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Determinao da viabilidade, brotamento e populao de leveduras (microscopia)

Nome Elaborao Anlise Crtica Aprovao Silene C. de Lima Paulillo Rudimar Cherubin Mrio Lcio Lopes Data 28/08/2006 26/02/2007 28/02/2007 Visto

1.

Escopo O mtodo descrito a seguir destina-se a descrever a metodologia para a Determinao da Viabilidade Celular, Brotamento e Populao de Leveduras por microscopia ptica em amostras de caldo de cana e vinho bruto.

2.

Sumrio do Mtodo O procedimento analtico se baseia na colorao de clulas de leveduras no viveis.

3.

Interferncias No aplicvel

4.

Definies e Terminologias Leveduras So fungos unicelulares, eucariontes e que possuem ncleo verdadeiro. Existem vrias espcies diferenciadas.

5.

Documentos Complementares

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a. b. c. d. e. f. g. h.

GE.002 LB.002 LB.003 EQ. xxx pertinentes. LE ME LB.008 Micropipetas.

Controle de Registros Recebimento e Controle da Amostra Segurana Geral no Laboratrio Procedimentos operacionais dos equipamentos Lista de Equipamentos de Medio e/ou Ensaios Manual dos Equipamentos Pertinentes Procedimento para Esterilizao de Vidrarias e

LB. 009 Procedimento para Esterilizao de gua Destilada ou Desmineralizada.

6.

Registros Aplicveis a. FRA Formulrios de Resultados Analticos RQ.029

7.

Referncias Normativas e Bibliogrficas a. CEREDA,M.P.,PINHO,S.Z.;MENEGUIM,M.A. Mtodos de avaliao de clulas viveis de levedura. In. CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 11. Florianpolis. 1981. Anais.

b. Roteiro para Treinamento de Controle Microbiolgico por Microscopia, 47p. Rev. Janeiro de 2006. Piracicaba, 2006. FERMENTEC-Editora.

8.

Informaes da Amostra Uma amostra slida ou lquida que est disponvel para ser analisada, que j foi aprovada na inspeo de recebimento de amostra, realizada no ato da sua entrada no laboratrio, conforme instrues previstas no LB.002. Portanto, toda amostra deve estar: Claramente descrita na Requisio para Anlises; Com identificao individual, nica e legvel (etiqueta); Armazenada em meio apropriado;

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Em quantidade suficiente para a anlise; Mantida temperatura adequada;

9.

Equipamentos e Vidrarias a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. k. Balana Microscpio ptico Agitador de tubos Tubo de ensaio 16 X150 mm. Cmara de Newbauer Lamnula Pipetas (0,1 mL e 1mL) Micropipeta Ponteiras Algodo Funil

10.

Solventes e Reagentes a. b. c. gua destilada ou desmineralizada Soluo de Eritrosina Soluo Tampo Fosfato

11.

Solues Todas as solues devem ser preparadas de acordo com o Procedimento para preparo de solues da Fermentec.

12.1. Soluo estoque de eritrosina Pesar 1,0g 0,01g de Eritrosina e dissolver em 100mL de gua destilada e esterilizada. Cobrir o frasco com papel laminado, para mant-lo fora do alcance da luz. Conservar a soluo em geladeira.

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12.2. Solues tampo fosfato.

12.2.1.Soluo A Pesar em folha de papel laminado 17,90 0,01g de Na2HPO4 Transferir para balo volumtrico de 250 mL .Dissolver com gua destilada esterilizada, com agitao at completa dissoluo. Completar o volume. Validade da Soluo A: 8 meses.

12.2.2. Soluo B Pesar em folha de papel laminado 6,89 0,01g de Na2HPO4. Transferir para balo volumtrico de 250mL. Dissolver com gua destilada esterilizada, com agitao at completa dissoluo. Completar o volume.

12.2.3. Soluo tampo fosfato de trabalho Em um frasco de vidro com tampa, adicionar as solues A e B em propores de 1:1. Homogeneizar e, conservar em geladeira. Validade da Soluo B: 8 meses.

12.2. Soluo de trabalho de eritrosina: Transferir 1mL da soluo estoque de Eritrosina para um frasco mbar e diluir em 50mL da soluo Tampo Fosfato de Trabalho.

12.

Condies Ambientais No Aplicvel

13.

Procedimento de Ensaio Amostras de caldos Homogeneizar a amostra; Filtrar a amostra em algodo para eliminar as impurezas slidas em suspenso;

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Transferir 1 mL de amostra filtrada para um tubo de ensaio; Transferir 1 mL da soluo corante para o tubo de ensaio que contm 1 mL da amostra filtrada; Homogeneizar em agitador para tubos; Transferir 2,0 ou 3,0 l da amostra corada para uma lmina de vidro (26x76 mm); Colocar uma lamnula sobre a preparao, tomando o cuidado para no formar bolhas; Realizar a contagem de bastonetes no corados presentes em 70 campos, uniformemente distribudos em toda a rea da lamnula, utilizando a objetiva para imerso (100x).

Amostras de vinho bruto Homogeneizar a amostra; Transferir uma alquota da amostra (3 5 mL) para um tubo de ensaio; Adicionar papana na amostra; Homogeneizar em agitador para tubos; Deixar em repouso durante 5 min; Homogeneizar em agitador para tubos; Diluir a amostra com gua destilada; A diluio realizada para que o nmero de clulas seja adequado para a faixa de maior preciso da metodologia; Transferir 1 mL da amostra diluda para outro tubo de ensaio; Transferir 1 mL da soluo corante para o tubo de ensaio que contm a amostra diluda; Homogeneizar em agitador para tubos; Transferir 2,0 L (lamnula de 20 x 20mm) ou 3,0 L (lamnula de 22 x 22mm) da amostra corada para uma lmina de vidro (26x76 mm); Colocar uma lamnula sobre a preparao, tomando o cuidado para no formar bolhas;

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Proceder a contagem de bastonetes no corados presentes em 50 campos, uniformemente distribudos em toda a rea da lamnula, utilizando a objetiva para imerso (100x).

14.1.

Contagem das clulas de leveduras A contagem das clulas de leveduras poder ser feita com objetiva de imerso (100X). Focalizar as clulas de leveduras com objetiva de imerso (100 x). Contar as clulas contidas nos quatro retculos centrais dos 25 quadrculos da cmara. Contar as clulas de leveduras vivas, clulas de leveduras mortas e brotamento vivo individualmente.

Clula Viva Clula Morta Clula em Brotamento, vivo Clula em Brotamento, morto

No colorida, caracterizada por transformar o corante eritrosina para forma incolor. Rosa intenso, por incapacidade de transformar o corante. Apresenta uma colorao idntica a da clula me Apresenta uma colorao idntica a da clula morta

OBS: As clulas de brotamento mortas no so consideradas como brotos. So considerados como brotos as clulas cujo tamanho for menor que a metade da clula me ou originria. . 14.2. Clculos e Apresentao dos Resultados 14.2.1.Clculo para determinao da porcentagem de clulas viveis. % de Clulas Viveis = [(Total de clulas vivas / (Total de clulas vivas + mortas)] x100

14.2.2.Clculo para determinao da porcentagem de clulas em brotamento. % de Brotamento = (Total de clulas em brotamento / Total de clulas vivas) x100

14.2.3.Clculo para determinao da populao de leveduras. Populao leved./mL = [(Total de clulas vivas x 4000) / Total de retculos contados)] x diluio x 1000 Sendo: Total de retculos contados (objetiva 100x) = 25 quadrculos x 4 retculos = 100 .

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14. Anexos No aplicvel