INTRODUCCION La catlisis biologa, fue reconocida hace varios aos a partir de la observacin de diferentes de variables que influan con

la velocidad de bioprocesos. La primera conclusin a la que llego Berzelius, luego de sus estudios, es la introduccin del termino catlisis para describir la accin de algunas sustancias en una reaccin sin verse afectadas o alteradas. Mas adelante Kne le dio el nombre de enzimas a tales sustancias. Los pasos siguientes en el avance del entendimiento de la catlisis biolgica se resumen en el intento de aislar las sustancias responsables de los cambios en varios procesos conocidos por la humanidad desde siglos atrs, comenzando por la precipitacin alcohlica de la enzima responsable de transformar el almidn en azcar. El avance en qumica orgnica fue significativo al lograr Whler (1828), a partir de una molcula inorgnica (cianuro de amonio) obtener urea. Conforme la tecnologa y los procesos se mejoraban lentamente, la separacin de protenas se logro eficazmente, manteniendo su pureza lo que permiti la asociacin proteica de las enzimas que finalmente se definieron como protenas de carcter cataltico gracias a su capacidad de activacin especifica. Se descubri que las enzimas funcionaban solamente a ciertas condiciones muy especficas, que si no son apropiadas la actividad enzimtica no se produce. La actividad cataltica de estas protenas se mide mediante la cantidad derivada de rapidez de reaccin catalizada la cual no es fija pues depende de la concentracin de las enzimas. La unidad empleada usualmente en los estudios de la actividad cuntica ha sido la unidad internacional de actividad y refiere a la cantidad de enzima necesaria para transformar un micromol de sustrato por minuto, la unidad sugerida por la IUPAC es el KATAL la cual se define como la reaccin de 1 mol por segundo en el sistema de medicin. La concentracin de la actividad cataltica se expresa en unidades de especficamente se usa la medida de , y mas

, para enzimas puras es anlogo y se

define la actividad cataltica molar. Michaelis y Menten con los postulados de Cleland aportaron uno de los mayores avances en la cintica enzimtica, representando las interacciones entre formas enzimticas, sustratos y productos. Por formas enzimticas se entiende la enzima libre o complejos de enzima y se designan como E, E, E, etc. Las formas enzimticas capaces de reacciones unimoleculares con liberacin de un sustrato o producto, o de isomerizacin a tales formas se designan como complejos transitorios y se designan mediante combinaciones de letras. Los complejos transitorios que no pueden participar en reacciones biomoleculares y que solo pueden sufrir degradacin unimolecular para liberar sustratos o productos se designan como complejos centrales y se diferencian por incluirlos entre parntesis.

Cuando todos los sustratos se unen al sitio activo de la enzima antes de que se libere alguno de los productos, se dice que el mecanismo es secuencial; mientras que si es posible la adicin de sustratos y productos de forma alternada se dice que es un mecanismo ping-pong, en este mecanismo la enzima oscila entre dos formas enzimticas diferentes, a su vez los mecanismos pueden ser ordenados cuando hay un origen obligatorio en la adicin de sustratos en el mecanismo secuencial, o por el contrario aleatorios cuando cualquiera de los sustratos se puede unir primero a la enzima. GRAFICOS 1. Determinacin de la curva de progreso para determinacin de la rapidez inicial de la reaccin. t minutos 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 [A] 0 2.30258509 2.94443898 3.29953373 3.53805656 3.71357207 3.84801768 3.95508249 4.04305127 4.11577984 4.17592455
m moles de producto

0 10 19 27.1 34.4 41 46.9 52.2 57 61.3 65.1

[P] 0 2.30258509 2.94443898 3.29953373 3.53805656 3.71357207 3.84801768 3.95508249 4.04305127 4.11577984 4.17592455

t 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

5 4.5 moles producto -0.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1.5 3.5 5.5 t minutos y = 0.3656x + 2.5882 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 0 1 2 3 4 5 y = 1.106x - 1.1131 R = 0.6646

[ ] A partir de la ecuacin la rapidez inicial de la reaccin es

[ ] y por la linealizacin de la funcin exponencial

2. Determinacin de los valores de Ka y Vm mediante linealizacin de los diferentes sistemas de la ecuacin de Michaelis. a. Sistema de Henri-Michaelis. Vo micromol/min 0 23.8 45.5 83.3 142.9 222.2 307.7 380.9

[A] mM 0 10 20 40 80 160 320 640

600 Vo 400 200 0 0 200 400 600 800 [A] y = 0.587x + 57.606 60 Vo 40 20 0 0 10 20 30 [A] y = 2.275x + 0.35

Vm= 499.3 mol/min Ka= 20% b. Sistema de Lineweaver-Burk 1/[A] 0 0.1 0.05 0.025 0.0125 0.00625 0.003125 0.0015625
0.05 0.04 1/Vo 0.03 0.02 0.01 0 0 0.05 0.1 0.15 1/[A] y = 0.4001x + 0.002

1/Vo 0 0.042016807 0.021978022 0.012004802 0.006997901 0.00450045 0.003249919 0.002625361

La ecuacin linealizada corresponde a la expresin

[ ]

Para obtener a partir del punto de corte y posteriormente de la pendiente se obtiene el valor de Ka

= 20,05%

c. Sistema de Hanes La ecuacin correspondiente a este sistema es [A]/Vo 0 0.42016807 0.43956044 0.48019208 0.55983205 0.72007201 1.039974 1.68023103
2 1.5 [A]/Vo 1 0.5 0 -100 100 300 [A] y = 0.002x + 0.3999 500 700
[ ]

[ ]

[A] 0 10 20 40 80 160 320 640

= 19.99% d. Sistema de Hofstee Vo 0 Vo/[A] 0

23.8 45.5 83.3 142.9 222.2 307.7 380.9

2.38 2.275 2.0825 1.78625 1.38875 0.9615625 0.59515625

[ ]

La ecuacin correspondiente a este sistema es

400 300 Vo 200 100 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 y = -199.94x + 499.92 Vo/[A]

3. Determinacin del tipo de inhibidor y las constantes de inhibicin a partir de la tabla siguiente [l] mM 0 [A] mM 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 V0 0 100 133.3 150 160 166.7 171.4 175 177.8 180 181.8 10 20 Vo micromol/minuto V10 V20 0 0 66.7 50 88.9 66.7 100 75 106.7 80 111.1 83.3 114.3 85.7 116.7 87.5 118.5 88.9 120 90 121.2 90.9 30 V30 0 40 53.3 60 64 66.7 68.6 70 71.1 72 72.7

1/[A] 0 1 0.5 0.33333333 0.25 0.2 0.16666667 0.14285714 0.125 0.11111111 0.1

1/V0 0 0.01 0.00750188 0.00666667 0.00625 0.0059988 0.00583431 0.00571429 0.0056243 0.00555556 0.00550055

1/V10 0 0.0149925 0.01124859 0.01 0.00937207 0.0090009 0.00874891 0.00856898 0.00843882 0.00833333 0.00825083
0.03

1/V20 0 0.02 0.0149925 0.01333333 0.0125 0.0120048 0.01166861 0.01142857 0.01124859 0.01111111 0.0110011

1/V30 0 0.025 0.01876173 0.01666667 0.015625 0.0149925 0.01457726 0.01428571 0.0140647 0.01388889 0.01375516

0.025 0.02 1/[A] 0.015 0.01 0.005 0 -1.5 -1 -0.5 0 -0.005 1/Vo

y = 0.0125x + 0.0125 y = 0.01x + 0.01 y = 0.0075x + 0.0075 y = 0.005x + 0.005 V0 V10 V20 V30

0.5

1.5

Los datos corresponden a un inhibidor NO COMPETITIVO o irreversible, pues en la extrapolacin de las lneas correspondientes todas cortan el eje x en un mismo punto por la parte negativa. Para hallar las constantes de inhibicin Ki se aplica la formula de pendiente para un inhibidor irreversible: [ ] [ ]

[L] = 0

[L]=10

[L]=20

[L]=30

Vm=200 Ka=1 Ki=0

Vm=133.33 Ka=1 Ki=-10.07

Vm= 100 Ka= 1 Ki= -20.20

Vm= 80 Ka= 1 Ki= -30.37

4. Antibitico. % nucleotidos incorporados

Sustrato M/L nucleotidos En presencia etanol Ausencia etanol

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 0 0.4 1.9 5.9 13.2 24 37 50 61.6 70.9

0 0.2 2.5 11.5 29.5 50 67.5 79.3 86.8 91.3 94.1

1/V 0.016
0.015 0.014 0.013 0.012 0.011 0.01 0.01 0.02 0.03 0.04 y = 0.0177x + 0.0098 R = 0.8226 0.05 y = 0.1134x + 0.0083 R = 0.8284

1/[S] 0.06

El etanol es un inhibidor competitivo del antibitico por lo cual el laboratorio esta en lo correcto, es preferible que no se consuma alcohol para que el efecto antibitico sea eficaz y no se inhiba, retardando la mejora del paciente. CONCLUSIONES Se puede hallar la velocidad de reaccin linealizando la ecuacin de Michaelis y para esto se utiliza Ln. Al ser una lnea de progreso es necesario hacer la linealizacin tangente a la grafica. La sencillez del modelo de Michaelis es un factor importante para el desarrollo d investigaciones de la cintica enzimtica, pues a partir de datos medibles en laboratorio se pueden analizar fcilmente.

Los diferentes sistemas de ecuaciones linealizados, permiten escoger para modelar mejor las variables involucradas en el proceso, por lo tanto es necesario definir el sistema que mas convenga. El modelado de un sistema con los diferentes tipos de ecuaciones arrojo resultados esperados de similitud, por lo que se pueden llegar a los mismos resultados por todos los diferentes modelos de ecuaciones con variaciones muy pequeas. A partir de un comportamiento cataltico se puede determinar el tipo de inhibidor por medio de una regresin lineal y extrapolacin, en este caso el inhibidor al cortar el eje de la velocidad en la parte negativa es irreversible o no competitivo, y siendo la determinacin de estas variables importante para la realizacin de antibiticos y medicinas importantes para la calidad de vida humana. A partir de estos datos se pueden modelar sistemas con variables como otras sustancias en la actividad enzimtica, determinando la efectividad de los tratamientos mdicos.

ENZIMAS ALOSTERICAS El modelo de Michaelis-Menten ayudo de manera significativa al desarrollo de la qumica enzimtica especialmente por su simplicidad y aplicabilidad. Sin embargo hay enzimas que no obedecen al modelo cintico de Michaelis-Menten, pues poseen varias subunidades y varios sitios activos. A estas enzimas se les dio la denominacin de alostricas. En estas molculas la unin de un sustrato a un sitio activo puede alterar las propiedades de otros sitios activos en la misma molcula. Un resultado de esta interaccin de subunidades es que la unin de estos resulte cooperativo, donde la unin del sustrato en un sitio activo facilita la unin de los otros sustratos en sitios activos circundantes. La actividad de la enzima alostrica puede ser alterada por molculas regulatorias que se unan de manera reversible sitios sobre la protena que se encuentren en sitios diferentes al sitio activo. Entonces las propiedades catalticas de las enzimas alostricas se pueden ajustar para cumplir con las demandas de la celula. Por lo tanto las enzimas alostricas son puntos clave en la regulacin de vas metablicas. Las enzimas reguladas por modificaciones no-covalentes son llamadas de alostricas. Las mismas son encontradas en casi todas las vas metablicas y generalmente est catalizando una reaccin irreversible localizada en el inicio de la va. En cuanto a su estructura, son oligomricas o sea compuestas de varas cadenas polipeptdicas, cada una con una casa de campo activa. La conexin del substrato a la casa de campo activa de una de las subunidades afecta la conformacin de las dems, facilitando la conexin de los dems substratos a casas de campo activas. Las enzimas alostricas son reguladores del metabolismo, pues al causa grandes cambios en el metabolismo celular mediante metabolitos que pueden ser positivos si aumentan la velocidad de reaccin o negativos si la reducen, relacionado con el efecto que producen.

En la mayora de las vas metablicas es comn que el producto final acte como modulador alostrico negativo de la enzima que cataliza las primeras reacciones de la va. Por lo tanto cuando la concentracin de este producto llegue a aumental l va a actuar como un inhibidor alostrico, disminuyendo la velocidad de la va y su propia produccin. Este mecanismo es denominado inhibicin por retroalimentacin o feedback. Si el producto final comience a ser consumido y consecuentemente su concentracin disminuya l va a dejar de inhibir la va, haciendo con eso que la va haya su velocidad aumentada.

Mecanismos de actividad reguladora de las enzimas alistricas.

Estudia los mecanismos moleculares mediante los cuales la unin del modulador al centro regulador puede, alterar la actividad del centro cataltico. Esta explicacin se ha obtenido de los estudios con la hemoglobina, a travs de dos modelos: Secuencial y el de Simetra. Modelo de simetra. Modelo propuesto por J. Monod et al. Establece que la unin de la primera molcula de sustrato incrementa la tendencia de las restantes subunidades a experimentar transicin a la forma de elevada afinidad, a travs de un efecto de todo o nada. Hallndose todas las subunidades en estado de baja o elevada afinidad. Modelo secuencial. Modelo propuesto por D.E. Koshland. Aplicable a las enzimas alostricas que poseen multiples subunidades y que se suponen que existen en dos conformaciones diferentes, donde cada una puede experimentar cambios secuenciales individuales en su conformacin entre los extremos de todo o nada. Pueden existir diversos estados de conformacin intermedios, cada uno con su propia actividad cataltica intrnseca. Este modelo propone una sintonizacin ms fina de la actividad de la enzima alostrica. Se ha hecho evidente que las enzimas estn sujetas a la regulacin de su capacidad cataltica, ya sea en direccin positiva o negativa, o en ambas, mediante molculas pequeas que han sido denominadas efectores o moduladores. Este tipo de sustancias incluye substratos, productos, metabolitos posteriores a una va metablica, precursores de una ruta metablica e incluso metabolitos que participan en una va metablica aparentemente no relacionada. En la mayora de los sistemas multienzimticos, es decir, aquellos en que intervienen secuencialmente varias enzimas y en que el producto de una es el substrato de la siguiente, la primera enzima de la secuencia funciona como reguladora de la velocidad de todo el sistema y se denomina enzima reguladora o enzima alostrica. Habitualmente esta enzima es inhibida por el producto final de la secuencia, de tal modo que cuando se produce acumulacin del producto final por sobre cierta concentracin crtica, ste inhibe a la primera enzima de la secuencia (enzima reguladora), interrumpiendo o cerrando as ese segmento del metabolismo. Este tipo de inhibicin se conoce como inhibicin por producto final o retroinhibicin (inhibicin "feedback"). Las enzimas reguladoras o alostricas estn formadas por dos a ms subunidades, las que tienen sitios de unin no slo para su substrato normal, sino tambin para el metabolito regulador, el cual se denomina efector o modulador alostrico. El sitio de unin para el modulador se denomina sitio alostrico y es altamente especifico para ese

metabolito. Cuando el sitio alostrico est desocupado, la enzima funciona con su velocidad cataltica normal; en cambio, si est ocupado por el metabolito regulador, la enzima sufre una modificacin en su conformacin a una forma menos activa o ms activa, dependiendo de s el modulador es inhibidor o estimulador.

Cuando la concentracin de sustrato se incrementa, el sustrato se une a la enzima y dispara el cambio de conformacin hacia la conformacin activa de la enzima. En presencia de inhibidor, se requiere mayor concentracin de sustrato para que la enzima cambie a su conformacin activa. Sin embargo, cuando se alcanza la suficiente concentracin de sustrato para disparar el cambio hacia la conformacin activa, el sustrato se une cooperativamente (curva con forma-S) y la misma velocidad mxima se alcanza, en presencia o ausencia de inhibidor.

BIOCATALIZADORES O ENZIMAS INMOVILIZADAS Hay que empezar por definir inmovilizacin, confinamiento fsico de una enzima o clula en una determinada regin del espacio, de manera que su actividad cataltica se retenga y pueda ser reutilizada.1 Aplicado al contexto se definen como inmovilizadas, enzimas o clulas enteras u organelos (o combinaciones de ellos) que se encuentran en un estado tal que se permite su reutilizacin.
1

1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, NewHampshire, USA.

Ventajas e inconvenientes de la inmovilizacin:

Como ventajas principales encontramos la disminucin de problemas de autolisis (proteasa) o de agregacin, al estar limitados los movimientos y rotaciones translacionales. Se ralentizan los cambios conformacionales, por lo que se pueden estudiar las relaciones estructura-funcin. Pueden simular reacciones in vivo y sistemas estructuralmente simtricos para estudio de membranas. Cuando se desea estudiar sistemas entrecruzados se pueden fijar interacciones con fosfolpidos, polisacridos para simular organelos celulares. Las uniones multipuntuales a soportes deformables permiten estudiar la deformacin de protenas globulares. Los inconvenientes de la inmovilizacin son bsicamente la disminucin de la actividad enzimtica al inmovilizar. Si la preparacin enzimtica no es homognea se dificulta la interpretacin de datos. Se pueden originar contactos protena-protena no deseados. Desde el punto de vista de aplicaciones se mencionan: 1.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima o clula inmovilizada. 2.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimtica por la capacidad de reutilizacin. 3.- Se aumenta la facilidad de recuperacin y purificacin de los productos. 4.- Se puede elegir entre una gran variedad de diseos ingenieriles 5.- Se aumenta la facilidad de operacin y control del proceso, al trabajar en condiciones ms suaves. Tambin existen desventajas asociadas a la aplicacin de las enzimas o clulas inmovilizadas: 1.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimtica. 2.- Se aumentan los problemas difusionales. 3.- Se aumenta el costo del proceso. 4.- El intervalo de pH de trabajo puede ser distinto al del biocatalizador nativo. Las formas de inmovilizacin, comprenden retencin fsica y qumica. La retencin fsica comprende la utilizacin de polmeros y miscelas, como atrapamiento en matrices, tambin hay atrapamiento en membranas y se hace por medio de fibras huecas o reactores de membrana. La retencin qumica se hace por medio de enlaces covalentes, no covalentes, adsorcin y reticulado. Los requisitos mnimos para implementar las inmovilizaciones son: La enzima o clula debe ser estable en las condiciones experimentales empleadas. Si se emplean agentes entrecruzantes, stos no deben afectar al centro activo. Si pudieran interferir con ste, se debe utilizar un agente entrecruzante lo ms grande posible. Si es posible, se debera proteger el centro activo:

si existen grupos -SH, stos deben hacerse reaccionar con cistena o glutation, para reactivarse posteriormente tras la inmovilizacin. se puede realizar la inmovilizacin en presencia de concentraciones saturantes de sustrato. El proceso de lavado no debe afectar negativamente a la enzima. Coherencia con la posterior biotransformacin. si soporte = polianin, la conversin de un sustrato aninico ser muy difcil (repulsin) enzima atrapada en un gel: si el sustrato presenta un alto peso molecular, el resultado ser malo. Gran importancia de las propiedades mecnicas (estabilidad del soporte, forma fsica del mismo) El soporte debe presentar una alta superficie especfica, para minimizar los problemas de transferencia de materia. El soporte debe conferir al derivado inmovilizado una buena resistencia a la contaminacin microbiana. El soporte debe permitir que se inmovilice una alta cantidad de biocatalizador (alto "loading"). El soporte debe ser comercialmente accesible: Disponibilidad y bajo precio Una ilustracin de una inmovilizacin covalente es mostrada en la figura.