Tcnicas en bioqumica

Existen numerosas tcnicas que se utilizan para la purificacin y clasificacin de una o varias
protenas, pero primero necesitamos la obtencin de la protena que deseamos utilizar.

Si la protena que interesa se halla localizada en el citosol su liberacin solo requiere la apertura de
la clula por ruptura (lisis), el mtodo ms utilizado se denomina lisis osmtica y no es ms que
suspender la clula en una solucin hipotnica. Si la protena que se necesita es un componente
de la asociacin subcelular, como las membranas o las mitocondrias, puede efectuarse una
purificacin considerable de la protena, separando, en primer lugar, la asociacin subcelular del
resto del material celular, este objetivo, puede conseguirse, habitualmente, por centrifugacin
diferencial, proceso en el que el lisado celular se centrifuga a una velocidad que elimina solamente
los componentes celulares ms densos que el organelo deseado, seguido de centrifugacin a una
velocidad que obliga a depositarse al componente deseado; La protena que se trata de separar se
extrae del componente ya purificado con disoluciones salinas concentradas o detergentes o
disolventes organicos.

Mtodos especializados

Cromatografa: Uno de los mtodos ms potentes para el fraccionamiento proteico.
Aprovecha las diferencias de carga, tamao, afinidad de unin y otras propiedades de las
protenas. Se introduce, en una columna, un material solido poroso de propiedades
qumicas adecuadas (fase estacionaria) a travs de la cual se hace pasar una solucin
tamponada (fase mvil). La solucin que contiene las protenas se introduce en la cabeza
de la columna y a continuacin se filtra a travs de la matriz solida. Las protenas
individuales migran ms rpido o ms lentamente en funcin a sus propiedades
1. Cromatografa por intercambio inico: La matriz solida (o estacionaria) contiene
grupos cargados. Se subdivide en catinica (en la fase estacionaria la matriz
contiene grupos cargados negativamente. En la fase mvil, las protenas con carga
positiva neta migran ms lentamente que aquellas con carga negativa neta) y
aninica (en la fase estacionaria la matriz contiene grupos cargados
positivamente. En la fase mvil, las protenas con carga negativa neta migran ms
lentamente que aquellas con carga positiva neta).
2. Cromatografa de exclusin molecular: Separa protenas segn su tamao. Las
protenas de mayor tamao emergen de la columna antes que las pequeas. La
fase solida consiste en pequeas perlas, partculas que contienen unos poros o
cavidades de tamao calibrado. Las protenas de mayor tamao no pueden entrar
a las cavidades, por lo que toman el camino ms corto (y ms rpido) rodeando las
partculas por el exterior. Las protenas ms pequeas penetran en las cavidades y,
por tanto, migran ms lentamente a travs de la columna.
3. Cromatografa de afinidad: las partculas de la columna tienen grupos qumicos
unidos covalentemente. Una protena afn a este grupo qumico particular se unir
a las partculas de la columna, lo que retardara su migracin.

Electroforesis: Se basa en el desplazamiento de las protenas cargadas en un campo
elctrico. Es muy til como mtodo analtico. Su ventaja es que las protenas pueden
visualizarse adems de separarse, lo que permite hacer una estimacin rpida del nmero
de protenas en una mezcla o del grado de pureza de una preparacin proteica
determinada. Tambin permite la determinacin de propiedades cruciales como punto
isoelctrico (pI) y masa molecular aproximada. Se lleva a cabo generalmente por geles
formados por poliacrilamida, el cual, retrasa las protenas en forma aproximadamente
proporcional a su cociente carga/masa (las menos pesadas se desplazan ms rpido). Un
mtodo electrofortico frecuentemente utilizado para la estimacin de la pureza y la masa
molecular emplea el detergente dodecil sulfato sdico (SDS), el cual tiene la capacidad de
desnaturalizar la protena (romper sus enlaces no covalentes). Si la protena tiene dos o
ms subunidades diferentes, las subunidades se separarn generalmente a consecuencia
del tratamiento con SDS y aparecer una banda individual para cada una.
1. El enfoque isoelctrico es un procedimiento utilizado para determinar el pI de una
protena. Es una variante de la electroforesis. Se establece un gradiente de pH
dejando que una mezcla de cidos y bases se distribuya espontneamente en un
campo elctrico generado a travs del gel. Cuando se aplica una mezcla de
protenas, cada una de ellas se desplaza hasta que alcanza el pH que iguala su pI.
2. La combinacin secuencial del enfoque isoelctrico y la electroforesis en gel con
SDS (PAGE-SDS) es un proceso denominado ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
3. Si la electroforesis solo se realiza con PAGE, la protena se distribuye en su estado
nativo, ya que el estudio no agrega ningn examen que sea capaz de
desnaturalizar la protena.