PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh : Nama NIM Kel#m$#% R#m'#n(an A)i)ten : Putri Etty Ferayanti : B1 !11!"! :& : II : Arthi%a L#*ia Sari

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDA+AAN UNI,ERSITAS ENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PUR-OKERTO &!1.

I/ PENDA0ULUAN A/ Latar Bela%an( Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri, berutas ganda, dan berbentuk sirkuler (Jusuf 2001). Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan Escherichia coli sebagai inang se ingga dalam rekayasa genetika, plasmid sering digunakan sebagai !ektor untuk memba"a gen#gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Plasmid dapat di$adikan sebagai !ektor disebabkan dapat melakukan replikasi, terletak ekstrakromosom, ditransfer se%ara stabil, berukuran ke%il, susunan DNA suda dketa ui, arus mempunyai $umla salinan yang banyak di dalam sel inang, memiliki titik &ri, memiliki marker seleksi, memiliki marker kedua yang berguna untuk tanda bila plamid disisipkan gen asing, dan memiliki situs restriksi yang unik sebagai tanda untuk menyisipkan gen asing ('rolle, 1(()). Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui proses isolasi plasmid, elektroforesis, dan !isualisasi menggunakan sinar ultra !iolet (*+). ,lektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisa kan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. -el yang biasa digunakan dalam proses elektroforesis adala agarosa. ,lektroforesis biasanya digunakan untuk analisa ukuran dan konfirmasi sampel DNA, kuantifikasi DNA, pemisa an dan ektraksi DNA. Proses kuantifikasi DNA dan analisa kualitas merupakan serangkaian proses yang berperan untuk mengeta ui konsentrasi dan menganalisa kualitas dari DNA tersebut. .ualitas DNA sangat erat kaitannya dengan kemurnian DNA ter adap berbagai kontaminan seperti kontaminan protein. .emurnian DNA dapat diukur melalui rasio antara absorpsi suspensi DNA pada pan$ang gelombang 2/0 nm ter adap pan$ang gelombang 210 (Jusuf, 2001). Dia"ali dengan isolasi DNA. 2al ini bertu$uan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organisme. .emudian dilakukan dengan u$i kualitatif DNA dengan metode ,lektroforesis gel agarosa yang bertu$uan untuk mengeta ui keberadaan DNA dalam larutan %onto dan metode spekrofotometri dimana pengukuran $umla DNA dengan spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultra!iolet yang diserap ole nukleotida dan protein dalam larutan. Analisis asam nukleat umumnya dilakukan untuk penentuan konsentrasi

rata#rata dan kemurnian DNA yang terdapat dalam sampel. Jumla dan kemurnian tertentu diperlukan untuk kiner$a optimal sampel DNA yang digunakan. Asam nukleat menyerap sinar ultra!iolet dengan pola tertentu. 3ampel ditembus sinar ultra!iolet dan fotodetektor %a aya pada 200 nm, semakin besar %a aya yang diserap sampel, maka semakin tinggi konsentrasi asam nukleat dalam sampel (3ambrook dan 4ussel 2001). B/ Tu1uan 5u$uan dari a%ara praktikum kali ini adala untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA asil isolasi.

II/

MATERI DAN METODE

A/ Materi 'a an yang digunakan pada praktikum adala akuades steril dan DNA asil isolasi dari bua (bua stra"berry (Fragaria X ananassa), bua alpukat (Persea americana), bua naga (Hylocereus undatus), bua coli. Alat yang digunakan dalam praktikum ini adala 3pektrofotometer *+ (dalam praktikum ini digunakan *+#+63 3pe%trop otometer 3 imad7u model *+ 8ini 1290), tabung reaksi, tisu, ku!et dan mikropipet beserta tipnya. B/ Met#2e 1. Dimasukkan ke dalam tabung reaksi : ;l DNA < akuades steril !olume :000 ;l. 2. Disiapkan spektrofotometer, larutkan blankonya dan dibandingkan tingkat kemurnian dan konsentrasi DNA bua ananassa), bua americana), bua 210 dan 3 :20. :. Di itung konsentrasi DNA. DNA = 3 200 nm Protein = 3 200> 3 210 nm .arbo idrat dan kemikalia = 3 200> 3 2:0 nm (bua stra"berry (Fragaria X alpukat (Persea papaya (Carica naga (Hylocereus undatus), bua mangga (Mangifera indica) dan bua ingga mangga

(Mangifera indica) dan bua papaya (Carica papaya)) dan bakteri Escherichia

papaya)) dan bakteri Escherichia coli dengan nilai absorbansi 3 2:0, 3 200, 3

III/ 0ASIL DAN PEMBA0ASAN A/ 0a)il

Ta'el 1/ Perhitun(an K#n)entra)i DNA N#/ Sam$el 3tra"berry 1 (Fragaria X ananassa) Pepaya (Carica papaya) Alpukat (Persea americana) 8angga (Mangifera indica) 'ua Naga (Hylocereus undatus) 0 Escherichia coli #0.020 #0.01: #0.01/ 0.00( 0.01( 0.020 0.010 0.011 3 &.! A4S5 6 A4B5 3 &"! A4S5 6 A4B5 A')#r'an)i 3 &7! A4S5 6 A4B5 3 .&! A4S5 6 A4B5

2 : 9

0.102 0.00( 0.0:)

0.00: 0.02/ 0.02:

0.09/ 0.012 0.01/

0.090 0.011 0.012

0.02:

0.020

0.01/

0.012

Keteran(an : A?3@ = Absorbansi sampel A?'@ = Absorbansi blanko Ta'el &/ Perhitun(an K#n)entra)i DNA terha2a$ K#ntamina)i K#n)entra)i N#/ 1 2 : 9 / 0 Inter$reta)i : D2 B 210 C 1,1 3 &"! 1:00 ng>;A :1/0 ng>;A 12/0 ng>;A 11/0 ng>;A 1:00 ng>;A # 0/0 ng>;A 3 &7! 1.02/ ng>;A 1.9 ng>;A 2.01 ng>;A 1./:: ng>;A 1.):: ng>;A 0.10) ng>;A 3 &.! 0.100 ng>;A 0.:1( ng>;A 0.: ng>;A 0.022 ng>;A 0.1:0 ng>;A 0./ ng>;A

B 2:0 C 2#2,2 = DNA murni = kemikalia>karbo idrat = DNA murni E2,2 = blanko tidak sesuai

D 1,1 = protein E 1,1 = 4NA Perhitun(an : DNA 'ua 1. .onsentrasi DNA (B 200) C B 200 F /0 F faktor pengen%eran C B 200 F /0 F 1000 C 0,02/ F /0 F 1000 2. Protein (B 210) C 12/0 ng>;A C B 200 B 210 C 0,02/ 0,012 C 2.01 ng>;A :. .emikalia (B 2:0) C B 200 B 2:0 C 0,02/ 0,011 C 0.: ng>;A DNA 'akteri 1. .onsentrasi DNA (B 200) C B 200 F /0 F faktor pengen%eran C B 200 F /0 F 1000 C # 0,01: F /0 F 1000 C # 0/0 ng>;A 2. Protein (B 210) C B 200 B 210 C # 0,01: # 0,01/ C 0.10) ng>;A :. .emikalia (B 2:0) C B 200 B 2:0 C # 0,01: 0,00( C 0./ ng>;A

B/ Pem'aha)an 'erdasarkan praktikum didapatkan asil absorbansi per itungan

konsentrasi DNA bua alpukat pan$ang gelombang 2:0, 200, 210 dan :20 nm adala 0.00(, 0.02/, 0.012 dan 0.011ng>;A, sedangkan per itungan pan$ang DNA bua alpukat ter adap kontaminasi pan$ang gelombang 200, 210 dan 2:0 nm adala 12/0, 2.01 dan 0.:ng>;A. 2asil absorbansi per itungan konsentrasi DNA bakteri ,.coli pan$ang gelombang 2:0, 200, 210 dan :20 nm adala #0.020,

#0.01:, #0.01/ dan 0.00(ng>;A, sedangkan per itungan pan$ang DNA bakteri ,.coli ter adap kontaminasi pan$ang gelombang 200, 210 dan 2:0 nm adala G 0/0, 0.10) dan 0./ng>;A. Jumla DNA di%erminkan berat molekul bukan ole !olume .ualitas DNA yang ber ubungan dengan kemurnian ter adap kontaminan protein dapat dili at dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada pan$ang gelombang 200 nm ter adap 210 nm. 4asio &D200>&D210 antara 1,1#2,0 men%erminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada pan$ang gelombang 200 nm dapat dikon!ersikan men$adi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada &D200 C /0 ug DNA utas ganda tiap ml. .emurnian asam nukleat dari pengotor karbo idrat ataupun materi organi% lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada pan$ang gelombang 200 nm ter adap absorbansi pada pan$ang gelombang 2:0 nm. 'ila perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 ingga 2,2 dikatakan ba "a sampel asam nukleat yang diukur murni. Namun, bila nilai tersebut lebi renda dari 2 dikatakan ba "a asam nukleat terkontaminasi ole karbo idrat, materi organi% lain ataupun kemikalia. 3ebaliknya, $ika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebi tinggi dari 2,2 al ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA yang digunakan (3u arsono dan Hidyastuti, 2000). DNA murni dapat diperiksa pada pan$ang gelombang 200 dan 210 nm (. adye dan Ab i$it, 2012). 3pektrofotometri adala metode untuk mengukur konsentrasi senya"a berdasarkan kemampuan senya"a tersebut mengabsorbsi %a aya. 8enurut *nder"ood (2001), spektofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis ole suatu la$ur larutan ber"arna pada pan$ang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. 3pektrofotometer adala alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi pan$ang gelombang. 3edangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri ('asset, 1((9). 3pektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan !isual dengan studi yang lebi mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi ole suatu sampel diukur pada berbagai pan$ang gelombangdan dialirkan ole

suatu perkam untuk meng asilkan spektrum tertentu yang k as untuk komponen yang berbeda (. opkar, 200:). 3pektrometri molekular (baik kualitatif dan kuantitatif) bisa dilaksanakan di daera sinar tampak, sama alnya seperti di daera yang sinar ultra!iolet dan daera sinar inframera . 3pektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan !isual dengan studi yang lebi mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi ole suatu sampel diukur pada berbagai pan$ang gelombangdan dialirkan ole suatu perkam untuk meng asilkan spektrum tertentu yang k as untuk komponen yang berbeda ( 8at ias, 200/ ). .elebi an analisis kualitatif dan kuantitatif DNA dengan menggunakan metode spektrofotometri yakni prosesnya %epat atau seder ana dan dapat p2, su u, dan adanya 7at pengganggu menganalisa dari konsentrasi yang sangat ke%il. 3edangkan kekurangannya yakni absorbansi sendiri dipengaru i ole se ingga kebersi an ku!et arus ter$aga agar nilai absorbansi tidak terganggu kemudian pemakainannya anya dapat dipakai pada *+ daera yang pan$ang gelnya paling tinggi 11/ nm. 8enurut pustaka 3astro amid$o$o (1((2), .euntungan utama pemili an metode spektrofotometri ini adala metode ini memberikan metode sangat seder ana untuk menetapkan kuantitas 7at yang sangat ke%il. 3pektrofotometri menyiratkan pengukuran $au nya penyerapan energi %a aya ole suatu sistem kimia itu sebagai suatu fungsi dari pan$ang gelombang radiasi, demikian pula pengukuran penyerapan yang menyendiri pada suatu pan$ang gelombang tertentu. Analisis spektrofotometri digunakan suatu sumber radiasi yang men$orok ke dalam daera ultra!iolet spektrum itu. Dari spektrum ini, dipili kurang dari 1 nm. 3pektrofotometri analisis sampel DNA terutama dilakukan untuk memeriksa kualitas dan kuantitas sampel DNA terisolasi. .uantifikasi sampel DNA terisolasi ditentukan ole mengambil absorbansi di 200 nm (1 &D C /0 g mA.1 double terdampar DNA). Juga A200 210, A200>2:0 dan A200 2)0 bertekad untuk mengidentifikasi kotoran dari protein, polisakarida dan polyp noli%s masing#masing. DNA murni, rasio A200 210 arus 1.1, A200>2:0 arus lebi besar dari 1,1 dan A200 2)0 arus antara 1.2 untuk 1,:. *ntuk agarose ,lektroforesis, 0,1I agarose gel disiapkan dan ditempatkan ke dalam sebua unit pan$ang#pan$ang gelombang tertentu dengan lebar pita

ele%trop oreti% yang mengandung 1 J 5A, buffer. 3ampel DNA murni (2 A) di%ampur dengan bromop enol biru yang dimuat ke dalam sumur dan 1/0 tegangan + diterapkan untuk 20#9/ menit. 'and utu DNA genom diamati di gel dengan pe"arnaan dengan et idium bromida. 5es kualitatif untuk memeriksa apaka DNA terpen%il adala PK4 amplifiable, dilakukan untuk mengu$i $ika ada men%emari ba an yang bisa meng ambat reaksi PK4. 3a am DNA genom dien%erkan sampai kadar ak ir /0.1 dan a%ak primers urutan= /#-5-A5K-KA-# : (,urofins -enomi%s, 'angalore) digunakan dalam %ampuran reaksi PK4 (5eare, 2011).

I,/ KESIMPULAN DAN SARAN A/ Ke)im$ulan 'erdasarkan asil praktikum dan pemba asan dapat diambil kesimpulan ba "a = 1. 3pektrofotometri adala berdasarkan metode untuk mengukur konsentrasi senya"a senya"a tersebut mengabsorbsi %a aya. kemampuan

3pektrofotometer adala alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi pan$ang gelombang.

2. .ualitas DNA yang ber ubungan dengan kemurnian ter adap kontaminan protein dapat dili at dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada pan$ang gelombang 200 nm ter adap 210 nm. 4asio &D200>&D210 antara 1,1#2,0 men%erminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. :. .emurnian asam nukleat dari pengotor karbo idrat ataupun materi organi% lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada pan$ang gelombang 200 nm ter adap absorbansi pada pan$ang gelombang 2:0 nm. 'ila perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 ingga 2,2 dikatakan ba "a sampel asam nukleat yang diukur murni. Namun, bila nilai tersebut lebi nukleat terkontaminasi ole renda dari 2 dikatakan ba "a asam karbo idrat, materi organi% lain ataupun

kemikalia. 3ebaliknya, $ika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebi tinggi dari 2,2 al ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA yang digunakan. 9. 2asil absorbansi per itungan konsentrasi DNA bua alpukat pan$ang gelombang 2:0, 200, 210 dan :20 nm adala 0.00(, 0.02/, 0.012 dan 0.011ng>;A, sedangkan per itungan pan$ang DNA bua alpukat ter adap kontaminasi pan$ang gelombang 200, 210 dan 2:0 nm adala 12/0, 2.01 dan 0.:ng>;A. 2asil absorbansi per itungan konsentrasi DNA bakteri ,.coli pan$ang gelombang 2:0, 200, 210 dan :20 nm adala #0.020, #0.01:, #0.01/ dan 0.00(ng>;A, sedangkan per itungan pan$ang DNA bakteri ,.coli ter adap kontaminasi pan$ang gelombang 200, 210 dan 2:0 nm adala G 0/0, 0.10) dan 0./ng>;A. B/ Saran A%ara praktikum suda ber$alan dengan baik, namun arus lebi teliti dan ati# ati. 3ebaiknya sebelum melakukan praktikum, praktikan arus mengeta ui dan mema ami dengan baik prosedur ker$a terlebi kesala an saat melakukan praktikum. da ulu agar tidak ter$adi

DAFTAR REFERENSI 'asset, J. 1((9. Kimia Analisis Kuantitatif Anorgani . ,-K. Jakarta. 'rolle. 1((). Microbiology !iotechnology. *ni!ersity of 5ubingen, -ermany. Jusuf 8. 2001. "eneti a # $tru tur dan e spresi "en. 3agung 3eto, 'ogor. . adye, +is "anat 3. dan Ab i$it + 3a asrabud e. 2012. 4apid Dete%tion &f -eneti%ally 8odified &rganisms 6n Kotton 3eeds 'y 4eal 5ime PK4. %nt. &. 'ife$c. !t ( Pharm. )es. 1(9)= ((#10/. . opkar, 3.8. 200:. .onsep Dasar .imia Analitik. *ni!ersitas 6ndonesia. Jakarta . 8at ias, A mad. 200/. 3pektrofotometri. ,Fa%ta= 3olo. 3ambrook J, 4ussell DH. 2001. Molecular Cloning* A laboratory manual. ,d ke# :. Ne" Lork= Kold 3pring 2arbor Aaboratory Press. 3astro amid$o$o, 2ard$ono. 1((2. 3pektroskopi 6nframera . Logyakarta = Aiberty Logyakarta 5eare, J.8. 2011. 8easurement of Nu%lei% A%id Kon%entration *sing t e DyNa Muant and t e -eneNuant. !io+echni,ues. 22(0)=11)0#11)1.

3u arsono dan Hidyastuti, *. 2000. Penuntun Pra ti um Pelatihan +e ni Peng lonan "en. Pusat Penelitian 3umber Daya 2ayati dan 'ioteknologi, 6P'. *nder"ood,A.A dan 4.A day, J.4. 2001. Analisis .imia .uantitatif. ,rlangga. Jakarta.