Tcnicas Instrumentales Avanzadas Fluorescencia

TEMA 1. Repaso de conceptos generales. Instrumentacin: fuentes de excitacin, monocromadores, filtros detectores. Excitacin multifotnica. Espectroscopia de fluorescencia en estado estacionario. Espectroscopia de fluorescencia con resolucin temporal. Medidas en el espacio de tiempo. Medidas en el espacio de frecuencias. TEMA 2. Anisotropa de fluorescencia y su aplicacin al estudio hidrodinmica de molculas. Estado estacionario y resolucin temporal. Ejemplos de aplicacin TEMA 3. Transferencia de energa. Estado estacionario y resolucin temporal. Ejemplos de aplicacin TEMA 4. Espectroscopa de correlacin de fluorescencia ( FCS). Aplicacin al estudio de interacciones moleculares TEMA 5. Espectroscopia de fluorescencia en el estudio de molculas individuales. Espectroscopia de fluorescencia en clulas vivas ( FRET, BRET, FLIM, FRAP)

ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Caractersticas de la fluorescencia que pueden analizarse y aportar informacin sobre procesos biolgicos: Intensidad (quenching, espectroscopia de correlacin de fluorescencia...) Longitud de onda de emisin ( transferencia de energa ) Vida media ( anlisis de vidas medias ) Polarizacin (anisotropa de fluorescencia)

ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Aplicaciones en Biologa Permite identificar molculas de forma especfica Permite estudiar procesos dinmicos a nivel molecular: plegamiento de protenas comportamiento hidrodinmico de molculas en solucin interaccin entre ligandos

LUMINISCENCIA
S2
(10-12s)

S1
(10-9s- 10-8s) (10-15s)

T1
(10-6-102s)

hA S0

hf

Absorcin

Fluorescencia
(transicin desde estado singlete)

Fosforescencia
(transicin desde estado Triplete)

CARACTERSTICAS DE LA EMISION DE FLUORESCENCIA

Desplazamiento de Stokes:
La energa de la emisin de fluorescencia es menor que la energa de absorcin

El espectro de emisin es independiente de la longitud de onda de excitacin

RENDIMIENTO CUANTICO

Constante de decaimiento radiativo Constante de decaimiento no radiativo

Rendimiento cuntico: nmero de fotones emitidos en relacin al nmero de fotones

absorbidos

VIDA MEDIA DE FLUORESCENCIA

hexc hemision

t <0

t =0

t >0

Nb Aba Na
Constante de decaimiento radiativo ( )

dNb = Aba N b dt

ln(Nb)

vida media -Aba= -1/

N b (t ) =N b (0)e

Aba t

VIDA MEDIA DE FLUORESCENCIA

Constante de decaimiento radiativo Constante de decaimiento no radiativo

Vida media del estado excitado: tiempo promedio que pasa la molcula en el estado
excitado antes de regresar al nivel base

Vida media intrinseca: vida media en ausencia de decaimiento no radiativo

n = 1/

n = /Q

BLANQUEO DE FLUORESCENCIA ( QUENCHING )

BLANQUEO DE FLUORESCENCIA ( QUENCHING ) Mecanismos: Colisin de la molculas excitada con otras molculas:
( oxgeno, halgenos, aminas, acrilamida...)

Formacin de complejos no fluorescentes

Ecuacin de Stern-Volmer
constante de quenching kq = constante de quenching bimolecular o = vida media en ausencia de quencher [Q] = concentracin de quencher

Kq =

EJEMPLOS DE APLICACIN DEL FENMENO DE BLANQUEO

DESPLAZAMIENTO DE LA LONGITUD DE ONDA DE EMISIN

solvent relaxation (10-10s)

Fluorescence

e
Absorption

DESPLAZAMIENTO DE LA LONGITUD DE ONDA DE EMISIN: EJEMPLOS

TRANSFERENCIA DE ENERGIA

distancia de Foster ( refleja el grado de

solapamiento espectral ) nm

distancia entre el donante y el aceptor Vida media del donante Velocidad de transferencia de energa
Eficiencia de la transferencia de energa

E = Ro6 / (Ro6 + r6 )

TRANSFERENCIA DE ENERGIA: EJEMPLO DE APLICACION

ANISOTROPIA DE FLUORESCENCIA

I//

Polarizador de excitacin

I Polarizador de emisin

Momento dipolar de transicin de absorcin Momento dipolar de transicin de emisin

Polarizacin:
P(t ) = I || (t ) I (t ) I || (t ) + I (t )

Anisotropa de fluorescencia

r (t ) =

I || (t ) I (t ) I || (t ) + 2 I (t )

ANISOTROPIA DE FLUORESCENCIA Se puede usar para medir difusin rotacional de molculas

Anisotropa en ausencia de rotacin

Ecuacin de Perrin
Tiempo de correlacin rotacional viscosidad Volumen molecular

Vida media

Constante de los gases Angulo entre los dipolos de absorcin y emisin

temperatura

ANISOTROPIA DE FLUORESCENCIA: OTROS EJEMPLOS

ESTADO ESTACIONARIO Y RESOLUCION TEMPORAL

Espectrofluormetro

FUENTES DE ILUMINACIN
Lmparas de Xenon (Xe) 250-750 nm Lmparas de Mercurio de alta presin (Hg) emisin en lneas Lmparas de Mercurio-Xenon (Hg-Xe) lneas ms anchas que en la de Hg Lmparas halgenas de cuarzo-tungsteno (QTH) espectro continuo en visible e infrarojo Lmparas de mercurio de baja presin lneas muy finas ( apropiadas para calibracin).

violet blue green yellow orange

380450 nm 450495 nm 495570 nm 570590 nm 590620 nm

ESPECTROSCOPIA BIFOTONICA
El fluorforo absorbe dos fotones de menor energa

Requerimientos:
-2 fotones presentes en 10-15 - 10 -16 s -Se consigue excitando con lseres pulsados de picosegundos o femtosegundos

ESPECTROSCOPIA BIFOTONICA
Las reglas de seleccin son distintas:
- los espectros de absorcin y excitacin no son los mismos que cuando se excita con un fotn - todava se sabe poco sobre los espectros de absorcin con excitacin bifotnica

Los espectros de emisin son iguales No se cumple la Ley de Beer:

La luz absorbida es proporcional al cuadrado de la intensidad de la luz incidente

dI = In dx

No. de molculas

Seccin transversal efectiva

Ley de Beer

ESPECTROSCOPIA BIFOTONICA
Consecuencia importante - perfil de distribucin espacial de la poblacin de molculas excitadas Ventajas -solo se excitan los fluorforos que estn en el punto focal

TIPOS DE FLUOROFOROS Intrnsecos Extrnsecos sensibles al solvente sondas de membrana sondas para medir potencial de membrana sondas de DNA sondas qumicas protenas fluorescentes

TIPOS DE FLUOROFOROS - Intrnsecos o Naturales

TIPOS DE FLUOROFOROS

TIPOS DE FLUOROFOROS - Extrnsecos

TIPOS DE FLUOROFOROS Sondas de membrana

TIPOS DE FLUOROFOROS

Sondas de DNA

TIPOS DE FLUOROFOROS
Protenas fluorescentes
Ficobilisomas en algas azules y rojas ( 470-650 nm)

TIPOS DE FLUOROFOROS
Green Fluorecence Protein GFP
Presente en una medusa bioluminiscente

Constituida por 238 amino cidos constituye un cilindro de aprox 30 x 40 angstroms con el fluorforo localizado en el centro Ciertos mutantes emiten a distintas longitudes de onda y pueden formar el fluorforo ms rpidamente

MUTANTES DE GFP

Espectros de excitacin y emisin de GFP wt ( lneas negras) y el mutante GFPuv ( lineas violetas). La emisin se obtuvo excitando a 385 nm.

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Experimento en solucin

Molcula individual, Varios fluorforos

Fluorforo nico

fluorforo ~10-6M

1015 molculas

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Ventajas Distribucin # moleculas

EFRET, r, If

Experimento en solucin da el mismo resultado en los tres casos: el valor promedio

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Dinmica
Se puede seguir la evolucin temporal de una reaccin qumica ( con FRET por ejemplo) solo si se puede disparar la reaccin externamente .

Intensidad del donante Intensidad del aceptor

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Se pueden estudiar transiciones que quedaran enmascarada en experimentos con muchas molculas

molcula #1
Propiedad medida

molcula #2

molcula #3

time

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Observables
quencher

Intensidad de fluortescencia y/o vida media Se pueden detectar movimientos a escala molecular que acercan o alejan al fluoroforo de un quencher como fluctuaciones temporales de intensidad de fluorecencia.

Intensidad de Fluorescencia

tiempo

Transferencia de energa: Pequeos cambios en la distancia entre el donanete y el aceptor afectan mucho la eficiencia de transferencia de energa

Polarizacin de Fluorescencia La variacin temporal de la orientacin del dipolo anclado rgidamente en la molcula puede aportar informacin de los movimientos angulares de la molcula. Union del fluorforo en zonas flexibles puede aportar informacin sobre su movilidad

Fluorforo est fijo en la molcula Rotacin del fluorforo en escalas de tiempo de nanosegundos

Principles of Fluorescence Spectroscopy Joseph R. Lakowicz J. Lakowicz Format:Textbook Hardcover, 2nd ed., 698pp. ISBN: 0306460939 Publisher: Kluwer Academic Publishers Pub. Date: January 1999

Biophysical Chemistry. C. R. Cantor and P.R. Schimmel. Vol. II Techniques for the study of biological molecules (!980), Freeman, New York.

Topics in Fluorescence Spectroscopy Joseph R. Lakowicz (Editor) (Kluwer Academic/Plenum Publishers ) Volume 1: Techniques January 1992 Volume 2: Principles Volume 3: Biochemical Applications Volume 4: Probe Design and Chemical Sensing Volume 5: Nonlinear and Two-Photon Induced Fluorescence Volume 6: Protein Fluorescence November 2000

Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences. Eds. D. L. Taylor, A. S. Waggoner, F. Lanni, R. F. Murphy, and R. R. Birge. (1986), Alan R. Liss, Inc., New York.

Revisiones recientes
Single-Molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer
Methods: A Companion to Methods in Enzymology vol. 25, No. 1, September 2001 pp. 78-86.

Single-molecule fluorescence methods for the study of nucleic acids

Taekjip Ha CURR OPIN STRUC BIOL 11 (3): 287-292 JUN 2001

Measuring conformational dynamics of biomolecules by single molecule fluorescence spectroscopy Shimon Weiss
Nature Structural Biology Vol.7 Number 9- September 2000.

Fluorescence Spectroscopy of Single Biomolecules

Shimon Weiss Science March 12 1999 pp.1676-1683

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Deteccin de Molculas Individuales
La seal detectada debe ser mayor que la seal debida a las impurezas del solvente, de sustrato de vidrio, los componentes pticos y el ruido del detector. Es necesario: - excitar un volmen muy pequeo - usar una ptica muy eficiente - usar detectores de alta eficiencia cuntica y poco ruido Microscopa confocal Microscopa de Fluorescencia

Utilizan detectores puntuales ( fotodiodos de avalancha) Buena resolucin temporal y sensibilidad Se observa una molcula a la vez

Detectores bidimensionales como cmaras CCD Se detectan varias molculas simultaneamente La sensibilidad y la resolucin temporal no son tan buenas

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Microscopa Confocal

La muestra se ilumina de forma secuencial en un elemento de volumen cada vez Se pueden iluminar zonas hasta de 250 nm y 500 nm de profundidad

Basement membrane labeled with cy2 (green) Neurons labeled with cy3 (red)

http://www.atto.com/Carv/CarvSkinSection.htm

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Refleccin Total Interna c reflected ray i = r n1 n1 n2
t i = r

n1 > n2

n2

refracted ray n1.sin i = n2.sin t

t= 90

n1.sin c = n2

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Refleccin Total Interna
Se forman ondas evanescentes cuando ondas sinusoidales se relejan internamente de una interfase a un ngulo mayor que el ngulo crtico , cuando ocurre relexin total interna La intensidad de la onda evanescente decae exponencialmente con la distancia de la interfase a la que se forman

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/tirf/olympusaptirf.html

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Refleccin Total Interna Con microscopa convencional es difcil distinguir la fluorescencia de las cuentas porque la fluorescencia ms intensa de la clula la oculta. Con reflexin total interna se pueden distinguir fcilmente las cuentas

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Microscopa confocal color beam splitter or polarizing beam splitter Reflexin total interna

APD 1

CCD

APD 2

laser

sample mounted on a piezo scanner

laser
counts per second photobleaching

time

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

SO3 SO3

Fluoroforos:
-fotoestabilidad

+N

Cy3 (570 nm)

SO3 SO3

- alto rendimiento cuntico - coeficiente de extincin alto - pocas fluctuaciones en intensidad - absorcin y emisin en el visible

+N

Cy5 (650 nm)

SO3 NH2 O SO3 + NH2

- pequeos.

COO

2 Li+

Para reducir el fotoblanqueado:

TAMRA (570 nm)

(H 3C) 2N O

Glucosa

Glucosa oxidasa O2 H2O2

cido glucnico

+ N(CH 3)2

COO

H2O2
Alexa Fluor 488 (520 nm)

H2O + 1/2 O2 catalasa

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Inmovilizacin de mleculas a superficies
La observacin de procesos dinmicos de molculas individuales requiere tiempos de obervacin largo y, por tanto, inmovilizacin de molculas de forma funcional

biotina-streptavidina Molcula biotinilada

streptavidina Superficie de vidrio BSA biotinilada > Ni-NTA (Nickel- cido-nitrilotriactico)- proteinas

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

Fluorescencia de molculas individuales inmovilizadas

Cambios conformacionales de una molcula de RNA inducidos por la unin a una protena (a) RNA de tres hlices se pliega al unirse al la protena ribosomal S15. (b) Imgen de fluorescencia del donante y el aceptor . Puntos verdes representan RNA sin protena y los puntos rojos, con alta FRET, RNA plegado

Ligand-induced conformational changes observed in single RNA molecules Taekjip Ha, Xiaowei Zhuang, Harold D. Kim, Jeffrey W. Orr , James R. Williamson , and Steven Chu, PNAS Vol. 96, Issue 16, 9077-9082, August 3, 1999

FLUORESCENCIA DE MOLCULAS INDIVIDUALES

F1FO ATP Synthase: F1FO-ATPase: ATP

ADP + Pi ADP + Pi

ATP

V H

time
Stepping rotation of F1-ATPase visualized through angle-resolved single-fluorophore imaging. Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jun 20;97(13):7243-7 Adachi K, Yasuda R, Noji H, Itoh H, Harada Y, Yoshida M, Kinosita K Jr.

ESPECTROSCOPIA DE CORRELACION DE FLUORESCENCIA

-Se miden fluctuaciones durante 1 microsegundo a un segundo en la fluorescencia de volmenes muy pequeos ( del orden de femtolitros) -el nmero de molculas que se analiza es del orden de 3 molculas/femtolitro, - ( equivalente a ~5 nM concentracin macroscpica)

http://www.probes.com/handbook/boxes/1571.html

http://imd-www.es.hokudai.ac.jp/~cback/volume.html

ESPECTROSCOPIA DE CORRELACION DE FLUORESCENCIA

http://imd-www.es.hokudai.ac.jp/~cback/volume.html

ESPECTROSCOPIA DE CORRELACION DE FLUORESCENCIA

Compara la intensidad de fluorescencia a tiempo t con la intensidad a tiempo (t + ), donde es un intervalo variable de tiempo, promediada en todos los puntos de la serie temporal (indicado por < >)

FCS simulada: azul- ligando de bajo peso mlecular rojo- ligando unido a molcula verde- mezcla 1:1 de ligando libre y unido

ESPECTROSCOPIA DE CORRELACION DE FLUORESCENCIA

La funcin de autocorrelacin G(t) de molculas fluorescentes: y relacin entre ligandos libres y unidos s parmetro estructural de deteccin de volmen N nmero de molculas marcadas - tiempo de difusin