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Artemisa en lnea

II. Factores que intervienen en la reaccin antgenoanticuerpo

Javier Bautista-Jurez*

La reaccin antgeno-anticuerpo es la piedra angular de la respuesta inmune y se pone de manifiesto in vitro por la formacin de un precipitado o aglutinacin de partculas (eritrocitos). El acoplamiento estructural entre las macromolculas est dado por varias fuerzas dbiles que disminuyen con la distancia, como son los puentes de hidrgeno, las fuerzas de van der Waals, las interacciones electrostticas dbiles y las hidrofbicas. El reconocimiento antgeno-anticuerpo es una reaccin de complementariedad, por lo que se efecta a travs de mltiples enlaces no covalentes entre una parte del antgeno y los aminocidos del sitio de unin en el anticuerpo. La reaccin se caracteriza por ser especfica, rpida, reversible y espontnea.1 Especfica. Capacidad de los anticuerpos para distinguir entre dos ligandos de estructura similar. La unin dada por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos qumicos con diferencias mnimas. Rapidez. La velocidad con que ocurre la primera etapa de la reaccin antgeno-anticuerpo es del orden de milsimas de segundo, y esta limitada nicamente por la difusin. La segunda etapa, que es ms larga, incluye todas las manifestaciones que se presentan como consecuencia de la interaccin tales como precipitacin, aglutinacin, neutralizacin, etc. Espontaneidad. La reaccin antgeno-anticuerpo no requiere energa adicional para efectuarse y es factible explicarla en trminos de la ley de accin de masas. K1 Ab+H =========AbH K-1 Keq= (AbH) (Ab)(H) Donde el valor de la constante de equilibrio es una medida de afinidad del anticuerpo por el antgeno y, desde un punto de vista termodinmico, permite conocer la energa libre de Gibbs mediante la ecuacin de : E Gibbs=-RT ln Keq.

Reversibilidad. Dado que la reaccin se debe a fuerzas no covalentes, es reversible y, en consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura, proporcin antgeno-anticuerpo, el pH y la fuerza inica. En pruebas de laboratorios que usan la aglutinacin como punto final, la alteracin de las condiciones fsicas del sistema puede incrementar o reducir la sensibilidad de la prueba.1-4 Temperatura. La temperatura tiene efectos inversamente proporcionales con la constante de equilibrio y la velocidad de reaccin si uno se aleja de los puntos ideales a trabajar. En inmunohematologa los anticuerpos eritrocitarios reaccionan dentro de un margen restringido de temperatura. En general los anticuerpos IgM reaccionan a temperaturas de entre 4-27C, mientras que los anticuerpos IgG reaccionan mejor a 37C, es por eso que los procedimientos para la deteccin de anticuerpos pueden detectarse a diferentes temperaturas, se debe de tener cuidado adems de clasificar los anticuerpos que son clnicamente significativos, a los que actan a un amplio margen trmico, a los que fijan complemento etc.

pH
No existe un pH exacto ptimo, pero se dice que entre 6-7.3 se detecta la mayora de los grupos sanguneos clnicamente significativos, con excepciones como el anti MeI que actan mejor a pH ms bajos, notndose marcadamente el cambio de la especificidad de los anticuerpos en especial de los monoclonales. Uno de los puntos ms importantes a observar es el almacenamiento de reactivos, entre los que figura principalmente la solucin salina isotonica, la cual despus de un largo periodo de almacenamiento el pH cambia de 5.06.0, por lo que algunos tcnicos prefieren la utilizacin de soluciones amortiguadas en las pruebas serolgicas.

Fuerza Inica
Est directamente relacionada con el potencial z. En la solucin salina normal, los iones de Na+ y Cl- se renen alrededor de los antgenos y de los anticuerpos y neutralizan

* Banco Central de Sangre. Centro Mdico Nacional Siglo XXI. IMSS. Mxico, D.F.

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parcialmente cargas opuestas, esto impide la asociacin del anticuerpo con el antgeno, pero puede disminuirse de diferentes formas. Por lo que el resultado del efecto de eliminar, neutralizar o disminuir estas cargas ayuda a conseguir una constante de equilibrio mejor y a incrementar la velocidad de reaccin.

Concentracin de antgeno-anticuerpo
Aunque est muy relacionada, un exceso de anticuerpos podr inhibir la aglutinacin como en la precipitacin en el efecto prozona de la curva de equivalencia. Una relacin comnmente usada es de dos gotas de suero con una gota de eritrocitos resuspendidos a 2-3% en solucin fisiolgica. Por lo que el nmero de anticuerpos en el sistema y el nmero de sitios antignicos por el eritrocito afectan la velocidad con que se lleva a cabo una reaccin de aglutinacin, vindose que una relacin de suero-clula aumentada puede detectar anticuerpos dbilmente reactivos.5-7

Tiempo de incubacin
El tiempo necesario para alcanzar el equilibrio vara para la mayora de los anticuerpos y de su medio de reaccin. En algunos casos los agentes potenciadores pueden incrementar la cantidad de anticuerpo que se fija al antgeno en los primeros 15 minutos, y en consecuencia disminuir el tiempo de incubacin el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio. Pero en medios como en solucin salina fisiolgica o albmina, en los cuales el suero antiglobulina es necesario para demostrar la fijacin de anticuerpos, lo adecuado son 30 minutos a 37C para detectar la mayora de los anticuerpos clnicamente significativos. No obstante con algunos anticuerpos con constantes de equilibrio muy bajas, la asociacin no alcanzara el equilibrio a los 30 minutos, por lo que la extensin del tiempo de incubacin incrementara la sensibilidad de la prueba, por lo que en general para todos los anticuerpos, el aumento del tiempo de incubacin en estos medios tiene mayores ventajas.

Estructura antignica
Los antgenos de grupo sanguneo son protenas o hidratos de carbono. Su especificidad antignica est determinada por una secuencia concreta de aminocidos o por una molcula constituida por 3 o 4 azcares. La membrana del hemate est constituida por una doble capa de lpidos. Las cadenas hidrocarbonadas, en cuyos extremos se unirn los azcares especficos de A, B, H, P1 y Lewis, se unen directamente a la capa lipdica a travs de radicales de fosfato especficos. (Cuadro I). Mecanismos mediante las protenas se encuentran insertadas a la membrana

Cuadro I. Sistemas de grupo sanguneo N 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Nombre ABO MNS P Rh Lutheran Kell Lewis Duffy Kidd Diego Cartwrigth Xg Scianna Dumbrock Colton Landstainer -Weiner Chido/ rodgers Hh Kx Gerbich Cromer Knops Indian Smbolo ABO MNS P RH LU KEL LE FY JK DI YT KG SC DO CO LW CH/RG H XK GE CROM KN IN Nombre gen ABO GYPA, GYPB, GYPE P1 RHD,RHCE LU KEL FUT3 FY JK AE1 ACHE XG SC DO AQP1 LW C4A,C4B FUT1 XK GYPC DAF CR1 CD44 cromosoma 9q34 4q28-31 22q31 1p36-p34 19q 12-q13 7q33 19p 1q22-q23 18q11-q12 17q 7q22 Xp22.3 1p34-p32 7p14 19p 13-p11 6p21.3 19q Xp21.1 2q14-q21 1q32 1q32 11p Producto gnico Glicosiltransferasa Glicoforinas A,B Glicosiltransferasa Polipptidos CE y D Glicoprotena Glicoprotena Glicosiltransferasa Receptor Protena de tranmsporte Banda 3 Acetilcolinesterasa Glicoprotena Glicoprotena Glicoprotena CHIP 28 Glicoprotena C4 Glicosiltransferasa Glicoprotena Glicoforinas C,D DAF (CD55) CR1 (CD35) H-CAM (CD44) Funcin Aade azcares GPA=inhibidor C Aade azcares Transporte de lpidos Superfamilia de Inmunoglobulinas Metaloproteasa ligadora de Zn++ Aade azcares Receptor citoquina (IL-8) Transporte de urea Transporte de aniones Desconocido en hemates Desconocido Desconocido Desconocido Canal de agua, acuaforina Molcula de adhesin Va clscica de C Aade azcares Desconocido Desconocido Control de complemento Receptor de complemento Adhesin celular

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1.

Protenas orientadas longitudinalmente cuyos extremos NH2 y COOH pueden estar dentro del citoplasma o en el exterior de la clula.
Protena Glicoforina A Glicoforina B Glicoforina C CD44 CR1 Lutheran LW Xg Kell Antgeno M,N S,s,U Gerbich Indian Knops Lutheran LW Xga Kell

NH2 exterior

COOH exterior

2.

Protenas que interaccionan con la doble capa lipdica atravesndola transversalmente formando circunvalaciones. Estas protenas constituyen el llamado esqueleto de la membrana del hemate, responsable de su flexibilidad y resistencia.
Protena Polipptidos D y CcEe Banda 3 (AE 1) Aguaporina 1 (CHIP) Duffy Kidd Kx Antgeno Rh Diego Colton Duffy Kidd Kx

NH2 y COOH NH2 exterior COOH interior

En otras situaciones se requiere la interaccin entre dos protenas para que el eptopo se exprese. Este es el caso de los antgenos Wr, U, Duclos, Fy5 y Kell. La expresin del antgeno Rh(D) depende de la relacin del polipptido D con los lpidos de la membrana. La localizacin de los antgenos en la membrana condicionar las tcnicas de deteccin. As, mientras los antgenos Rh y Diego estn situados muy cerca de la capa de lpidos, los antgenos como A, B, H, y MN se sitan en la superficie de la capa glicosilada externa (1012.5 nm de los lpidos). La capacidad de un anticuerpo de naturaleza IgG de producir aglutinacin directa depender de la localizacin del antgeno, por ejemplo, los anti-A y anti-M de clase IgG fcilmente sern aglutinantes, mientras que, los anticuerpos de la misma naturaleza, dirigidos contra los antgenos del sistema Rh y diego sern detectados mediante pruebas llevadas hasta la fase de antiglobulina. Estas diferencias no se aprecian cuando se trata de anticuerpos clase IgM, dado que estas molculas cubren distancias de 30 nm.

Referencias
1. Glyan, LE, Steward MW. (eds.) (1977), Inmunochemistry: An advanced Textbook, J. Wiley & Sons. Chichester, Brisbane, Londres y Toronto. Heidelberger M. (1956) Lectures in Immunochemistry. Academic Press. Londres y Nueva York. Klotz LM. (1982). Number of receptor sites from Scatchard graphs: Facts and fantasies. Science 217:1247. Roitt LJ, Brostoff D. Male. (1985). Immunology. Churchill Livingstone, Edimburgo, Londres, Melbourne y Nueva York: Gower Medical Publishing Ltd., Londres y Nueva York. Watson JD. (1976). Molecular Biology of the Gene, 3a edicin. W.A. Benjamin, Inc. Menlo Park. Mollison PL, Engelfriet FP, Contreras M. Blood transfusion in clinical medicine, 9th ed. Oxford: Blackwell Scientific, 1993. Coombs RRA, Mourant AE, RaceRR. A new test for the detection of weak and incomplete Rh agglutinins. Br J Exp Pathol 1945;26:255-66. Ribera Anna. Seminario de Inmunohematologa; resolucin de problemas serolgicos complejos. Sistemas de Grupos sanguneos eritrocitarios humanos. Menarini diagnostics. Barcelona 29Nov1995. Pags 5-17.

3.

Protenas unidas a la cara externa de la membrana a travs de radicales fosfotidilinositol.

Antgenos Yt Cromer Dombrock

2. 3. 4.

Protena Acetilcolinesterasa CD55 (DAF) Dombrock

4. 5.

Mecanismo de unin desconocido: scianna. Protenas adsorbidas del plasma

Antgenos Chido/Rogers

5. 6. 7.

Protena Componente 4 del Complemento (C4)

La expresin de determinados antgenos requiere la presencia de secuencias especficas de aminocidos y de carbohidratos especficos: M, N, Tm, Sj, M1, Can, Sext, Hu y Wb.

8.

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