Metodologia

SEQUENCIAMENTO DO DNA HUMANO

Sequenciar o DNA significa delinear a ordem das bases presentes nos genes, lembrando que os genes formam a estrutura dos 23 cromossomos que so analisados no genoma humano. Foi utilizado amostras de DNA de 17 pessoas diferentes, para que no futuro no tenhamos problema de privacidade gentica com esses doadores. O sequenciamento constituiu-se das seguintes etapas: A. Picotando o DNA As seqncias de DNA so picotadas em pedaos menores para serem analisadas. Essa diviso do DNA feita por enzimas especiais (enzimas de restrio). Alguns desses mtodos permitem apenas que os cromossomos sejam cortados individualmente, outros conseguem cortar o genoma inteiro de uma vez. B. Clonagem Os fragmentos de DNA so colocados em uma soluo com bactrias, as quais multiplicam o DNA para que os cientistas possam ter mais matria prima para anlise. Essa etapa pode ser realizada tambm utilizando-se a tcnica de Reao em Cadeia da Polimerase (PCR): Uma desnaturao no DNA, utilizando-se uma temperatura mdia de 92C, na qual provoca-se o rompimento das pontes de hidrognio, e a conseqente separao da cadeia dupla do DNA; Aps a abertura, uma seqncia de bases iniciadora ou primer que foi introduzida na reao de PCR se liga de forma complementar na extremidade da fita de DNA. Sem esse artifcio a enzima responsvel pela replicao, chamada Taq polimerase, no consegue iniciar seu trabalho de formao da cadeia complementar do DNA. Dentre as bases que sero usadas na replicao do DNA, h algumas especiais chamadas terminadoras, que tm a propriedade de interromper a ao da enzima de replicao. C. Marcao com fluorescncia Os fragmentos de DNA clonados so divididos em quatro solues. Cada uma das solues contm substncias florescentes que reconhecem os fragmentos de DNA que terminam com uma determinada letra (A, T, C ou G). Quando a letra encontrada, o fragmento recebe uma espcie de "etiqueta" fluorescente para que possa ser reconhecido ( verde - A, azul - C, laranja - G e vermelho - T ). D. Separao

Os fragmentos de DNA "etiquetados" so ligados a tubos finos cheios de gel. Uma carga eltrica lentamente "puxa" os pedaos de DNA para dentro dos tubos. Os pequenos fragmentos viajam mais rapidamente do que os grandes. O processo acaba separando os fragmentos de acordo com o tamanho (eletroforese). E. Leitura Finalmente, todos os fragmentos so separados de acordo com o tamanho. Cada fragmento que colocado na ordem um par (A-T ou C-G) maior do que o fragmento seguinte. As etiquetas fluorescentes no fim de cada fragmento podem ento ser lidas por um sistema a laser, que fornece em seguida a sequncia gentica daquele pedao de DNA. Os dados so processados em supercomputadores para que os cientistas remontem a sequncia de DNA, agora totalmente digitalizada. O que aconteceu depois?

O mdico Salmo Raskin, presidente da Sociedade Brasileira de Gentica Mdica (SBGM), afirma que o feito permitiu uma srie de descobertas. E os dados devem se multiplicar medida que novos genomas forem sequenciados. Algumas descobertas importantes proporcionadas pelo Projeto Genoma Humano, citadas pelo geneticista: - Contrariando todas as expectativas, que estimavam o nmero de genes da espcie humana em torno de 100 a 300 mil, o nmero de genes encontrado por ambos os grupos de pesquisa do Genoma Humano foi de cerca de 26 mil (hoje se estima cerca de 20 mil). A complexidade de uma espcie no diretamente proporcional ao nmero de genes. Uma minhoca tem 19 mil genes. - Dados revelados pelo sequenciamento indicam que uma parcela da complexidade do ser humano provavelmente ser explicada pelo potencial de produo de formas alternativas de protena. A hierarquia das espcies estaria ao nvel proteico e no genmico, diz Raskin. - Uma parte dos 98% do cdigo gentico que no produzem protenas so resqucios do passado evolutivo do ser humano. Essas sequncias, ou fsseis genmicos, podem ter tido alguma funo reguladora ao longo da evoluo. Elas no so apenas lixo gentico, como se pensou no incio. Hoje, sabe-se que pelo menos metade dessas

sequncias no tm nada de lixo, comenta o geneticista. Elas produzem cidos nucleicos do tipo RNA, que tm o potencial de exercer inmeras funes biolgicas. - O genoma completo de mais de 20 seres humanos foi sequenciado e os cientistas sabem que a variabilidade entre as bases nitrogenadas dos seres humanos bem maior (estimada em 1%) do que se imaginava (a estimativa era de 0,1%). Esta correo aconteceu quando os pesquisadores detectaram que a maior variabilidade entre o DNA de dois Homo sapiens est em trechos de DNA maiores que podem estar repetidos, faltando ou s vezes invertidos. Isso pode explicar diferenas como a resposta a certos medicamentos. - possvel comparar espcies com grande preciso porque genomas inteiros de mais de 3.800 outras espcies j foram sequenciados e analisados por completo (inclusive de mamferos muito prximos ao ser humano na escala hierrquica da vida). Os estudos mostram que os mamferos so muito parecidos, em termos genticos (nossa sequncia de 3 bilhes de pares de bases nitrogenadas difere em apenas 1% da sequncia do genoma do chimpanz). Assim, fica mais fcil estudar certas doenas, transferindo o conhecimento obtido pela pesquisa em animais. Por outro lado, entender melhor as diferenas entre os genomas pode trazer dados sobre doenas que afetam os seres humanos e ainda so pouco compreendidas, como autismo e Alzheimer.