Introduccin

Las protenas son macromolculas que se conforman por una o ms cadenas de aminocidos, una protena tpica puede contener de 200 a 300 aminocidos, siendo unos ms pequeos que otros. Esto nos da a entender que los aminocidos son la unidad funcional y estructural de una protena. Qu es un pptido? Se conoce como pptido a la unin de 2 o ms aminocidos mediante enlaces amida. Qu es un polipeptido? Las protenas se encuentran formadas por molculas llamas Polipeptidos, los cuales son una secuencia de aminocidos que estn unidos entre s por medio de enlaces peptdicos, si los aminocidos unidos en el enlace son ms de 100 entonces ya se consideran una protena. Qu es una protena? Las protenas son compuestos qumicos muy complejos que se encuentran en todas las clulas vivas se componen de carbono, hidrogeno, oxgeno y nitrgeno. Clasificacin de protenas Las protenas se clasifican segn su estructura: Las Holoprotenas, que son aquellas protenas formadas solamente por aminocidos, las cuales pueden ser Globulares o Fibrosas. Las Heteroprotenas las cuales estn formadas por aminocidos y un grupo prosttico. Estas pueden ser Glicoprotenas, Metaloprotenas, Lipoprotenas y Fosfoprotenas.

La estructura primaria de una protena hace referencia a la secuencia de aminocidos por los cuales se compone, el primer aminocido tiene siempre libre el grupo amina, recibiendo as el nombre de deaminocido n-terminal. El ltimo aminocido siempre tiene libre el grupo carboxilo, recibiendo as el nombre de aminocido c-terminal. Cabe mencionar que la estructura primaria ser la que determine las dems estructuras de la protena. Estructura secundaria Esta estructura es el nivel de organizacin que adquiere la molcula, dependiendo de cmo sea la secuencia de aminocidos por la que se compone y se refiere a la conformacin de local de algunas de las partes del polipeptido. Hay dos tipos de estructuras secundarias: -hlice lminas

Estructura Terciaria Se refiere a la forma que manifiesta una protena en el espacio, esta depende de la estructura de los niveles de organizacin inferiores, puede tener una conformacin redondeada y compacta lo que le da un aspecto globular pero a su vez tambin puede ser una estructura fibrosa y alargada. Las protenas con una forma globular van a recibir el nombre de escleroprotenas. Estructura Cuaternaria Cuando ocurre una unin de varias protenas entre s, se forma una organizacin superior, esta es la estructura cuaternaria. Cada protena que forma la asociacin va a conservar su estructura terciaria. Las uniones se realizan mediante un gran nmero de enlaces dbiles. Materiales: Para esta prctica se utilizaron: 20 tubos de ensayo Pipetas

Estructura de las protenas La estructura de una protena se puede estudiar desde 4 niveles de complejidad, los cuales son la estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria Estructura Primaria

Propipetas 2 vasos de precipitado 2 mecheros bunsen 2 telas de alambre 1 gradilla Albmina Peptona Gelatina Tirosina Reactivo de Biuret cido Ntrico (NHO3) Hidrxido de Amonio (NH4OH) Agua destilada

Cuestionario 1. Describir y explicar mediante un esquema la reaccin entre el reactivo de Biuret y los enlaces peptdicos

5. Explique porque cada protena se comporta de manera diferente en las reacciones de Biuret y en la Xantoproteica En la reaccin de Biuret la coloracin de las sustancias va a depender de la cantidad de enlaces peptdicos que solo se encuentran en protenas, por ende si no es una protena no tendr enlaces peptdicos y su coloracin ser azul cielo. En la Xantoproteica, la coloracin depende de la presencia de un anillo bencnico que caracteriza a los compuestos aromticos que pueden ser o no ser protenas lo que indica que independientemente de ser protena o no, si hay existencia de anillo bencnico el cido ntrico reaccionara con este dndole color amarillo a la sustancia. Objetivo Identificar protenas por sus caractersticas estructurales que se pueden comprobar mediante diferentes tcnicas de clasificacin y cuantificacin. Metodologa

La reaccion de Biuret es un metodo que detecta la presencia de enlaces peptidicos

Su reactivo (sulfato de cobre) reacciona con los enlaces peptidicos y cambia el color cuando entra en contacto con otra sustancia

Mientras mas cantidad de proteina este presente mas oscuro sera el tono de violeta.

Primero se procedi a asegurarse que los materiales a utilizar se encontraran limpios, una vez que los materiales estuvieron limpios y secos se separaron 5 tubos de ensayo para cada reaccin del experimento 1 y se colocaron en la gradilla. A continuacin en cada tubo se colocaron las sustancias estndar a utilizar segn la tabla para cada reaccin utilizando las Propipetas y pipetas, una vez que las sustancias se colocaron en los tubos de ensayo se utiliz un marcador para sealar que sustancia se encontraba en cada tubo y as evitar confusiones.
Tabla 1. Datos de la reaccin de Ninhidrina sobre la cantidad de sustancias a colocar en cada tubo de ensayo.

2. Mencione y describa 2 reacciones que sean anlogas a la Xantoproteica Test de Le Rosen y Test de Friedel, ya que ambas reacciones identifican hidrocarburos aromticos

3. Mencione 2 reacciones que sirvan para cuantificar protenas Reaccin de Biuret y Reaccin de Lowry

Tubo Estndar (ml) Agua (ml) Ninhidrina 1 2 3 0.5 ml Peptona 0.5 ml Gelatina 0.5 ml Albmina -------------------------------0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

4. Define el termino de secuencia proteica La secuencia de aminocidos se refiere al orden en el que se encuentran los aminocidos en una protena

4 5

0.5 ml Tirosina -----------------

----------0.5 ml

0.5 ml 0.5 ml

Color azul cielo corresponde a un resultado negativo.

Reaccin Xantoproteica Despus de que se tuvo las sustancias estndar en cada tubo, como lo indica la tabla, se colocaron 0.5 ml de Ninhidrina a cada tubo, despus se mezclaron las sustancias en el tubo de ensayo y se calentaron en bao Mara por 3 minutes utilizando un mechero bunsen. En una reaccin de Ninhidrina el resultado depende del color que tome cada muestra. Un color violeta indica que el resultado es positivo Si la muestra es transparente el resultado es negativo.
Tabla 3 Cantidad de Sustancias a agregar a los tubos de ensayo en la reaccin Xantoproteica

Tubo 1 2 3 4 5

Estndar (ml) 0.5 ml Peptona 0.5 ml Gelatina 0.5 ml Albmina 0.5 ml Tirosina --------------

Agua (ml) ----------------------------------------------------0.5 ml

HNO3 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Reaccin de Biuret
Tabla 2 Cantidad de Sustancias a agregar a cada Tubo de ensayo Para la Reaccin Tubo Estndar (ml) Agua (ml) Reactivo de Biuret

Al igual que en las reacciones anteriores, Primero se colocaron las sustancias estndar, agua y cido ntrico (HNO3) en cada tubo de ensayo segn lo indicado en la tabla. Una vez que se tuvo cada tubo de ensayo listo y marcado, se procedi a calentarlos por 5 minutos a bao Mara sobre el mechero Bunsen. Una vez que se termin de calentar las sustancias, se procedi a retirarlas del fuego y sacarlas del bao Mara para que se enfriaran por 10 minutos. Una vez transcurridos los 10 minutos se agregaron 4 gotas de Hidrxido de Amonio (NH4OH), se dej reposar las sustancias y los cambios se observaron segn transcurri el tiempo. En una reaccin Xantoproteica un anillo amarillo indica que es un Nitroderivado.

1 2 3 4 5

1 ml Peptona 1 ml Gelatina 1 ml Albmina 1 ml Tirosina -------------

------------------------------------------------1 ml

de Biuret 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Al igual que en la reaccin de Ninhidrina se colocaron las sustancias estndar en los tubos de ensayo y despus se coloc agua, seguido de reactivo de Biuret en cada uno, segn lo indicado en la tabla, una vez que se colocaron las sustancias se mezclaron las sustancias y se dejaron en reposo por 15 minutos. Color violeta corresponde a resultado positivo

Si la reaccin fue positiva aparece un anillo y se toma un color amarillo Si la reaccin es negativa ser transparente.

Experimento 2 La finalidad del segundo experimento es la cuantificacin de protenas.

Se tomaron 5 tubos de ensayo para colocar disoluciones seriadas de albmina con una concentracin inicial de 10 mg/ml, despus de 5, 2.5, 1.25 y .625 respectivamente, a continuacin en el primer tubo se administraron 2 ml de albmina a 10 mg/ml, en el segundo tubo se colocaron 2 ml de albmina y 2 ml de agua destilada, despus se utiliz una propipeta para colocar 2ml del tubo 2 en el tubo 3 en el cual tambin se coloc agua destilada a 2 ml, el procedimiento se repiti hasta el quinto tubo, una vez terminado este paso, se mezclaron las sustancias en cada tubo y se procedi a colocar reactivo de Biuret a cada tubo y se dejaron en reposo por 15 minutos. Una vez terminado este paso las muestras se llevaron a un espectrofotmetro calibrado a 0 utilizando el tubo blanco, el espectrofotmetro registr una longitud de onda de 595 nm. Utilizando las absorbancias obtenidas se procedi a realizar una curva de calibracin. Se prosigui a medir la absorbencia de las muestras problema y se procedi a calcular la concentracin con la ecuacin y = 0.547x + 0.0627 en la que y
representa la concentracion. Problema 1 ( Problema 2 ( ) ) absorbancia y x representa la

Ilustracin 1 se observan de izquierda a derecha, Blanco, Gelatina (violeta claro), Peptona (violeta), Albmina (violeta), tirosina (violeta)

Reaccin Xantoproteica La reaccin Xantoproteica se utiliza para determinar la cantidad de protena soluble en una solucin utilizando cido ntrico concentrado, reacciona sobre grupos bencenos y con el cido ntrico se forman derivados de nitrgeno.

Ilustracin 2 se Observan de izquierda a derecha, Tirosina (amarilla y con anillo), Albmina (amarilla y con anillo), Gelatina (sin cambios), Peptona (sin cambios), Blanco que se encuentra en esta imagen detrs de la peptona (sin cambios)

Reaccin de Biuret Las muestras tomaron diferentes tonalidades violeta dependiendo en su cantidad de enlaces peptdicos

Resultados Experimento 1 Reaccion de Ninhidrina Se observo proteinas en las muestras a excepcion del tubo blanco, todos los demas cambiaron a diferentes sombras de violeta.
Ilustracin 3 Se observa de izquierda a derecha: Tirosina (sin cambio), Blanco (sin cambio), Albmina (violeta), Gelatina (violeta), Peptona (violeta)

Experimento 2 Cuantificacin de protenas

de los 2 es protena, lo cual se comprob que era cierto. Reaccin Xantoproteica Al terminar la reaccin se pudo observar que la albmina y la tirosina son compuestos aromticos con anillos bencnicos ya que estas reaccionaron con el cido ntrico formando derivados del nitrgeno a diferencia de las dems sustancias que al no tener anillos bencnicos no tuvieron reaccin con el cido ntrico y no tuvieron cambios. Experimento 2 La absorcin de la luz es una caracterstica importante porque se pude utilizar para cuantificar sustancias, la absorcin de luz depende de la estructura qumica del compuesto que la absorbe asi como de sus grupos funcionales. Con el espectofotometro que sirve para medir la amplitud de onda se puede medir la absorbancia de luz de una serie de solucioes de concentracin conocida siempre y cuando sean tratadas con el mismo mtodo y en el mismo instrumento a igual longitud de onda, asi se puede graficar una curva de calibrado con la cual despus se puede determinar la concentracin de una muestra problema. Conclusin:
y = 0.0547x + 0.0627 R = 0.8132

Muestras problema y su absorbancia 1:

2:

Absorbancia
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8

10

12

Absorbancia

Linear (Absorbancia)

Discusin En el experimento 1 en la reaccin de Ninhidrina desde un principio se supo que los tubos que cambiaran de color seran los primero 4 ya que eran los que son protenas mientras que la tirosina es un aminocido por la tanto en ella no deba haber cambios, esto se comprob al terminar la reaccin. En la reaccin de Biuret En esta reaccin se esperaba de antemano que la tirosina y el blanco se tornaran azules pues ninguno

Es importante saber que las protenas estn compuestas por aminocidos y que estas mismas pueden formar otros compuestos, por lo cual es importante conocer tcnicas de identificacin de protenas cualitativas y cuantitativas as como que es lo que pasa en cada una de las diferentes tcnicas y el porqu. Bibliografa Lenhinger Albert L. (1978). Bioqumica, Las bases moleculares de la estructura y funcin celular. Casanova, 220-Barcelona: Omega, S.A. Murray Robert K. (2010) Bioqumica Harper. Bioqumica ilustrada 28. ed. editorial: McGraw-Hill

http://chem.winthrop.edu/faculty/grossoehme/lin k_to_webpages/courses/chem525/methods.pdf