente (i) estacionaria , denominada de difusin, que alcanza un valor
lmite cuando el flujo de sustancia electroactiva hacia el electrodo es mximo; es decir,
cuando el potencial impuesto obliga a que C(x=0) = 0, y la corriente limite de difusin
deviene independiente del potencial aplicado. Entonces, dicha corriente es directamente
proporcional a la concentracin de la sustancia en el seno de la solucin [C = C(x= o)]:
C k i = ( 26)
siendo esta expresin la funcin de respuesta del transductor amperomtrico, la cual
regir las curvas de calibracin de la seal del sensor (i) frente a la concentracin (C) de
la sustancia electroactiva (analito). El valor exprimental de la pendiente de esta curva de
calibracin k corresponde al factor nFAD/o, donde n es el nmero de electrones en la
reaccin redox, F es la constante de Faraday, A el rea activa del electrodo, D el
coeficiente de difusin de la especie electroactiva y o el espesor de la capa de difusin.

3.1 Electrodos modificados qumicamente

De hecho, los electrodos slidos voltamperomtricos, si nos fijamos en la definicin
dada en 1 sobre los sensores qumicos, deben considerarse como transductores
electroqumicos, ya que carecen de elementos de reconocimiento. Su selectividad,
aunque limitada pero suficiente para muchas situaciones experimentales reales, se
consigue mediante la seleccin adecuada del potencial impuesto al electrodo de trabajo,
mediante el sistema potenciosttico de medida, normalmente en configuracin de tres
electrodos (electrodos de trabajo, auxiliar y de referencia).

Los sensores amperomtricos se consideran verdaderos sensores qumicos cuando sobre
los materiales transductores incorporan elementos que les propocionan selectividad.
Este es el caso de los electrodos modificados qumicamente, que comentaremos a
continuacin , y del electrodo de oxgeno, que comentaremos despus.

La modificacin superficial de los electrodos slidos voltamperomtricos se realiza para
propsitos analticos muy diferentes. Por ejemplo, puede ser para la aceleracin de las
reacciones de transferencia heterognea de electrones entre el electrodo y las especies
electroactivas en solucin o para la acumulacin o permeacin selectivas de los analitos.
46
Es decir, se modifican los electrodos para mejorar la sensibilidad y la selectividad de los
dispositivos sensores voltamperomtricos, amn de mejorar su estabililidad.

A continuacin vamos a repasar las tres reas conceptuales de aplicacin de los
electrodos modificados qumicamente, teniendo presente que en muchos casos dichas
reas no estn completamente deslindadas entre s y podemos encontrar conjuntamente
ms de uno de dichos conceptos en muchos diseos de sensores amperomtricos.

3.1.1 Electrocatlisis

A menudo la especie electroactiva a detectar presenta una transferencia electrnica lenta
sobre los electrodos habituales (Pt, Au o C). Por lo tanto slo conseguiremos una seal
analtica til cuando impongamos al electrodo un potencial sustancialmente superior a
su potencial redox termodinmico, con la consiguiente prdida de calidad en la
respuesta, en trminos de selectividad (posible deteccin simultnea de especies
interferentes) y de sensibilidad (peor relacin seal/ruido).

A partir de consideraciones de la cintica rpida de determinadas especies sobre el
electrodo y de sus propiedades redox en sistemas heterogneos, con potenciales redox
no muy elevados, podemos utilizar dichas especies como electrocatalizadores,
aceleradores o mediadores de reacciones electroqumicas, y as poder detectar
determinadas sustancias a potenciales de trabajo ms adecuados. Por ejemplo,
consideremos que el proceso andico siguiente se realiza a unos potenciales que no son
analticamente convenientes, por ser una reaccin electroqumicamente lenta:

A(red) A(ox) + n e
-
Supongamos que tenemos inmovilizado sobre el electrodo un mediador electrocataltico
M(ox); es decir, una especie redox con un comportamiento electroqumico reversible,
con una cintica electrdica rpida en comparacin con A(red), y que presenta una
transferencia electrnica homognea con esta especie en solucin:

A(red)+ M(ox) + A(ox) + M(red)

Al estar el electrodo polarizado andicamente, la forma reducida del mediador se
regenera instantneamente a su forma oxidada inicial

M(red) M(ox) + n e
-
Siendo el resultado neto: A(red) A(ox) + n e; es decir, gracias a la especie
mediadora electrocataltica, existe una transferencia de electrones continua entre el
analito y el electrodo, governada por el potencial redox del mediador y a una velocidad
47
(intensidad de seal) comparativamente mayor que la del electrodo sin modificar. Tanto
mayor ser la seal cuanto ms cerca se encuentren los centros redox del mediador de la
superfcie conductora del electrodo, ya que la velocidad de transferencia decae
exponencialmente con la distancia. De aqu, la importancia de los procesos de
inmovilizacin de los mediadores sobre los electrodos, que se comentarn ms adelante.
Lo acabado de comentar se puede esquematizar de la siguiente forma:

De forma anloga podramos considerar un sistema electrocataltico para detectar una
especie A(ox) actuando el electrodo como ctodo.

En la literatura especializada podemos encontrar multitud de esquemas electrocatalticos
con fines analticos, implementados en forma de electrodos modificados qumicamente.
Electrodos modificados con cobalto ftalocianina para determinacin de tioles, con
nquel ftalocianina para antioxidantes o con dixido de rutenio para carbohidratos. A
causa de su importancia como cofactor de muchas reacciones enzimticas, la
electroqumica del par NAD
+
/NADH ha atrado un gran inters. La oxidacin del
NADH se puede conseguir con electrodos no modificados, pero a grandes
sobrepotenciales y dando productos que se adsorben y envenenan el electrodo. En
cambio, si adsorbemos azul de Meldola (7-dimetilamino-1,2-benzofenoxazina) sobre un
electrodo de grafito, por ejemplo, se reduce considerablemente el potencial a aplicar,
obtenindose una seal analtica til.

3.1.2 Preconcentracin

En la determinacin de trazas de especies con propiedades redox puede ocurrir que la
especie a determinar se encuentre a una concentracin por debajo del lmite de
deteccin de la tcnica voltamperomtrica a disposicin. La modificacin superficial de
un electrodo con una capa de material que facilite la acumulacin preferencial
(selectiva) del analito nos permitir, despus de un tiempo de acumulacin, la
determinacin de las trazas de analito, por reduccin o oxidacin mediante un barrido
de potencial. De hecho, esta estrategia es anloga a una tcnica de stripping o de
redisolucin, pero siendo el paso inicial de acumulacin de naturaleza no
electroqumica.

Desde el punto de vista prctico es conveniente separar la etapa de preconcentracin
(electrodo en contacto con la muestra) de la de medida (el electrodo en un medio ms
n e
- M(ox)
M(red)
A(red)
A(ox)
Electrodo modificado Solucin
48
apropiado), ya que de esta forma ambas etapas pueden estar optimizadas por separado
(pH, fuerza inica, agitacin, etc.) para una mejor determinacin, especialmente
eludiendo las posibles interferencias de la muestra.

Los requisitos que deben poseer las superficies modificadas para una buena
preconcentracin son una buena estabilidad qumica y mecnica del recubrimiento, una
inmovilizacin fuerte y estable de los modificadores, una elevada densidad superficial
de los sitios activos a la acumulacin para evitar la saturacin y que estos sitios sean
reversibles para una conveniente regeneracin superficial.

Para esta aplicacin se han diseado superficies modificadas, con materiales de
intercambio inico o ligandos formadores de complejos, soportados dentro de una fina
matriz polimrica hidrofbica o directamente enlazados sobre el electrodo. Se han
utilizado recubrimientos de polielectrolitos para la determinacin de metales en forma
inica o de complejos cargados, el polmero intercambiador Nafion para lantnidos, el
ligando 2,9-dimetil-1,10-fenantrolina para cobre, ligandos macrocclicos como teres
corona y criptandos para plomo y porfirinas para nquel. Tambin se han utilizado
materiales adsorbentes, como zeolitas, bentonitas o gel de slice, para la determinacin
de algunos compuestos farmacuticos, y electropolmeros (polipirrol) para productos
orgnicos.

3.1.3 Permeacin selectiva

Una intencin muy comn en la modificacin superficial de los electrodos estriba en
aplicarles un recubrimiento para prevenir el transporte hacia el electrodo de especies
interferentes electroqumicamente o que puedan pasivarlo o envenenarlo, sin restringir
demasiado el transporte del analito. Evidentemente, con estos recubrimientos se gana en
selectividad y en estabilidad de la seal.

Para ello podemos utilizar distintas estrategias, basadas en distintos mecanismos, para
discriminar el transporte hacia el electrodo de las especies en solucin. Existen distintos
tipos de recubrimientos que discriminan sustancias en base a sus dimensiones
moleculares, cargas o polaridad.

Se han empleado recubrimientos de acetato de celulosa para la exlusin de molculas
voluminosas, por ejemplo para minimizar el efecto de protenas en la determinacin de
perxido de hidrgeno. En este sentido, los recubrimientos por electropolimerizacin
permiten controlar el espesor de la capa, habindose reportado detecciones
amperomtricas selectivas por medio de electrodos modificados con polipirrol y
polianilina.

La discriminacin debida a las cargas de las distintas especies en la muestra se ha
utilizado tambin para mejorar la selectividad de la deteccin. As, los recubrimientos
de finas pelculas con grupos cargados presentan diferencias notables de permeabilidad
49
hacia especies inicas de signo contrario en comparacin con las especies del mismo
signo. Por ejemplo, se ha descrito una exclusin efectiva de interferencias aninicas
(cidos rico y ascrbico) por polmeros intercambiadores aninicos, como Nafion y
poliestersulfonatos.

La modificacin de los electrodos con capas hidrofbicas lipdicas o de protenas
permite la discriminacin de especies hidrofbicas con respecto a especies hidroflicas.
De esta forma se han podido detectar frmacos hidrofbicos . Mediante la formacin
espontnea sobre electrodos de oro de monocapas autoensambladas de n-alquiltioles
de propiedades hidrofbicas se pueden determinar noradrenalina y dopamina en
presencia de compuestos hidroflicos como el cido ascrbico.

La integracin de elementos de permeacin selectiva y de electrocatalisis en la
superficie de un electrodo puede ser muy interesante. Por ejemplo, se puede conseguir
simultneamente la proteccin de los centros electrocatalticos (p. ej., respecto a
tensioactivos) y la discriminacin de las especies a catalizar con respecto a su carga o
dimensiones.

3.2 Electrodo de oxgeno

El electrodo para medir oxgeno en solucin, debido a Clark (1956), es quiz el sensor
amperomtrico ms utilizado, y aun se encuentra actualmente en constante modificacin
y perfeccionamiento. El sensor se basa en un par de electrodos que estn en contacto
con un pequeo volumen de solucin de electrolito, estando separado este conjunto de
la muestra por medio de una fina membrana hidrofbica. Esta membrana permeable al
oxgeno, normalmente de Teflon, silicona o polietileno, evita que lleguen a la superficie
del electrodo indicador (ctodo) especies interferentes, ya sean electroactivas o
pasivantes. El ctodo puede ser de platino, oro o plata, segn los distintos diseos
comerciales, y el nodo, que a la vez acta de electrodo de referencia, es de
plata/cloruro de plata. El electrolito encapsulado consiste en una solucin
amortiguadora cido-base con cloruro potsico, que fija un valor de pH adecuado para
la deteccin de oxgeno, independiente del de la muestra, y el nivel de cloruro presente
mantiene constante el potencial del electrodo de referencia (ver Figura 26).

50
Figura 26. Secciones longitudinal y transversal idealizadas de un
electrodo de Clark, basado en una sonda amperomtrica de oxgeno
recubierta con una membrana permeable a gases, y esquema de su
funcionamiento voltamperomtrico.

El oxgeno disuelto en la muestra se difunde a travs de la membrana y se equilibra con
el electrolito. El potencial aplicado (0.6 V) produce la reduccin del oxgeno en el
ctodo con una corriente lmite de difusin proporcional a la concentracin del oxgeno
en el electrolito interno y, por tanto, a la presin parcial del oxigeno en la muestra.
Como todo sensor, presenta pequeas derivas de la seal, por lo que se debe calibrar
peridicamente. Usualmente por exposicin en soluciones de contenido conocido de
oxgeno, siendo el caso ms prctico en soluciones saturadas de aire asumiendo que el
20,93 % es oxgeno. Por ejemplo, la solubilidad a 25C produce una disolucin con un
contenido de 8.4 mg O
2
litro
-1
. Evidentemente, para que esta calibracin sea funcional
se necesita una correccin precisa de la temperatura.

3.3 Modificacin qumica de los electrodos

Entendemos por modificacin qumica la alteracin, normalmente de la superficie, de
un material para proporcionarle unas nuevas propiedades fsico-qumicas superficiales.
En caso de los electrodos modificados qumicamente, el proceso de modificacin ha de
ser capaz de inmovilizar el modificador, con la mnima prdida de su actividad fsico-
qumica, sobre el electrodo slido, tambin sin que las propiedades electroqumicas
transductoras de ste se resientan excesivamente.

51
Son muchas y de difcil clasificacin las estrategias de modificacin qumica, ya que,
como hemos visto en 3.1, diversos son los propsitos por los que se modifican los
electrodos, implicando una gran variedad materiales modificadores. En cambio, los
materiales modificados, los tipos de electrodos a modificar, son ms reducidos
(carbono, platino y oro).

Una posible clasificacin de los tipos de modificacin qumica podra ser atendiendo al
espesor de la capa o recubrimiento modificador.

Monocapas

Podemos obtener monocapas sobre oro adsorbiendo protenas, especialmente a travs de
los residuos de cistena, para obtener superficie hidrofbicas, o sobre carbono
adsorbiendo compuestos orgnicos o complejos metlicos con dobles enlaces, cadenas
largas hidrocarbonadas o con anillos aromticos (como algunos electrocatalizadores, por
ejemplo metilviolgeno, dimetilferroceno, complejos de rutenio, osmio o hierro,
complejos metlicos de bipiridilo, etc). La modificacin por adsorcin se consigue
mediante procedimientos muy simples, siendo sta su mayor ventaja, conjuntamente
con que alteran muy poco las propiedades tanto del modificador como del transductor.
Se consigue sumergiendo el electrodo en una disolucin diluida del modificador o
depositando unas gotas de sta sobre la superficie del electrodo, dejando que se evapore
el disolvente de forma controlada. Evidentemente, los procesos de adsorcin sufren de
una cierta irreversibilidad y las superficies modificadas por adsorcin tiende a perder
actividad con el uso, por desprendimiento del material adsorbido.

Un procedimiento ms elegante, pero tcnicamente ms complicado, es la
inmovilizacin covalente del modificador sobre la superficie sensora. En este caso el
procedimiento tiene normalmente dos estapas. La primera es la activacin o
funcionalizacin de la superficie del transductor. Por ejemplo, la oxidacin qumica o
electroqumica de grafito aumentar la densidad de grupos xido, hidroxilo, carboxilo o
anhdrido de cido en la superficie. En la segunda etapa se trata de enlazar
covalentemente el modificador sobre el transductor activado. Normalmente el
modificador se trata de un electrocatalizador, ya que nos interesa que est conectado
directamente con la superficie electroactiva. Este esquema implica que el modificador
contenga grupos funcionales distintos por donde poder enlazarse a los grupos rectivos
del transductor. El enlace de ambos grupos puede realizarse directamente en algunos
casos, pero en la mayora de veces se consigue normalmente con unos agentes
bifuncionales (silanos, carbodiimidas, cido cianrico, etc ).

En otros casos podemos confinar monocapas autoensambladas (de ingls, self-
assembled monolayer, SAM) sobre los electrodos. Por ejemplo, los electrodos de oro se
pueden modificar simplemente sumergiendo en una disolucin de un n-alquiltiol
determinado. De esta forma obtenemos una monocapa densa bien organizada con las
cadenas alqulicas perpendiculares a la superficie, ancladas a lla a travs del grupo tiol.
52
Con esta estrategia, por ejemplo, se han conseguido unas superficies selectivas hacia
compuestos hidrofbicos.

Bicapas autoensambladas, del tipo de las membranas bilipdicas (BLM, bilayer lipid
membrane), anlogas a las membranas naturales, se pueden construir fcilmente con la
tcnica de Langmuir-Blodgett. Una pelcula monocapa bidimensional de una molcula
tensioactiva (cabeza polar y cola lipoflica) se comprime en la superficie de una cubeta
con agua, con la ayuda de una esptula rasante. La monocapa organizada en la interfcie
agua/aire (cabeza en el agua y cola en el aire) se transfiere fcilmente a la superficie de
un electrodo slido. Mediante una inmersin y emersin cuidadosas se consigue una
monocapa; repitiendo el proceso se consigue una bicapa. Entre la primera y la segunda
inmersin, se puede proceder al atrapamiento entre capas de molculas electroactivas.
Eventualmente las molculas tensioactivas formadoras de las capas pueden estar
mezcladas con otras del mismo carcter pero funcionalizadas electroqumicamente.

Multicapas

Con este nombre nos referimos a recubrimientos superficiales de cierto espesor.
Normalmente se efectan con polmeros disueltos en un disolvente voltil, se aplica la
disolucin sobre la superficie (por deposicin, inmersin o rotacin [cast-, dip-, spin-
coating]). Tambin se pueden aplicar las capas polimricas sobre los electrodos a partir
de los monmeros y efectuar la polimeracin va distintas estrategias segn las
propiedades del monmero, por ejemplo a travs de polimerizacin trmica, qumica,
fotoqumica o electroqumica.
La modificacin multicapa, con los procedimientos acabados de comentar, es
normalmente fcil de preparar. Permite el control del espesor del recubrimiento, lo cual
se aprovecha para modular las caractersticas permselectivas del recubrimiento. Al ser
los materiales bsicos de tipo polimrico, la multicapa tiene una gran estabilidad fsica y
qumica la mayora de veces, siendo compatible con una gran variedad de
modificadores electroqumicos. Esto quiere decir que fcilmente los puede atrapar en su
seno, resultando un proceso general de inmovilizacin y, en particular, de modificacin
electrocataltica, tanto en base a materiales sintticos como biolgicos. Eventualmente,
los materiales polimricos utilizados pueden incorporar grupos funcionales que sean
electroactivos o que sirvan para poder enlazar o coordinarse con modificadores
electroactivos. La modificacin multicapa proporciona una zona confinada sobre el
electrodo, con una mayor densidad de sitios activos en comparacin con las monocapas,
lo que ocasiona una respuesta relativamente sensible.

Polmeros intercambiadores inicos. Estos conocidos materiales polimricos, con
grupos fijos cargados y grupos mviles intercambiables de carga opuesta, se han
utilizado para modificacin superficial de electrodos. Un tipo de polmeros de esta clase
son los ionmeros, unos polielectrolitos lineales, ms o menos ramificados, sin
entrecruzamiento tridimensional. Tienen en su forma aninica una elevada selectividad
de intercambio inico hacia cationes voluminosos hidrofbicos en comparacin a
53
cationes inorgnicos comunes. El Nafion es un inomero muy utilizado. Es un polmero
perfluorosulfonato del tipo:

[CF
3
(CF
2
)
n
]
2
=CFOCF
2
CF(CF
3
) O(CF
2
)
2
SO
3
-
Na
+
que tiene zonas hidrofbicas e hidroflicas en su estructura. Puede preconcentrar en su
seno, con cierta selectividad, cationes (voluminosos) electroactivos, para
posteriormente proceder a su determinacin voltamperomtrica (voltamperometra de
intercambio inico). Adicionalmente, al ser un material con grupos fijos aninicos
(SO
3

), funciona como un apantallador de especies interferentes con carga del mismo

signo. As, por ejemplo, a un pH determinado podemos determinar el neurotransmisor
dopamina en presencia de especies interferentes potenciales como el anin ascorbato.
Los ionmeros no son electroactivos de por s, pero los podemos tener con especies
mviles electrocatalizadoras o mediadoras redox, por ejemplo del tipo metilviolgeno,
dimetilferroceno, Ru(byp)
3
2+
[byp=2,2-bipiridilo] o Ru(NH
3
)
4
2+
, Fe(CN)
6
2+
. De todas
formas debemos tener presente que, aunque la especie redox retenida
electrostticamente en el sitio intercambiador sea electroactiva, sta se encuentra aislada
elctricamente del electrodo. Por lo tanto, la capacidad (contenido) en sitios redox de
estos materiales ha de ser elevadada. En este caso, la movilidad de la carga puede
producirse por difusin de los grupos mviles cargados o por conduccin redox; es
decir, los electrones saltan entre grupos redox vecinos.

Polmeros redox. Sn unos polmeros funcionalizados con grupos redox (grupos
coordinantes de metales de transicin [Ru, Os], porfirinas o ftalocianinas de hierro(II),
cobalto(II), etc.). Se han reportado uniones covalentes de estos y otros grupos redox
sobre poliestireno, celulosa, etc., preservndose ms o menos su actividad. Presentan
tambin el fenmeno de conduccin redox. La movilidad de la carga de los
recubrimientos de electrodos con polmeros redox puede modularse con el potencial
aplicado al electrodo. La conductividad es mxima en el potencial normal del grupo
redox, cuando los grupos en estado oxidado y en estado reducido se igualan. De todas
formas, la cintica de transferencia electrnica con los electrodos es bastante baja, en
comparacin con la reaccin en solucin

Polmeros conductores. La propiedad que fundamenta a este tipo de polmeros es la
presencia de doble enlaces conjugados a lo largo de su esqueleto polimrico. Cadenas
de carbonos unidos alternativamente por enlaces dobles y simples. No obstante, esta
conjugacin no es suficiente para que el material polimrico sea muy conductor. Por
esto, se dopa el material con portadores de carga en la forma de electrones (n) o de
huecos (p) adicionales. Cuando un hueco se llena con un electrn, que ha saltado de
una posicin adyacente, se crea un nuevo hueco, y as sucesivamente, permitiendo la
movilidad a largas distancias de las cargas.
Por el descubrimiento y desarrollo de estos materiales Heeger, MacDiarmid y
Shirakawa recibieron el premio Nobel en el 2000. Actualmente, estos plsticos
conductores se utilizan en muchos y variados campos, por ejemplo como inhibidores de
corrosin, en la fabricacin de condensadores compactos, de recubrimientos
antiestticos, en el blindaje electromagntico de los ordenadores, en vidrios inteligentes
54
que pueden variar el paso de la luz, etc. Una segunda generacin de estos materiales ha
encontrado aplicacin como transistores, diodos emisores de luz (LED) y lsers. Las
ventajas principales de los polmeros conductores son su bajo precio y que pueden ser
procesados fcilmente, por ejemplo en forma de pelcula.
El poliacetileno no es conductor, pero su oxidacin con vapores de cloro, bromo o yodo
hace que este material sea 10
9
veces ms conductor que el material original. El
poliacetileno dopado tiene una conductividad de 10
5
S m
-1
[10
-16
S m
-1
(Teflon), 10
8
S
m
-1
plata o cobre]. El poliacetileno se oxida con el oxgeno del aire y tambin es
sensible a la humedad. Polipirrol y politiofeno son estables al aire y tienen el valor
aadido que se pueden sintetizar directamente en la forma dopada. No obstante son un
poco menos conductores, pero suficiente para la mayora de aplicaciones prcticas.
En el campo de los sensores, estos materiales se preparan fcilmente in situ por
electropolimerizacin, a partir de la oxidacin del monmero (pirrol, tiofeno o anilina),
en modo galvanosttico, potenciosttico o en barridos voltamperomtricos cclicos
mltiples. Se obtienen as unas pelculas conductoras adheridas a la superficie del
electrodo, cuyas propiedades dependen del electrolito (dopante), solvente (puede ser
agua) y concentracin del monmero utilizados en la celda electroqumica y del
potencial o intensidad aplicados y de su duracin. Adicionalmente, las propiedades del
polmero pueden ser moduladas partiendo de monmeros modificados con grupos con
funciones especficas.
Estos polmeros (pP) han atrado la atencin debido la propiedad que poseen de pasar,
revertiendo el potencial aplicado, de una forma oxidada (conductora) a otra reducida
(aislante), a la vez que incorporan o expelen especies inicas (A
-
):

oxidacin
reduccin
pP
+
A
-
+ e pP + A
-
As, este cambio drstico y controlable en la conductividad elctrica y el rpido
intercambio del in dopante ofrece diversas aplicaciones electroanalticas. Por ejemplo,
la posible deteccin de especies no electroactivas o de gases. Los polmeros conductores
son materiales intercambiadores de iones, y la naturaleza del contrain dopante puede
modificar profundamente sus propiedades intercambiadoras (la selectividad) del
polmero. Este hecho ha sido aprovechado para desarrollar sensores potenciomtricos.
Los polmeros conductores han resultado tiles tambin en voltamperometras de
redisolucin, para la preconcentracin de metales en la superficie de los electrodos
modificados. Finalmente, como veremos ms adelante, estos polmeros pueden ser
utilizados como matrices para atrapar en su seno entidades biolgicas de
reconocimiento molecular.

Compsitos conductores

Una estrategia completamente distinta a la modificacin en superficie de los electrodos
es la modificacin en volumen. Este tipo de modificacin se consigue fcilmente con
los electrodos de pasta de carbono conocidos tambin por su acrnimo en ingls CPE
(carbon paste electrodes). Consisten en un material compsito formado por una mezcla
55
del modificador con grafito en polvo y un aglomerante (Nujol, aceite de parafina, aceite
de silicona, etc.), dando lugar a una pasta conductora. La pasta se introduce unos
milmetros en un cuerpo tubular hasta contactar internamente con un conductor metlico
por donde se efectuar la conexin exterior.
Este simple procedimiento de modificacin, debido a Adams (1969), encierra
varias ventajas desde el punto de vista del desarrollo de sensores, especialmente si lo
comparamos con algunos de los procedimientos complejos sealados ms arriba de
modificacin en superficie. Es un procedimiento que se lleva a cabo mediante
operaciones simples de va seca. Permite unas superficies electroactivas muy
reproducibles, ya que se tiene un control total de los componentes de la mezcla en
volumen y, por tanto, en superficie. El seno del material funciona como reservorio de
los componentes modificadores; cuando la superficie se desactiva con el uso o por otro
motivo, se puede renovar fcilmente con un simple pulido. Por contra, las pastas de
carbono poseen limitadas propiedades mecnicas que no las hacen muy idneas para
dispositivos comerciales. Adems no son compatibles con la mayora de solventes no
acuosos.
En este sentido, se han desarrollado compsitos rgidos conductores, anlogos a
las pastas blandas de carbono, pero sustituyendo el aglomerante lquido por un material
polimrico (resina epoxy, silicona, metacrilato, etc) que permite que, una vez efectuada
la mezcla, el compsito se endurezca en un tiempo de curado determinado. Estos
materiales rgidos conductores modificados en volumen poseen unas buenas
propiedades mecnicas (se pueden tornear, perforar, pulir, etc.; se pueden utilizar con
fluidos en movimiento) y qumicas (son compatibles con medios no acuosos). Adems,
ocluyen a los modificadores de forma muy estanca, preservndolos de su alteracin por
el ambiente, obtenindose una superficie activa al cabo de aos, en algunos casos, con
un simple pulido. Finalmente, los compsitos rgidos conductores, antes de curar,
modulando su fluidez, se pueden utilizar en la fabricacin de sensores por tecnologas
planares (thick-film technologies).
Los compsitos acabados de comentar son conocidos como compsitos
dispersos, por su forma de preparacin. Son menos utilizados en electroanlisis los
compsitos consolidados, obtenidos por compresin de la mezcla homognea de los
componentes electroactivos, generalmente con material polimrico (como Teflon) para
dar consistencia.
Los electrodos compsitos presentan intensidades de corriente
significativamente altas. Esto es debido a que su superficie es una dispersin aleatoria
de regiones conductoras y regiones aislantes, similar a un haz de microelectrodos. Por
tanto, cuando operan, mientras es despreciable la superposicin de las capas de difusin
entre los sitios conductores adyacentes, la seal es la suma de las intensidades de
corriente de cada sitio individual, intensificada por el efecto de microelectrodo.
Adems, proporcionan una corriente con una mejor relacin seal/rudo, en
comparacin con una superficie conductora continua, y son insensibles al caudal de los
flujos continuos cuando se usan en detectores de flujo. En definitiva, los electrodos
compsitos permiten trabajar con una seal con propiedades de microelectrodo con
instrumentacin convencional.

56
4 Biosensores electroqumicos

Los biosensores electroqumicos son electrodos modificados biolgicamente. Combinan
el poder analtico de los transductores electroqumicos, ya comentado en 1.1, y la
selectividad de los biorreceptores (ver Cuadros 6A y 6B).

4.1 Biosensores basados en enzimas

La transduccin electroqumica es muy indicada para el desarrollo de biosensores
enzimticos, como veremos ms adelante, ya que se acopla muy bien con dichos
biocatalizadores. La mejor integracin se consigue con transductores amperomtricos y
enzimas que catalizan reacciones redox. No nos debe de extraar, pues, que la mayora
de implementaciones comerciales actuales de dispositivos biosensores se basen en esta
forma de transduccin. El Cuadro 6A nos introduce a las propiedades generales de las
enzimas y la Tabla 12 nos resume las ventajas principales de la utilizacin de estos
materiales como elementos de reconocimiento molecular en el desarrollo de biosensores
y , en particular, de los de tipo electroqumico.

Tabla 12. Propiedades de las enzimas como elementos de
biorreconocimiento en el desarrollo de biosensores electroqumicos
Propiedades de las enzimas en los biosensores
Alta selectividad para un substrato (o familias de substratos)
Mecanismo de accin bien caracterizado
Mecanismo cataltico rpido y sensible, amplificador de la seal
Posibilidad de integracin a distintos modos de transduccin
Posibilidad de transduccin directa y continua
Disponibilidad de materiales enzimticos de distinta clase, origen, actividad
y estabilidad
Posibilidad de determinar grupos de sustancias mediante enzimas selectivas
a dichos grupos o mediante la inhibicin enzimtica que producen
determinados grupos sobre algunas enzimas
Procedimientos de inmovilizacin bien establecidos
Reutilizables
Precio moderado
Produccin masiva
57
4.1.1 Biosensores potenciomtricos

Este tipo de biosensor generalmente integra material enzimtico con electrodos
selectivos de iones o electrodos potenciomtricos de gases. Las enzimas utilizadas,
hidrolasas o de otro tipo, producen productos de reaccin idneos para ser detectados
con este tipo de electrodos; es decir, H
+
, NH
4
+
, NH
3
, CO
2
, CN
-
, etc.

La Figura 27, ilustra el mecanismo de respuesta de un biosensor de esta clase. A causa
de la cintica enzimtica sobre la respuesta termodinmica del electrodo interno
potenciomtrico, la sensibilidad de estos dispositivos no sigue la ley de Nernst. Adems,
hay que tener en cuenta la capacidad amortiguadora del medio de trabajo, que compite
con el equilibrio cido-base del producto detectado y que tambin modula la actividad
enzimtica, interviniendo ambos aspectos en el intervalo de respuesta. Normalmente las
curvas de calibrado tienen una forma sigmoidal.

Como todos los biosensores electroqumicos, los biosensores potenciomtricos son de
coste moderado. Adems, hay que tener en cuenta que el aparato de medida (pH/mV
metro) est presente en todos los laboratorios. Con respecto a los biosensores
amperomtricos, que se comentarn a continuacin, los de tipo potenciomtrico
presentan un perfil muy bajo de interferencias, gracias a la selectividad del sensor
interno. El inconveniente que presentan, fcilmente deducible de la observacin de la
Figura 27, es su dilatado tiempo de respuesta, de varios minutos.

Figura 27. Mecanismo de respuesta idealizado de un biosensor enzimtico
basado en un electrodo potenciomtrico de gases. 1) El substrato (S) es
transportado (por conveccin) a la superfcie sensora. 2) S difunde a travs
de la membrana permselectiva hacia la membrana enzimtica (la enzima est
retenida por una membrana permselectiva.3) S reacciona con un sitio activo
de la enzima. 4) Parte del producto (P) de la reaccin, que es gaseoso,
difunde hacia la membrana selectiva de iones, a travs de la membrana
permeable a gases 5) P genera un potencial de membrana, y 6) P difunde a la
solucin a travs de la membrana permselectiva. La respuesta de potencial es
estacionaria, en la prctica controlada por la difusin de S, y depende
pseudonernstianamente de la concentracin de S en la solucin
58
La Tabla 13 nos muestra distintas configuraciones de biosensores
potenciomtricos. Cabe destacar que en algunos casos, dependiendo del tipo de reaccin
catalizada, existen distintas alternativas de sensores potenciomtricos internos. Este es
el caso del biosensor de urea, cuya reaccin en la membrana sensora es:

CO(NH
2
)
2
+ 2 H
2
O + H
+
HCO
3
-
+ 2 NH
4
+
conllevando la aparicin de especies CO
2
/HCO
3
-
y NH
3
/ NH
4
+
, y cambios de pH, que
pueden ser detectados por diferentes tipos de electrodos selectivos de iones. Un caso
similar son los biosensores de aminocidos que se pueden implementar en base a
sensores potenciomtricos de pH, NH
3
o NH
4
+
. Cuando se utilizan enzimas de
selectividad reducida, como la L-aminocido oxidasa o D-aminocido oxidasa, entonces
el biosensor detecta aminocidos levgiros o dextrgiros segn la variante utilizada.

Tabla 13. Ejemplos de biosensores potenciomtricos para diferentes tipos de
substratos. El correspondiente biosensor integra una enzima que cataliza la
descomposicin del substrato produciendo un producto que activa el sensor
potenciomtrico interno (ESI)
Biosensores potenciomtricos
Substrato Enzima ESI
Urea
L-Fenilalanina
Glutamina
Creatinina
Adenosina
Aspartamo
Ureasa
Fenilalanina amonaco liasa
Glutaminasa
Creatina iminohidrolasa
Adenosina desaminasa
L-aspartasa
NH3
NH4
+
Urea
Oxalato
Tirosina
Ureasa
Oxalato descarboxilasa
L-Tirosina descarboxilasa
CO2
Urea
Glucosa
Penicilina
Acetilcolina
Ureasa
Glucosa oxidasa
Penicilinasa
Acetilcolinesterasa
pH
Amigdalina |-glucosidasa CN
-
Como veremos en el apartado siguiente, algunas enzimas catalizan reacciones
redox, como las oxidasas, que transfieren dos hidrgenos desde el substrato al oxgeno
molecular, produciendo perxido de hidrgeno, y como las peroxidasas que catalizan la
oxidacin de un substrato por el perxido de hidrgeno. As pues, inmovilizando
conjuntamente ambos tipos de enzimas en un electrodo selectivo de ioduro podemos
determinar cualquier substrato de una oxidasa en un medio con presencia de ioduro. Por
ejemplo, la deteccin de L-fenilalanina seguira el siguiente esquema bienzimtico:
59

L-fenilalanina H
2
O
2
L-aminocido oxidasa
peroxidasa
H
2
O
2
+ 2 H
+
+ 2 I
-
I
2
+ 2 H
2
O
Con un esquema anlogo, podramos preparar un biosensor de glucosa, inmovilizando
conjuntamente glucosa oxidasa y peroxidasa. De todas formas, este tipo de estrategias
que implican aadir un reactivo (en este caso un nivel constante de ioduro en el medio,
para que el electrodo de ioduro detecte la disminucin de este anin provocada por la
presencia de la fenilalanina) se van abandonando, ya que la tendencia actual es la total
inmovilizacin de los sistemas de reconocimiento sobre los transductores, lo que se
conoce como sensores sin reactivos (en ingls, reagentless sensors).

BioFET. Los transistores de efecto de campo sensibles a iones (ISFET) (ver 2.3.8), en
su variante de sensores de pH, han encontrado aplicacin en el desarrollo de biosensores
enzimticos, en configuraciones anlogas a las comentadas anteriormente para los
biosensores enzimticos basados en electrodos selectivos de iones (ver Tabla 13). La
literatura muestra varios ejemplos de EnFET (FET modificado con enzimas), la
mayora modificados con penicilinasa, ureasa y glucosa oxidasa, para la determinacin
de los respectivos substratos a partir de los cambios de pH experimentados en la parte
sensible del transductor modificada biolgicamente. Las distintas versiones de cada uno
de ellos son debidas principalmente al mtodo de inmovilizacin de la enzima utilizado.

4.1.2 Biosensores amperomtricos

Estos dispositivos sensores combinan la selectividad de los distintos tipos de enzimas
como materiales de reconocimiento molecular (ver Cuadro 6A) con la simplicidad de
los transductores amperomtricos, constitudos por materiales conductores como
grafito, platino, oro, etc, modificados qumicamente o no.
El mecanismo de reconocimiento es cataltico. La Figura 28 muestra un posible
mecanismo de respuesta para un biosensor enzimtico amperomtrico . En este tipo de
dispositivos la seal transducida (intensidad de corriente) estar limitada por tres tipos
principales de procesos: a) la difusin del substrato desde el seno de la solucin, b) la
difusin del substrato dentro de la membrana enzimtica y c) la cintica de la reaccin
enzimtica

60
Figura 28. Mecanismo de respuesta esquematizado de un biosensor
enzimtico amperomtrico. 1) El substrato (S) es transportado (por
conveccin) a la superfcie sensora. 2) S difunde a travs de la membrana
enzimtica .3) S reacciona con un sitio activo de la enzima. 4) Parte del
producto electroactivo (P) de la reaccin difunde hacia la superficie
transductora amperomtrica, que tiene impuesto un potencial determinado.
5) P es transformado electroqumicamente en P
ox
. 6) P
ox
difunde a la
solucin a travs de la membrana enzimtica. La respuesta de intensidad de
corriente es estacionaria, en la prctica controlada por la difusin de S o por
la actividad de la enzima, dependiendo de distinta forma de la concentracin
de S en la solucin.

De la observacin de la Figura 28, para el mecanismo descrito, se deduce que la
respuesta es una transduccin directa de la velocidad de reaccin enzimtica aunque
presupone necesariamente un producto electroactivo. Adems, dicha respuesta estar
controlada, segn el caso, por la difusin del substrato (S) o por la cintica de la
catlisis enzimtica. Empricamente, utilizando enzimas de poca actividad, el biosensor
se encuentra bajo un control cintico, siguiendo la seal la ecuacin de Michaelis-
Menten (Cuadro 6A), y, por tanto, el rango de respuesta til queda limitado a [S] < K
M
.
Si utilizamos enzimas de gran actividad, la respuesta estar bajo control difusional, aun
a concentraciones de S del orden de K
M
. Debemos de tener en cuenta que, en la
prctica, la propia membrana enzimtica es una barrera difusional, de espesor constante,
que nos impondr un control difusional aun a altas concentraciones de S. En estas
condiciones, la respuesta lineal del biosensor se extender a [S] > K
M
. Tanto ms
amplio ser el rango de respuesta cuanto ms espesor tenga la membrana, pero , en
contra, la sensibilidad disminuir y el tiempo de respuesta se alargar.
Las enzimas conocidas como oxidorreductasas catalizan reacciones de oxidacin
o reduccin transfiriendo hidrgenos o electrones. Son el candidato ideal para acoplar
biocatalizadores con transductores amperomtricos. Han encontrado aplicacin en el
desarrollo de biosensores los siguientes tipos de enzimas redox : oxidasas,
deshidrogenasas, peroxidasas y oxigenasas. A continuacin comentaremos las
principales configuraciones desarrolladas de biosensores amperomtricos basados en
cada uno de estos tipos de enzimas.

61
Oxidasas

Estas enzimas catalizan la transferencia de hidrgeno desde el substrato hacia el
oxgeno molecular. Contienen un grupo prosttico fuertemente enlazado al apoenzima,
derivado de la flavina, constituido por el mononucletido de flavina (FMN) o por el
dinucledido de flavina y adenina (FAD), que son los grupos que confiere propiedades
redox al centro activo de las diferentes enzimas de esta clase. Catalizan reacciones del
siguiente tipo, segn la capacidad de la enzima de transferir cuatro o dos electrones al
oxgeno molecular:

S + O
2
P + H
2
O
S + O
2
P + H
2
O
2
Es prctico visualizar la catalisis de una oxidasa de la siguiente forma:

En la que vemos el papel biocataltico del grupo prosttico FAD, que oxida S, y cuya
forma reducida (FADH
2
) es reoxidada a su forma nativa por el oxgeno presente, que
hace el papel de aceptor (colector) natural de electrones, transformndose en H
2
O
2
o
H
2
O. Por lo tanto, estos sistemas enzimticos son dependientes del oxgeno, que es un
cosubstrato esencial en los sistemas biolgicos naturales donde actan estas enzimas.

Transduccin de O
2
o H
2
O
2
. Precisamente, el primer biosensor histrico (Clark y Lyons,
1953), el electrodo enzimtico de glucosa se bas en la glucosa oxidasa (GOD),
siguiendo la siguiente reaccin:

Glucosa + O
2
cido glucnico
+
H
2
O
2
GOD
Estos investigadores montaron sobre la membrana permeable a gases de un electrodo
amperomtrico de oxgeno (ver 3.2) una pelcula de disolucin amortiguada de GOD,
retenida por una membrana de dilisis. Cuando el biosensor se introduce en una
muestra, el substrato y el cosubstrato (glucosa y oxgeno en exceso) atraviesan la
primera membrana permselectiva y reaccionan con la enzima. Solamente el oxigeno no
consumido atravesar la membrana permeable a gases y ser medido por el electrodo.
Por lo tanto, la seal catdica transducida ser indirectamente proporcional a la
concentracin de glucosa en la solucin, para concentraciones por debajo de K
M
y en un
exceso de oxgeno. Este biosensor tiene el inconveniente que la respuesta est limitada
por el oxgeno presente en la muestra, especialmente grave cuando se encuentra a una
concentracin por debajo de la de substrato. Adems este biosensor no es muy sensible
y tiene unos tiempos de respuesta dilatados. Ahora bien presenta muy pocas
H
2
O
2
o H
2
O
O
2
FAD

FADH
2
S
P
Oxidasa
62
interferencias. Con todo versiones ms modernizadas de estos biosensores se
comercializan actualmente especialmente para aplicaciones biotecnolgicas.

Por otro lado, un biosensor de glucosa tambin puede operar en modo andico,
inmovilizando la enzima GOD sobre un transductor de grafito o platino, y aplicando el
potencial adecuado para detectar H
2
O
2
. En este caso, la seal ser directamente
proporcional a la concentracin de glucosa en el seno de la solucin. De todas formas la
deteccin andica de perxido, aunque es ms sensible que la deteccin catdica de
oxgeno con el electrodo de Clark, presenta varios inconvenientes analticos. La
reaccin electroqumica depende del pH

H
2
O
2
O
2
+ 2 H
+
+ 2 e
-
y, adems, el potencial a aplicar es muy extremo; entre 0.6 y 0.7 V (vs.Ag/AgCl, a pH
7.0) si utilizamos electrodos metlicos y ms superiores aun si utilizamos electrodos de
carbono. Este hecho, hace que este modo de operacin no sea adecuado para muestras
biolgicas, ya que el electrodo, a dichos sobrepotenciales, tambin detectara otras
sustancias oxidables presentes en la muestra (ascorbato, urato y paracetamol, por
ejemplo). Esta inconveniencia ha sido parcialmente paliada, en multitud de diseos, en
base a membranas permselectivas en contra de las especies interferentes

Mediacin electrnica. Una forma de eludir los problemas acabados de citar, ligados a
la dependencia de las oxidasas al cosubstrato natural O
2
, es sustituir a ste en su accin
regeneradora de la enzima por un mediador artificial. Los mediadores son pares redox
de bajo peso molecular que transportan electrones desde el centro redox de la enzima a
la superficie del transductor. Durante el ciclo cataltico, la forma oxidada del mediador
primero reacciona con la forma reducida de la enzima y despus difunde hacia el
electrodo indicador donde es rpidamente reoxidado. Dicha estrategia, basada en un
mecanismo de difusin del mediador se puede esquematizar de la siguiente forma:

en donde el mediador (M) y la enzima oxidasa modifican la superficie de un transductor
amperomtrico. De la observacin del esquema anterior, se puede deducir que para que
este sistema bioelectrocataltico propuesto tenga propiedades biosensoras es necesario
que el mediador posea las siguientes propiedades: a) Que reaccione rpidamente con la
enzima. b) Que posea una transferencia heterognea de electrones reversible (rpida).c)
Que necesite un bajo sobrepotencial para ser regenerado en el electrodo, para reducir el
efecto de las interferencias. e)Que sea independiente del pH, f) Que sea estable tanto en
su forme oxidada como reducida. g) Que no reaccione con el oxgeno, y h) Que no sea
txico.
n e
-
M(red)

M(ox)
FAD

FADH
2
S
P
Oxidasa
63
El mediador 1,1-dimetilferroceno adsorbido sobre carbono y posteriormente la
enzima GOD inmovilizada covalentemente es una configuracin, insensible al oxgeno,
que opera a 165 mV vs. SCE, y que ha sido comercializada con xito como biosensor de
glucosa en sangre entera para autocontrol de pacientes diabticos. Han sido preparados
derivados del ferroceno funcionalizados con pirrol monomrico, con el que se pueden
preparar sobre un transductor capas electropolimerizadas, que ocluyen GOD, y que
actuan de mediadoras electrnicas. El tetratiafulvaleno (TTF) es otro mediador que
compara favorablemente con el ferroceno.
Recientemente, han sido propuestos unos cables redox (redox wires), por
ejemplo, el complejo de poly-4-vinilpiridina y [Os(bpy)
2
Cl
2
], que sirven para mediar
entre los centros redox de la enzima y el transductor mediante un mecanismo de salto
de electrones.

CH
3
CH
3
Fe
2+
S
S
S
S
(a) (b)

Figura 29. Ejemplos de mediadores electrnicos artificiales: 1,1-
dimetilferroceno (a) y tetratiafulvaleno (b).

Transferencia electrnica directa. El centro redox de una enzima esta rodeado de una
cubierta de protena, que dificulta la transferencia electrnica directa hacia o desde el
electrodo. Normalmente no es posible, o es lenta e irreversible, ya que la velocidad de
transferencia electrnica entre molculas y electrodos decrece exponencialmente con la
distancia, y adems las protenas tienden a desnaturalizarse por las zonas de contacto
con una superficie Pero se puede conseguir una transferencia directa si la
macromolcula enzimtica se orienta adecuadamente sobre el electrodo. Uno de los
primeros ejemplos de transferencia directa reportados se basa en la adsorcin conjunta
de citocromo c y el promotor 4,4-bipiridil sobre un electrodo de oro. Los anillos de
piridina del promotor adsorbido reconocen los grupos de lisina del borde del grupo
hemo de la protena, orientando a sta para una rpida transferencia de carga.
Las sales orgnicas conductoras (metales orgnicos) son unos buenos materiales
electrdicos que permiten la transferencia directa. Estos materiales son complejos
estables de transferencia de carga, formados por la transferencia parcial de un electrn
entre una molecula dadora y otra aceptora. Ambas molculas orgnicas son planas, con
sistemas de electrones t, y se disponen en forma de capas segregada dadoras y
aceptoras, alternadamente. Las sales orgnicas conductoras presentan unos bajos
potenciales operacionales, con una buena cintica de transferencia electrnica, una
respuesta rpida y una buena estabilidad. Estos materiales conductores son atractivos,
no slo desde el punto de vista electroqumico, sino por su fcil preparacin.
Han sido reportados biosensores de glucosa basados en una mezcla de glucosa
oxidasa y una sal conductora en polvo, comprimida en forma de disco para ser adaptado
a un electrodo. Las sales ms utilizadas para GOD y otras oxidasas (xantina oxidasa
,colina oxidasa, etc.) son del tipo NMP
+
TCNQ
-
o TTF
+
TCNQ
-
.
64
CN
NC
NC
CN
S
S
S
S
N
N
CH
3
(a) (b) (c)

Figura 30. Ejemplos de molculas dadoras, tetratiafulvaleno (a) y N-
metilfenacinio (b) y aceptoras, tetracianoquinodimetano (c) utilizadas en la
preparacin de sales orgnicas conductoras.
La Tabla 14 recoge algunos ejemplos de biosensores amperomtricos que utilizan
oxidasas.
Tabla 14. Ejemplos de biosensores amperomtricos basados en enzimas.
Biosensores amperomtricos enzimticos
Substrato Enzima Transduccin Observaciones
Glucosa GOD
GOD/HRP
O2
H2O2
[Fe(CN)6]
3-

Ferroceno
TTF,TCNQ
ferroceno
Analytical Instruments (Japn)
Yellow Springs (USA)
ZWG(Alemania)
Hofmann-LaRoche (Suiza)
Exactech (USA)
Perxidos orgnicos HRP o-fenilendiamina Alimentacin
Aminocidos D-AOx
L-AOx
H2O2
H2O2
Selectividad enantiomrica
Lactosa |-Gal/GOD Leche
Glutamato GlOD Biofermentadores
Lactato LDH
Citocromo b2
LOD
NADH
[Fe(CN)6]
3-
H2O2
Vinos, leche, medicina deportiva
ZWG (Alemania)
Fructosa FDH NADH Miel, zumos
Malato MDH NADH Vinos
Alcohol ADH, NADH
AOD
Azul de Meldola
NMP,TCNQ
H2O2
Vinos
Yellow Springs (USA)
Metano MMO NADH
NADH Diaforasa [Fe(CN)6]
3-

Hipoxantina XOD/HRP Ferroceno Calidad del pescado
Bilirrubina BOD/HRP Fe(CN)6]
3-

Acetiltiocolina AChE Producto de la
reaccin
Determinacin de pesticidas por
inhibicin enzimtica
Fenoles Laccasa
Tirosinasa
Polifenol
oxidasa
Producto de la
reaccin
Control ambiental
Colesterol COD
COD/HRP
H2O2
ferroceno
Colesterolemia
Acido rico Uricasa H2O2 Uriquemia
Nitrato Nitrato
reductasa
Metil violgeno Control ambiental
Nitrito Nitrito
reductasa
Metil violgeno Control ambiental
Sulfito Sulfito oxidasa H2O2 Pasta de papel
65

Deshidrogenasas

Estas enzimas catalizan la transferencia de hidrgeno desde el substrato S hacia un
aceptor redox A (que no es oxgeno molecular) o viceversa. Catalizan reacciones del
siguiente tipo:

S + A P + AH

Un grupo de unas 250 deshidrogenasas requieren de la misma coenzima NAD
+
(dinucletido de nicotinamida y adenina) o NAD(P)
+
(con un fosfato adicional) para
funcionar catalticamente. As pues, a causa de la importancia de este cofactor redox, su
electroqumica ha atrado una atencin muy considerable para poderla implementar en
un electrodo para poder detectar substratos segn el siguiente esquema:

El NAD
+
no se encuentra unido a la estructura proteica de la respectiva deshidrogenasa,
es una especie soluble que se manipula analticamente como un reactivo adicional.
Este cofactor es caro y no muy estable, y difcil de inmovilizar en un electrodo, para
conseguir un biosensor sin reactivos. La oxidacin del NADH es la va utilizada para
el diseo de estos biosensores. Desafortunadamente el comportamiento del par
NAD
+
/NADH es ms bien irreversible en el electrodo. Se puede llevar a cabo la
oxidacin con electrodos no modificados, pero a un elevado sobrepotencial, y adems
dando un producto que se adsorbe y pasiva el electrodo, degradando la respuesta. En
efecto, los primeros biosensores de lactato, basados en lactato deshidrogenasa (LDH)
coinmovilizada con NAD
+
sobre carbono vitrificado, permitan detectar el substrato a
0.75 V vs. Ag/AgCl (muy por encima del potencial redox del cofactor: 0.32 V) ,
segn la siguiente reaccin:

CH
3
CHOHCOO
-
+ NAD
+
CH
3
COCOO
-
+ NADH + H
+
LDH

pero la estabilidad del dispositivo era muy reducida.

La estrategia que se ha seguido, en general, para superar estas dificultades y mejorar la
transferencia electrnica es la modificacin del electrodo, para operar a potenciales ms
convenientes. Se han utilizado modificadores electrocatalticos como
hexacianoferrato(III), hidroquinona, catecoles, etc. Los mejores resultados se obtienen
con mediadores que funcionen tambin como aceptores de protones. Un mecanismo de
funcionamiento distinto tiene el azul de Meldola (7-dimetilamino-1,2-benzofenoxazina).
S
P
NAD
+
Deshidrogenasa
NADH + H
+
n e-
66
Este colorante, que se adsorbe bien sobre grafito, reduce el sobrepotencial de la
transferencia electrnica (0.0 mV vs. SCE), a travs de un complejo de transferencia de
carga entre el cofactor y el modificador, que permite la mediacin electrnica por
transferencia intermolecular (saltos de electrones). El problema encontrado en todos
estos sistemas es su pobre estabilidad, debida a la prdida de mediador adsorbido en la
superficie del electrodo.

Las sales orgnicas conductoras han resultado particularmente tiles para la reoxidacin
del NADH (a -0.2 V vs. Ag/AgCl) y han permitido desarrollar biosensores basados en
un gran nmero de deshidrogenasas ( para glucosa, alcohol, colesterol, etc)

Como que este tipo de catlisis es reversible se puede utilizar el esquema anterior en
direccin contraria para detectar piruvato a pH < 7, a partir de la reduccin de NAD
+
en
el electrodo. Aunque la reduccin de NAD
+
en el electrodo ocurre fcilmente, no se
recicla el NADH sino que pasa por una especie dimrica que se adsorbe. Por otro lado,
los mediadores que se utilizan para rebajar el potencial de oxidacin del NADH, como
los acabados de comentar, no funcionan muy bien en la direccin reversa de reduccin
del NAD
+
.
Finalmente, una estrategia que permite controlar reversiblemente las propiedades
electroqumicas del NAD
+
es mediante una regeneracin enzimtica mediada. Se
emplea una enzima (diaforasa) capaz de reducir el cofactor, mientras que el mediador
(metil violgeno) transferir los electrones al electrodo a un bajo potencial aplicado (-
0.45 V):

El esquema anterior tambin podra funcionar en sentido contrario, para medir
substratos tipo P a partir de la corriente catdica obtenida disminuyendo adecuadamente
el valor del potencial aplicado.

Adems del grupo de deshidrogenasas acabadas de comentar que funcionan con el
cofactor lbil NAD
+
,
existen las deshidrogenasas que contienen el grupo prosttico
PQQ (2,7,9-tricarboxi-1H-pirrolo[2,3]quinolin-4,5-diona o pirroloquinolinquinona)
fuertemente unido al apoenzima.. Forman la clase de enzimas conocidas como
quinoprotenas. Este tipo de deshidrogenas, en principio, nos facilitan las
configuraciones de biosensores reagentless, ya que nos simplifican su diseo porque no
precisan de la inmovilizacin adicional del cofactor, por tenerlo ya incorporado. La
glucosa deshidrogenasaPPQ cataliza la oxidacin de la glucosa en presencia de
aceptores de electrones como NMP
+
o ferrocinio, pero no funciona en presencia de O
2
.
O sea , esta enzima nos permite preparar biosensores de glucosa independientes del
(red)

Diaforasa
(ox)
S
P
n e
-
(ox)

violgeno
NAD
+
NADH + H
+
67
oxgeno que pueda contener las muestras. La Tabla 14 tambin recoge algunos ejemplos
de biosensores amperomtricos basados en deshidrogenasas.

Peroxidasas

Estas enzimas catalizan la oxidacin de un substrato por el perxido de hidrgeno,
siguiendo reacciones simbolizadas por

S + H
2
O
2
P + H
2
O
En la reaccin con el cosubstrato perxido de hidrgeno, la forma nativa de la enzima se
oxida en una etapa en que intervienen dos electrones (compuesto I). La regeneracin a
la forma nativa se lleva a cabo mediante dos etapas de reduccin de un electrn cada
una, pasando por un intermediario (compuesto II). El inters analtico de este sistema
enzimtico es para la determinacin de perxido de hidrgeno (y de algunos perxidos
orgnicos). Para ello se utilizan como substratos dadores de electrones con propiedades
electroqumicas reversibles, tales como hexacianoferrato(II), ferroceno, aminas
aromticas, compuestos fenlicos, ascorbato, yoduro, etc., haciendo el papel de
mediadores electrnicos entre la enzima y el electrodo, segn el esquema siguiente:

Tambin ha sido descrita la transferencia directa de electrones entre la enzima y el
electrodo, a potenciales inferiores a 0.6 V vs. SCE. La corriente medida es debida a la
reduccin directa bioelectrocataltica de los compuestos I y II. Dicha reaccin
electrdica, no obstante es ms bien lenta en la mayora de materiales electrdicos. Por
esta razn, aparte de utilizar los mediadores ya comentados, tambin se han ensayado
electrodos modificados con polmeros conductores, tanto redox como electrnicos, para
facilitar la transferencia electrnica.

Hemos visto que el perxido de hidrgeno es un producto de las reacciones enzimticas
catalizadas por las oxidasas. Por lo tanto, si coinmovilizamos una oxidasa y una
peroxidasa podremos detectar el substrato de la oxidasa utilizando los sistema de
deteccin de perxido comentados anteriormente As, por ejemplo, la glucosa se puede
determinar a potenciales mucho ms bajos que los de oxidacin de H
2
O
2
, a partir de la
reduccin catdica del cosubstrato mediador de la peroxidasa coinmovilizada con la
glucosa oxidasa sobre grafito, segn las siguientes ecuaciones:

S(red)

P(ox)
I
Peroxidasa II

0
H
2
O
2
H
2
O
n e
-
68
Glucosa + O
2
cido glucnico + H
2
O
2
H
2
O
2
+ M(red) H
2
O + M(ox)
M(ox) + ne M(red)

La Tabla 14 tambin muestra algunos ejemplos de biosensores amperomtricos basados
en peroxidasas.

4.2 Biosensores electroqumicos basados en clulas

Los biosensores enzimticos acabados de comentar en la seccin anterior utilizan
enzimas purificadas, separadas de diferentes tipos de materiales biolgicos
(microorganismos y tejidos de plantas y animales). Aunque las enzimas puras presentan
un mayor grado de selectividad que los preparados enzimticos crudos, ya que estos
contienen generalmente varios materiales bocatalticos, hay que tener en cuenta que las
enzimas conservan toda una serie de propiedades cuando se encuentran en su medio
celular, optimizado de una forma natural. Este hecho hace que, a causa de las
propiedades potenciales de los materiales celulares (ver Cuadro 6A y Tabla 15) y de su
facilidad de integracin con los transductores electroqumicos, se haya explorado
intensamente el desarrollo de biosensores basados en clulas enteras.

Los biosensores basados en microorganismos (bacterias y levaduras) se construyen
fcilmente. Se aplica sobre el transductor electroqumico una biocapa ( pat de clulas)
preparada por filtracin de un volumen determinado de un medio de cultivo en donde se
ha efectuado el crecimiento de las clulas, inmovilizndola fsicamente a travs de una
membrana semipermeable. De forma anloga podemos retener sobre el transductor
finos cortes (0.2-0.5 mm de espesor) de tejidos animales, de hongos, pulpa de frutos,
triturados de tallos y estructuras intactas de plantas (ptalos, hojas, etc).

Aunque hay algn material celular con actividad enzimtica muy selectiva en
conjuncin con el transductor adecuado (por ejemplo, clulas de mucosa de intestino
pequeo de ratn para la adenosina, Bacillus subtilis para o-amilasa, Methylomonas
flagellata para metano ) no es la situacin habitual. Uno de los problemas de estos
biosensores es su escasa selectividad, pero esta limitacin se puede solventar en algunos
casos fijando muy bien las condiciones operacionales. De todas formas, la investigacin
en este campo dispone de diferentes y variadas herramientas citolgicas,
microbiolgicas y electroqumicas que dotan de selectividad (y sensibilidad) a las
medidas efectuadas con estos dispositivos. A modo de ejemplo citaremos: uso de cepas
manipuladas genticamente, permeabilizacin de las membranas celulares y prevencin
del transporte de interferentes a travs de ellas, induccin de sntesis enzimtica en
clulas microbianas, inhibicin enzimtica de rutas metablicas interferentes, regulacin
del medio de trabajo, uso de membranas para prevenir de interferencias el transductor o
69
el material celular, uso de mediadores redox cuando intervienen sistemas biocatalticos
de este tipo y, finalmente, siempre es necesario realizar una seleccin racional del
transductor.

Tabla 15. Propiedades de los materiales celulares, en comparacin con las
enzimas aisladas, como elementos de biorreconocimiento en el desarrollo de
biosensores electroqumicos.
Propiedades de los materiales celulares en los biosensores
Los microorganismos y los tejidos de plantas y animales son una fuente muy
accesible de enzimas no alteradas
La rutas enzimticas inherentes a las clulas son de difcil reproduccin al exterior
de ellas
Las reacciones enzimticas ya estn optimizadas en el interior de las clulas
Cofactores, activadores, etc., necesarios para la reaccin enzimtica se encuentran
ya en el interior de las clulas
La estabilidad enzimtica frente a cambios del medio es mayor que en las
enzimas purificadas
Bajo coste, ya que no necesitan de procesos purificacin ni de aditivos (cofactores,
estabilizadores, etc.). El cultivo de clulas microbianas y la preparacin de cortes
finos de tejidos es fcil y barato.
Permiten la deteccin de efectos de una sustancia o grupos de sustancias sobre
un paso metablico determinado o sobre el metabolismo global de la clula
Buena integracin con los sistemas electroqumicos
Posibilidad de transduccin directa y continua, y de otros principios de medida a
partir de la actividad respiratoria de la clulas vivas.
Inmovilizacin ms simple que la que precisan las enzimas aisladas
Tiempo de vida largo, especialmente el material celular, ya que es regenerable
Tiempo de respuesta largo, a causa de la resistencia a la difusin de las
membranas celulares
Menor selectividad que las enzimas aisladas
Se han desarrollado dos clases principales de biosensores basados en clulas, si
atendemos a su diferente principio de funcionamiento. A continuacin se comentan
brevemente.

Deteccin de un producto de la reaccin enzimtica. El elemento transductor del
biosensor detecta una sustancia que proviene del substrato transformado dentro de la
clula. El producto medido puede ser amonaco, dixido de carbono, iones hidrgeno,
perxido de hidrgeno, sulfuro de hidrgeno, etc. (ver Tabla 16). Estos productos
pueden provenir de uno o varios pasos enzimticos. En la mayora de casos se detectan
con los correspondientes electrodos selectivos de iones. En el caso de reacciones
enzimticas redox tambin se pueden hacer la deteccin a travs de mediadores
electrnicos (iones ferrocinio, hexacianoferrato(II), etc.)

Cambios en la respiracin microbiana. Cuando las clulas no convierten el substrato en
un producto adecuado para su deteccin selectiva con un transductor, los
70
microorganismos se pueden inmovilizar directamente sobre la membrana permeable a
gases de un electrodo de oxgeno (3.2). El electrodo registra la actividad respiratoria de
las clulas vivas como una disminucin de la concentracin de oxgeno cerca del
transductor. Este tipo de electrodo, llamado electrodo respiromtrico, ha sido aplicado a
la determinacin de glucosa y otros azcares, etanol, metanol, acido actico y otros
compuestos (ver Tabla 16). Ya que el consumo de oxgeno va asociado a la produccin
de dixido de carbono, tambin puede ser utilizado un sensor potenciomtrico de CO
2
como transductor.

La deteccin de O
2
o CO
2
puede estar relacionada con la asimilacin de varios
substratos; por esta razn, este principio de medida se ha utilizado en la estimacin de la
contaminacin de las aguas por sustancias orgnicas, expresada en forma del conocido
parmetro demanda biolgica de oxgeno (DBO).

Tabla 16. Ejemplos de biosensores electroqumicos basados en clulas.
Biosensores basados en clulas
Substrato Tipo de clula Transduccin
cido actico
Adenosina
Aminoglicsidos
DBO
Catecolaminas
Cefalosporinas
Dopamina
Etanol
Glutamina
Azcares reductores
Trichosporon brassicae
Mucosa del intestino de ratn
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Hoja de espinaca
Citrobacter feundii
Pulpa de pltano
Saccharomyces cerevisae
Rin de cerdo o ptalo de magnolia
Bacterias de la placa dental
O2
NH3
CO2
O2
O2
H
+
O2
[Fe(CN)6]
3-

NH3
H
+
Otra interesante aplicacin de los electrodos respiromtricos es en la determinacin de
vitaminas. El aumento en el consumo de oxgeno en la respiracin de la levadura
Saccharomyces cerevisiae es proporcional a la concentracin presente de tiamina
(vitamina B
1
). De forma contraria, la presencia de sustancias inhibidoras disminuye el
consumo de oxgeno (o la produccin de dixido de carbono). De esta forma se han
empleado biosensores con distintos tipos de cepas sensibles para la determinacin de
antibiticos como tetraciclinas, gentamicina, nistatina, etc. Con el mismo fundamento
estos biosensores se pueden utilizar como sensores de grupos de sustancias txicas en
aguas (pesticidas, metales pesados, etc.). O pueden ser utilizados en el screening de
mutgenos, como en el caso de la utilizacin de una cepa de Bacillus subtilis deficiente
genticamente que reduce la respiracin en presencia de una sustancia mutagnica,
mientras que no se altera la misma cepa salvaje utilizada de control, ya que es capaz de
reparar la molcula de DNA daada.

71
4.3 Inmunosensores
Los inmunosensores representan una estrategia de integracin de los procedimientos
convencionales de inmunoensayo, con el valor aadido que conlleva la configuracin de
sensor (pequeas dimensiones, bajo coste y utilizacin amigable). En el formato clsico
de sensor y utilizando transduccin electroqumica, los inmunosensores, por utilizar una
reaccin de reconocimiento de afinidad, como es la interaccin anticuerpo-antgeno (ver
Cuadro 6B), no pueden generar la informacin en tiempo real, la tienen que efectuar
indirectamente a travs de marcadores del evento de reconocimiento. En este sentido no
son verdaderos sensores, sino ms bien unas sondas inmunoqumicas
(immunochemical probes).

La especificidad de la interaccin anticuerpo-antgeno se puede utilizar para separar,
identificar y cuantificar cualquier sustancia que tenga propiedades inmunoqumicas.
As, pues, los anticuerpos han encontrado aplicacin como potentes herramientas
analticas cualitativas y cuantitativas. Han sido usados en procedimientos de diagnstico
y cuantificacin, en donde el analito es el antgeno o el propio anticuerpo, no
nicamente en el campo clnico y veterinario, sino tambin en muestras ambientales, de
alimentos y en monitoreo de bioprocesos industriales.

El desarrollo de metodologas qumicas para conjugar (enlazar) enzimas a los
anticuerpos, sin que unas y otros pierdan su actividad biolgica, conjuntamente con la
posibilidad de inmovilizar el material inmunolgico sobre fases slidas, represent un
paso importante en la consolidacin de las tcnicas de inmunoensayo, gracias al
concepto ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). En esta metodologa, la
cuantificacin de un antgeno se facilita por el marcaje enzimtico de una de las
especies del par inmunolgico (antgeno o anticuerpo), ya que una vez formado el
inmunocomplejo sobre una fase slida, y una vez lavado el exceso de reactivos, la
enzima fijada en la superficie se pueda cuantificar mediante la adicin del substrato en
exceso.

Inmunosensores amperomtricos. Implementan las tcnicas ELISA en un formato de
biosensor amperomtrico. Permiten detectar la interaccin anticuerpo-antgeno a partir
de reactivos inmunolgicos, por un lado, marcados enzimticamente y, por el otro,
inmovilizados sobre un transductor amperomtrico, Es decir, integran la selectividad y
otras importantes propiedades de las reacciones inmunolgicas (ver Tabla 17), la
sensibilidad y otros atributos de las reacciones enzimticas (ver Tabla 12) y la
simplicidad de la deteccin amperomtrica (ver 3).

72
Tabla 17. Propiedades de los anticuerpos como elementos de
biorreconocimiento en el desarrollo de biosensores electroqumicos.
Propiedades de los anticuerpos
Elevada selectividad y sensibilidad
Disponibilidad potencial de anticuerpos anti cualquier tipo de sustancia qumica
Amplio intervalo de respuesta
Procedimientos de inmovilizacin bien establecidos
Ms estables que las enzimas
Mecanismo de accin relativamente rpido pero de difcil transduccin
Transduccin indirecta y discontinua
Adsorcin inespecfica sobre las superficies de trabajo
Precio alto
Difcil reutilizacin
Produccin masiva
Las determinaciones inmunolgicas con inmunosensores se llevan a cabo normalmente
en formato competitivo o no competitivo (sandwich) (ver Figura 31) En el ensayo no
competitivo, el analito compleja a su contraparte, que est inmovilizada sobre el
transductor. Se aade un segundo anticuerpo marcado enzimticamente anti un eptopo
del analito distinto del interviene en la formacin del complejo. Finalmente, se adiciona
substrato en exceso y se mide la actividad de la enzima en la superficie del transductor.
El valor de la intensidad de corriente es proporcional a la cantidad de analito en la
muestra. En el ensayo competitivo, se basa en un equilibrio competitivo entre un exceso
de conjugado enzimtico (antgeno o anticuerpo, segn as sea el analito) y el analito en
la solucin muestra y su contraparte inmovilizada sobre el transductor. Se adiciona
substrato en exceso y se mide la actividad de la enzima en la superficie del transductor.
El valor de la intensidad de corriente es inversamente proporcional a la cantidad de
analito en la muestra.

Para la mayora de aplicaciones, la informacin requerida es del tipo s o no,
especialmente si o no el antgeno est presente en la muestra o por encima de una cierto
valor umbral. En los ensayos deben incluirse referencias con controles positivos y
negativos para validar los resultados. Para cuantificacin de un antgeno o un anticuerpo
se debe preparar una curva de calibrado con varios puntos ya que no son lineales.

73
S
P
a
b
c
d
(B)
S
P
(A)
Figura 31. Determinacin de especies inmunolgicas mediante inmuno-
sensores amperomtricos. a) Se bloquea los sitios de enlace inespecfico de
la superficie del inmunosensor con una protena inespecfica; por ejemplo,
con albmina de suero bovino .(A) Formato no competitivo: b) Se incuba el
inmunosensor en la muestra durante un tiempo prefijado. Se lava el material
adsorbido inespecficamente en la superficie del transductor modificado. c)
Se aade un anticuerpo marcado enzimticamente anti analito, que se une a
ste por otro eptopo distinto al que ha utilizado el anticuerpo inmovilizado.
Se lava la superficie para remover el conjugado enzimtico que no se ha
adsorbido especficamente. d) Se adiciona el substrato en exceso y se mide la
intensidad de corriente, que corresponde a la velocidad mxima de la
reaccin enzimtica (saturacin por el substrato) y, por tanto, proporcional a
la actividad enzimtica en superficie y a la concentracin del analito en la
muestra. (B) Formato competitivo. b) Se incuba el inmunosensor en
presencia del analito y de un conjugado enzimtico de la misma estructura
que el analito. c) Durante un tiempo prefijado, el analito y el conjugado
enzimtico compiten por los sitios de enlace del anticuerpo inmovilizado
sobre el transductor amperomtrico. Se lava la superficie del inmunosensor
de especies adsorbidas inespecficamente. d) Se aade el substrato en
exceso y se mide la intensidad de corriente, que es inversamente proporcional
a la concentracin del analito en la muestra.
Algunos inmunosensores utilizan un electrodo de Clark como transductor . En este caso
los marcadores enzimticos son la glucosa oxidasa (consumo de O
2
) o la catalasa
(produccin de O
2
). Se ha descrito un inmunosensor de hCG (gonadotropina corinica
humana) en donde el anticuerpo est inmovilizado en la cara exterior de la membrana
permeable al oxgeno y compite con hCG analito y hCG conjugado con catalasa.

74
Catalasa
H
2
O
+
O
2
H
2
O
2
Despus de un tiempo de incubacin del inmunosensor en la muestra, se mide la
actividad de catalasa presente en la membrana a partir de la seal del oxgeno.

Otras configuraciones que inmovilizan el material inmunolgico directamente sobre el
transductor amperomtrico (carbono o platino), utilizan como marcador la fosfatasa
alcalina (ALP). Esta enzima cataliza la hidrlisis de steres fosfricos para producir
fosfato inorgnico y un derivado fenlico:

ALP
Ph-OH
+
HPO
4
2-
H
2
O
2
Ph-OPO
3
2-
+ H
2
O
Se ha utilizado el fenilfosfato como substrato, que permite detectar el fenol producido
a 750 mV vs. Ag/AgCl, pero el electrodo se va pasivando a causa de la
electropolimerizacin del radical fenoxi formado. Mejores resultados proporciona el 4-
aminofenil fosfato debido a la electroqumica reversible que presenta el producto de la
reaccin enzimatica, el 4-aminofenol a 100 mV vs. Ag/AgCl. Otros marcadores
enzimticos utilizados son la glucosa oxidasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

Finalmente, las ventajas de un ensayo con un inmunosensor amperomtrico sufren de la
necesidad de remover los materiales adsorbidos no especficamente (analito, conjugado
enzimtico, etc) antes de efectuar la medicin de la actividad enzimtica del marcador
enlazado correctamente. Esto conlleva una serie de precauciones y de lavados repetidos,
que hace que la tcnica pierda en parte su propiedad potencial de ser usada en
diagnstico no centralizado, fuera del laboratorio. Por esto las investigaciones actuales
van en la direccin de mtodos ms simples y rpidos sin necesidad de separacin.

Inmunosensores potenciomtricos. Pocos ejemplos existen en la literatura sobre la
deteccin directa de reacciones inmunoqumicas basadas en transductores
electroqumicos. Una posibilidad es la modulacin del potencial de membrana a travs
de reacciones inmunoqumicas, y su posible implementacin como dispositivos
sensores. Si en un electrodo selectivo de iones basado en una membrana de portador
mvil, funcionalizamos el portador (ionforo) responsable del reconocimiento con una
molcula de antgeno, convertimos el electrodo en un sensor del correspondiente
anticuerpo. En efecto, la respuesta del electrodo frente a un nivel de referencia del ion
principal, se modificar en presencia del anticuerpo, ya que, en la interficie de la
membrana, la interaccin anticuerpo-antgeno causar un reequilibrio del portador con
el ion principal, provocando un cambio de potencial.

ImFET. Los transistores de efecto de campo sensibles a iones (ISFET) (ver 2.3.8) han
encontrado aplicacin en el desarrollo de biosensores, en configuraciones anlogas a las
comentadas anteriormente para los EnFET (ver 4.1.1).
La aportacin potencialmente ms interesante de estos dispositivos de estado slido es
en configuracin de ImFET (FET modificado con material inmunoqumico). Los
ImFET pueden seguir de forma directa las interacciones anticuerpo-antgeno. En efecto,
un FET puede ser considerado como un dispositivo que responde a cambios de la
75
distribucin de carga interfacial. La inmovilizacin covalente de un anticuerpo en la
capa sensible de dielctrico de un FET har que el material biolgico de reconocimiento
forme parte de la doble capa existente en la superficie sensora. Los anticuerpos son
polielectrolitos cuya carga neta depende de las condiciones del medio. La interaccin
del anticuerpo con un antgeno (tanto si ste es inico como neutro) provocar un
cambio en la distribucin de cargas en la doble capa, que ser transducida por el
dispositivo segn su modo de operacin.

4.4 Genosensores

El anlisis del DNA se ha convertido en un rea de estudio que ha trascendido la
biologa molecular. La deteccin de una secuencia especfica de bases nitrogenadas en
cidos nucleicos de personas, animales, vegetales, virus y bacterias (ver Cuadro 6B) nos
permite tratar problemas de naturaleza muy diversa. Por un lado poder determinar las
causas de enfermedades hereditarias e infecciosas, e investigar diversas cuestiones
relativas a muestras forenses. Por otro lado, muchos problemas que tradicionalmente
slo se podan abordar mediante tcnicas microbiolgicas clsicas, actualmente se
pueden estudiar a travs del anlisis del DNA, con tcnicas de biologa molecular y, en
ltimo trmino, con unas herramientas bioqumicas, como es el caso de problemas de
contaminacin por microorganismos de alimentos y aguas potables, y de muchos otros
aspectos medioambientales. A medida que avanza la revolucin biotecnolgica,
animales, plantas y microorganismos son modificados genticamente para proporcionar
nuevos productos, cuya deteccin y control necesita de herramientas analticas de tipo
gnico.
Las tcnicas convencionales de anlisis de una secuencia gnica especfica se
basan en la secuenciacin directa o en la hibridizacin del DNA. En general, debido a
su simplicidad, las tcnicas de hibridizacin son cada vez ms utilizadas para fines
diagnsticos. En dichas tcnicas, la secuencia de inters (analito) es identificada por una
hebra de DNA (ssDNA), cuya secuencia es complementaria; es decir, forma una doble
hlice (dplex , hbrido o dsDNA) con el analito. La reaccin de hibridizacin ocurre
con gran especificidad y afinidad; tengamos en cuenta que la formacin del hbrido se
produce en muestras reales en presencia de una gran diversidad de otros DNA no
complementarios.
El desarrollo de tcnicas de ensayo que permitan la hibridizacin en fase slida y
que adems sean rpidas, sensibles y que se puedan multiplexar, es una demanda
acuciante en diagnstico genmico. Los genosensores, en especial los de tipo
voltamperomtrico (ver Tabla 18) pueden dar una respuesta a dicha demanda.
Representan una estrategia de integracin de los procedimientos convencionales de
anlisis de DNA por hibridizacin, con el valor aadido aportado por la configuracin
de sensor (pequeas dimensiones, bajo coste y utilizacin amigable). No obstante, en el
formato clsico de sensor y utilizando transduccin electroqumica, los genosensores,
por utilizar una reaccin de reconocimiento de afinidad, como es la interaccin DNA-
DNA, muy difcilmente pueden generar la informacin en tiempo real, lo hacen
76
indirectamente a travs de marcadores del evento de reconocimiento. En este sentido no
son verdaderos sensores, sino ms bien unas sondas (probes).

Tabla 18. Propiedades de los cidos nucleicos como elementos de
biorreconocimiento en el desarrollo de biosensores electroqumicos.
Propiedades de los cidos nucleicos
Especificidad y sensibilidad
Disponibilidad de las sondas de DNA mediante sntesis qumica
Amplio intervalo de respuesta
Posibilidad de amplificacin del DNA por PCR (polymerase chain reaction)
Procedimientos de inmovilizacin bien establecidos
Ms estable que las enzimas y los anticuerpos a los cambios de fuerza inica,
temperatura y solventes orgnicos.
Mecanismo de accin relativamente rpido pero de difcil transduccin
Reversibilidad de la hibridizacin
Transduccin indirecta y discontinua
Adsorcin inespecfica sobre las superficies de trabajo
Precio bajo
Produccin masiva
Los genosensores amperomtricos integran, como elemento de reconocimiento,
biolgico una simple hebra de DNA (sonda), que confiere selectividad, y un
transductor amperomtrico, que aporta sensibilidad y nos permite disponer de una seal
del dominio elctrico. Para implementar esta integracin han sido ensayadas distintas
estrategias, algunas parecidas a las ya comentadas de inmunoensayo, otras ms
especficas de la molcula de DNA. La Figura 32 ilustra dichas estrategias.

Amplificacin. En principio, las sondas gnicas permiten detectar picogramos de cido
nucleico. En muchos casos este lmite de deteccin no es suficiente y, a diferencia de
todos los analitos que hemos tratado en las secciones precedentes, el material gentico
se puede amplificar. Un procedimiento muy potente se basa en la amplificacin
enzimtica de una secuencia de DNA determinada con la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR, polimerase chain reaction), por la que K. Mullis recibi el premio
Nobel (1993). La secuencia en cuestin es amplificada por esta enzima termoestable en
ciclos repetidos de calentamiento (deshibridizacin de la sonda y el analito) y
enfriamiento (hibridizacin), pasando por un temperatura intermedia en la que la
polimerasa replica la secuencia del analito y la sonda, o sea que se doblan las copias de
DNA en cada ciclo, aproximadamente 10
6
copias en 20 ciclos (2
20
).

Deteccin cronopotenciomtrica. . Esta estrategia se basa en la deteccin directa de la
hibridacin a partir de las propiedades electroqumicas de la guanina. Si adsorbemos
una sonda gnica sobre un electrodo de grafito, presenta un pico cronopotenciomtrico
(dt/dE vs. E) de oxidacin a 1.03 V vs. Ag/AgCl, debido a la guanina. Dicho pico
disminuye en presencia de una secuencia complementaria de analito. Esto es debido a
77
que con la hibridacin las bases de un dsDNA se disponen en el interior de la doble
hlice, rodeadas exteriormente por los azcares, siendo su deteccin ms impedida en
comparacin con la de una sonda de ssDNA. Este mtodo tiene la limitacin que no se
puede utilizar para un ssDNA analito que contenga muchas bases de guanina, ya que
podra interferir en la seal de referencia de la sonda. Una posibilidad para soslayar este
problema es utilizar sondas que contengan inosina en vez de guanina, ya que el pico de
la inosina est separado del de la guanina y, por tanto, podremos detectar en este caso
la hibridizacin a travs nicamente de los residuos de guanina provenientes del DNA
analito.

(D)
(C)
(B) (A)
(D)
(C)
(B) (A)
(C)
(B) (A) (B) (A) (B) (A) (B) (A) (A)
Figura 32. Algunos formatos asociados a la utilizacin de genosensores
electroqumicos. La sonda no marcada se adsorbe sobre el transductor y la
hibridizacin se detecta a travs de los residuos de guanina del dplex (A) o
de un reactivo electroactivo (intercalador) (B). El analito se inmoviliza sobre
el transductor y la sonda conjugada con una enzima se encuentra en solucin
(C). Una sonda de captura est inmovilizada sobre el transductor y otra sonda
conjugada con una enzima se encuentra en solucin, las cuales reconocen dos
secuencias distintas del analito (D). Los formatos A y B utilizan tcnicas de
redisolucin cronopotenciomtrica como sistema de medida. Los formatos C
y D tambin se pueden realizar con las respectivas sondas adsorbidas sobre el
transductor , aunque la inmovilizacin covalente de ssDNA por uno de sus
extremos proporciona una hibridizacin ms eficiente. Los formatos C y D,
con marcadores enzimticos, permiten la utilizacin de tcnicas
amperomtricas

Una estrategia muy productiva para detectar si se ha formado un dplex (dsDNA) en la
superficie de un electrodo, se basa en el uso de indicadores electroactivos de
hibridizacin, tales como complejos metlicos catinicos del tipo Co(phen)
3
3+
o
Co(bpy)
3
3+
y anlogos de Ru(II), Fe(II) , Cu(II), etc, o compuestos orgnicos como
daunomicina, naranja de acridina, antraciclinas, fenotiazinas,etc. Estos compuestos,
conocidos como intercaladores, interaccionan de una forma distinta con el ssDNA o
78
con el dsDNA, pero lo hacen preferencialmente con el dsDNA, ya sea a travs de
interacciones electrostticas dentro de los surcos mayores o al interior de la hlice en
posiciones planares paralelas, intercaladas con las de las bases. El mtodo adolece de
que necesita una cantidad elevada de dsDNA sobre el electrodo, para poder obtener una
seal voltamperomtrica significativa del intercalador electroactivo acumulado. La
tcnica de eleccin es la de anlisis por redisolucin cronopotenciomtrica.

Deteccin amperomtrica. La utilizacin de este tipo de transduccin va ligada al uso
de marcadores enzimticos conjugados con las sondas de DNA. El poder de
amplificacin del efecto cataltico hace que el evento de hibridacin pueda ser detectado
mediante transduccin amperomtrica, en formatos no muy alejados conceptualmente a
los usados para detectar las interacciones anticuerpo-antigeno (ver la Figura 32)

Finalmente, otro modo de utilizacin de los genosensores es como biosensores de
productos electroactivos como frmacos, carcingenos, contaminantes, etc., que tienen
la propiedad de intercalarse o enlazarse electrostticamente con dsDNA, siendo
utilizado ste como elemento de reconocimiento molecular inmovilizado sobre el
transductor.. La transduccin se realiza como ya se ha comentado anteriormente por
CPSA (anlisis por redisolucin cronopotenciomtrica). Hay tambin esquemas en la
bibliografa para transducir en una seal electroqumica la acumulacin de un analito no
electroactivo : a) desplazamiento competitivo de un intercalador electroactivo
previamente acumulado , y b) cambios en la seal intrnseca asociada a la oxidacin de
la guanina, ocasionados por los cambios qumicos, estructurales o conformacionales en
el complejo dsDNA-analito.

4.5 Inmovilizacin de material biolgico

El concepto de biosensor implica que el elemento de reconocimiento biolgico est en
ntimo contacto con el elemento transductor. Este contacto debe ser permanente, por lo
que los materiales biolgicos tienen que estar fijados de alguna forma en la superficie
del transductor. El proceso de fijacin de material biolgico se denomina
inmovilizacin. Conceptualmente es anlogo al ya comentado de modificacin (ver
3.3), utilizndose uno o otro trmino cuando se quiere hacer nfasis sobre el material
que se inmoviliza o sobre el substrato que se modifica. En relacin al campo de los
biosensores, tal como se coment en el apartado referido a los electrodos modificados
qumicamente, y ahora tambin para la modificacin biolgica, los procesos de
inmovilizacin, que pueden ser en superficie o en volumen, no deben daar la actividad
del material biolgico ni al material transductor. Cualquiera que sea el mtodo de
inmovilizacin tiene que tener en cuenta una serie de extremos que son descritos en la
Tabla 19.

79
Tabla 19. Factores a tener en cuenta en los procesos de inmovilizacin de
material biolgico sobre transductores electroqumicos.
Factores para la inmovilizacin
Preservacin de la actividad y de la selectividad de la biomolcula
Preservacin o incremento de la estabilidad de la biomolcula, durante la
utilizacin, reutilizacin y almacenamiento del biosensor
Preservacin de la superficie activa del transductor
No introducir sustancias extraas con los procesos de inmovilizacin
Reproducibilidad y simplicidad de los mtodos de inmovilizacin, para poder
fabricar los biosensores en serie
Deben de evitarse condiciones extremas ( pH, temperatura, fuerza inica, etc.).
Existe un arsenal de metodologas de inmovilizacin de material biolgico sobre las
superficies de los transductores. Recordemos que dichas superficies son de carbono,
platino, oro o slice (dispositivos de estado slido). A continuacin clasificamos y
comentamos, de una forma muy general, las distintitas metodologas de inmovilizacin,
sin pretender ser exhaustivos, remitiendo al lector a la bibliografa ms especializada.

Adsorcin fsica

La adsorcin de biomolculas sobre los transductores es el procedimiento ms simple y
menos agresivo de inmovilizar. No se necesitan reactivos especiales. Los materiales
biolgicos adsorbidos prcticamente guardan intacta su actividad. Pero la adsorcin no
es muy reproducible ni estable, y los biosensores resultante presentan problemas de
prdida de sensibilidad con el uso, debido al desprendimiento del material inmovilizado.
Las protenas (enzimas y anticuerpos) y los cidos nucleicos se adsorben bien sobre
distintos materiales, va fuerzas de van del Waals, puentes de hidrgeno, interacciones
hidrofbicas, interacciones electrostticas, etc. Dichas fuerzas son reversibles y se
interrumpen fcilmente con cambios de pH, temperatura, y fuerza inica. Un exceso de
material proteico puede formar mltiples capas y bloquear la superficie del transductor.
De hecho, la inmovilizacin por adsorcin se reserva para trabajos exploratorios.

Entrecruzamiento

Se puede conseguir una estabilizacin adicional de las protenas adsorbidas sobre los
transductores mediante el enlace intermolecular con reactivos bifuncionales de
entrecruzamiento (crosslinking), tales como glutaraldehido, diisocianato de
hexametileno, etc. El entrecruzamiento puede alterar los centros activos de la enzima,
por esto es aconsejable mezclarla con una protena no activa, como la albmina de suero
bovino (BSA), para que ambas se entrecrucen y se repartan el efecto indeseable del
agente bifuncional, preservndose ms la actividad enzimtica. Aunque se puede
controlar el grado de entrecruzamiento con la cantidad de agente bifuncional utilizado,
80
la capa resultante de material inmovilizado introduce restricciones en la difusin de los
substratos, que pueden ser moduladas para extender el intervalo de respuesta del
biosensor. Este es un mtodo simple para inmovilizar biomolculas, especialmente
enzimas, pero altera la actividad biolgica e introduce barreras difusionales a los
substratos.

Atrapamiento

La inmovilizacin de biomolculas mediante su atrapamiento fsico en matrices de
geles, como poliacrilamida, goma de silicona o gelatina, por ejemplo, es un mtodo que
preserva bien la actividad biolgica. El polmero ms utilizado es la poliacrilamida,
preparado por copolimerizacin de acrilamida con N,N-metilenbisacrilamida. La
polimerizacin, en presencia del material biolgico, se puede llevar a cabo bajo
radiacin UV in presencia de vitamina B
1
como fotosensibilizador. Hay que optimizar
el procedimiento para que la biomolcula no se libere con facilidad y los biosensores
pierdan sensibilidad. Los microorganismos se inmovilizan a menudo con este tipo de
tcnicas. Corresponde tambin a este apartado el atrapamiento de material biolgico,
bsicamente enzimas, en polmeros conductores (ver 3.3).

Los mtodos de atrapamiento son muy utilizados porque preservan la actividad
biolgica, pero no retienen bien a la biomolcula e introducen barreras difusionales,
limitando el transporte del substrato y alargando la respuesta del biosensor.

Retencin con membranas

El uso de membranas semipermeables de varias porosidades permite retener sobre el
transductor el material biolgico sin necesidad de reactivos de ningn tipo, dejando
permear el substrato ms o menos libremente. As por ejemplo, las membranas de
acetato de celulosa (membrana de dilisis) retienen a las protenas y retardan la difusin
de algunos iones interferentes, las de policarbonato (Nucleopore

) son microporosas,
las de PTFE (Teflon

) son permeables a gases, las de Nafion excluyen aniones, etc. Las

membranas de polmeros conductores se pueden considerar por analoga permeables a
electrones. .

La utilizacin de membranas permite un buen contacto entre el material biolgico y el
transductor, Es un mtodo muy adaptable , que preserva las propiedades del material
biolgico. Limita la contaminacin y la biodegradacin. Es estable a los cambios de pH,
temperatura, fuerza inica y composicin del medio.

Unin covalente

El enlace qumico de una biomolcula a un transductor proporciona superficies sensoras
muy estables a los cambios de pH, temperatura y fuerza inica. Tal como ya se ha
comentado en 3.3, este tipo de inmovilizacin no es trivial y comporta el uso de
procedimientos tediosos y de difcil reproducibilidad. Normalmente se parte de la
activacin de grupos funcionales en la superficie sensible del transductor (carbono,
81
platino o slice) para posteriormente, mediante agentes bifuncionales (como el
glutaraldehdo), poder unir covalentemente la protena o los cidos nucleicos, a travs
de sus grupos funcionales (-NH2, -COOH, -OH,-SH, -Ph-OH, etc.), los cuales no han
de ser esenciales para la accin cataltica o el reconocimiento por afinidad. Muchas
veces, el enlace covalente daa la actividad biolgica.

Este mtodo de inmovilizacin disminuye la actividad biolgica, pero permite obtener
superficies estables modificadas biolgicamente, que proporcionan unos biosensores de
largo tiempo de vida.

Biocompsitos

Los mtodos anteriores son procedimientos de modificacin superficial de los
transductores. En el caso de los biosensores amperomtricos, de forma anloga a la que
se coment para los compsitos conductores (ver 3.3), es posible preparar un material
biocompsito que integra en su seno el transductor (grafito en polvo), la enzima, los
posibles mediadores o cofactores, y un material aglomerante que hace la funcin de
matriz de soporte. Segn las propiedades de esta matriz, los biocompsitos pueden ser
blandos o rgidos, presentando unos propiedades muy atractivas como materiales para el
desarrollo de biosensores enzimticos e inmunosensores, anlogas a las comentadas
anteriormente para los compsitos conductores.

82

5 Bibliografa seleccionada

1. R.W.Cattrall, Chemical Sensors, Chemistry primers, Oxford University Press,
Oxford (1997).
2. J. Inczdy, T. Lengyel, A. M. Ure. Electrochemical analysis, cap. 8, en
International Union of Pure and Applied Chemistry: Compendium of analytical
nomenclature. Definitive rules 19, Blackwell Science, Glasgow (1997).
3. D. Diamond (Ed). Principles of chemical and biological sensors. Wiley, Nueva
York (1998).
4. Ll. God. Los electrodos selectivos en el anlisis de aguas. Coleccin Temas
Ambientales, GPE SA, Barcelona (1996).
5. M.J.Madou, S.R.Morrison. Chemical sensing with solid state devices, Academic
Press, San Diego, CA (1989).
6. P. Bergveld , A. Sibbald. Analytical and biomedical applications of ion selective
field effect transistors, Elsevier, Amsterdam (1988).
7. D. Ammann. Ion-selective micro-electrodes. Principles, design and application.
Springer-Verlag, Berlin (1986).
8. J. Janata, Principles of Chemical Sensors, Plenum Press, Nueva York, 1989.
9. T. Seiyama y N. Yamazoe, eds., Chemical Sensor Technology, Elsevier,
Amsterdam, 1988- : srie de varios volmenes.
10. A.P. F. Turner, I. Karube, y G.S., eds., Biosensors: Fundamentals and
Aplications, Oxford University Press, Oxford, 1987.
11. E. A. H. Hall, Biosensors, Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1991.
12. F. Scheller, F. Schubert, Biosensors, Elsevier, Amsterdam, 1992.
13. E. Kress-Rogers, ed., Handbook of Biosensors and Electronic Noses, Medicine,
Food and the Environment, CRC Press, Boca Raton, FL, 1996.

Revistas especializadas

Sensors and Actuators, serie B, Elsevier, Amsterdam
Biosensors and Bioelectronics, Elsevier, Amsterdam
Materials Science & Engineering: C (Biomimetic Materials, Sensors and Systems),
Elsevier, Amsterdam
Sensors, http://www.mdpi.net/sensors/ (revista digital)
IEEE Sensors Journal, IEEE, USA.

83

CUADRO 6A. BIORRECEPTORES Y BIOSENSORES: Biorreceptores catalticos.
Los biosensores son sensores qumicos cuya parte receptora est formada por material biolgico de
reconocimiento molecular. En primer lugar se realiza un sucinto repaso a los distintos materiales
metablicos, enzimas y clulas, utilizados en la construccin de biosensores; para una informacin ms
detallada remitidos al lector a una obra general de bioqumica o de biologa.

Enzimas. Combinan el reconocimiento molecular con la transformacin molecular. Son unos
catalizadores, especficos y eficientes, que hacen posible la coexistencia de un elevado nmero de
reacciones qumicas en la clula. En algunas enzimas, los grupos funcionales se completan con metales
o molculas orgnicas (cofactores) que contribuyen a ampliar la gama de reacciones a catalizar. Los
metales pueden actuar de catalizadores, estabilizadores de estructuras transitorias o transportadores de
electrones. Las molculas orgnicas con funcin de cofactor pueden estar unidas permanentemente
(grupo prosttico) o no (coenzima) al resto de la molcula enzimtica.
El centro activo de una enzima (E) es una regin tridimensional donde se une el substrato (S) y el
cofactor si participa, formada por un clster de grupos funcionales que determinan la afinidad, la
especificidad y la capacidad de transformacin qumica de S en P (producto de la reaccin).
Generalmente los centros activos son unas cavidades hidrofbicas que excluyen casi totalmente las
molculas de agua. La unin entre S y E se realiza mediante fuerzas dbiles (enlaces electrostticos, de
van der Waals, hidrofbicos, puentes de hidrgeno, etc.). La complementariedad entre E y S determina el
nmero y la direccin de estos enlaces y, en ltimo trmino, es la causa de la especificidad y de la
afinidad de la interaccin entre S y E.
Las enzimas catalizan las reacciones acercando los substratos a sus cavidades hidrofbicas y
obligndolos a adquirir orientaciones y geometras reactivas. Los centros activos son una rplica
complementaria de la geometra del estado de transicin (Pauling, 1948). ste es un estado postulado,
difcil de conseguir, en el cual la molcula tiene que pasar durante su transformacin de S en P. Pero las
enzimas ofrecen una cavidad complementaria a la estructura del estado de transicin, estabililizndolo, y
haciendo ms fcil la consecucin de una determinada geometra molecular que sera improbable de otra
manera, cuya geometra conlleva una disminucin de la energa de activacin y, consecuentemente, una
aceleracin de la reaccin. Por esto si existe la presencia de compuestos anlogos estructurales al estado
de transicin, estas molculas se comportarn como poderosos inhibidores enzimaticos competitivos o,
por otro lado, si obtenemos anticuerpos monoclonales anti-anlogos del estado de transicin, estos
presentarn propiedades catalticas (anticuerpos catalticos o abzimas).
Como que el estado de transicin implica la complejacin entre S y E, habr un mximo de concentracin
de substrato que se puede procesar a la vez. Para explicar este fenmeno de saturacin, que no
presentan los catalizadores no biolgicos, en donde la velocidad de reaccin tiende a un lmite (velocidad
mxima, Vmax) independiente de S, se postul la existencia de un complejo especfico entre E y S (ES). El
mecanismo ms simple que da una interpretacin de la saturacin puede ser:
E + S ES E + P
k
1
k
-1
k
cat

Para expresar la ecuacin de la velocidad inicial (vo) en trminos de magnitudes conocidas, como [S] y
[E]o (concentracin estequiomtrica total de los centros activos, siendo [E]o = [E]+[ES]) se aplica el
concepto de estado estacionario. Al cabo de poco tiempo (ms) de mezclar E y S, la velocidad de
formacin de ES (k1[E][S]) se iguala a la velocidad de descomposicin de ES (k-1 + kcat[ES]).De esta
manera, la concentracin del complejo ES se mantiene constante con el tiempo, Con esta hiptesis se
llega a la ecuacin de Michaelis-Menten:
[ ]
[ ] S K
S V
v
M
max
o
+
=
donde Vmax = kcat[E]o y KM =( k-1 + kcat )/ k1 . La representacin grfica de vo frente [S] es una hiprbole
rectangular (ver Fig. C2). A concentraciones bajas de substrato, [S]<< KM , la velocidad de reaccin vo es
directamente proporcional a la concentracin de substrato (reaccin de primer orden). En cambio, a altas
concentraciones de substrato, [S]>> KM, la asntota vo tiende a Vmax
, la reaccin es de orden cero, la
velocidad es independiente del substrato, slo depende de la actividad de la enzima (todos los centros
activos estn ocupados por S, es decir [ES]=[E]o); es lo que explica el fenmeno de saturacin. KM es
conocida como constante de Michaelis y operativamente corresponde a la concentracin de substrato en
que vo = Vmax/2 .

Adems de KM y Vmax, la constante cataltica o nmero de recambio (kcat) y la actividad especfica([E]o)
son importantes parmetros que caracterizan las reacciones enzimticas y, desde el punto de vista de los
sensores, su poder de amplificacin de la seal.
Cada enzima tiene un valor de pH ptimo caracterstico, en el cual su actividad es mxima. Este valor
depende de la composicin del medio, la temperatura y la estabilidad de la enzima en el medio. Como
todas las reacciones enzimticas, la velocidad de las recciones enzimticas aumenta con la temperatura.
Ciertas sustancias (inhibidores) rebajan la velocidad de las reacciones enzimticas y pueden actuar
84
reversiblemente o irreversiblemente. Entre los mecanismos cinticos de inhibicin reversible, se pueden
citar la inhibicin competitiva, la no competitiva y la mixta (tambin llamada acompetitiva).

V
max
0.5 V
max
K
M
[S]

Comportamiento hiperblico de la velocidad inicial (en escala relativa a la
velocidad mxima) frente la concentracin de substrato para una reaccin
enzimtica monosubstrato.
Clulas. Una alternativa a las enzimas purificadas es la utilizacin de material celular. Son una fuente de
enzimas ms barata que las enzimas aisladas y purificadas. Varios tipos de clulas se han utilizado en la
construccin de biosensores. Las ms comunes son clulas bacterianas y levaduras. Tambin se han
utilizado organismos multicelulares como tejidos de plantas y animales superiores, normalmente
preparados en forma de finos cortes de determinados rganos.
Algunas enzimas pierden parte de su actividad cuando se inmovilizan; este riesgo se minimiza utilizando
clulas enteras, ya que de hecho inmovilizan de forma natural a las enzimas que contienen. Adems las
enzimas en el interior de la clula se encuentra en su medio natural, lo que conlleva una mayor
estabilidad en comparacin con las enzimas aisladas. Son ms tolerantes a los cambios de temperatura y
pH, y ms insensibles a la inhibicin. A menudo, las clulas presentan coenzimas y activadores, por lo
que no hace falta aadirlos a los medios de trabajo. El cultivo de clulas microbianas o la preparacin de
cortes de tejidos es fcil y barato. Los microorganismos pueden regenerar o modular su actividad
enzimtica utilizando los nutrientes adecuados.
De todas formas la utilizacin de microorganismos y de tejidos de animales o plantas para catalizar
reacciones presenta unos tiempos de respuesta y de recuperacin ms largos, debido las barreras
difusionales introducidas por las membranas celulares. Generalmente presentan una multiplicidad de
enzimas y esto hace que la selectividad de las reacciones sea menor.
Las mitocondrias son estructuras subcelulares que contienen componentes biocatalticos. Su utilizacin
puede, en algunos casos, mejorar la selectividad.

85

CUADRO 6B. BIORRECEPTORES Y BIOSENSORES: Biorreceptores de afinidad.

Como segundo grupo de materiales, se repasan los conceptos biolgicos relacionados con los
biorreceptores de afinidad: anticuerpos, receptores celulares y cidos nucleicos; para una informacin
ms detallada remitidos al lector a una obra general de bioqumica o de biologa.

Anticuerpos. Son protenas plasmticas de elevado peso molecular (inmunoglobulinas) producidas por el
sistema inmune de los organismos en respuesta a sustancias extraas (antgenos). Un antgeno es
cualquier tipo de macromolcula capaz de inducir una respuesta inmune. A diferencia de las enzimas, los
anticuerpos no son catalizadores.
Las inmunoglobulinas (Ig) pueden dividirse en varias clases, de distintos peso moleculares y propiedades
(IgG , IgM, IgA, IgD e IgE). Cada inmunoglobulina consiste de dos cadenas peptdicas ligeras(L) y de dos
cadenas pesadas (H) enlazadas entre s por puentes de disulfuro e interacciones no covalentes entre los
residuos de aminocidos. Las cadenas H son casi el doble de largas que las L. La molcula de anticuerpo
se puede describir como una estructura en forma de Y, teniendo en el extremo de cada brazo un sitio
especfico para enlazarse en una parte de la molcula del antgeno, llamada epitopo.. La interaccin
anticuerpo-antgeno se efecta a travs de enlaces dbiles no covalentes (puentes de hidrgeno, fuerzas
de van der Waals, hidrofbicas, electrostticas, etc), reconocindose mutuamente la estructura
complementaria de ambas molculas.
El resultado de la reaccin de bioafinidad entre un anticuerpo (Ab) y un antgeno (Ag) es un complejo de
reconocimiento molecular (AbAg) de una elevada estabilidad, gobernado por la constante de afinidad K
[ ]
[ ][ ] Ag Ab
AbAg
K =
Los valores de K estn comprendidos entre 10
4
y 10
12
litromol
-1
.
Aunque estos biorreceptores se pueden considerar muy atractivos por su selectividad y sensibilidad, al no
poseer efecto cataltico, es decir, al no ir acompaado el reconocimiento de transformacin, el
seguimiento de la interaccin anticuerpo-antgeno mediante transductores electroqumicos debe
efectuarse mediante mtodos indirectos, generalmente utilizando marcadores enzimticos en alguna de
las especies del par inmunolgico.
Mientras que las enzimas slo cubren un nmero determinado de substratos, ligados a las rutas
metablicas de los organismos, optimizadas evolutivamente, en base a la regulacin enzimtica, se
pueden preparar anticuerpos contra una amplia gama de sustancias, naturales o sintticas, siempre que
provoquen la respuesta del sistema inmune del animal husped. La molcula debe de poseer un cierto
tamao (> 5000 D) y complejidad. Sustancias de bajo peso molecular, como frmacos, lpidos, esteroides,
hormonas, pptidos y antibiticos, no inducen respuesta inmune por s mismas, pero s que lo hacen si se
conjugan a una molcula grande inmunognica (por ejemplo, una protena). Dicho tipo de sustancias se
llaman haptenos.
Cuando un animal se inmuniza con una sustancia inmunognica se produce una mezcla de molculas de
anticuerpo (anticuerpos policlonales). En efecto, normalmente una molcula inmunognica posee varios
epitopos distintos (determinantes antignicos) susceptibles de inducir sus respectivos anticuerpos. La
produccin in vivo de suero policlonal y la consiguiente separacin del material inmumolgico es un
procedimiento bien establecido. En la prctica, en los procedimientos de inmunoensayo, puede que un
anticuerpo policlonal no sea adecuado para algunas aplicaciones analticas. Actualmente tambin existe
la produccin in vitro de anticuerpos monoclonales (tecnologa del hibridoma) o de fragmentos de
anticuerpos (tecnologa del DNA recombinante), que proporciona material inmunolgico idntico, que se
une a un mismo epitopo de la molcula de antgeno. Aunque estos reactivos inmunolgicos son cada vez
ms accesibles, su precio es elevado en comparacin con las enzimas. Conviene seleccionar bien el tipo
de material a utilizar para una aplicacin concreta, ya que los precios son muy dispares (antisuero <
fracciones de inmunoglobulinas < policlonales intactos purificados por afinidad = monoclonales intactos <
fragmentos).

Receptores. Son protenas que muestran una bioafinidad especfica hacia hormonas, neurotransmisores,
neurotoxinas, etc. (agonistas). Generalmente estn localizadas en las membranas celulares.
La unin receptor-agonista es estereoespecfica y no covalente. Cuando acontece dicha unin se dispara
un efecto biolgico amplificado (de varios rdenes de magnitud) en el interior de la clula, como puede ser
la apertura de un canal inico que altera el potencial de transmembrana, la activacin de un mensajero
secundario o de un sistema enzimtico.
La utilizacin de este concepto pasa por la incorporacin del receptor en una membrana artificial; en otros
casos se han utilizado estructuras biolgicas intactas, por ejemplo antenas de cangrejo, que son unos
86
rganos quimisensores olfativos adaptados evolutivamente en medio acuoso para detectar trazas de
sustancias vitales. De todas formas, la integracin de este tipo de reconocimiento sobre transductores,
para su posterior desarrollo prctico de biosensores, est aun en sus estadios iniciales, pero sus
aplicaciones potenciales son muy interesantes.

Acidos nucleicos. La informacin del genoma requerida por los organismos para mantenerse vivos,
reproducirse y hacer posible su diversidad est codificada por los cidos nucleicos. Los cidos
desoxirribonuclico (DNA) y ribonucleicos (RNA) son polinucletidos transportadores de informacin
biolgica, codificada en secuencias determinadas de nucletidos derivados de slo cuatro bases
nitogenadas adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T) para el DNA o uracil (U) para el RNA.
Los nucletidos son steres fosfricos de los nuclesidos, los cuales, a su vez, estn formados por la
unin de una base nitrogenada y una pentosa (2-desoxi-|-D-ribosa o |-D-ribosa), mediante un enlace N-
glicosdico. Todas las molculas de DNA muestran bsicamente una estructura de doble hlice. Las dos
cadenas de polinucletidos son complementarias y antiparalelas, se mantienen juntas principalmente por
puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas adenina y timina y entre guanina y citosina. El
reconocimiento entre ambas cadenas es altamente selectivo. Una sola alteracin en una base de una
secuencia con respecto a la secuencia complementaria hace que no se lleve a cabo o se desestabilice el
apareamiento o reconocimiento (hibridizacin).
As, pues, esta especificidad del proceso de hibridizacin ha sido explotada para fines diagnsticos y
analticos, especialmente por la facilidad en obtener secuencias sintticas (sondas gnicas)
complementarias a las secuencias de los analitos. No obstante, la identificacin de este reconocimiento
no es trivial, a menudo se realiza a travs de marcadores, de forma parecida a las metodologas
inmunoqumicas.

87

CUADRO 7. SENSORES: LA PRXIMA OLA EN TECNOLOGAS DE LA INFORMACIN
Llevamos aproximadamente cincuenta aos de revolucin de la informacin, desde la llegada de la radio
y televisin a todos los hogares, hasta la multidifusin del PC. Nuestros abuelos quedaran perplejos de
cmo los ordenadores se han introducido en el trabajo, los hogares, el ocio, etc. abriendo una senda que
todava no queda claro donde nos puede llevar.

Si analizamos la poca reciente de las tecnologas de la informacin se observa que aproximadamente
cada dcada surge un paradigma diferente, que lleva asociados sus dispositivos y operaciones.

Los aos 80 fueron la dcada del microprocesador, que vivi su explosin desde los centros informticos
hacia los hogares. Esta fue llamada la Revolucin del Ordenador Personal, pero en realidad lo que
signific es que comenz a procesarse mediante ordenadores una cantidad de informacin y de procesos
hasta entonces no imaginada.

A finales de los 80 una segunda tecnologa sufri una difusin masiva parecida, que fue la disponibilidad
de lasers baratos y adaptados a las comunicaciones. Este punto supone el paso de una capacidad
ingente de procesamiento a una capacidad enorme de acceso a informacin procesada, que est
teniendo su culminacin en el la red global actual, Internet. Dicha red accede a informacin por medios
pticos (el CD-ROM) y tambin por medios pticos es como la transmite a la mxima velocidad (la fibra
ptica). Dicho sea de paso, dicho acceso universal presupone tambin una interconexin universal de
millones de ordenadores.

En esta visin cada nuevo escaln no hace obsoleta la anterior tecnologa, sino que la potencia. La
llegada de Internet no hizo anticuados los ordenadores, quizs nicamente el modelo concreto del que
disfrutbamos, pero supuso la necesidad de mas ordenadores en lugares donde hasta aquel momento no
se haban necesitado.

As pues, cual es la tecnologa que nos espera en la primera dcada del siglo XXI? Algunos futurlogos
ya estn afirmando que lo que representar la nueva revolucin ser precisamente la incorporacin de los
sensores al esquema ya existente de millones de ordenadores con una vasta capacidad de
procesamiento y con acceso remoto a cantidades ingentes de informacin. Lo nuevo ser la generacin
puntual de esa informacin gracias a los sensores con los que habremos dotado a los ordenadores, lo
cual significar un incremento exponencial de la informacin de nuestro entorno. Para ello se necesitan
sensores baratos, ubicuos y de altas prestaciones. Y su forma, la implementacin en pequeos ingenios,
inteligentes e interconectados, que recogen la informacin de su entorno. El comienzo estar en el uso de
sensores fsicos, pero el reto est en lograr lo mismo con sensores qumicos y biosensores, los cuales
podrn suministrar informacin valiosa en el campo agrcola, de produccin industrial, ambiental, clnico,
etc. Y la accin caracterstica de la tercera poca ser, tras el procesamiento y el acceso a la informacin,
la interaccin, esperemos que inteligente, maquina-maquina, hombre-maquina y hombre-hombre
(mediada por ordenador). Es decir, la revolucin ciberntica.

88
6 ndice
1 Sensores qumicos................................................................................................... 1
1.1 Sensores electroqumicos ............................................................................... 3
2 Sensores potenciomtricos ..................................................................................... 8
2.1 Electroqumica de los sensores potenciomtricos........................................ 8
2.1.1 Puente salino........................................................................................... 14
2.2 Potencial de membrana................................................................................ 15
2.3 Los diferentes sensores potenciomtricos................................................... 18
2.3.1 Una primera clasificacin....................................................................... 18
2.3.2 Electrodos cristalinos.............................................................................. 18
2.3.3 Electrodos no cristalinos......................................................................... 21
2.3.4 Electrodos de portador mvil ................................................................. 22
2.3.5 Electrodos selectivos miniaturizados ..................................................... 28
2.3.6 Electrodos sensibles a gases ................................................................... 29
2.3.7 Biosensores potenciomtricos ................................................................ 31
2.3.8 Sensores potenciomtricos basados en FETs ......................................... 33
2.4 Aspectos prcticos en el trabajo con sensores potenciomtricos.............. 36
2.4.1 Expresiones de trabajo............................................................................ 36
2.4.2 Caracterizacin de la selectividad .......................................................... 38
2.4.3 Actividad y concentracin...................................................................... 39
2.4.4 Procedimientos y aplicaciones................................................................ 40
3 Sensores amperomtricos .................................................................................... 44
3.1 Electrodos modificados qumicamente ....................................................... 45
3.1.1 Electrocatlisis........................................................................................ 46
3.1.2 Preconcentracin .................................................................................... 47
3.1.3 Permeacin selectiva .............................................................................. 48
3.2 Electrodo de oxgeno .................................................................................... 49
3.3 Modificacin qumica de los electrodos...................................................... 50
4 Biosensores electroqumicos ................................................................................ 56
4.1 Biosensores basados en enzimas.................................................................. 56
89
4.1.1 Biosensores potenciomtricos ................................................................ 57
4.1.2 Biosensores amperomtricos .................................................................. 59
4.2 Biosensores electroqumicos basados en clulas ........................................ 68
4.3 Inmunosensores ............................................................................................ 71
4.4 Genosensores................................................................................................. 75
4.5 Inmovilizacin de material biolgico.......................................................... 78
5 Bibliografa seleccionada ..................................................................................... 82
6 ndice ..................................................................................................................... 88