INFORME LABORATORIO ENZIMAS I Y II

Nombre: Ignacio Fonseca Fecha : 4 de Noviembre 2013 Ramo: Bioqumica Profesor: Marcelo Villagrn

1. Curva de Progreso (lab 5) 1.1 Complete una tabla con sus resultados experimentales
Tubo N Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 40 50 60 Absorbancia Umoles totales PO4H-2 0,084 1,105 1,630 1,837 2,031 2,241 2,353 2,586 2,651 2,727 Umoles PO4H-2 menos 0 minutos 0,084 1,021 1,546 1,753 1,947 2,157 2,269 2,502 2,567 2,643 Umoles PO4H-2 en 5 minutos -------1,021 0,525 0,207 0,194 0,21 0,112 0,117 0,034 0,038

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,030 0,394 0,581 0,655 0,724 0,799 0,839 0,922 0,945 0,972

Absorbancia de estndar: 0,3565(1mol) 1.2 Grafique la curva de progreso (umoles de producto formado V/S tiempo). Sobre el grfico indique en qu periodo de tiempo se logra el equilibrio qumico y en qu periodo la reaccin est en condiciones de velocidad inicial. Indique si su curva se ajusta a lo esperado o no

moles totales PO4 H-2 v/s Tiempo

moles totales PO4 H-2 ( moles) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Tiempo (min) 45 50 55 60 65 Tiempo en el cual se comienza alcanzar el equilbrio quimico

Condiciones de V0

Basado en la grfica anterior se puede analizar diversos aspectos de la curva : llegando a los 40 minutos se est logrando el equilibrio qumico , siendo completamente comprobable a los 50 minutos donde se logra apreciar por la orientacin de la curva que la reaccin ya est en el equilibrio. Llamamos equilibrio al instante en que la velocidad de formacin de productos y reactantes es la misma .

La Velocidad inicial (V0) se encuentra entre los 0 min hasta los 5 min , lo cual se comprueba en la orientacin lineal de la grfica (producto v/s tiempo). La grfica se gener de acuerdo a lo esperado con una velocidad inicial con orientacin lineal en la cual la enzima mayormente transforma el sustrato en producto, para luego seguir con un periodo en la cual se comienza a agotar el sustrato, por ende la cantidad de producto formado por unidad de tiempo va disminuyendo ,generando una curva asinttica producindose el equilibrio. 1.3 Sobre el mismo grfico anterior dibuje cmo resultara una curva de progreso realizada en las mismas condiciones del experimento salvo que con el doble de la cantidad de enzima agregada.

1.4 Grafique velocidad de reaccin en funcin del tiempo.

Velocidad de reaccion v/s Tiempo

1.2 Velocidad de reaccin (moles/min) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Tiempo (minutos) 45 50 55 60 65

2. Curva de Saturacin (lab 6) 2.1 Complete una tabla con sus resultados experimentales
Tubo N [S] (mM) Absorbancia Velocidad (umol/PO4H/10min) 2,5 2,42 1,99 1,42 1,22 1/[S] 1/Vi

1 2 3 4 5

4 3 2 1 0,5

0,944 0,914 0,752 0,535 0,460

0,25 0,33 0,50 1,00 2,00

0,4 0,41 0,50 0,70 0,82

Absorbancia del estndar: 0,3775

2.2 Grafique la curva de saturacin. Sobre el grfico indique en que rango de concentracin saturacin.

Grfica de Michaelis-Menten
3 2.5 Velocidad (mM/min) 2 1.5 1 0.5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Concentracin de Sustrato (mM) 3.5 4 4.5 Rango de Concentracin de saturacin

Basado en la grfica anterior se puede plantear que la saturacin enzimtica se encuentra entre los 3 a 4 mM de sustrato . Cuando hablamos de saturacin se refiere a que en ese instante todas las enzimas estn ocupadas , mantenindose esta concentracin con el aumento de sustrato. Se presenta mayormente el complejo Enzima-Sustrato (ES) bien enzimas que ya catalizaron una reaccin vuelve a unirse a un nuevo sustrato

2.3 Realice el grafico de dobles recprocos y calcule la Vmx y Km. Para trazar la recta realice una regresin lineal, indicando sobre el grfico la ecuacin de la recta y el valor de R2. Para ello puede utilizar software apropiado.

Grfico del Doble Recproco

1 0.8 0.6 1/V 0.4 0.2 0 -2 -1.5 -1 -0.5 -0.2 0 1/[s] 0.5 1 1.5 2 2.5

y = 0,2466x + 0,3647 R = 0,9175

Clculos: Ecuacin de la recta y=mx+b 1/Vo= Km/Vmax x 1/[S] + 1/Vmax Y=1/Vo; B=1/Vmax; M=Km/Vmax; X=1/[S] y= mx+b-y= 0,2466x+0,3647 b= 1/Vmax0,3647=1/VmaxVmax=1/0,3647Vmax= 2,742 mM/min m= Km/Vmax0,2466=Km/2,7420,2466 x 2,742=KmKm=0,676 mM 2.4 Compare el valor de Km obtenida con el valor de Km de la fosfatasa alcalina de literatura (indique la fuente de donde obtuvo el valor de Km de literatura puede ser un link-). Si hay discrepancia significativa discuta posibles razones. Basado en lo que encontr en la literatura , la fosfatasa alcalina intestinal de bovino tiene un Km de 2,4x10-4 mM, lo cual difiere del valor que calculamos en el laboratorio teniendo en este caso 0,676mM. Esta lejana entre los valores pudo deberse a distintos factores causantes del error como : Precisin durante la actividad prctica,(error humano) PH y Temperatura , Cantidades de Sustrato y de enzima . http://tecnociencia.uach.mx/numeros/v6n2/data/Fosfatasa_alcalina_(E.C.3.1.3.1)_bioq uimica_y_aplicaciones_en_las_ciencias_biomedicas_ecologicas_y_alimentarias.pdf

3. Dependencia de la velocidad de la concentracin de enzima 3.1 Complete una tabla con sus resultados experimentales
Tubo N Preparacin enzimtica (ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 Unidades de enzima 0,25 0,5 1 1,5 2 Absorbancia Velocidad (Vmax) (umolesPO4H/10min) 0,72 1,13 1,89 2,30 2,49

1 2 3 4 5

0,271 0,426 0,712 0,869 0,940

Absorbancia de estndar: 0,3775 3.2 Grafique la velocidad de reaccin en funcin de las unidades internacionales de enzima (UI). Considere que en su experimento, la concentracin de la enzima fue de 2,5 UI/ml. El grafico obtenido se ajusta a lo esperado?

Velocidad de reaccin v/s Unidades de Enzima

3 Velocidad (umol/min) 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 Unidades de Enzima (UI) 1.75 2 2.25

El grfico presenta algunas diferencias con respecto a lo ptimo esperado debido a que se esperaba una lnea recta basado en una proporcionalidad directa entre ambas ,sin embargo producto de un error en el procedimiento esta lnea recta se curva a partir de 1 UI

3.3. Explique cmo hubiese resultado este grfico si la concentracin de sustrato usada fuera no saturante. Si la concentracin de sustrato no fuera saturante la orientacin lineal de la grafica dejara de ser as, debido a que en algn instante el sustrato dejara de estar , por lo que la actividad enzimtica se hara nula por lo que aunque se agregue infinitamente enzima no se generara la reaccin por falta de sustrato. 3.4. La presencia de enzimas en plasma es muy til para el diagnstico de algunas enfermedades. Nombre algunos ejemplos Lactato deshidrogenasa o LDH Valores elevados :Infarto de Miocardio, cncer, distrofia muscular progresiva, hepatitis aguda, dermatomiositis, accidentes cerebrovasculares, hemopatas, malaria, SIDA, neumona. Amilasa Valores elevados: Pancreatitis aguda , Ulcera gstrica y parotiditis Fosfatasa alcalina Valores elevados : Ictericia obstructiva Hiperparatiroidismo primario, Enfermedad de Paget, Cncer de prstata, Mieloma mltiple, Raquitismo, Escorbuto , Acondroplasia. Transaminasas o aminotransferasas Valores elevados: Infarto miocardio, hepatitis aguda, hepatitis alcohlica, pancreatitis aguda, afecciones musculares Creatn fosfoquinasa o CPK Actividad aumentada: Miopatas Congnitas, infarto de miocardio, Miocarditis, accidentes cerebrovasculares, embolia perifrica Actividad disminuida: Artritis reumatoide y en otros procesos reumticos postoperatorios.

3.5 En base a los datos obtenidos en el laboratorio disee un mtodo para determinar fosfatasa alcalina a travs de la medicin de su actividad enzimtica. Detalle todas las condiciones experimentales claves asegurar que la actividad de la enzima sea un fiel reflejo de su concentracin en el plasma. Asuma que la enzima trabajada en el prctico es fosfatasa alcalina humana. En primer lugar se debe extraer una muestra de sangre del paciente, luego separar el plasma mediante centrifugacin. Seguido a esto hay que separar la fosfatasa alcalina del plasma mediante cromatografa por exclusin molecular. Introducir la fosfatasa alcalina en un ambiente similar al humano con una temperatura de 37C y un PH cercano a 8 ,este sera -glicerofosfato . Se cuantifica la absorbancia luego de detener la reaccin enzimtica con molibdato de amonio. La grfica a realizar es de velocidad v/s UI , basndose en un patrn conocido para poder encontrar la concentracin del paciente .Los niveles enzimticos son en casos claves para poder identificar una patologa