CAPTULO 10

BIOSEPARACIONES
BIOSEPARACIONES
Remocin de insolubles
Aislamiento primario
Purificacin
Acabado
Introduccin
Las operaciones que comprenden los
procesos biotecnolgicos se dividen en
operaciones previas (upstream) y
operaciones posteriores o bioseparaciones
(downstream).
La bioseparacin comprende todos los
tratamientos que requiere el caldo de cultivo
para la obtencin de producto deseado con
la purificacin deseada.
Evolucin de los bioprocesos
Se reconocen tres generaciones
Las grandes diferencias estriban en

El uso o no de clulas recombinantes
La concentracin al inicio de la bioseparacin
La concentracin al final de la bioseparacin
Las tcnicas de bioseparacin utilizadas


Caractersticas de los procesos
biotecnolgicos
Caracterstica
Generacin
Primera Segunda Tercera
Perodo - 1975 1975 - 1985 -
Tipo de clulas
No
recombinantes
Recombinantes Recombinantes
Fortaleza de las
clulas
Alta Alta Baja
Conocimiento
de propiedades
bsicas
Alto Bajo Bajo
Conocimiento
tecnolgico
Alto Bajo Bajo
Caractersticas de los procesos
biotecnolgicos
Caracterstica
Generacin
Primera Segunda Tercera
Producto tipo
Antibiticos
Aminocidos
Insulina humana
Factor VIII
tPA
Localizacin
Intra y
Extracelular
Intracelular Intracelular
Tamao Intermedio Macromolculas Macromolculas
Actividad al
secretarse
Si No No
Pureza deseada Alta Muy alta Muy alta
Similitud con
contaminantes
Baja Alta Alta
Valor Bajo Alto Alto
Tarea
Qu son el factor VIII de la sangre y el
agente tromboltico activador del
plasmingeno tisular (tPA)?
El rendimiento y las etapas
Las operaciones de bioseparacin deben
seleccionarse con el fin de que el costo sea
mnimo.
Se busca que el rendimiento por paso sea
alto y que el nmero de pasos sea mnimo
para que el rendimiento global sea alto.
Rendimiento contra nmero de pasos
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Nmero de pasos
%

d
e

r
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
30%
95%
90%
80%
60%
Remocin de insolubles y ruptura
celular
Los principales insolubles que se consideran son
clulas enteras, restos celulares y cuerpos de
inclusin.
La seleccin de los equipos depende de la clula, la
disponibilidad del equipo, la eficiencia y el costo.
Las operaciones tpicas son la filtracin (hongos
filamentosos) y la centrifugacin (levaduras,
bacterias y clulas de mamferos).
Cuando el producto de inters es intracelular es
necesario romper a las clulas.
Filtracin
La filtracin es la separacin de un slido de
un fluido por accin de un medio filtrante y
un gradiente de presin.
En los procesos biotecnolgicos se utilizan
tres tipos de mecanismos de filtracin.

Filtracin de lecho profundo
Filtracin con formacin de torta (convencional)
Filtracin por membranas (micro y ultrafiltracin)
Fundamentos
La filtracin convencional forma parte de un
conjunto de operaciones llamadas
Bioseparaciones Slido-Lquido (BSL).
Los fundamentos se centran en:

La filtracin como parte de los sistemas de BSL
El pretratamiento de caldos biolgicos
La teora de filtracin convencional
La filtracin como parte
de los sistemas de BSL
Un proceso de
separacin slido-
lquido consta
generalmente de una
o ms etapas entre
las que se destacan:
Operaciones en los procesos de BSL
En general todos los sistemas mecnicos de
BSL estn basados en dos principios que
dan origen a las operaciones de:

Sedimentacin
Filtracin
Sedimentacin
En el proceso de sedimentacin la
separacin se basa en una diferencia de
densidad entre la fase slida y la fase
lquida. Entre mayor sea esta diferencia la
separacin es ms fcil. Cuando esto no
ocurre, la diferencia puede ser aumentada
aparentemente aplicando una fuerza
centrfuga o incrementando la densidad de la
partcula mediante coagulacin y floculacin.
Filtracin
En la filtracin la separacin se logra
utilizando un medio fsico que no permite el
paso de slidos a travs del cual el fluido se
hace pasar por medio de un gradiente de
presin.

Pretratamiento de caldos para BSL
Las propiedades de los caldos sujetos a BSL
pueden ser mejoradas por medio de
pretratamientos fsicos, qumicos o
biolgicos con el objeto de facilitar estas
operaciones.

Pretratamiento trmico
Coagulacin y floculacin
Uso de ayudas-filtro
Pretratamiento trmico
El calentamiento de caldos permite reducir
su viscosidad, su volumen y romper
estructuras gelatinosas que dificultan las
operaciones posteriores. En el caso de
caldos con clulas recombinantes esta
operacin es obligada por cuestiones de
seguridad ambiental. Esta operacin es de
uso limitado cuando se manejan productos
termolbiles.
Coagulacin y floculacin
Debido a que los caldos biolgicos
presentan partculas muy pequeas (0.5 a
100 m), los pretratamientos para
incrementar el tamao de partcula facilitan
su manejo.
Las partculas coloidales (tamao en el
rango de una micra) no sedimentan
fcilmente debido a que por accin de las
cargas superficiales forman suspensiones
muy estables llamadas soles.

Coagulacin
Las soles pueden ser alteradas por medio de
agentes qumicos. En el proceso de
coagulacin se emplean electrolitos simples
que neutralizan las cargas repulsivas
superficiales de las clulas o partculas, lo
que genera fuerzas de atraccin que
permiten formar partculas ms grandes y
densas.
Se utilizan derivados de iones polivalentes
positivos como fierro, aluminio y calcio.
Floculacin
En el proceso de floculacin se utilizan
sustancias qumicas sintticas de alto peso
molecular llamadas polielectrolitos. Estos
producen un efecto combinado ya que
actan neutralizando las cargas superficiales
y provocan su atrapamiento por medio de las
redes que forman.
Se utilizan derivados de la poliacrilamida,
polietilenimina y la poliamina.
Mecanismo de floculacin
Uso de ayudas-filtro
Estas sustancias se adicionan al caldo de
filtracin y/o se utilizan como precubierta del
filtro. Los AF actan como adsorbentes de
las partculas coloidales mejorando el
tamao de partcula y mejorando la
incompresibilidad y permeabilidad de los
slidos de tal manera que se facilite su
filtracin.
Los AF ms utilizados son las tierras de
diatomeas y las perlitas.
Teora de la filtracin
La teora de filtracin convencional se deriva
de los estudios de mecnica de fluidos en
medios porosos. La ecuacin que describe el
movimiento de fluidos newtonianos a travs
de medios porosos fue formulada en 1856
por el gelogo francs Darcy.
Concepto de filtracin
Teora de la filtracin
La aplicacin de esta ecuacin al caso particular
donde se desprecian los efectos gravitacionales
(lechos cortos) puede ser descrita como:
l
P k
v

A
=
Donde:
v es la velocidad superficial del lquido (flujo volumtrico por rea de
filtracin)
k es la constante de permeabilidad del lecho
AP es la cada de presin a travs del lecho
l es la profundidad del lecho
Es la viscosidad del fluido
Teora de filtracin
La velocidad de filtrado puede ser descrita en
trminos del volumen de filtrado y el rea de filtracin
como:
dt
dV
A
v
1
=
Combinando ecuaciones y expresando la relacin l/k
como una resistencia R:
R
P
dt
dV
A
A
=
1
Teora de filtracin
La resistencia puede expresarse como la suma de
dos resistencias en serie:
( )
m t
R R
P A
dt
dV
+
A
=
Esta ecuacin aplica a soluciones diluidas en rgimen
laminar
Tarea
Investigar sobre equipos de filtracin
Centrifugacin
La separacin de sustancias de diferente densidad
mediante movimiento giratorio se conoce como
centrifugacin.
La centrifugacin es una de las principales
operaciones utilizada para la separacin de clulas
de caldos biolgicos, especialmente cuando los
caldos no son fcilmente filtrables.
Cuando se utiliza la centrifugacin la diferencia entre
la densidad de los slidos y el caldo, se incrementa
por la accin de las fuerzas centrfugas que se
generan por las altas velocidades de rotacin de los
equipos.
Fundamentos de la centrifugacin
El estudio de las BSL por centrifugacin est basado
en la teora de la sedimentacin.
La teora de la sedimentacin est basada en la Ley
de Stokes que establece los aspectos bsicos del
movimiento de un slido en un lquido cuando existe
un gradiente de densidad. Los fundamentos se
centran en:
La Ley de Stokes
La sedimentacin por accin de la gravedad
La sedimentacin por accin de la fuerza centrfuga
El factor G
La ley de Stokes
La velocidad de sedimentacin de una
partcula esfrica en un medio continuo para
Reynolds menores a 1 (regin de resistencia
viscosa), est descrita por la ley de Stokes.
Se puede suponer que para las
suspensiones diluidas caractersticas de los
caldos biolgicos esta ley es aplicable.
La ley de Stokes
La ley de Stokes establece que cuando se
aplica una fuerza a una partcula en un
medio continuo sta se acelera (F = ma),
hasta que alcanza una velocidad a la cual la
resistencia a su movimiento iguala a la
fuerza aplicada.
La ley de Stokes
Las fuerzas que se oponen al movimiento de
partculas puede agruparse en la fuerza de
empuje (principio de Arqumedes) y la fuerza
de arrastre (resistencia de forma y friccin).
Entonces, en el equilibrio
Fuerza de aceleracin = fuerza de flotacin + fuerza de arrastre
La ley de Stokes
Para el caso de partculas esfricas:

t +
t
=
t
v d
a d a d
p
L p p p
3
6 6
3 3
Donde:
d
p
es el dimetro de la partcula

p
es la densidad de la partcula
a es la aceleracin

L
es la densidad del fluido
es la viscosidad del fluido
v

es la velocidad terminal de la partcula

La ley de Stokes
Resolviendo para la velocidad terminal:

A
=

18
2
a d
v
p
Se puede expresar la velocidad de
sedimentacin de la partcula en dos casos
de inters:
Sedimentacin por accin de la gravedad
Sedimentacin por accin de la fuerza centrfuga
Sedimentacin por accin de la
gravedad
En varios procesos de BSL la fuerza
impulsora en la sedimentacin es la
gravedad. La velocidad de sedimentacin por
gravedad de una sustancia, proporciona
informacin bsica necesaria para el diseo
de cualquiera de los procesos de
sedimentacin.

A
=
18
2
g d
v
p
g
Sedimentacin centrfuga
En las separaciones centrfugas slido-
lquido la velocidad de sedimentacin es
mayor que en la sedimentacin por gravedad
debido a que al girar los equipos producen
una mayor aceleracin de las partculas.

e A
=
e
18
2 2
r d
v
p
Implicaciones de la ley de Stokes
El dimetro aparente de las bacterias es del orden de
diez veces menor que el de las levaduras, por lo que
su velocidad de sedimentacin es 100 veces menor
(d
p
2
).
Las clulas contienen ms del 70% de agua por lo que
su densidad es semejante a la de los caldos lo que
ocasiona que sea pequea.
Algunos caldos biolgicos son muy viscosos propiedad
que dificulta la sedimentacin.
La velocidad de sedimentacin en un equipo
centrfugo puede incrementarse si se aumenta la
velocidad de rotacin o la distancia de sedimentacin.
Tarea
Integrar la ecuacin que describe la separacin
centrfuga diferencial.

e A
= =
e
18
2 2
r d
dt
dr
v
p
Estimar el tiempo de sedimentacin relativo de una
partcula celular de 5 m de dimetro (ncleo) con
respecto al de una partcula de 1 m de dimetro
(mitocondria), suponiendo que tienen la misma
densidad y estn sujetos al mismo campo centrfugo
de acuerdo a la siguiente figura:
Tarea
Tarea
La centrfuga de la figura anterior va a ser
utilizada para separar levaduras con 10 m
de dimetro y 1.05 g/cm
3
de densidad. Las
propiedades del caldo se pueden suponer
iguales a las del agua. La distancia del eje
de giro a la superficie del lquido en los tubos
es R
1
= 3 cm y la longitud del tubo es de 10
cm. La centrfuga gira a 400 rpm. Estimar el
tiempo para lograr una sedimentacin
completa de las levaduras en suspensin.
Factor G
En la caracterizacin y escalamiento de
centrfugas frecuentemente se emplea el
factor G, que es una medida relativa de la
velocidad de sedimentacin de una partcula
en un campo centrfugo con respecto a su
velocidad de sedimentacin en el campo
gravitacional.
g
r
G
2
e
=
Tarea
Investigar sobre equipos de centrifugacin
Rompimiento de clulas
Cuando el producto de inters es
intracelular, una vez realizada la cosecha de
clulas, se hace necesario romper a las
clulas para la liberacin del producto de
inters.
La tcnica de rompimiento celular determina
el tamao de los desechos resultantes y la
influencia que estos tendrn en las
operaciones que se utilicen para su
separacin.
Productos que requieren de una
ruptura celular
Tipo de producto Ejemplos
Protenas recombinantes
Insulina, protena A,
protena G
Enzimas
l-asparaginasa, invertasa,
glucocinasa
Vacunas Tetanos, meningitis
Otros
DNA, mitocondrias,
esporas, toxinas
Fundamentos
La recuperacin de productos intracelulares requiere
del conocimiento de la estructura de las capas
externas que protegen a las clulas: la membrana y
la pared celular.
Requiere adems del conocimiento de los sistemas
que permiten a ciertas clulas secretar los productos
de inters.
Los mtodos ms severos involucran el rompimiento
de la clula. Los menos severos alteran la
permeabilidad de la cubierta celular facilitando la
salida del producto de inters.
Estructura de la pared celular
Las paredes celulares de las bacterias son
rgidas y porosas debido a que poseen una
elevada presin osmtica interna y a que
frecuentemente se hallan expuestas a
diferentes condiciones ambientales externas.
Las paredes celulares de las bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas poseen un
esqueleto peptidoglucano rgido, cuya
unidad bsica es el disacrido constituido
por N-acetil-D-glucosamina y el cido C-
acetilmurmico.
Estructura de la pared celular
En las clulas Gram-positivas la capa de
peptidoglucano es mucho ms gruesa que
en las clulas Gram-negativas.
Los esfuerzos deben estar encaminados a
romper el esqueleto de peptidoglucano ya
sea atacando a los pptidos o a los enlaces
glucosdicos que mantienen la estructura.

Mtodos de rompimiento celular
Mtodo Tcnica Principio Ejemplos
Qumicos
Choque osmtico
Ruptura osmtica de
membrana
Ruptura de glbulos rojos
Disolucin lipdica
Desestabilizacin de la pared
celular por solventes orgnicos
Rompimiento de
levaduras por tolueno
Digestin enzimtica Digestin de la pared celular
M. lysodeikticus tratados
con lisozima
Tratamiento alcalino
Solubilizacin de membrana
por saponificacin de lpidos
Mecnicos
Molido en molino de
perlas
Las clulas son prensadas
entre perlas de vidrio
Tratamiento de
suspensiones celulares a
gran escala
Homogeneizacin
Las clulas se rompen al pasar
por un orificio pequeo
Tratamiento de
suspensiones celulares a
gran escala
Choque osmtico
Se fundamenta en el fenmeno de smosis.

Choque osmtico
El rompimiento celular por choque osmtico
consiste en la carga de un volumen dado de
clulas dentro de agua pura. La clula se
expande debido a que contiene solutos que
ocasionan un flujo osmtico hacia su interior.
Esta expansin puede conducir a su lisis o
rompimiento. La factibilidad de este mtodo
depende de la resistencia mecnica de las
clulas de inters.
Disolucin lipdica
La extraccin por solventes ha sido usada
para la disolucin selectiva de ciertos
componentes celulares.
En la tcnica de disolucin lipdica se aade
a la suspensin celular un volumen de
tolueno. El tolueno es absorbido dentro de
los lpidos de la pared celular, lo que
produce la expansin de la pared y ruptura
de sta. El contenido celular es liberado.
Digestin enzimtica
La digestin enzimtica consiste en el empleo de
enzimas que atacan la pared y provocan el
rompimiento celular
Una de las enzimas ms utilizada es la lisozima.
Esta enzima rompe el enlace entre el cido N-
acetilmurmico y la N-acetil glucosamina de la capa
de peptidoglucano provocando el rompimiento de la
pared y de la clula misma. A pHs menores a 5 las
clulas no se rompen an cuando ya no tenga pared
celular, por lo que se deben buscar condiciones de
solubilidad favorable del protoplasma.
Mtodos mecnicos
Las tcnicas empleadas a gran escala son:
La molienda hmeda en molinos de perlas
agitados a alta velocidad
La homogenizacin a alta presin
La desintegracin celular no es una tarea
fcil si se considera la alta resistencia
mecnica de las paredes celulares y el
tamao tan pequeo de los microorganismos
(1-10 m).
Tarea
Investigar como funcionan los molinos de
perlas a alta velocidad y los
homogenizadores a alta presin en el
rompimiento celular.
Mtodos de permeabilizacin
Los mtodos de permeabilizacin consisten
en alterar la estructura de la pared y la
membrana celular para facilitar la difusin
del producto hacia el exterior de la clula.
Para esto se utilizan solventes como tolueno
al 5%, detergentes aninicos, catinicos o no
inicos, agentes caotrpicos como guanidina
y urea y agentes quelantes como el EDTA.
Comparacin conceptual entre
permeabilizacin y rompimiento
Estructuras
qumicas de
agentes
solubilizadores
Mtodos de permeabilizacin
La base de una solubilizacin efectiva radica
en la estructura del detergente o agente
solubilizante. Estas estructuras tienen una
porcin hidroflica (generalmente inica) y
una parte hidrofbica (generalmente un
radical orgnico). Esta estructura permite
interactuar con el agua y con un lpido.
Aislamiento primario
Las tcnicas ms utilizadas son la extraccin
y la adsorcin. Estas tcnicas permiten
concentrar los productos diluidos de los
caldos biolgicos que son obtenidos en la
etapa de separacin de slidos.
Estas tcnicas no son muy selectivas
Extraccin
La extraccin lquido-lquido es una
operacin que permite la recuperacin de un
soluto de una solucin mediante su mezcla
con un solvente.
El solvente de extraccin debe ser insoluble
o soluble en grado limitado en la solucin
que se va a extraer y el soluto debe
presentar una elevada afinidad por el
solvente de extraccin.
Extraccin
La extraccin lquido-lquido se realiza
bsicamente en dos pasos:

Mezcla ntima del solvente de extraccin con la
solucin a procesar
Separacin de la mezcla en dos fases lquidas
inmiscibles
Fundamentos
La operacin de extraccin implica el uso de
tres tipos de sustancias cuando menos: el
soluto de inters y los componentes puros
de cada una de las dos fases.
En base a lo anterior, los fundamentos se
centran en:
Tipos de sistemas de extraccin lquido-lquido
Qumica de la extraccin
Seleccin del solvente
Sistemas de dos fases acuosas inmiscibles
Tipos de sistemas de extraccin
lquido-lquido
Los sistemas de extraccin presentan
diferente grado de complejidad de acuerdo a:
Las fases pueden ser completa o parcialmente
inmiscibles.
La presencia de otros solutos diferentes al soluto
de inters.
La naturaleza de las fases, siendo lo tradicional
manejar una fase acuosa y una fase orgnica.
Otros sistemas emplean dos fases acuosas
inmiscibles.
Qumica de la extraccin lquido-
lquido
Cuando un soluto es repartido entre dos
fases E y R formando soluciones diluidas, al
alcanzarse el equilibrio los potenciales
qumicos del soluto en ambas fases son
iguales:
( ) ( ) E R =
El potencial qumico est dado por:
( ) ( ) ( ) ( )
E R
A T E A T R ln R ln R
0 0
+ = +
Qumica de la extraccin lquido-
lquido
Si las soluciones son diluidas
Definiendo el coeficiente de particin
( ) ( ) x T E y T R ln R ln R
0 0
+ = +
y
x
K
p
=
Definiendo el coeficiente de particin
( ) ( )
(

=
T
E R
K
p
R
ln
0 0
Propiedades del coeficiente de
particin
El coeficiente se define slo en un punto de equilibrio
El coeficiente vara con el nivel de concentracin de
equilibrio
Para sistemas diluidos el coeficiente puede considerarse
constante e igual a la constante de equilibrio
El coeficiente es constante a un temperatura dada,
independientemente de la concentracin o presin global
del sistema
Un valor alto del coeficiente indica que en el equilibrio la
concentracin de soluto en el extracto es mayor que en el
refinado
Los valores del coeficiente se determinan
experimentalmente
Coeficientes de particin
Compuesto Soluto Solvente K
p
Observaciones
Aminocidos
Glicina
Lisina
Ac. Glutmico
n-butanol/agua
n-butanol/agua
n-butanol/agua
0.01
0.20
0.07
25 C
Antibiticos
Celesticetina
Eritromicina
Novobiocina

Penicilina F

Penicilina K

n-butanol/agua
Amil acetato/agua
Butil acetato/agua

Amil acetato/agua

Amil acetato/agua
110.00
120.00
100.00
0.01
32.00
0.06
12.00
0.10


a pH 7.0
a pH 10.5
a pH 4.0
a pH 6.0
a pH 4.0
a pH 6.0
Protenas
Glucosa
isomerasa
Catalasa
PEG 1550/fosfato de
potasio
PEG/dextrano crudo
3.0

3.0
Cambios en el solvente
Lo primero que puede hacerse para mejorar
un sistema de extraccin es cambiar el
solvente de extraccin por uno cuyo potencial
qumico estndar est ms prximo a
0
(R).
Puesto que la termodinmica no puede
realizar esto con seguridad se utiliza un
enfoque aproximado que utiliza parmetros de
solubilidad en el clculo de coeficientes de
particin.
Cambios en el solvente
El coeficiente de particin puede ser
expresado como:
( ) ( )
A
E A E R A R
p
TV
V V
K
R
ln
2 2
o o o o
=
Donde:
V
i
son los volmenes molares parciales del solvente
pesado, R, el solvente ligero, E, y el soluto A.

i
son los parmetros de solubilidad
correspondientes.
Parmetros de solubilidad
Solvente (cal
1/2
cm
-3/2
)

Amilacetato 8.0
Disulfuro de carbono 10.0
Tetracloruro de carbono 8.6
Cloroformo 9.2
Ciclohexano 8.2
Tolueno 8.9
Agua 9.4
Cambios en el soluto
Cuando no es factible cambiar el solvente es
necesario ver la posibilidad de realizar
cambios en el soluto. Estos cambios deben
ser de carcter reversible.

Cambios en el soluto por pares de iones
Cambios en el soluto por pH
Cambios en el soluto por pares de
iones
Los cambios en el soluto dependen del
comportamiento inico que ste pueda tener.
Si el soluto tiene comportamiento inico y es
posible encontrar un material que permita
suprimir esta ionicidad sin alterar el soluto,
entonces la unin del soluto a este material
permitir aumentar la solubilidad del soluto
en el solvente de extraccin.
Cambios en el soluto por pares de
iones
Los cambios a solutos empleando
contraiones se basan en el hecho de que un
soluto que es inico en agua, formar un
par-in sin carga neta en un solvente
orgnico.
Cambios en el soluto por pares de
iones
Si de una solucin acuosa de cloruro de
tetrabutilamonio se extrae el catin utilizando
cloroformo, se tiene
( ) | |
( ) | |
3 . 1
agua en
cloroformo en
4
9 4
4
9 4
= =
+
+
H C N
H C N
K
p
Si se agrega acetato de sodio a la solucin acuosa y
se realiza de nuevo la extraccin, se encuentra
( ) | |
( ) | |
132
agua en
cloroformo en
4
9 4
4
9 4
= =
+
+
H C N
H C N
K
p
Cambios en el soluto por pares de
iones
Puede observarse que en el primer caso se
extrae una solucin diluida de par-in de
N(C
4
H
9
)
4
+
Cl

y que en el segundo caso se
obtiene una solucin ms concentrada de
par-in de CH
3
COO

N(C
4
H
9
)
4
+
.
El empleo de pares inicos requiere de la
seleccin de contraiones solubles en la fase
no polar. Este tipo de sustancias se conoce
como sales grasas.
Contraiones tpicos
Ion Estructura qumica Observaciones
Acetato CH
3
COO
-
Simple, poco soluble en
solventes orgnicos
Butirato CH
3
(CH
2
)
2
COO
-
Ms soluble en solventes
orgnicos que el acetato
Tetrabutilamonio (C
4
H
9
)
4
N
+
Slido
Hexadecil-tributilamonio CH
3
(CH
2
)
15
(C
4
H
9
)
3
N
+
Puede formar micelas
Perfluor-octanato CF
3
(CF
2
)
6
COO
-
Puede permanecer inico
en solventes orgnicos
Dodecanato CH
3
(CH
2
)
10
COO
-
Puede formar micelas
Linolato CH
3
(CH
2
)
4
CH=CHCH
2
CH=(CH
2
)
7
COO
-
Puede formar cristales
lquidos
Tetrafenil-boruro B(C
6
H
5
)
4
-
Puede degradarse en
varios solventes
Cambios en el soluto por pH
Algunos productos como las protenas o los
aminocidos son sensibles a cambios en el
pH por lo que el conocimiento de las
propiedades cido-base es sumamente
importante.
Muchos de los solutos que se desean aislar
son cidos o bases dbiles por lo que su
extraccin puede ser afectada por cambios
en el pH.
Cambios en el soluto por pH
Un cido dbil puede ionizarse parcialmente en
agua y no ionizarse significativamente en un
solvente orgnico.
El cido dbil RCOOH, en solucin acuosa, se
disocia de la siguiente manera:

+
+ H COO COOH R R
Su constante de disociacin es
| | | |
| |
R
R R
a
COOH
H COO
K
R
R
+
=
Cambios en el soluto por pH
Cuando este cido dbil se distribuye en dos fases,
una orgnica, E, y una acuosa, R, el coeficiente de
particin aparente se expresa como

Combinando ecuaciones
| |
R
a
i
p
H
K
K
K
+
+
=
1
| |
| | | |
R R
E
p
COO COOH
COOH
K

+
=
R R
R
Cambios en el soluto por pH
El K
i
es el coeficiente de particin intrnseco y se
define como

Puesto que pK
a
= - log K
a
a
p
i
pK pH
K
K
=
(
(

|
|
.
|

\
|
1 log
10
| |
| |
R
E
i
COOH
COOH
K
R
R
=
Cambios en el soluto por pH
Para una base dbil:
pH pK
K
K
b
p
i
=
(
(

|
|
.
|

\
|
1 log
10
Los cambios en el coeficiente de particin pueden ser usados
tambin para seleccionar el pH al que debe extraerse
preferentemente un soluto determinado. Para dos solutos A y B
la selectividad de la separacin est dada por , donde:
( )
( )
( )
| |
( )
| |
|
|
|
|
.
|

\
|
+
+
|
|
.
|

\
|
= |
+
+
H
A K
H
B K
B K
A K
a
a
i
i
1
1
Tarea
Se dice que una variacin de una unidad
positiva entre el pH y el pK
a
provoca que poco
ms del 90% de las molculas se encuentren
en la forma ionizada. Por el contrario una
variacin de una unidad negativa entre el pH y
el pK
a
provoca que poco ms de 90% de las
molculas se encuentren en la forma
molecular.
Compruebe esta afirmacin utilizando la
ecuacin de Henderson-Hasselbach.
Valores de pK
a
para solutos biolgicos
Compuesto pK
1
pK
2
pK
3
cido actico 4.76
H
3
PO
4
2.14
Leucina 2.36 (COOH) 9.6 (NH
3
+
)
Histidina 1.82 (COOH) 9.17 (NH
3
+
) 6.0 (grupo R)
Lisina 2.18 (COOH) 8.95 (NH
3
+
) 10.53 (grupo R)
Gly-Gly 3.06 (COOH) 8.13 (NH
3
+
)
Gly-Asp 2.81 (COOH) 8.60 (NH
3
+
) 4.45 (grupo R)
Cefalosporina 3.9 5.3 10.5
Lincomicina 7.6
Penicilamina 1.8
Tarea
En el sistema agua-amilacetato la penicilina
K y la penicilina F tienen valores de K
i
de
215 y 131, respectivamente. Sus pK
a
s son
de 2.77 y 3.51.
Si se desea recuperar penicilina F,
determinar cmo se alcanza mayor pureza
de producto: si se extrae a pH 3.0 o a pH
4.0.
Seleccin del solvente
Se toman en cuenta las siguientes consideraciones:
Selectividad. Para cuando se requiere concentrar con cierto
grado de purificacin.
Coeficiente de particin. Mientras mayor sea menor ser la
cantidad de solvente a utilizar.
Grado de solubilidad. Mientras ms insoluble sea en la
alimentacin, la extraccin ser ms fcil.
Facilidad de recuperacin (reutilizacin).
Densidad. Mientras mayor sea la diferencia de densidad mayor
ser la separacin de fases.
Tensin superficial. Una tensin superficial alta favorece la
coalescencia.
Estabilidad del soluto. El solvente no debe cambiar al soluto.
Otras. Inocuo, esterilizable, no-inflamable, barato y disponible.
Tarea
Investigar la solubilidad de diferentes
solventes orgnicos en agua (solventes
inmiscibles con el agua) as como su
densidad.
Extraccin en dos fases acuosas
inmiscibles
Cuando se opera con sistemas biolgicos
hay un nmero limitado de solventes que
pueden ser usados en los procesos de
extraccin ya que algunas molculas de
inters como las protenas, pueden ser
desnaturalizadas por los solventes
orgnicos.
La extraccin en dos fases acuosas
inmiscibles permite preservar la actividad de
las biomolculas.
Extraccin en dos fases acuosas
inmiscibles
En general los sistemas de dos fases
acuosas se pueden clasificar en dos tipos:

Los sistemas polmero-polmero
Los sistemas polmero-sal

Extraccin en dos fases acuosas
inmiscibles
Los sistemas de dos fases acuosas inmiscibles
polmero-polmero se forman cuando dos
polmeros como el polietilen-glicol (PEG) y el
dextrano (un carbohidrato) se mezclan en
presencia de agua.
En el caso de los sistemas polmero-sal, el
sistema se forma por la mezcla en agua de un
polmero y una sal como el fosfato de potasio.
El hecho comn es que ambas fases son acuosas
y el contenido de agua vara entre 85 y 99%.
Extraccin en dos fases acuosas
inmiscibles
Los sistemas de dos fases se caracterizan
por presentar una baja tensin superficial en
el rango de 0.0001 a 0.1 dina/cm.
Esta baja tensin superficial y el hecho de
que las fases sean acuosas proporciona un
medio ambiente que permite que las
biomolculas y partculas celulares puedan
repartirse entre las fases conservando su
actividad.
Extraccin en dos fases acuosas
inmiscibles
La extraccin con dos fases acuosas de enzimas y
protenas es atractiva debido a que:
El escalamiento es sencillo (no hay variacin del
coeficiente de particin con la escala).
La transferencia de masa es alta y el equilibrio se
alcanza con poca energa de mezclado.
Se puede realizar en forma continua.
Los polmeros le confieren estabilidad a las protenas.
La separacin puede ser selectiva y rpida
La separacin puede efectuarse a temperatura
ambiente.
Es ms econmica que otros procesos.
Adsorcin
La adsorcin es una de las operaciones ms
utilizadas en la etapa de concentracin de
caldos acuosos diluidos. Mediante la
adsorcin, las molculas de un soluto se
concentran en una superficie slida por la
accin de fuerzas intermoleculares entre el
soluto y el slido. Debido a la naturaleza de
estas fuerzas el fenmeno es fcilmente
reversible.
Etapas de la
adsorcin
Fundamentos
Las operaciones de adsorcin son utilizadas en
la recuperacin de productos biotecnolgicos
como aminocidos, antibiticos, vitaminas y
enzimas.
Por lo anterior es necesario conocer los
fundamentos de la adsorcin que se centran en:
Los tipos de adsorcin segn el tipo de interaccin
Los tipos de adsorbentes
Las relaciones de equilibrio
La cintica de adsorcin
Tipos de adsorcin segn el tipo de
interaccin soluto-adsorbente
De acuerdo al tipo de interaccin del soluto
con el adsorbente, se distinguen cuatro tipos
bsicos de adsorcin:

Fsica
Inica
Hidrofbica
Por afinidad
Tipos de adsorcin
Tipos de adsorbentes
En el caso de la adsorcin fsica, el
adsorbente ms utilizado es el carbn
activado y menor grado la silica gel. Tambin
se utilizan resinas sintticas derivadas del
estireno-divinilbenceno para la adsorcin de
solutos no polares a partir de solventes
polares. Las resinas basadas en steres
acrlicos remueven solutos polares de
solventes no polares.
Tipos de adsorbentes
Los adsorbentes ms utilizados para
intercambio inico son sintticos. Estos
adsorbentes estn formados por matrices de
polmero unidos lateralmente. A la matriz se le
unen grupos funcionales que le dan la
capacidad de intercambio inico.
Estos adsorbentes tambin son derivados del
estireno-divinilbenceno. Tambin se utilizan
matrices de celulosa activada.
Tipos de adsorbentes
En la adsorcin por afinidad el adsorbente
consta de dos partes, el soporte o matriz y el
ligando. El ligando se une a la matriz por
medio de un brazo que evita impedimentos
estricos.
Las matrices utilizadas son fabricadas de
celulosa, celulosa modificada, poliacrilamida,
dextrano y agarosa.
Relaciones de equilibrio
El anlisis de los procesos de adsorcin requiere
de datos de equilibrio que se expresan
normalmente como isotermas de adsorcin. Las
isotermas son parte esencial para modelar la
adsorcin y por lo tanto para el diseo, clculo de
eficiencias y costos. Las isotermas nos permiten
estimar el grado de purificacin que puede ser
alcanzado, la cantidad de adsorbente requerido y
la sensibilidad del proceso respecto a la
concentracin del producto.
Isotermas de adsorcin ms comunes
Isoterma de Freundlich
La isoterma de Freundlich se describe por la
ecuacin exponencial:
n
Ky q =
Donde
q es la cantidad de soluto adsorbida por cantidad de
adsorbente, y es la concentracin de soluto en la
solucin, n es una constante adimensional y K es una
constante cuyas unidades dependen de n.
Tanto K como n se determinan experimentalmente.
Isoterma lineal
La isoterma lineal se describe por la
siguiente ecuacin :
Ky q =
Donde
q es la cantidad de soluto adsorbida por
cantidad de adsorbente, y es la concentracin
de soluto en la solucin y K es una constante de
proporcionalidad que se determina
experimentalmente.
Isoterma tipo Langmuir
La isoterma tipo Langmuir se describe por la
siguiente ecuacin :
y K
y q
q
d
o
+
=
Donde
q
o
es la capacidad mxima del adsorbente y K
d

es la constante de desorcin
Ambas constantes, q
o
y K
d
, se determinan
experimentalmente
Tarea
Los datos de equilibrio de la adsorcin de albmina de
suero bovino en Q-sefarosa se presentan en la tabla
y mg/ml q mg/ml
0.05 30.00
0.10 43.70
0.20 56.53
1.00 73.85
2.00 76.81
4.00 78.37
Encontrar la expresin matemtica
de la isoterma que mejor ajusta los
datos
Cintica de la adsorcin
El estudio de las isotermas de adsorcin nos
permite determinar el grado de separacin
que puede ser logrado y la sensibilidad del
proceso con respecto a la concentracin del
soluto. Sin embargo, para el desarrollo del
modelo de la adsorcin es necesario poder
establecer la velocidad de adsorcin
(mediante el empleo de coeficientes de
transferencia de masa) o el tiempo necesario
para alcanzar una cierta separacin.
Cintica de la adsorcin
La velocidad efectiva de la adsorcin
depende tanto de las condiciones de
operacin (flujo, temperatura, composicin y
presin), como de la configuracin del
sistema (intermitente, columna, etc.) y del
tamao del equipo. El estudio de estos
efectos se divide en dos conceptos:
Los mecanismos de transporte (fsicos y qumicos)
Los efectos de mezclado
Mecanismos de transporte
En los procesos de adsorcin se utilizan
materiales porosos que ofrecen una gran rea
por unidad de volumen.
Las resistencias al movimiento del soluto en
adsorbentes porosos son:
Resistencia de la pelcula que rodea al adsorbente
Resistencia a la difusin en el seno del adsorbente
Resistencia a la difusin dentro del poro
Resistencia a la reaccin en la superficie
Resistencias en la
adsorcin
Control de la resistencia en la pelcula
Cuando la resistencia de la pelcula es
mucho mayor que la del poro o la de la
reaccin de superficie, la velocidad de
adsorcin est controlada por el flujo de
soluto a travs de la pelcula que rodea al
adsorbente. En este caso la expresin de
velocidad de adsorcin puede expresarse
como:
( )
*
y y a k R
L
=
Control de la resistencia en la pelcula
Donde:
k
L
es el coeficiente de transferencia de masa
a es el rea del adsorbente por unidad de volumen
de lecho
y es la concentracin de soluto en el seno del
lquido
y
*
es la concentracin de soluto en el lquido en
equilibrio con la concentracin de soluto en el
adsorbente
R es la velocidad de adsorcin referida al volumen
del lecho
( )
*
y y a k R
L
=
Control de la resistencia en la pelcula
La resistencia de la pelcula por si misma
rara vez controla la rapidez de la
transferencia de masa, excepto en los casos
en que la partcula de adsorbente es
pequea y la difusividad en el poro es
grande.
Control de la resistencia en la pelcula
Para sistemas de adsorcin en columnas, k
L

generalmente se puede correlacionar con
una expresin de la forma:
( ) ( )
b a
C C Sc Re Sh
2 1
+ =
AB
p L
D
d k
= Sh
L
p L
d v

= Re
AB L
L
D

= Sc
Control de la difusin del soluto en el
seno del adsorbente
La difusin en la fase slida del soluto una
vez que ha pasado del seno del lquido a la
fase slida, se presenta en algunos slidos
homogneos permeables como la resinas de
intercambio inico o en adsorbentes porosos
impregnados con lquido. Considerando una
geometra esfrica uniforme el balance de
soluto en la partcula est dado por:
|
|
.
|

\
|
c
c
+
c
c
=
c
c
r
q
r r
q
D
t
q
s
2
2
2
Control de la difusin del soluto en el
seno del adsorbente
Donde:
D
s
es la difusividad efectiva del soluto en la fase
slida
r es la coordenada radial al interior de la partcula
q es la concentracin de soluto en la fase slida
|
|
.
|

\
|
c
c
+
c
c
=
c
c
r
q
r r
q
D
t
q
s
2
2
2
Control de la difusin del soluto en el
seno del adsorbente
Las condiciones frontera son:
|
|
.
|

\
|
c
c
+
c
c
=
c
c
r
q
r r
q
D
t
q
s
2
2
2
a
R r
s
r
q
aD R
=
c
c
=
0
0
=
c
c
= r
r
q
Control de la difusin del soluto en la
fase lquida al interior de los poros
Cuando la velocidad de adsorcin est
controlada por la difusin del soluto al
interior de los poros de la partcula de
adsorbente, hasta el sitio de adsorcin, el
balance de soluto al interior de la partcula
est dado por la expresin:
( )
t
q
r
y
r r
y
D
t
y
p
c
c
c
|
|
.
|

\
|
c
c
+
c
c
=
c
c
c 1
2
2
2
Control de la reaccin de superficie
Generalmente la reaccin de adsorcin en la superficie
del adsorbente es mucho ms rpida que los otros
mecanismos y rara vez es el mecanismo controlante.
Dos expresiones utilizadas para sistemas de
intercambio inico son:
Cintica reversible de primer orden


Cintica reversible de segundo orden
( ) q k y k R
2 1
c =
( ) | | q k q q y k R
o 2 1
c =
Efectos de mezclado
La velocidad de adsorcin efectiva tambin
puede disminuir por efectos de un mezclado
imperfecto. Esta situacin es caracterstica
de columnas largas donde se presentan
irregularidades en el flujo (canalamiento) o
en el mezclado (espacios muertos, difusin
molecular o dispersin axial).
Efectos de mezclado
Uno de los modelos ms utilizados para
describir la desviacin del comportamiento
ideal del flujo al interior de columnas, es el
modelo de flujo tapn con dispersin, donde
los efectos de la dispersin axial debida a
remolinos y a la difusin molecular, se
agrupan en el concepto del coeficiente
efectivo de dispersin axial.
Modelo de flujo tapn con dispersin
Resistencias combinadas
En la elaboracin de un modelo cintico se
puede suponer que una resistencia a la
transferencia de masa es la controlante, lo cual
simplifica la solucin matemtica del modelo
de adsorcin. Sin embargo en algunos
sistemas, la cintica de adsorcin puede ser
descrita en forma ms adecuada utilizando un
modelo donde la combinacin de resistencias
(por ejemplo pelcula y poro) describen en
forma ms precisa la cintica,
Resistencias combinadas
Surge entonces el coeficiente global de
transferencia de masa y solo basta fijar si las
resistencia estn relacionadas en serie o en
paralelo. Por ejemplo, si se consideran que las
resistencias de pelcula y poro estn actuando
en serie se tiene:
p L o
k k K
1 1 1
+ =
Adsorcin en lecho fijo
La adsorcin en lecho fijo es la operacin ms
empleada a escala industrial para la concentracin de
caldos. Este tipo de operacin se efecta en columnas
empacadas con adsorbente. Por la parte superior de la
columna se alimenta la solucin que contiene al soluto
de inters. Durante su paso por la columna el soluto es
adsorbido en el lecho y la solucin agotada es obtenida
en el fondo de la misma. Una vez que la concentracin
de soluto a la salida alcanza cierta concentracin, se
interrumpe la operacin y se recupera el soluto
concentrado.
Adsorcin en lecho fijo
En la descripcin de la adsorcin en columna
se utilizan grficas de la variacin de la
concentracin de soluto a la salida de la
columna con el tiempo. Estas grficas son
llamadas curvas de rompimiento.
La forma de esta curva depende del tipo de
equilibrio del sistema y de los mecanismos de
transporte involucrados.
Teora cintica
Los modelos de columnas de adsorcin que
se enmarcan dentro de la teora cintica se
desarrollan mediante la combinacin de
balances de masa, relaciones de equilibrio,
relaciones de transferencia de masa entre
las fases y las condiciones iniciales y de
frontera del sistema.
Balance de soluto
en el volumen de
una columna de
adsorcin
Balance de soluto en la fase lquida
Velocidad de acumulacin de soluto en la
fase lquida = velocidad de entrada de soluto
por conveccin velocidad de salida de
soluto por conveccin + velocidad de entrada
de soluto por dispersin velocidad de
salida de soluto por dispersin velocidad
de adsorcin de soluto por el slido.
Balances de soluto en las fases lquida
y slida
En un sistema isotrmico y despreciando los
efectos radiales este balance puede ser
escrito como:
R
dz
dy
v
z
y
E
t
y

c
c
=
c
c
c
2
2
El balance de masa del soluto sobre el
adsorbente se puede expresar como:
( ) R
t
q
=
c
c
c 1