Anda di halaman 1dari 12

ISOLASI DNA

Oleh : Nama NIM Kelom o! #om$on%an A&i&ten : Putri Etty Ferayanti : B1J011060 :" : II : Arthi!a Lo'ia Sari

LAPO#AN P#AK(IK)M BIOLO*I MOLEK)LE#

KEMEN(E#IAN PENDIDIKAN DAN KEB)DA+AAN )NI,E#SI(AS JENDE#AL SOEDI#MAN FAK)L(AS BIOLO*I P)#-OKE#(O "01.

I/ PENDA0)L)AN A/ Latar Bela!an% DNA adalah polimer nukleotida biasa. Satu gugusan fosfat dari setiap trifosfat pelopor termasuk dalam polimer. Gugusan fosfat ini, yang terikat pada 5 karbon gula pentosa pada satu nukleotida, juga terikata se ara kimia!i pada " karbon gula nukleotida kedua, sehingga suatu deret 5-" pautan fosfat mengikat nukleotida nukleotida itu menjadi satu sejauh panjangnya polimer. #katan ikatan fosfat itu sangat kuat dan dikenal sebagai ikatan ikatan ester ko$alen, atau ikatan fosfodiester. %esidu fosfat & '()- * sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga diberi nama asam nukleat & Goodenough, +,-- *. DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, he!an dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. 'enyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti &nu lear DNA genome* berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria &mito hondrial DNA genome* berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. (rganisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel &pada bakteri* atau dibungkus oleh protein tertentu &pada $irus*. .romosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. 'lasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih ke il dibanding kromosom &'urna!arman et al., /0+/*. DNA merupakan dasar se ara kimia!i dari hereditas dan merupakan polimer dari nukleotida-nukleotida yang dihubungkan satu dengan yang lainnya oleh ikatan fosfodiester, yaitu ikatan yang terjadi antara nukleotida yang terdiri dari sebuah gula pentosa &deoksiribosa*, satu buah fosfat dan satu basa nitrogen. 1asa nitrogen tersebut berikatan dengan karbon pertama dari gula deoksiribosa, sedangkan fosfat berikatan dengan karbon kelima dari gula yang sama. 1asa nitrogen yang menyusun nukleotida dikelompokan menjadi / yaitu purin &adenin dan guanin* dan pirimidin &sitosin dan timin* &'riyani, /00)*.

B/ (u1uan 2ujuan dari a ara praktikum kali ini adalah mengetahui prinsip dan proses isolasi DNA kromosom dan melakukan isolasi DNA kromosom bakteri Escherichia coli.

II/

MA(E#I DAN ME(ODE A/ Materi

1ahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah isolat absolut, al ohol 908 kloroform, akuades dan SDS +08

air

Escherichia coli, buffer 2A3 +4, a5uades steril, 50 6l tenderi7er "08, etanol Alat-alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah tabung eppendorf, sarung tangan, seperangkat mikropipet beserta tipnya, freezer, labu 3rlenmeyer, in ubator dan kamera digital.

B/ Meto2e +. Sebanyak +,5 ml kultur hasil inkubasi semalam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan ke epatan 5000rpm selama " menit dalam suhu ruang. /. .emudian supernatant dibuang lalu ditambahkan + ml akuades, disentrifugasi dengan ke epatan 5000rpm selama " menit. ". Supernatant dibuang, ditambahkan tenderi7er "08 sebanyak 50 6: kemudian diinkubasi selama + jam dalam suhu "9;<. ). Setelah itu ditambahan 50 6: SDS +08 kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi dengan ke epatan +0000 rpm selama +0 menit. 5. Supernatan yang dihasilkan ditampung dalam tabung eppendorf baru lalu ditambahkan kloroform dengan perbandingan +=+ dari $olume supernatant, lalu dihomogenkan dengan disentrifugasi +0.000 rpm selama +0 menit. >. DNA diambil dan dipindah ke tabung baru kemudian ditambahkan etanol absolut dingin kemudian diendapkan selama 94/) jam dalam lemari pendingin &freezer). 9. Sentrifugasi dengan ke epatan +0000 rpm dilakukan selama +0 menit pada suhu );<. Supernatan yang terbentuk dibuang kemudian ditambahkan alkohol 908 lalu disentrifugasi lagi dengan ke epatan +0000 rpm selama +0 menit.

-. Supernatan kembali dibuang, tabung dikeringkan, ditambahkan 50 6: 23 +4 dan diresuspensi dengan ara membolak-balik. Suspense yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri

III/ 0ASIL DAN PEMBA0ASAN A/ 0a&il

*am$ar/ 0a&il I&ola&i DNA Kromo&om Ba!teri Escherichia coli

B/ Pem$aha&an

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, he!an dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. 'enyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti &nuclear DNA genome* berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria &mitochondrial DNA genome* berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. (rganisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel &pada bakteri* atau dibungkus oleh protein tertentu &pada $irus*. .romosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. 'rokariot memiliki materi genetik berupa DNA yang tidak dibungkus membrane inti DNA prokariotik berbentuk sirkuler atau disebut nukleoid. Di luar nukleoid terdapat juga DNA sirkuler lain yang lebih ke il disebut plasmid. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. 'lasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih ke il dibanding kromosom &.imbal, /005*. 'enge ekan keberadaan E. colidi bagian usus karena, untuk megetahui jenis-jenis E. coli apa saja yang hidup di usus dan tingkat resistensi terhadap antibiotik &?edina et al., /0++*. #solasi merupakan ara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakkan murni. .ultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. #solasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu #solasi sel, lisis dinding dan membran sel, 3kstraksi dalam larutan, purifikasi dan presipitasi. 'rinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada /, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. 'rinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul. ?enjalankan prosedur dengan benar akan diperoleh DNA kromosom dan plasmid dengan kemurniannya ukup tinggi, dapat dilihat dari penampakan hasil elektroforesis yang baik. .etelitian dan ke ermatan dalam pelaksanaan penelitian, sangat menentukan hasil kemurnian DNA kromosom dan plasmid &@aatih, /00,*. 2ahap-tahap isolasi DNA dia!ali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan ara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan ara en7imatis seperti pemberian

liso7im. :angkah berikutnya adalah lisis sel. 1ahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium buffer non osmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton A-+00 atau dengan sodium dodesil sulfat &SDS*. 'ada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang, biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. 'rotein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihan urkan se ara en7imatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih ter ampur dengan %NA sehingga perlu ditambahkan %NAse untuk membersihkan DNA dari %NA. ?olekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan <s<l &Bubaidah, /00)*. 'rinsisp isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan ampuran berdasarkan berat molekul komponennya. ?olekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian ba!ah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Casil sentrifugasi akan menunjukkan dua ma am fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian ba!ah. 2ahap presipitasi dilakukan dengan ara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian di$orte4 yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. :arutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senya!a baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap &Damilah, /005*. 3kstraksi DNA dari organisme eukaryote &manusia, he!an dan tumbuhan* dilakukan melalui proses penghan uran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan %NA &cell digestion* dan pengendapan DNA &precipitation of DNA* dan pemanenan. 1erbagai teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini mun ul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. 'rinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel

lainnya. Casil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. (leh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi &:e!is, /00"*. Se ara kimia!i penghan uran sel dilakukan dengan memanfaatkan senya!a kimia seperti 3D2A &ethyllenediamine tetraacetic*, dan SDS &Sodium Dodecyl Sulfate*. 3D2A berfungsi sebagai perusak sel dengan ara mengikat ion magnesium &ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan akti$itas en7im nuclease yang merusak asam nukleat*. SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. 3n7im proteinase . dapat digunakan untuk menghan urkan protein. .otoran akibat lisis sel dipisahkan dengan ara sentrifugasi. .emudian molekul nu leotida &DNA dan %NA* yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. 'roses ini sebagian ke il %NA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. 3n7im %NAase digunakan untuk menghan urkan %NA sehingga DNA dapat diisolasi se ara utuh. 'emurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan men ampur larutan DNA tersebut dengan Na<l yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA se!aktu di ampur dengan ethanol. 'roses sentrifugasi dengan ke epatan tinggi akan mengendapkan tepung ber!arna putih &DNA* dan menempel di dasar tabung ependorf &Carisha, /009*. <ara kerja isolasi DNA kromosom bakteri 3.coli dan fungsinya adalah isolat air +,5 ml kultur 3. coli disentrifugasi dengan ke epatan 5000 rpm, selama " menit. Supernatan dibuang, tambahkan + ml akuades steril disenrifugasi 5000 rpm selama " menit, suhu /5 0<. Supernatan dibuang dan disuspensikan tenderi7er "08 sabanyak 50 6l . Diinkubasi selama + jam pada suhu "9 0<. kemudian ditambahakan SDS +08 brfungsi melisiskan sel dan sentrifugasi +0000 rpm selama +0 menit suhu /5 0<. Supernatan dipindahkan ketabung baru dengan penambahan kloroform berfungsi merusak protein +=+ dan diko ok /0 kali. .emudian disentrifugasi selama +0 menit dengan ke epatan +0000 rpm selama +0 menit suhu /5 0<. Supernatan dibuang dan ditambahakan etanol absolute berfungsi menggumpalkan DNA +=+ dan diinkubasi dalam freezer 9 A /) jam.

Disentrifugasi selama +0 menit dengan ke epatan +0000 rpm dengan suhu ) 0<. Supernatan dibuang kemudian ditambahakan alkohol 908 untuk membersihkan dari etanol absolut dan disentrifugasi +0000 rpm +0 menit suhu ) 0<. Supernatan dibuang kembali kemudian ditambahkan 2A3 +4 sebanyak 50 6l untuk melarutkan DNA kembali dan 3D2A menjaga struktur DNA kemudian disuspensikan se ara bolak-balik. 1erdasarkan pengamatan dan pembahasan isolasi DNA kromosom bakteri 3.coli menunjukan hasil yang positif artinya berhasil mengisolasi DNA kromosom bakteri tersebut. #solat bakteri E.coli sebagai sumber DNA, DNA yang berhasil diisolasi menunjukan seperti kabut putih. ?enurut .imball /005*, DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan.

I,/ KESIMP)LAN DAN SA#AN

A/ Ke&im ulan 1erdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan bah!a = +. 'rinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada /, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. 'rinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan ara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. /. 'roses pengisolasian DNA bakteri adalah isolasi isolat, perusakan dan pembuangan dinding sel, pelisisan sel, pembuangan sisa remukan dengan sentrifugasi, pembersihan protein sehingga didapatkan DNA murni.

B/ Saran Saran untuk praktikum isolasi DNA kromosom bakteri selanjutnya agar lebih memperhatikan dalam penambahan E penambahan larutan serta dalam proses sentrifugasi.

DAF(A# #EFE#ENSI

3pplen, D.3. dan 2. :ubjuhn. +,,,. DNA Profiling and DNA 1irhkhauser Ferlag, 1erlin.

ingerprinting.

@aatih, ?. /00,. #solasi dan Digesti DNA .romosom. !urnal Penelitian Sains " #e$nologi, +0 &+*= >+ E >9. Goodenough, Grsula. +,--. %enetics. 3rlangga, Dakarta. Carisha, S. /009. &iotechnology Procedures and E'periments (and)oo$ (An *ntroduction #o &iotechnology).#nfinity S ien e 'ress ::<, <anada. Damilah. /005. Pengaruh &er)agai +acam Penam)ahan Enzim #erhadap (asil *solasi DNA &er)agai +acam &uah Se)agai #opi$ Pra$ti$um +ata ,uliah %eneti$a. Skripsi tidak diterbitkan. ?alang = Gno$ersitas Negeri ?alang. .imball, D.H. /005. &iologi. 3rlangga, Dakarta. :e!is, %. /00". (uman genetics- .oncepts and Applications. 2he ? Gra!-Cills <ompany, #n . ?edina, ?.? et al. /00,. ?ole ular Di$ersity of 3s heri hia oli in the Cuman Gut= Ne! 3 ologi al 3$iden e Supporting the %ole of Adherent-#n$asi$e E. coli &A#3<* in <rohns Disease. *nflamm &owel Dis /00,I+5=-9/E --/. 'urna!arman, 2., Hiba!an, #., 'asaribu, @. C., Setiyono, A. dan Saepulloh, ?. /0+/. Sensiti$itas dan Spesifisits Nested 'olymerase <hain %ea tion &'<%* untuk ?endeteksi DNA <o4iella burnetii. !urnal /eteriner. 01&+*. 'riyani, N. /00). Sifat isi$ dan ,imia DNA. @akultas ?atematika Dan #lmu 'engetahuan Alam Gni$ersitas Sumatera Gtara, ?edan. Bubaidah, siti. /00). *dentifi$asi, 2ariasi geneti$, distri)usi dan upaya eliminasi )a$teri penye)a) ./PD (.itrus /ein Phloem Degeneration). Desertasi tidakl diterbitkan. 'rogram pas a sarjana Gni$ersitas 1ra!ijaya, ?alang.