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c a p t u l o

Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

Marcadores genticos: Deniciones y conceptos bsicos

El genoma nuclear humano comprende aproximadamente 3.200.000.000 nucletidos de cido desoxirribonucleico (ADN) empaquetados en molculas lineales de ADN, cada una contenida en un cromosoma diferente (Brown, 2002) (ver pgina web http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html para estadsticas generales sobre el genoma humano). Los cromosomas consisten en 22 autosomas y 2 cromosomas sexuales (X e Y). La inmensa mayora de las clulas nucleadas del organismo humano son diploides y poseen dos copias de cada autosoma ms dos cromosomas sexuales (XY en hombres y XX en mujeres), lo que lleva a un total de 46 cromosomas en cada clula. Estas clulas son las llamadas somticas, en contraste con las clulas de la lnea germinal (gametos) que son haploides y slo tienen 23 cromosomas. En las clulas somticas, los cromosomas se organizan en pares llamados pares homlogos (uno heredado desde la madre y otro desde el padre) que contienen la misma sucesin de genes y marcadores genticos. Sin embargo, la secuencia nucleotdica de estos genes no siempre es exactamente igual en los genes del cromosoma paterno respecto a los genes del cromosoma materno debido a la existencia de variaciones genticas. A lo largo de este libro, se asumir por parte del lector un conocimiento bsico de la estructura y funcin del ADN, en especial en referencia a la secuencia especca de nucletidos adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), que dene la informacin gentica contenida en el genoma. La secuencia nucleotdica en el genoma nuclear se organiza de forma general en secuencias relacionadas con genes (secuencias codicantes, promotoras, intrones, UTRs) y no-codicantes (repetitivas o no repetitivas). Un porcentaje sensible del genoma estara compuesto por las llamadas duplicaciones segmentarias o duplicones. Las duplicaciones segmentarias se denen como fragmentos de ADN mayores de 1 Kb, que se encuentran ms de una vez en el genoma, ya sea en un mismo cromosoma o en diferentes cromosomas, y que comparten una identidad de secuencia superior al 90% (Emanuel y cols., 2001). Hay que mencionar que el proyecto ENCODE (The ENCODE Project Consortium, 2007) ha revelado una gran actividad transcripcional y una gran complejidad en los elementos funcionales del genoma, que van mucho ms all de las originales visiones del gen como unidad discreta de la herencia (Gerstein y cols., 2007). El examen conjunto de los diferentes tipos de variaciones genticas, junto con el anlisis funcional del genoma, ser decisivo en el futuro prximo para estimar la contribucin de la gentica frente a la susceptibilidad a desarrollar enfermedades, as como al estudio de la diversidad gentica humana (Redon y cols., 2006; Wong y cols., 2007; The ENCODE Project Consortium, 2007). El material gentico humano tambin incluye la presencia del ADN mitocondrial (ADNmt). El ADNmt se diferencia claramente del ADN nuclear debido a su localizacin en un organelo citoplasmtico, su alta tasa de mutacin, su reducido tamao (incluye slo 37 genes en algo ms de 16.500 nucletidos) y en la disposicin continua de sus genes (Anderson y cols., 1981). Se han

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Epidemiologa gentica

descrito diferentes haplogrupos del ADNmt que se han relacionado con grupos tnicos y con susceptibilidad a enfermedades comunes (Moraga y cols., 2000; Huerta y cols., 2005). El ADNmt se hereda por va materna, lo que signica que las enfermedades mitocondriales presentan una herencia desde la madre hacia la progenie en un patrn vertical no mendeliano. El ADNmt se caracteriza por presentar poliplasmia, lo que signica que existe un alto nmero de copias de ADNmt tanto por mitocondria (entre 2 y 10 copias) como por nmero de copias por clula (entre 1.000 y 100.000 copias de ADNmt por clula en la mayora de los tejidos). En humanos, se ha descrito tambin la existencia de heteroplasmia o coexistencia de diferentes mutaciones en el ADNmt dentro de un mismo sujeto, lo que se ha asociado generalmente con la severidad de ciertas enfermedades mitocondriales (Chinnery y cols., 2000; Strachan y Read, 1999). Las diferencias que ocurren en la secuencia de ADN en una localizacin gentica determinada (locus gentico; en plural loci) dan lugar a diferentes versiones de un gen que se denominan alelos. Por tanto, un alelo se dene como cada una de las formas alternativas de un gen que pueden existir en una localizacin especca o locus. En los genes localizados en autosomas, cada persona tiene dos copias o versiones del mismo gen: una copia proviene del padre y otra proviene de la madre. Cuando en un mismo locus gentico no hay diferencia de secuencia entre la copia heredada del padre y la copia heredada de la madre, se dice que el sujeto es homocigoto en esa posicin (posee dos copias del mismo alelo), mientras que si coexisten dos alelos diferentes dentro de un mismo sujeto en ese locus, se dice que el sujeto es heterocigoto. Cuando en la poblacin existen al menos dos alelos, y ambos relativamente frecuentes en la poblacin (con frecuencia de al menos el 1% al 2% en el alelo menos frecuente), se dice que existe polimorsmo en ese locus (Vogel y Motulsky, 1997). En esta situacin, existe ms de un genotipo en la poblacin (genotipo = combinacin de alelos en un locus gentico), siendo el nmero de genotipos posibles dependiente del nmero de alelos que existan para ese gen, mientras que el nmero de genotipos observados en un grupo de sujetos depender del nmero de alelos existentes y de su frecuencia relativa en la poblacin. Cuando slo existen variantes genticas raras (denidas arbitrariamente como frecuencia menor del 1% al 2% en la poblacin) (Vogel y Motulsky, 1997), generalmente se habla de una mutacin

en lugar de un polimorsmo, especialmente si esta variante rara desemboca inevitablemente en una enfermedad. En cualquier caso, existe en la literatura gentica y epidemiolgica cierta inconsistencia sobre el uso de los trminos mutacin y polimorsmo (Cotton, 2002). En un sentido clnico, tambin se usa el trmino mutacin para referirse a alelos que conducen a un fenotipo patolgico severo, mientras que los cambios en la informacin gentica que no producen efecto visible sobre la enfermedad se denominan comnmente polimorsmos. Este tipo de denominaciones corre en paralelo con la clsica denicin de polimorsmo que se reere a los cambios genticos que se encuentran al menos en el 1% de la poblacin. En general, las variantes genticas muy abundantes tienen frecuentemente un sentido clnico escaso o nulo, por lo que ambas deniciones (clnica y clsica) coinciden en muchos casos (Cotton, 2002). El examen exhaustivo de la estructura del genoma humano est fuera del alcance de este libro. Por el contrario, en el presente captulo y en adelante, nos centraremos en la descripcin de la naturaleza y el uso de los marcadores ms comnmente empleados en estudios de epidemiologa gentica, que son los marcadores microsatlites (STR) y los polimorsmos simples de cambios de una sola base (SNP). Se mencionar tambin otros tipos de polimorsmos genticos, tales como repeticiones en tndem de tipo minisatlite (Mata y cols., 2004), pequeas inserciones/deleciones (INDELS) (Mills y cols., 2006) u otros polimorsmos particulares como la variacin gentica en la regin HLA (acrnimo del trmino Human Leukocyte Antigen) (Undlien y cols., 2001). Para efectos netamente pedaggicos, usaremos la terminologa de alelo M (mutado) y N (normal) para designar loci genticos causantes de enfermedad en patologas mendelianas (deniendo genotipos NN, NM y MM). En enfermedades multifactoriales, usaremos la terminologa de alelo S (o alelo de susceptibilidad) y alelo N (normal) para loci biallicos que otorgan susceptibilidad frente a enfermedades multifactoriales (genotipos NN, NS o SS). Para loci biallicos que aparentemente no estn relacionados de forma causal con enfermedades, se usar la terminologa de alelos A y a o alelos B y b para loci biallicos, (genotipos del tipo aa, Aa y AA o bb, Bb y BB). En loci multiallicos (por ejemplo, marcadores de tipo microsatlite), se usar la terminologa de alelos basados en nmeros (1, 2, 3, etc.) para expresar los genotipos 1/1, 1/3, 2/3

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etc. Dado que el ADN es una molcula lineal, es posible denir las posiciones de las variaciones de secuencia que existen entre individuos. Una medicin simple de la localizacin de las variaciones genticas se reere a la posicin de cada variacin dentro de los cromosomas con respecto a posiciones jas como telmero/centrmero o brazo corto/largo del cromosoma. De forma ms exacta, sera deseable medir las distancias directamen-

te en pares de bases (pb). Dado que el nmero de pares de bases es muy elevado, frecuentemente se reeren las distancias en pares de bases como kilo-bp (1 Kb = 1.000 pares de bases) o mega-bp (1 Mb = 1.000.000 pares de bases). De forma alternativa y como se ver en el Captulo 7: Estudios de ligamiento, es posible estimar la distancia gentica basndose en la frecuencia de los eventos de recombinacin.

Marcadores genticos medidos a nivel fenotpico

Aunque a lo largo de este captulo nos referiremos fundamentalmente a la variacin gentica medida a nivel de ADN, el trmino marcador gentico se usa de una manera amplia para denir cualquier variacin observable (fenotpica) que se deriva directamente de una variacin subyacente a nivel de ADN. Un tipo de marcador gentico medido a nivel fenotpico es la propia deteccin de los signos clnicos de enfermedades, tales como la brosis qustica, acondroplasia, anemia falciforme, fenilquetonuria y otras enfermedades genticas clsicas, cuyas manifestaciones clnicas son indicativas de un defecto gentico subyacente. Por otro lado, los marcadores genticos ms usados en dcadas pasadas eran aqullos relacionados con grupos sanguneos (Crow, 1993) y los marcadores del sistema HLA (Hsu y cols., 1981) determinados inicialmente mediante tcnicas serolgicas, en lugar de tcnicas basadas en la evaluacin directa del ADN. Otros ejemplos de marcadores genticos medidos a nivel fenotpico son los alelos E2, E3 y E4 de la apolipoprotena E (ApoE) determinados a travs de la tcnica de isoelectroenfoque (Quiroga y cols., 1999) o la determinacin de alelos de la enzima aminolevulnico deshidratasa (ALA-D) determinados a nivel de protenas (Battistuzzi y cols., 1981). Para cada uno de estos tests fenotpicos, existe un test equivalente basado en la deteccin directa a nivel del ADN (Yip, 2002; Infante-Rivard y cols., 2003; Santos y cols., 2001). Un marcador fenotpico clsico relacionado con la presencia de una variacin gentica simple subyacente es el test de la sensibilidad al sabor amargo al 6-propiltiouracilo (PROP) o del compuesto relacionado feniltiocarbamida (PTC). El PTC es equivalente al PROP , aunque se usa en raras ocasiones en pruebas fenotpicas debido a su olor desagradable. La prueba de sensibilidad al sabor amargo del PROP clasica a las personas como no-gustadores (no perciben el sabor amargo del PROP), gustadores medios y supergustadores (Figura 4-1) (Kim y Drayna, 2004; Tepper, 1998). Se han descrito importantes diferencias en la prevalencia de no-gustadores en diferentes poblaciones: del 3% en poblaciones africanas hasta el 40% en poblaciones asiticas (Tepper, 1998). Para determinar el nivel de sensibilidad al sabor amargo del PROP , se aplica el llamado test de tres soluciones (Zhao y cols., 2003) que consiste en la administracin de tres soluciones de PROP (0,032; 0,32 y 3,2 mmol/L) y tres soluciones de cloruro sdico (NaCl) (0,01; 0,1 y 1,0 mol/L). Las soluciones se sirven aleatoriamente en pares formados por una solucin de NaCl y otra de PROP , en vasos codicados con dgitos al azar. La comparacin de niveles de intensidad de sabor en muestras de concentraciones pareadas de PROP y NaCl permite clasicar a los sujetos de estudio como supergustadores (Figura 4-1A) cuando perciban el sabor amargo de las muestras de PROP ms intenso que el sabor salado de las muestras de NaCl; como gustadores-medios (Figura 4-1B) cuando la percepcin es similar para las muestras de PROP y NaCl; y como no-gustadores (Figura 4-1C) en el caso de percibir como ms intenso el sabor de las muestras de NaCl que el de las muestras de PROP . Para evaluar la intensidad de sabores amargo y salado se utiliza una escala semilogartmica semntica de magnitud sensorial (Figura 4-1D) (Santos y cols., 2006). Se ha determinado que el gen que controla de forma predominante la sensibilidad al sabor amargo del PROP es TAS2R38 (GeneID = 5726; 7q34), que pertenece a una familia de receptores de sabor (Kim y cols., 2003). Especcamente se ha descrito que una

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Epidemiologa gentica

FIGURA 4-1 Evaluacin fenotpica de la sensibilidad gentica al sabor amargo del PROP
A: Supergustador 100 75 50 25 0 Mnimo B: Gustador medio 100 75 50 25 0 Mnimo C: No-gustador 100 75 50 25 0 Mnimo Mediano Mximo
NaCl PROP NaCl PROP NaCl PROP

D: Escala semilogartmica semntica de magnitud sensorial de sabor amargo/salado Mediano Mximo Lo ms fuerte imaginable

Muy fuerte

Fuerte Mediano Mximo Moderada Dbil Casi indetectable

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gran parte de la variabilidad fenotpica de la percepcin del sabor amargo del PROP est regulada por tres SNPs presentes en TAS2R38 que producen cambios en la secuencia de aminocidos: 145C > G (P49A), 785C > T (V262A) y 886G > A (I296V) (Kim y cols., 2003). Se ha propuesto que la sensibilidad al sabor amargo del PROP podra estar relacionada con una menor acepta-

bilidad de ciertos tipos de frutas y verduras, as como a una mayor preferencia de alimentos ricos en grasas (Goldstein y cols., 2005). Por tanto, la sensibilidad al sabor amargo del PROP podra constituir un marcador gentico relacionado con diferentes patrones de dieta e inclinaciones hacia los alimentos (Keller y Tepper, 2004).

Obtencin de ADN genmico

En estudios epidemiolgicos, lo ms frecuente es obtener ADN a partir de linfocitos de muestras de sangre (Austin y cols., 1996), a partir de clulas bucales (King y cols., 2002) o mediante muestras de saliva (Rylander-Rudqvist y cols., 2006). Generalmente la cantidad de ADN es relativamente abundante para su uso en la mayora de los estudios epidemiolgicos utilizando mtodos clsicos de extraccin por fenol-cloroformo, mtodos de precipitacin salina o kits comerciales (Santella, 2006). Por ejemplo, el kit QIAGEN QIAamp DNA Blood Mini Kit es capaz de extraer entre 2 y 12 g de ADN a partir de 200 L de sangre total. Adicionalmente, existen tcnicas que permiten el aislamiento de clulas blancas de la sangre que representan el reservorio de ADN en sangre (por ejemplo, uso de gradiente de coll), as como tcnicas de amplicacin de genoma completo (por ejemplo, Genomiphi DNA amplication kit), que entrega la posibilidad de generar grandes cantidades de ADN genmico de forma simple a partir de nmas cantidades iniciales de esta molcula (Barker y cols., 2004; Paez y cols., 2004; Santella, 2006). Una vez extrado el ADN genmico, es necesario evaluar la integridad y la concentracin del mismo. La extraccin de ADN genmico de alto peso molecular es importante para la abilidad de los posteriores anlisis genticos. La integridad del ADN genmico puede comprobarse al cargar una pequea cantidad de ADN en un gel de agarosa 0,8% y comparar su migracin tras electroforesis con el marcador /HindIII: el ADN genmico de alto peso molecular debe traducirse en una banda nica con peso molecular entre 10 y 23,1 Kb. La concentracin de ADN genmico se puede calcular mediante mediciones espectrofotomtricas de absorbancia con longitud de onda de 260 nm (A260), mientras que la pureza del ADN genmico se evala mediante el cociente A260/A280, que debe situarse entre 1,7 y 1,9. La concentracin de ADN tambin puede determinarse de forma an ms sensible mediante el uso de un uorforo (PicoGreen) que se intercala en la doble hebra de la molcula de ADN, permitiendo calcular su concentracin a travs del registro de la uorescencia a una longitud de onda de 525 nm tras una excitacin a 470 nm (http://www.nanodrop.com). El almacenaje de muestras debe considerar una concentracin apropiada para posteriores experimentos de amplicacin (en nuestro laboratorio se diluyen las muestras hasta una concentracin de 50 ng de ADN por l), y tambin debe prevenir la contaminacin y evaporacin del ADN (Lahiri y Schabel, 1993; Santella, 2006).

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Una vez obtenido el ADN genmico, los investigadores pueden examinar la presencia de variaciones de secuencia que puedan ser relevantes de acuerdo a los objetivos particulares de cada estudio. Aunque existen mtodos de deteccin de variaciones genticas que no estn basados en la amplicacin inicial de material gentico (Tsuchihashi y Dracopoli, 2002), la inmensa mayora de los estudios en epidemiologa gentica contemplan una etapa de amplicacin del ADN en los segmentos genmicos de inters a travs de la reaccin en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en ingls son PCR (Polymerase Chain Reaction) (Mullis y Faloona,

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Epidemiologa gentica

FIGURA 4-2 Esquema de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

A: Detalle del primer ciclo de la PCR Inicio
5 3 3 5

Desnaturalizacin

94C

Hibridacin

55 a 65C

Extensin

Pol Pol

72C

B: Primeros ciclos de la PCR

Inicio Primer ciclo

5 3

3 5

Segundo ciclo

Tercer ciclo

1987). El objetivo de la PCR es obtener un gran nmero de copias del fragmento de ADN que contiene la variacin gentica buscada mediante la repeticin de 30 a 35 ciclos consistentes en tres pasos (desnaturalizacin a 94C, hibridacin a 52C a 65C y extensin a 72C) y que tienen lugar en un termociclador (Lorenz y cols., 2002; Tefferi y cols., 2002) (Figura 4-2). Tras la aplicacin de la PCR, se genera una suciente cantidad de copias de la secuencia deseada (producto de PCR) para poder continuar con diferentes sistemas de deteccin

de variantes genticas. Es posible visualizar el proceso de PCR en la pgina web http://www.sumanasinc.com/ webcontent/animations/content/pcr.html. Como su nombre indica, la PCR se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa termorresistente que es capaz de fabricar in vitro una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus nicos requerimientos son el ADN genmico, nucletidos en el medio, cofactores de la reaccin, polimerasa termorresistente (Taq polimerasa) y un buffer que contenga

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TABLA 4-1 Protocolo estndar para una PCR

Componente Buffer PCR dNTPmix MgCl2 50 mM P1 P2 Taq Concentracin inicial 10X 2 Mm 50 Mm 20 M 20 M 5 unidades / L Concentracin nal 1X 0,2 mM (200 (M) 1,5 mM 0,5 M 0,5 M 1 unidad Volumen 3 L 3 L 0,9 L 0,75 L 0,75 L 0,2 L 20,4 L 29 L 1 L 30 L

Agua ADN 1 L (~ 50 ng) ~ 50 ng

cationes Mg+2, adems de un par de oligonucletidos complementarios y anquentes al fragmento que queremos copiar (los partidores o cebadores; en ingls primers) (Roux 1995), y pueden disearse usando programas especcos, tales como PRIMER3 (http://frodo. wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). La Tabla 4-1 muestra un protocolo estndar de PCR. Una vez elegidos los primers adecuados, es aconsejable realizar una PCR virtual en el sitio web (http:// genome.ucsc.edu), que entrega el tamao y secuencia esperado del fragmento que se amplicar por PCR. Adicionalmente, el sitio web http://www.mutationdiscovery.com/md/MD.com/home_page.jsp (link: protocol-writer) sugiere un protocolo de condiciones de amplicacin especco para cada PCR. Tal y como se muestra en la Figura 4-3, es importante realizar una optimizacin de la PCR probando diferentes condiciones de los componentes de la reaccin (por ejemplo, cambiando la concentracin de MgCl2 o incorporando cosolventes como el BSA o el DMSO), as como diferentes temperaturas de hibridacin, lo que puede realizarse fcilmente en un termociclador con gradiente de temperatura (Roux, 1995; Altshuler, 2006). La Figura 4-3 muestra un gel de agarosa que corresponde a una PCR cuyas condiciones se optimizaron al probar diferentes temperaturas de hibridacin y diferentes concentraciones de MgCl2 para amplicar un

fragmento de 86 pares de bases de la regin promotora del gen MC3R (Schalin-Jantti y cols., 2003). En esta PCR, nalmente se eligi un protocolo de trabajo con una temperatura de hibridacin de 58C a una concentracin nal de 1,5 mM de MgCl2. Adicionalmente, es posible incrementar la especicidad de la PCR mediante el procedimiento llamado touch-down, que consiste en elegir altas temperaturas de hibridacin en los ciclos iniciales, para despus ir bajando paulatinamente la temperatura de hibridacin en los ciclos sucesivos (Don y cols., 1991). Otro enfoque utiliza el procedimiento de PCR en inicio caliente (PCR Hot Start), que se realiza iniciando la reacin al agregar la polimerasa al medio de reaccin en alta temperatura, o alternativamente mediante el uso de polimerasas especiales que slo se activan despus del calentamiento de la mezcla de reaccin por un tiempo predeterminado (Torok y cols., 2004). En muchos procedimientos de laboratorio que requieren mayor eciencia del trabajo, es deseable obtener una amplicacin simultnea de mltiples fragmentos de ADN, lo que se puede conseguir a travs de un estricto control de la temperatura de hibridacin, la compatibilidad de los diferentes primers en una reaccin comn de PCR multiplex y la compatibilidad de las regiones amplicadas de modo que no se solapen en la electroforesis (Markoulatos y cols., 2002).

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Epidemiologa gentica

FIGURA 4-3 Optimizacin bsica de una PCR

MgCl2 1,5 mM MgCl2 2,5 mM

Fragmento de 86 pb

54

58

61

63

54

58

61

63

L50

Temperatura de hibridacin (C)

Tipos de marcadores genticos comnmente usados en estudios de epidemiologa gentica

Pequeas inserciones/deleciones (INDELs)
Se ha descrito un elevado nmero de polimorsmos de variantes genticas consistentes en pequeas inserciones/deleciones (INDELS) (Mills y cols., 2006), tambin llamadas en ocasiones polimorsmos DIP (acrnimo de Deletion-Insertion Polymorphims). En general, las inserciones de pequeo tamao encontradas en el genoma humano bsicamente consisten en: Inserciones/deleciones de bases nucleotdicas nicas, siendo ms frecuentes las inserciones de A o T en relacin con las inserciones de C o G. Expansiones monomricas, donde se destaca la insercin de (A)n. Expansiones de 2 a 15 pares de bases. Transposones. Inserciones/deleciones de secuencias de ADN al azar, con tamaos de insercin variable, aunque ms del 99% de estas variantes descritas corresponden a inserciones/deleciones de un tamao menor a 100 pb (Mills y cols., 2006). La base de datos de variacin gentica (http://projects.tcag.ca/variation/) (Iafrate y cols., 2004) ha descrito un total de 17.323 indels de tamao entre 100 pb y 1 Kb (revisado en enero de 2008). Un indel de pequeo tamao sera la insercin del hexmero CAGACC en la posicin +2138 desde el inicio de la secuencia codicante del gen del receptor 3 de melanocortina humano (MC3R) (Boucher y cols., 2002). Otro ejemplo de este tipo sera la insercin de cinco nucletidos (CTTTA) en la regin 3 no traducida del gen del receptor de leptina humano (LEPR) (Oksanen y cols., 1998), cuyo cromatograma de secuencia se muestra en la Figura 4-4 para los genotipos Del/Del e Ins/Ins. Se han descrito otras inserciones/deleciones que involucran fragmentos de ADN de mayor tamao como el polimorsmo del gen del recepor de la hormona de crecimiento que consiste en la delecin o la retencin del exn 3 completo de este gen (Audi y cols., 2006).

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FIGURA 4-4 Insercin/delecin de CTTTA en el gen LEPR humano

30 G T 40 G

G T

G T

del/del

Insercin A T A G A 30 G T A C T T T A T A G 40 T T G T

ins/ins

Polimorsmos de tipo microsatlite (STR)

Los marcadores consistentes en repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucletidos han sido ampliamente usados en diferentes estudios de gentica humana (Weber y May, 1989). Las repeticiones de los mononucletidos A y T son muy frecuentes (dan cuenta de aproximadamente el 0,3% del genoma nuclear), mientras que las repeticiones de dinucletidos (especialmente del dinucletido CA) son relativamente abundantes y frecuentemente son tambin polimrcas, existiendo una alta heterocigosidad por el alto nmero de alelos posibles. Los marcadores de tipo microsatlite, tambin llamados Short Tandem Repeats (STR) o Short Sequence Repeats (SSR), consisten en repeticiones de nmero variable en tndem de secuencias cortas de 2 a 6 pares de bases (por ejemplo, la repeticin del dinucletido CA), as como otras repeticiones de trinucletidos, tetranucletidos u otras secuencias cortas ms complejas (Butler, 2006; Beckmann y cols., 2007; Beckman y Weber, 1992; Collins y cols., 2003; Ellegren,

2004; Subramanian y cols., 2003). Otro tipo de variacin gentica basada en repeticiones de secuencias con los llamados minisatlites, que en general se denen como regiones de ADN en las que existen repeticiones en tndem de 7 a 100 bp que se extienden sobre un segmento de 0,5 a 30 Kb (Beckmann y cols., 2007; Jeffreys y cols., 1985). Un ejemplo de marcador minisatlite es el que se localiza en el extremo 3 del gen ApoB (Verbenko y cols., 2003). Para muchos autores, el trmino VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) es usado frecuentemente como sinnimo de minisatlite (Verbenko y cols., 2003), mientras que para otros autores el trmino VNTR se aplica tanto para microsatlites como para minisatlites (Beckmann y cols., 2007). Los microsatlites son marcadores que pueden ser analizados mediante PCR seguida de una electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (Weber y May, 1989; Rojas y cols., 2002), mediante la que los productos de PCR se separan atendiendo a su tamao, que depende del nmero de repeticiones. Alternativamente, la determinacin de

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Epidemiologa gentica

FIGURA 4-5 Secuenciacin y anlisis de fragmentos para el marcador microsatlite (TTTC)n del gen de la leptina en un sujeto homocigoto (Valladares y cols., 2007)
A: Anlisis de secuenciacin 1 2 3 4 5 6 7 8
20 30 40 50 60 G G G G G C T C T G T T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C

10

11

12

13

70 80 90 T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C T A A C T T T T T T G C C A G

La secuencia corresponde a un homocigoto con 13 repeticiones del tetranucletido TTTC (tamao del producto de PCR = 157 pb).

B: Anlisis de fragmentos en electroforesis capilar 140 160 161 pb 180 200 220 240 pb

225 pb

Los marcadores de peso molecular en la electroforesis capilar se muestran en gris claro, y los alelos de la muestras problema se muestran en negro. El genotipo corresponde a un heterocigoto con tamaos de fragmento de 161 pb y 225 pb.

genotipos se realiza mediante electroforesis capilar de productos de PCR con primers marcados con uorocromos (Suazo y cols., 2005). La Figura 4-5 representa el resultado de un anlisis de determinacin de genotipos de un microsatlite hipervariable compuesto por la repeticin de cuatro nucletidos (TTTC)n, localizado en la

regin que anquea el gen de la leptina (Hinuy y cols., 2006). En la Figura 4-5A se puede apreciar la secuenciacin de un sujeto homocigoto para 13 repeticiones del tetranucletido. En la Figura 4-5B se representa el genotipo de un sujeto analizado a travs de electroforesis capilar, basndose en la deteccin de uorescencia

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

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con un equipo de electroforesis capilar. Otro ejemplo de este tipo de marcadores es el microsatlite D20S32e se encuentra en el cromosoma 20 y consiste en la repeticin de el dinucletido TG, que dene seis alelos identicables mediante productos de PCR de 115 a 125 pb segn el protocolo descrito por Yamada y cols. (1991). En repeticiones de dinucletidos, los peak de la electroforesis (correspondientes al tamao del producto amplicado) presentan un caracterstico peak adicional como resultado del llamado slippage (deslizamiento) de la polimerasa (Clarke y cols., 2001). Los STRs son los marcadores genticos ms utilizados en los estudios de ligamiento y en medicina forense debido a su alta heterocigosidad y alto nmero de alelos (Ellegren, 2004; Butler, 2006) (ver Captulo 7: Estudios de ligamiento). El sistema de deteccin de alelos en STR basada en uorescencia permite adems la identicacin simultnea de fragmentos de diferente tamao, lo que ha facilitado la determinacin de genotipos de STR en paralelo a travs de paneles de microsatlites (Reed y cols., 1994) (ver http://www.appliedbiosystems.com/index.cfm). En su mayora, las repeticiones cortas de nucletidos no tienen funcin biolgica conocida y ocurren en segmentos intergnicos o en intrones, aunque existen notables excepciones a esta regla, como por ejemplo ciertas repeticiones de trinucletidos y su efecto causal en enfermedades como el sndrome de X Frgil, debida a la expansin de la repeticin CGG (Kremer y cols., 1991), as como otras expansiones de trinucletidos relacionadas con enfermedades neurolgicas, y que pueden ocurrir en regiones codicantes (por ejemplo, CAG en la enfermedad de Huntington) (Sutherland y Richards, 1995; Mirkin, 2007). De manera interesante, la estructura repetitiva de los microsatlites los hace propensos a deslizamientos de la polimerasa durante la replicacin del ADN, lo que podra generar errores de apareamiento y generacin de pequeos bucles, que generalmente son corregidos por el sistema de reparacin de errores de replicacin. Sin embargo, en algunos tipos de cnceres, la maquinaria de reparacin est alterada, generndose variaciones genticas somticas y alelos nuevos en un fenmeno que se conoce como inestabilidad de microsatlites (Sreide y cols., 2006). La pgina web http://www.microsatellites.org/db_search.php permite la bsqueda de microsatlites a lo largo del genoma humano. La herramienta Tandem Repeats Finder (http://tandem.bu.edu/ trf/trf.html) es til para la localizacin de repeticiones

de nucletidos (Benson, 1999). La pgina web http:// www.cstl.nist.gov/div831/strbase/index.htm describe los diferentes tipos de STR y su nomenclatura.

Variaciones en el nmero de copias de segmentos genmicos (CNV)

Un tipo de variacin gentica consiste en variaciones estructurales en el nmero de copias de segmentos cromosmicos amplios (mayores de 1 Kb) llamados en la literatura Copy-Number Variations (CNV) (Komura y cols., 2006), Copy Number Polymorphisms (CNP) (Sebat y cols., 2004) o Large-scale Copy number Variations (LCV) (Iafrate y cols., 2004). Estas variaciones implican la prdida o ganancia de copias de segmentos cromosmicos en sujetos normales (Carter, 2004). Se ha sugerido que alrededor del 12% del genoma estara sujeto a este tipo de variacin en el nmero de copias (Sebat y cols., 2004; Iafrate y cols., 2004; Redon y cols., 2006; Wong y cols., 2007; Kehrer-Sawatzi, 2007), que podran potencialmente afectar al equilibrio de dosis allica, disrupcin de genes o la expresin gnica (Beckmann y cols., 2007). Mediante la aplicacin de tcnicas de hibridacin genmica comparativa (CGH, acrnimo del trmino Comparative Genomic Hybridization), PCR cuantitativa y fiber-FISH, Iafrate y cols. (2004) encontraron que el CNV ms frecuente observado consiste en el diferente nmero de copias de un segmento que comprende los genes de la amilasa salival y pancretica AMY1A y AMY2A situados en 1p2.1 (el 23,6% de ganancias relativas y el 25,5% de prdidas relativas en relacin a la secuencia de referencia). Perry y cols. (2007) mostraron que el nmero de copias del gen de la amilasa salival AMY1 se correlaciona de forma signicativa con los niveles de la a-amilasa en saliva, lo que implica la importante potencial contribucin de los CNV en rasgos que presentan variacin interindividual. Las pginas web http:// projects.tcag.ca/variation/ y http://www.sanger.ac.uk/ PostGenomics/decipher/, contienen bases de datos de variaciones estructurales del genoma que incluyen indels y CNVs. Tanto los CNV como las sustituciones simples de nucletidos (SNPs) se distribuyen ampliamente a lo largo del genoma. Aunque la frecuencia de eventos individuales de los SNPs es mucho mayor que la de los CNV (http://www.hapmap.org), cada evento de CNV afecta amplios segmentos genmicos mientras que cada SNP

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Epidemiologa gentica

FIGURA 4-6 Determinacin del nmero de copias variables del gen de la amilasa salival (AMY1) en ensayos SYBR-Green de PCR de tiempo real
18.779 17.279 15.779 14.279

Fluorescencia (483-533)

12.779 11.279 9.779 8.279 6.779 5.279 3.779 2.279 0.779

Fase exponencial PCR

25 ng 12.5 ng 6.3 ng 3.13 ng 1.6 ng

10 12

14 16 18 20 22 24 26

28 30 32 34 36

Ciclos

afecta a un solo nucletido, por lo que la variacin genmica humana estara fuertemente inuenciada tanto por la variabilidad en los SNPs como por la variabilidad en CNVs. Se ha sugerido tambin que la existencia de CNVs podra constituir un determinante importante en la explicacin de la penetrancia reducida de enfermedades genticas clsicas (Beckmann y cols., 2007), mientras que el impacto de los CNV sobre las enfermedades humanas de etiologa multifactorial ha sido an escasamente explorado (Gonzlez y cols., 2005; Redon y cols., 2006; Shelling y Ferguson, 2007; Beckmann y cols., 2007; McCarroll y Altshuler, 2007). En uno de los primeros estudios epidemiolgicos de asociacin CNV y rasgos complejos, se ha determinado la posible existencia de asociacin entre el nmero de copias del gen de la beta-defensina (rango de variacin habitual: 2 a 7 copias) y la presencia de psoriasis (Hollox y cols., 2008). En relacin a la deteccin de CNVs, se ha propuesto el uso de tcnicas de microarrays de CGH de

alta resolucin para el escaneo de CNVs en el genoma completo, as como otras tcnicas enfocadas a evaluar la variabilidad de CNVs en regiones cromosmicas delimitadas (Komura y cols., 2006; Beckmann y cols., 2007). Perry y cols. (2007) aplicaron tcnicas de PCR de tiempo real para determinar el nmero diploide de CNV y tcnicas de hibridacin in-situ con uorescencia de alta resolucin (Fiber FISH) para determinar el nmero de repeticiones presentes en cada cromosoma. La Figura 4-6 muestra la determinacin de CNV del gen de la amilasa salival usando tcnicas de PCR de tiempo real (Santos y cols., 2009). Por otro lado, tambin se ha descrito la tcnica de MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) y MLGA (Multiplex Ligation dependent Genome Amplication) (Isaksson y cols., 2007) para la deteccin de inserciones/deleciones, con potencial aplicacin a CNV (Schouten y cols., 2002; White y cols., 2007). Especcamente, MLPA se utiliz inicialmente para la deteccin de deleciones/duplicaciones como las que ocurren en el gen de la distrona,

FIGURA 4-7 Variantes genticas en la regin codicante del receptor 3 de melanocortina humano (MC3R)

60 30

LE-1

1 NH2 Pos. 6: Thr6Lys (17C>A) rs3746619

Medio extracelular LE-2 LE-3

Pos. 311: Ser311Cys (931T>A) rs17847261

300 RTM 119 241 LE: Loop extracelular LI: Loop intracelular RTM: Regin transmembrana

LI-1

180

COOH 360 ndice de hidrofobicidad LI-2 LI-3 4,5 ; 3,2 1,3 ; 0,4 1,8 ; 2,8

Pos. 81: Val81Ile (241G>A) rs3827103

Pos. 183: Ile183Asn (548T>A) Citoplasma

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

3,8 ; 4,5

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Epidemiologa gentica

y que son causantes de distroas musculares (Lalic y cols., 2005). MLPA se basa en el uso de sondas de tamao variable que hibridarn en diferentes posiciones, se ligarn entre s, y posteriormente se amplicarn utilizando primers comunes, lo que permita visualizar la presencia de deleciones/inserciones y CNVs (http:// www.mlpa.com). Finalmente, tambin se ha sugerido el uso de SNPs como marcadores secundarios de la presencia de CNV basados en el patrn de desequilibrio de ligamiento existente entre SNPs y CNVs (McCarroll y Altshuler, 2007).

Polimorsmos de cambios de una sola base (SNP)

Los marcadores genticos ms abundantes en el genoma humano son los SNPs (acrnimo del trmino en ingls Single Nucleotide Polymorphism) o sustituciones simples de una sola base nucleotdica, que ocurren aproximadamente con una frecuencia de 1 SNP por cada 100 a 1.000 pares de bases (Morton, 2005) (dbSNP database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects /SNP/; SNPedia http://www.snpedia.com). La pgina web de la base de datos dbSNP (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi) muestra las estadsticas bsicas del nmero de SNPs descritos en diferentes especies, mientras que la base de datos HapMap (http://www.hapmap.org) contiene, hasta el ao 2007, ms de 3,1 millones de SNPs validados y evaluados en diferentes grupos tnicos (The International HapMap Consortium, 2007). Los SNPs incluyen las transiciones purina-purina (AG) o pirimidina-pirimidina (CT) y las transversiones purina-pirimidina o pirimidina-purina (AC, AT, GC o GT). Los diferentes tipos de SNPs no se distribuyen uniformemente en el genoma, existiendo un predominio relativo de las transiciones sobre la transversiones en relacin con el nmero esperado al azar (Collins y Jukes, 1994). Los SNPs pueden ocurrir en cualquier localizacin cromosmica: regiones no codicantes, exnicas, intrnicas o reguladoras de la expresin gnica (Guttmacher y Collins, 2002; Hull y cols., 2007). El foco inicial de bsqueda de variaciones genticas se centra generalmente en el anlisis de secuencias codicantes, pero tambin incluye frecuentemente otras secuencias biolgicamente relevantes tales como regiones promotoras, zonas de unin intrn-exn, intrones y regiones no traducidas (3-UTR y 5-UTR, acrnimos del trmino

en ingls Untranslated Region). Si el cambio de base ocurre en una regin codicante, el SNP se clasica dependiendo de si la sustitucin que produce sea de tipo sinnimo o silente (no cambia la secuencia de aminocidos en la protena que codica) o no-sinnimo (cambia la secuencia de aminocidos). Si se cambia la secuencia de aminocidos, la sustitucin puede ser conservadora (se cambia un aminocido por otro qumicamente similar) o no conservadora (se cambia un aminocido por otro de propiedades qumicas diferentes). La nomenclatura de los SNPs se realiza con respecto a su posicin nucleotdica; por ejemplo, el SNP -174C > G de la interleuquina 6 (gen IL6) consiste en una sustitucin de una C por una G en la posicin -174 de este gen (regin promotora) (Berthier y cols., 2003). Si la variacin gentica afecta a la secuencia de aminocidos de la protena, es tambin frecuente referir esta condicin. Por ejemplo, el polimorsmo 241G>A del gen del receptor 3 de melanocortina (MC3R) genera un cambio de valina por isoleucina en la posicin aminoacdica 81, por lo que es frecuente encontrar ese polimorsmo en la literatura como Val81Ile (Feng y cols., 2005). La Figura 4-7 muestra la secuencia de aminocidos y la estructura del receptor 3 de melanocortina, consistente en una tpica estructura de 7 dominios transmembrana. En la Figura 4-7 se indican algunos de los SNPs descritos en la secuencia codicante incluyendo el SNP Val81Ile, mostrando colores de los aminocidos segn su ndice de hidrofobicidad (Kyte y Doolittle, 1982). Adicionalmente, la nomenclatura de los SNPs est basada en el llamado indicador de identicacin rs o Reference SNP accession ID. Por ejemplo, la identicacin para el SNP de 241G>A (Val81Ile) del gen MC3R es rs3827103. Los sitios web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http:// www.hapmap.org, http://www.ensembl.org, y http:// www.genecards.org/index.shtml constituyen adecuados puntos de partida para explorar los diferentes SNPs. La pgina web de NCBI-SNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ SNP , el consorcio de SNPs (http://snp.cshl.org/), la base de datos de variaciones genticas (http://hgvbase.cgb. ki.se/), la base de datos del proyecto HapMap (http:// www.hapmap.org), y la base de datos de variacin del genoma humano (http://www.gdb.org/) son lugares tambin tiles en la bsqueda de variaciones genticas humanas de diferente naturaleza. Existen publicaciones que revisan los diferentes tipos de variaciones genticas a nivel de ADN (Strachan y Read, 1999; Guttmacher y

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

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Collins, 2002), as como guas para la nomenclatura de dichas variaciones genticas (http://www.hgvs.org/). El sistema de genotipado ms clsico es el basado en la hibridacin del ADN con oligonucletidos especcos (ASO, acrnimo del trmino Allele-Specic Oligonucleotide hybridization). En este mtodo se construyen dos sondas alelo-especcas que se unen al segmento genmico de inters, hibridando cada oligonucletido con un fragmento de ADN si sus secuencias son totalmente homlogas. La capacidad de la hibridacin especca para discriminar alelos se puso inicialmente de maniesto en la determinacin de la mutacin que produce la anemia falciforme, usando ADN genmico mediante tcnicas de Southern Blot (Southern, 1975; Conner y cols., 1983). Esta tarea se facilit posteriormente con el advenimiento de la PCR (Saiki y cols., 1988), en el que las sondas marcadas hibridan con el producto de PCR inmovilizado sobre un ltro de nylon (dot-blot). En el anlisis llamado de dot-blot reverso, los oligonucletidos alelo-especcos son inmovilizados en un soporte slido (Saiki y cols., 1989), lo que puede considerarse como un enfoque precursor de los mtodos de determinacin de genotipos de SNPs basados en microchips de alta densidad (Lipshutz y cols., 1995; Syvanen y cols., 2001). En las siguientes subsecciones, se comentarn diferentes mtodos de genotipado basados en el uso de enzimas de restriccin (PCR-RFLP , PCR-dCAPS), en la hibridacin alelo-especca de los primers (PCRARMS, tetraprimer PCR-ARMS, MS-PCR) y en la hibridacin alelo-especca de sondas con marcadores uorescentes (PCR-Taqman). La pgina del Centro Nacional de Genotipado (CEGEN) (http://www.cegen.org) contiene informacin comprensible y actualizada sobre los diferentes sistemas de genotipado de SNPs. Determinacin de SNPs mediante el uso de enzimas de restricccin (PCR-RFLP). Un mtodo clsico de deteccin de variantes conocidas es la tcnica PCR-RFLP (RFLP es acrnimo del trmino en ingls Restriction Fragment Length Polymorphism o polimorsmos de longitud de fragmentos de restriccin) (Figura 4-8). En la PCR-RFLP , las diferencias de secuencia entre el alelo normal (silvestre, o wild-type) y el alelo mutado crean (o destruyen) un sitio de restriccin que es reconocido en el producto de PCR por enzimas de restriccin que generan un patrn de bandas caracterstico en la separacin electrofortica (Figura 4-8; ver animacin de un gel de agarosa en la pgina

web http://learn.genetics.utah.edu/units/biotech/gel/). La pgina web http://www.restrictionmapper.org/ es una herramienta til para identicar secuencias que generan sitios de restriccin. No todos los cambios de una sola base generan la creacin/destruccin de lugares de restriccin reconocibles por endonucleasas especcas y, consecuentemente, no son detectables por anlisis directo de PCRRFLP . En estas situaciones, puede aplicarse una una modicacin en uno de los primers para que presente una alteracin intencionada consistente en un cambio de un nucletido con respecto a la secuencia original, introducido con el objeto de generar un sitio de restriccin articial en conjuncin con el polimorsmo que se desea estudiar. Esta tcnica, llamada en ocasiones dCAPS (acrnimo del trmino en ingls Derived Amplied Polymorphic Sequence) (Neff y cols., 1998), requiere igualmente de la digestin del producto de PCR con una enzima de restriccin, examinndose el patrn de la digestin en un gel de agarosa o de poliacrilamida (Neff y cols., 2002) (Figura 4-9A). Como ejemplo de la aplicacin de PCR-dCAPS, el polimorsmo -239 A > G del gen MC3R (receptor 3 de melanocortina) no genera la creacin/destruccin de un sitio de restriccin (Schalin-Jantti y cols., 2003). Sin embargo, el uso de un primer modicado, que permite la determinacin de genotipos mediante la incubacin del producto de PCR (86 pb) con la enzima AlwI a 37C (Figura 4-9B). Los primers utilizados en este tipo de ensayos pueden disearse mediante la pgina web http://helix.wustl.edu/ dcaps/dcaps.html. Determinacin de SNPs mediante el uso de primers alelo-especcos (PCR-ARMS, tetraprimer PCR-ARMS y MS-PCR). Una tcnica simple que puede utilizarse tambin para la deteccin de SNPs es la llamada PCR-ARMS (ARMS es el acrnimo del trmino en ingls Amplication Refractory Mutation System: sistema de mutacin refractario a la amplicacin) (Newton y cols., 1989). En la PCR-ARMS, se realizan dos PCR diferentes para cada sujeto usando un primer comn en ambas reacciones, y uno de los dos primers alternativos, que son especcos para cada una de las secuencias genmicas. Esta especicidad se consigue mediante la alteracin del partidor directo de forma que la existencia de un desapareamiento en su extremo 3 impide la elongacin en la PCR cuando se usa uno de los partidores, mientras que la amplicacin tiene lu-

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Epidemiologa gentica

FIGURA 4-8 Representacin esquemtica de la deteccin de genotipos en polimorsmos de cambios de una sola base (SNPs) mediante PCR-RFLP
Sitio polimrfico de cambio de una base (sustitucin A G en la posicin 100) que define 2 alelos: A y G Partidor directo A T G C

Partidor reverso

150 pb

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Amplificado del fragmento de 150 pb Incubacin con enzima de restriccin que reconoce en el sitio polimrfico A G (corta con el alelo G) 1 200 pb 150 pb 100 pb 50 pb 2 3 4 1. Marcador de peso molecular 2. Homocigoto alelo A 3. Homocigoto alelo G 4. Heterocigoto

Electroforesis en gel de agarosa

gar cuando se usa el otro partidor (Figura 4-10). Esta tcnica se basa en la ausencia de actividad correctora 53 exonucleasa de las Taq polimerasas normalmente usadas en la PCR. Un ejemplo del uso de la tcnica de PCR-ARMS es la deteccin de la mutacin 35delG del gen de la conexina 26 (gen GJB2) causante de la hipoacusia congnita (Dong y cols., 2001). Un mtodo basado en el mismo principio que el PCR-ARMS es el llamado mtodo tretaprimer ARMS PCR (Ye y cols., 2001) (Figura 4-11). La ventaja del tetraprimer ARMS en comparacin con el PCR-ARMS

es que se requiere una sola PCR por cada muestra en lugar de las dos PCR que utiliza el PCR-ARMS. Este mtodo se basa en el uso de cuatro primers, dos de los cuales son primers externos y otros dos son primers especcos de cada alelo (primers internos). La combinacin de productos de PCR generados a partir de los primers externos e internos permite la discriminacin allica, mientras que el producto de PCR generado por los primers externos se amplica en todas las reacciones y sirve como control de la reaccin (ver http:// cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer1.html para diseo de primers en este ensayo).

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

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FIGURA 4-9 Deteccin de genotipos en polimorsmos de cambios de una sola base (SNPs) mediante PCR-RFLP con primers modicados (dCAPS)
A: Representacin esquemtica Partidor directo A T Partidor reverso G C El asterisco indica la introduccin artificial de una mutacin que crea un sitio de restriccin en conjunto con A G

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

100 pb

Amplificado del fragmento de 150 pb Incubacin con enzima de restriccin (corta con el alelo G) 1 200 pb 150 pb 100 pb 50 pb 2 3 4 1. Marcador de peso molecular 2. Homocigoto alelo A 3. Homocigoto alelo G 4. Heterocigoto

Electroforesis en gel de agarosa

B: Genotipos del polimorfismo -239A>G del gen MC3R

Primer directo 5-GAGGGAGACAGAAGGAAGACAG3;Primer reverso: 5TTCCAGGAGGAGCAGTTTTGATC3. El nucletido subrayado fue cambiado intencionadamente con el objeto de crear un sitio de restriccin para AlwI.

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Epidemiologa gentica

FIGURA 4-10 Representacin esquemtica de deteccin de genotipos en polimorsmos de cambios de una sola base (SNPs) mediante PCR-ARMS
Sitio polimrfico de cambio de una base (sustitucin A G) que define 2 alelos: A y G Partidor directo ARMS A A T G G C Partidor reverso

Partidor directo anti-ARMS

100 pb Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Amplificado del fragmento de 150 pb Electroforesis en gel de agarosa 1 200 pb 150 pb 100 pb 50 pb 2 3 4 5 6 7 1. Marcador de peso molecular 2 y 3. Homocigoto alelo A (A/A) 4 y 5. Homocigoto alelo G (G/G) 6 y 7. Heterocigoto (A/G)

Tambin basado en la hibridacin alelo-especca de primers, el sistema llamado MS-PCR (acrnimo de Mutagenically Separated Polymerase Chain Reaction) (Rust y cols., 1993), asigna genotipos considerando la especicidad de los primers en el extremo 3 frente a cada alelo, la diferencia de tamao de los primers, y la alteracin intencionada de nucletidos en los primers que evitan la aparicin de reacciones cruzadas (Figura 4-12). Usando mtodos con primers alelo-especcos y con el objeto de aumentar el procesamiento de geno-

tipos, se ha descrito adicionalmente el uso de electroforesis MADGE (acrnimo de Microtiter Array Diagonal Gel Electrophoresis), que permite la carga eciente de un nmero relativamente alto de muestras en geles y un mayor procesamiento de muestras (Ye y cols., 2001; Day y Humphries, 1994; Hunt y cols., 1999). Sin embargo, las tcnicas de alto procesamiento de muestras y determinaciones simultneas desarrolladas durante la dcada del ao 2000 han sobrepasado amplsimamente la capacidad de procesamiento de muestras de los mtodos basados en la deteccin de genotipos en geles.

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

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FIGURA 4-11 Representacin esquemtica de deteccin de genotipos en polimorsmos de cambios de una sola base (SNPs) mediante tetraprimer PCR-ARMS
Primer directo externo Primer directo interno G>A Primer reverso interno PCR Primer reverso externo

G/G Electroforesis en gel de agarosa

G/A

A/A Fragmento externo Fragmento especfico de alelo A Fragmento especfico de alelo G

FIGURA 4-12 Representacin esquemtica de deteccin de genotipos en polimorsmos de cambios de una sola base (SNPs) mediante MS-PCR
Los asteriscos indican la introduccin artificial de cambios de nucletidos

Partidor directo: alelo A

A A T G G C

Partidor directo: alelo G

Partidor reverso

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

100 pb

Amplificado del fragmento de 150 pb Incubacin con enzima de restriccin (corta con el alelo G) 1 200 pb 150 pb 100 pb 50 pb 2 3 4 1. Marcador de peso molecular 2. Homocigoto alelo A 3. Homocigoto alelo G 4. Heterocigoto

Electroforesis en gel de agarosa

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Epidemiologa gentica

Determinacin de SNPs mediante sondas uorescentes (PCR-Taqman). Para llevar a cabo el genotipado de SNPs mediante el mtodo PCR-Taqman, se utilizan dos sondas (oligonucletidos), adems de los dos primers de la PCR. Las sondas hibridarn de forma especca para cada alelo del SNP . Las sondas llevan adheridas una molcula uorescente (reporter) y otra molcula apagadora de la uorescencia (quencher) que inhibe esta uorescencia mediante un fenmeno llamado FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Cuando la sonda hibrida perfectamente con la secuencia que contiene el SNP , el reporter se libera de la accin del quencher por la accin 53 exonucleasa de la polimerasa de ADN AmpliTaq Gold, emitiendo una uorescencia que ser proporcional a la cantidad de ADN amplicado de cada secuencia especca (De la Vega y cols., 2005) (Figura 4-13). Las sondas que

no hibridan perfectamente son desplazadas sin emitir uorescencia. La discriminacin allica (allele calling) puede realizarse mediante la observacin de la uorescencia acumulada a travs de los ciclos de PCR en un equipo de PCR de tiempo real (Kubista y cols., 2006) (Figura 4-14). Adicionalmente, la asignacin de genotipos puede llevarse a cabo al registrar las seales estandarizadas de uorescencia al nal de la PCR. En este sentido, la Figura 4-15 muestra la asignacin de genotipos del SNP Q223R (rs1137101) del gen del receptor de leptina (LEPR) analizados mediante el ensayo Taqman (Gotoda y cols., 1997; Yiannakouris y cols., 2001). La ventaja del mtodo Taqman en relacin con los mtodos basados en el uso de geles (por ejemplo, PCR-RFLP) se reeja en una reduccin sustancial del tiempo del

FIGURA 4-13 Esquema de la discriminacin allica en ensayos Taqman

Sonda A A Sonda G G

Fluorescencia Hibridacin Primer forward A T Primer reverse Fluorescencia Hibridacin Primer forward G C Primer reverse

ADN polimerasa
FAM

MGB

Minor groove binder

Q

VIC

Fluorescencia VIC

Fluorescencia FAM

Inhibidor de la fluorescencia quencher

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

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FIGURA 4-14 Representacin de la evolucin de las seales de uorescencia en un equipo de PCR de tiempo real en ensayos Taqman

Fluorescencia

Fluorescencia

Ciclos

Ciclos

Fluorescencia

Genotipo homocigoto normal

Genotipo heterocigoto

Genotipo homocigoto alternativo

Ciclos

FIGURA 4-15 Representacin de la discriminacin de genotipos mediante uorescencia en el mtodo PCR-Taqman (SNP Q223R del gen LEPR)

Genotipos GG

0,6

Alelo 223G 0,2

Genotipos AG

Controles negativos

Genotipos AA

0,2 0,3 0,7 Alelo 223A 1,1

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Epidemiologa gentica

FIGURA 4-16 Hibridacin de sondas sealizadoras (molecular beacons)

F1 D F2 D

Sondas sealizadoras

C Fluorescencia Fluorescencia

F1

F2

C G

T A

ensayo, en la realizacin del genotipado en un solo paso enzimtico y en un tubo cerrado (evita contaminacin por producto de PCR), as como el uso de condiciones estandarizadas de PCR para diferentes mutaciones. Paralelamente, existe la posibilidad de reducir el tiempo de genotipado al solicitar sondas y primers a empresas especializadas. Una metodologa de genotipicacin tambin basada en FRET usa las llamadas sondas sealizadoras (molecular beacons) que son oligonucletidos de hebra simple que tienen secuencias autocomplementarias en sus extremos, alrededor de un segmento que a su vez es complementario al ADN que contiene el SNP de inters (Figura 4-16) (Tyagi y Kramer, 1996; Kostridis y cols., 1998; Sobrino y cols., 2005). La composicin de nucletidos permite a la sonda sealizadora mantener una estructura en forma de bucle con un tallo. Los dos extremos de la sonda sealizadora estn marcados con un uorforo y por un apagador de uorescencia respectivamente, que interaccionan mediante FRET. Cuando la sonda sealizadora hibrida perfectamente con una secuencia de ADN genmico, la estructura de bucle se abre permitiendo la emisin de uorescencia por parte del uorforo (Kostrikis y cols., 1998). Para la genotipicacin de SNPs, es necesario contar con

dos sondas sealizadoras marcadas con diferentes uorforos, cuya intensidad ser registrada en el curso de una PCR de tiempo real. Usando este procedimiento, Kostrikis y cols. (1998) lograron asignar genotipos del polimorsmo en el receptor 5 de chemoquinas consistente en una delecin de 32 nucletidos (CCR5delta32) que conere resistencia frente a la infeccin por virus HIV (Liu y cols., 1996). Determinacin de SNPs en estudios de gran escala. Es posible aplicar tcnicas de hibridacin mltiple para identicar un alto nmero de mutaciones ya conocidas, como es el caso de la hipercolesterolemia familiar, cuyo diagnstico provisional puede ser entregado por signos clnicos tpicos, datos analticos bioqumicos o historia familiar del paciente. En esta enfermedad, se han descrito ms de 900 mutaciones en el gen LDLR, lo que diculta el diagnstico molecular, que es considerado como gold standard. En este sentido, el lipochip (http://www.progenika.com) es capaz de determinar de forma simultnea las mutaciones ms frecuentes de los genes LDLR, PCSK9 y APOB. Adems de su abundancia a lo largo del genoma, una caracterstica importante de los SNPs es que la determinacin de sus genotipos puede ser automatizada mediante tecnologas que permiten un alto grado de procesamiento

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

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(high-throughput = alto nmero de genotipos por da) y una alta capacidad de determinaciones simultneas (Wang y cols., 1998; De la Vega y cols., 2005; Sobrino y cols., 2005; Isler y cols., 2007; Dunbar, 2006). Un primer acercamiento para la determinacin simultnea de SNPs consiste en el diseo de ensayos de PCR multiplex en los que se amplican diferentes regiones genmicas utilizando un conjunto de pares de primers compatibles (Markoulatos y cols., 2002). Sin embargo, la generacin de dmeros de primers es un importante factor negativo que limita el nmero de amplicaciones simultneas que pueden realizarse (Syvanen y cols. 2005), lo que podra optimizarse mediante la inmovilizacin fsica de los primers en el medio de reaccin (Meuzelaar y cols., 2007). Un mtodo que permite reducir la complejidad del proceso de genotipado a gran escala consiste en la fragmentacin del genoma con una enzima de restriccin y la posterior ligacin de secuencias adaptadoras en los fragmentos resultantes, lo que permite la amplicacin de una gran cantidad de fragmentos genmicos usando un nico par de primers universales (Kennedy y cols., 2003; Syvanen y cols., 2005). Este enfoque permiti el genotipado de ms de 10.000 SNPs utilizando hibri-

dacin alelo-especca de los fragmentos amplicados con sondas inmovilizadas en microarrays de oligonucletidos de alta densidad (Matsuzaki y cols., 2004a). El nivel de determinaciones simultneas se pudo incrementar hasta un nmero de 116.204 SNPs mediante el fraccionamiento del genoma con dos enzimas de restriccin (XbaI y HindIII) y la posterior amplicacin de fragmentos de hasta 2.000 pb (Syvanen, 2005). Este procedimiento signic la cobertura del genoma completo de marcadores SNPs separados por una distancia promedio de 23,6 kb (Matsuzaki y cols., 2004b; Syvanen, 2005). Como ejemplos comerciales de mtodos de genotipado con cobertura de SNPs de genoma completo, citaremos los paneles de Affymetrix Gene Chip 100K (116.204 SNPs), 500K (500.568 SNPs) y SNP array 6,0 (906.600 SNPs) (http://www.affymetrix. com/), y los paneles de Illumina HumanHap300 y HumanHap550, que incluyen aproximadamente 318.000 y 550.000 tagSNPs, respectivamente (http:/www.illumina.com). El panel HumanOmni5.0 provee hasta 5 millones de SNPs, incluyendo informacin de variantes comunes y variantes raras (con frecuencia allica menor al 1% y representadas recientemente en la fase 3 de HapMap). La Tabla 4-2 muestra las caractersticas de

TABLA 4-2 Caractersticas de algunos paneles de polimorsmos simples (SNPs) disponibles comercialmente
Marcadores genticos Cobertura del genoma (promedio/mediana) Frecuencia de alelos menos comunes (promedio/mediana) Espaciado entre marcadores (kb) (promedio/mediana) Percentil 90 de los espacios mayores (kb) Marcadores que anquean (10 kb) a genes SNPs no-sinnimos SNPs DNA mitocondrial HumanCyto SNP-12 Illumina 299.140 0,81/0,94 0,22/0,21 9,7/6,2 18,7 148.987 2.420 0 Human660w-QUAD Illumina 657.366 0,92/1,0 0,24/0,23 4,4/2,3 10,6 332.756 10.051 135 Human1M-DUO Illumina 1.199.187 0,96/1,0 0,20/0,28 2,4/1,5 6,0 672.002 21.877 138

Fuente: http://www.illumina.com. Datos referidos a la poblacin CEU. Ver paneles adicionales en http://www.affymetrix.com y http://www.illumina.com

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algunos paneles de SNPs disponibles comercialmente, que tienen un grado variable de cobertura del genoma. La tecnologa de genotipado est en constante evolucin, por lo que es necesario consultar las pginas web de las compaas que desarrollan estas tecnologas con el n de estar al tanto de los ltimos avances en esta materia (ver listado de pginas web en Perkel, 2008). La Figura 9-4 muestra los resultados de un barrido de genoma completo en un estudio de asociacin. Adems de estos paneles de SNPs, existen adicionalmente compaas privadas que realizan determinaciones de genotipos de SNPs a la carta (por ejemplo, http:// www.kbioscience.co.uk) (Perkel 2008). Desde 2007, se ofrece un servicio de genotipado personalizado de hasta un milln de SNPs por parte de una compaa privada (http://www.decodeme.com). La enumeracin y profundizacin de los diferentes mtodos de amplicacin, discriminacin allica y deteccin de SNPs a nivel masivo est lejos del alcance de este libro (ver http://www.cegen.org para la descripcin de diferentes mtodos de genotipado a gran escala) (Syvanen, 2001; Syvanen, 2005). Mencionaremos nicamente de forma breve la tecnologa SNPlex (Applied Biosystems), la tecnologa MassArray (Sequenom), la tecnologa xMap (LuminexCorp) y la tecnologa BeadArray (Illumina). La tcnica de SNPlex permite la discriminacin allica mediante una ligacin

especca de alelo (OLA; acrnimo de Oligonucleotide Ligation Assay), en la que se utilizan dos oligonucletidos alelo-especcos en el extremo 3 y otra sonda comn adyacente que se ligar con el oligonucletido especco mediante una ADN ligasa. La amplicacin tiene lugar con primers universales y permite deteccin de SNPs mediante sondas uorescentes (http://www. appliedbiosystems.com). La teconologa MassArray se basa en el uso de espectrometra de masas para la deteccin allica, dado que esta metodologa permite medir el peso molecular de los productos formados y distinguir ADN con diferencias de una sola base nucleotdica. La deteccin puede realizarse mediante la reaccin de extensin de un nico nucletido con MALDI-TOF (acrnimo de Matrix-assisted laser desorption/ionization time of light) (http://www.sequenom. com). La tecnologa xMAP est basada en el uso de oligonucletidos adheridos a microesferas con diferentes combinaciones de dos colores, lo que permite que puedan ser identicadas y separadas por citometra. Este enfoque permite hasta 100 determinaciones simultneas de SNPs por muestra (http://www.luminexcorp.com). Finalmente, la tecnologa BeadArray se basa tambin en el uso de microesferas, pero en este caso las microesferas se inmovilizan en pocillos slidos previamente a la reaccin de genotipado (http:// www.illumina.com).

Secuenciacin de ADN
La secuenciacin del ADN es la forma conceptualmente ms directa de explorar la existencia de polimorsmos de un gen en particular. El mtodo de secuenciacin de ADN ms comnmente citado en la literatura se basa en el uso de dideoxinucletidos (ddNTPs) que actan como terminadores de la elongacin por parte de la ADN polimerasa en una reaccin de PCR asimtrica llamada PCR de secuenciacin (Strachan y Read, 1999). En esta reaccin, los dNTPs y los ddNTPs competirn entre s en su incorporacin al ADN. La incorporacin al azar de ddNTPs marcados con uorescencia resulta en fragmentos de diferente tamao que permiten la identicacin de la secuencia de ADN en un cromatograma tras una electroforesis capilar. La Figura 4-17 muestra el cromatograma con el inicio de la secuencia codicante (de 999 nucletidos en total en un nico exn) del gen MC4R, sealndose el codn de inicio con una echa. En nuestro laboratorio, este gen se secuenci en dos fragmentos solapados como una forma de cubrir la secuencia completa del gen (Hinney y cols., 1999; Santos y cols., 2007). Una vez obtenido el cromatograma, se puede comparar la secuencia obtenida con una secuencia consenso mediante el uso de programas informticos como CLUSTALW (Larkin y cols., 2007; http://www.ebi.ac.uk/ tools/clustalw2). Las tecnologas de secuenciacin estn evolucionando rpidamente (Rusk y Kiermer, 2008; Chi, 2008) (ver por ejemplo, http://www.454.com),

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habindose reducido sustancialmente tanto el tiempo de secuenciacin como sus costos (Gharizadeh y cols., 2006; Service, 2006; Levy y cols., 2007).La aplicacin

de tcnicas de secuenciacin masiva paralela est permitiendo obtener secuencias del total del exoma de forma dirigida y eciente (Gnirke y cols., 2009).

FIGURA 4-17 Inicio de la secuencia codicante del gen MC4R (geneID 4160; 18q22)
C C A G C A T G G T G A A C T C C A C C C A C C G T G G G A

Bsqueda sistemtica de nuevas variaciones de secuencia en genes candidatos

Aunque la secuenciacin es el mtodo ms directo para la bsqueda de mutaciones en genes candidatos, se ha procedido frecuentemente a la aplicacin de mtodos de bsqueda rpida (screening) que permitan identicar la presencia de variaciones genticas en muestras que si resultan positivas frente a la presencia de alguna variante gentica, posteriormente seran sometidas a secuenciacin directa para la identicacin de las alteraciones de secuencia particulares (Shi, 2001; Gmez-Gonzlez y cols., 2002). Por tanto, la secuenciacin actuara como mtodo cualitativo de referencia para la identicacin de mutaciones, mientras que los mtodos de screening actuaran como mtodos alternativos, cuya validez debe ser contrastada con la ecacia de mtodo de referencia. Como ejemplos de estos mtodos de screening podemos citar SSCP (acrnimo del trmino en ingls Single Strand Conformational Polymorphism o Polimorsmo conformacional de hebra monocatenaria) (Marti y cols., 2003; Santos y cols., 2006), DGGE (acrnimo de Denaturing Gradient Gel Electrophoresis o electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante) (Patio-Garca y cols., 1999), as como las tcnicas basadas en la deteccin de heterodplex de ADN como el mtodo DHPLC (acrnimo de Denaturing High-Pressure Liquid Cromatography o cromatografa lquida de alta presin desnaturalizante) (Yamanoshita y cols., 2005) y el mtodo CSGE (acrnimo de Conformational Sensitive Gel Electrophoresis o electroforesis en gel sensible a conformacin) (Korkko y cols., 1998) (Figura 4-18). Finalmente, la determinacin de la temperatura de fusin (Tm) del producto de PCR mediante el anlisis de disociacin del amplicn, permite efectuar un screening de mutaciones mediante la tcnica llamada HRM (High Resolution Melting). Esta tcnica se lleva a cabo en un equipo de PCR de tiempo real que incorpora uorforos de alta sensibilidad (Vorkas y cols., 2010). Todas estas tcnicas (revisadas por Ferrari y cols., 1996; Gmez-Gonzlez y cols., 2002) poseen diferentes grados de sensibilidad y especicidad (Gerhardus y cols., 2007). El principio del SSCP se basa en el diferente comportamiento electrofortico del ADN monocatenario segn su estructura conformacional que depende a su vez de la secuencia nucleotdica. La aplicacin de SSCP requiere la amplicacin previa de un segmento particular de ADN que es desnaturalizado y cargado en un gel de poliacrilamida de condiciones no-desnaturalizantes, en el que se examina la diferente movilidad de los fragmentos de hebra simple (Figura 4-19). El anlisis de heterodplex est basado en la deteccin de los heterodplex, que son molculas de ADN bicatenario que contienen alguna base desapareada (Ferrari

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Epidemiologa gentica

FIGURA 4-18 Principio de deteccin de heterocigotos mediante anlisis de heterodplex

Amplificacin de segmento de inters (PCR) 94C A T G C

68C 1 2

1. Homodplex (normal) 2. Heterodplex

FIGURA 4-19 Representacin de deteccin de variantes genticas mediante PCR-SSCP

ADN genmico A T G C Desnaturalizacin del producto de PCR Amplificacin de segmento de inters (PCR)

Renaturalizacin en gel de poliacrilamida no desnaturalizante

1 y 2. Homocigoto normal 2. Homocigoto variante alternativa 3. Heterocigoto

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FIGURA 4-20 Bsqueda sistemtica de mutaciones en el gen MC4R

A: PCR-SSCP (mtodo de screening)

Muestra con una banda adicional que sugiere la presencia de una mutacin

B: Secuenciacin (mtodo de identificacin)

A C A G G T A C T T T A N T A T C T

449C > T (Thr150Ile) en estado heterocigoto

C: PCR-RFLP

Sujeto heterocigoto Thr150Ile

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Epidemiologa gentica

y cols., 1996). En el anlisis clsico de heterodplex, el ADN genmico se desnaturaliza mediante calor y se vuelve a renaturalizar. En presencia de una variacin gentica, se producirn cuatro tipos de molculas tras la renaturalizacin: dos de ellas sern homodplex (de los fragmentos mutados y normales respectivamente) y dos sern heterodplex (con secuencias desapareadas). Los homodplex y los heterodplex tienen diferente migracin electrofortica, lo que permite la deteccin de nuevas variantes genticas. La Figura 4-20 muestra el proceso que se emple en la identicacin de la alteracin Thr150Ile del gen del receptor 4 de melanocortina (MC4R) relacionada con la obesidad de tipo monognico a travs de la aplicacin inicial de SSCP en un grupo de personas con obesidad, seguida de un mtodo rpido de bsqueda en familiares (secuenciacin) y un mtodo de conrmacin (PCR-RFLP) (Santos y cols., 2006). Segn se indica en la Figura 4-19, se evidenci en primer lugar la presencia de la mutacin mediante el examen del patrn de electroforesis tras una PCR-SSCP , donde se encontr una banda adicional en una de las muestras de ADN tras revelado con nitrato de plata (carril de la izquierda de la Figura 4-20A). En la muestra de ADN genmico de esta persona se identic la presencia de la sustitucin 449C > T en estado heterocigoto (Thr150Ile) mediante una secuenciacin bidireccional por electroforesis capilar (Figura 4-20B). A pesar de que la secuenciacin mostr un claro patrn de genotipo heterocigoto en la posicin 449C > T (sealado en la Figura 4-20B tanto en la secuenciacin utilizada

con el primer directo como con el reverso). Adicionalmente se realiz un anlisis de PCR-RFLP , en el que se dise una pareja de primers en las que uno de ellos generaba articialmente un lugar de restriccin para la enzima MaeIII (Figura 4-20C). Esta estrategia permiti conrmar la presencia de un heterocigoto en la posicin 449C > T. Este proceso (PCR-SSCP + secuenciacin + PCR-RFLP) representa un ejemplo de protocolo sistemtico para la bsqueda de alteraciones de secuencia que intenta reducir al mnimo la posibilidad de errores de genotipicacin mediante la aplicacin de mtodos independientes de deteccin de variantes genticas. La tcnica de PCR-RFLP tiene por objeto fundamental el detectar de forma rpida la presencia de mutaciones en familiares del caso ndice. Es importante destacar que la bsqueda actual de nuevas mutaciones puede ser realizada de forma eciente mediante las tecnologas de secuenciacin masiva paralela (Gnirke y cols. 2009). El proyecto de los 1.000 genomas (http://www.1000genomes.org) est elaborando una base de datos de un alto nmero de secuencias del genoma, cuyos resultados sern depositados en bases de datos pblicas. Estos esfuerzos han permitido averiguar la presencia de variaciones allicas de baja frecuencia que se han incorporado en la fase 3 de HapMap. La aplicacin de estas nuevas tecnologas han permitido, por ejemplo, abordar la secuenciacin del exoma completo con la identicacin de mutaciones causantes de enfermedades monognicas (Ng y cols. 2010).