FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA UNIVERSIDAD SIMON BOLIVAR LABORATORIO DE ANLISIS INSTRUMENTAL Alumna: Silvana Tapia Cabrera Alejandra Jimnez

Molotla Mariana Delgado Domnguez Profesor: Rosalba Santiago Leonarda Carrillo PRCTICA 7: ESTUDIO DE ALGUNOS FACTORES QUE AFECTAN EL ESTABLECIMIENTO DE UN MTODO ESPECTROFOMTRICO INTRODUCCIN Las caractersticas esenciales de un mtodo espectrofotomtrico para que sea cuantitativo son: Que el mtodo sea selectivo al analito que se desea analizar. Que est libre de interferencias que afecten el resultado analtico que las interferencias se puedan controlar. Que tenga alta precisin y exactitud. Que tenga una alta sensibilidad y Que el lmite de deteccin corresponda a una concentracin baja. Experimentalmente para el establecimiento de un mtodo espectrofotomtrico, despus de optimizar las condiciones qumicas del sistema (pH, temperatura, control de interferentes, concentracin adecuada de reactivos, solvente apropiado, proteccin a la luz para evitar reacciones fotoqumicas, etc.) que garanticen que se tiene la especie de inters en condiciones adecuadas para la medida, se establecen los siguientes parmetros: 1-Longitud de onda analtica: Se escoge mediante el registro y/o la observacin de la curva espectral o espectro de la sustancia que indicar si es adecuado tomar la longitud de onda de mxima absorcin u otra banda caracterstica de la sustancia como longitud de onda para realizar las medidas, la longitud de onda escogida se conoce como longitud de onda analtica. (Rubinson, 2000) Fecha

2- Intervalo ptimo de concentraciones : Se debe trabajar, en lo posible, con concentraciones que permitan que se cumpla la ley de Beer, con el fin de obtener una curva de calibracin que tenga una relacin lineal. Para obtener el intervalo ptimo de concentraciones primero se construye la curva de Ringbom, que consiste en construir una grfica de absortancia (100- %T) vs lg Concentracin. Los datos se obtienen preparando una serie de soluciones patrn del analito, que cubran una variacin de por lo menos dos rdenes de magnitud de concentracin de este y se miden las transmitancias correspondientes a la longitud de onda analtica escogida. Para la mayora de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta grfica permite obtener el intervalo de concentraciones ptimo o el intervalo que presentara una relacin lineal entre absorbancia y concentracin. En esta grfica, los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, peden servir para determinar un valor para los lmites de deteccin mnimo y mximo, respectivamente. (Rubinson, 2000) 3- Curva de Calibracin : Con los datos de la parte recta de la curva de Ringbom se contruye la curva de calibracin Absorbancia (en las ordenada) vs Concentracin (en la abscisa ) previo ajuste de los datos por mnimos cuadrados (que incluyen el punto 0.0, 0.0000) revisando que el coeficiente de correlacin sea estadsticamente significativo. La grfica de la recta de calibracin debe incluir los puntos experimentales. La recta ajustada tambin se conoce con el nombre de curva de trabajo. (Rubinson, 2000) 4- Curva de Crawford: Con todos los datos obtenidos para la curva de Ringbom, se calcula el error analtico por unidad de error fotomtrico, y se construye la curva del error para el sistema de inters, previa determinacin experimental del error fotomtrico o instrumental. Si no se conoce D T, entonces solo se puede obtener (D C/C)/D T. (Rubinson, 2000) 5- Sensibilidad del mtodo analtico: Se calcula la sensibilidad del mtodo de la pendiente de la curva de calibracin y se expresa como se indic anteriormente. Lmite de deteccin: Se preparan, por lo menos, diez soluciones del blanco de procedimiento, se leen las transmitancias o absorbancias respectivas y se calcula como se indic anteriormente. Precisin del mtodo. Carta de dispersin: La precisin indica la dispersin de las medidas o la variabilidad del mtodo. La precisin se mide mediante un parmetro estadstico de dispersin, generalmente se utiliza la desviacin estndar, S: S = [ ( X- Xpromedio)2 /( n -1)] 1/2 donde X es la variable medida concentracin, absorbancia, etc., Xpromedio el valor medio de la variable medida y n el nmero de medidas o datos. Un valor pequeo de desviacin estndar con relacin al valor medio, indica que las medidas presentan poca dispersin o que son precisas. En muchos casos, se observa si todos los datos de una serie de medidas caen entre el valor medio y ms o menos dos desviaciones estndar, Xpromedio 2S, si es as, se dice que el mtodo tiene una precisin del 95 %.(Rubinson, 2000) El procedimiento que se sigue para obtener los datos que permitan el calculo de la desviacin estndar en concentracin, se ilustra a continuacin: Se preparan, por lo menos, diez soluciones patrn del analito de la misma concentracin (concentracin que produzca una transmitancia cercana a 37.0%) siguiendo todos

los pasos del procedimiento, se lee su transmitancia, se calcula la absorbancia para cada solucin, se interpolan los valores en la curva de calibracin y se obtienen las concentraciones respectivas. Con las concentraciones halladas se obtiene el valor promedio de concentracin y la desviacin estndar, S, que corresponde a la medida de la dispersin de los datos. Se construye la carta de dispersin de los datos y se calcula elcoeficiente de variacin del mtodo as: % Coeficiente de variacin = (desviacin estndar / valor medio) x 100 Exactitud del mtodo: La exactitud de un mtodo analtico indica que tan alejado se encuentra el valor medido del valor verdadero o valor real, se mide mediante: El error absoluto: (Valor medido - Valor esperado) x 100, en valor absoluto; o El error relativo: [(Valor medido - Valor esperado) / Valor esperado] x 100, en valor absoluto. (Rubinson, 2000) Si la diferencia es muy pequea el mtodo presentar una buena exactitud, o al contrario baja exactitud. Para determinar la exactitud del mtodo, se aplica el procedimiento analtico a varias rplicas de un patrn certificado o de referencia, cuyas caractersticas sean muy similares a las de la muestra, es decir que la matriz de anlisis sea lo mas parecida a la muestra que se esta analizando. Se obtiene el valor medio de concentracin del analito y se calcula el error relativo, tomando como valor esperado el contenido del analito certificado en el patrn de referencia. Si se calcula la desviacin estndar se obtiene tambin la reproducibilidad o precisin del mtodo, como se indic antes. El patrn certificado es obtenido de instituciones que se encargan de preparar estos patrones, como National Institue of Standars and Technology, Environmental Protection Agency, World Health Organization, etc., del que se conoce la cantidad del analito presente y sus parmetros estadsticos. Es posible conseguir patrones certificados de un analito dado, por ejemplo, mercurio o fenol u otra especie qumica en agua, en agua de mar, en suelos, en alimentos, de ciertos metales en aleaciones, en suelos, en rocas, etc,. (Rubinson, 2000) Los parmetros antes sealados, l analtica, intervalo ptimo de concentraciones, curva del error, sensibilidad, lmite de deteccin, precisin y exactitud permiten la caracterizacin de un mtodo espectrofotomtrico. Estos parmetros se establecen cuando previamente se hayan optimizado las variables qumicas que puedan afectar la medida de la absorcin de luz por parte de la especie de inters . (Rubinson, 2000) OBJETIVOS Seleccionar tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas para el espectrofotmetro Baush and Lomb. Analizar algunos de los parmetros que intervienen en el establecimiento de un mtodo espectrofotomtrico para establecer las condiciones ptimas de trabajo.

PROCEDIMIENTO I. SELECCIN DE TUBOS PARA SER USADOS COMO CUBETAS a)Se seleccionaron tubos que tuvieran superficies pticamente equivalentes 1. Se seleccion la longitud de onda adecuada; en el caso particular de esta prctica, 400 nm es la indicada para usarse en la seleccin de cubetas. 2. Se adicion un mnimo de 5 ml de agua destilada a 25 tubos de la misma medida y marca comercial, previamente lavados. 3. Se escogi un tubo que fue utilizado como blanco, el cual debe tener pared ptica y dimetro interno muy semejante a la mayora. Se ajust el espectrofotmetro a cero, Se coloc el tubo y se llev la escala de transmitancia a una lectura de 95 %T. Se marc una lnea vertical en el extremo superior del tubo, alineada exactamente con la marca

correspondiente del receptculo de la cubeta, para colocarlo siempre en la misma posicin. 4. Se coloc otro tubo en el espectrofotmetro, se gir lentamente hasta hallar una posicin donde una pequea rotacin no haga variar la lectura del aparato en 2 %T. Se marc una lnea vertical igual que en el anterior y numerarlo como No. 2. 5. Se repiti el paso 4 con cada uno de los tubos, numerndolos y se anot la lectura de %T. 6. Se seleccionaron 15 de los tubos anteriores que den lectura de 95 2 %T, cuando se colocan en la posicin marcada. b) Se seleccionaron tubos con dimetro equivalente. 1. A los 15 tubos seleccionados, con pared pticamente se les adicionaron 5 ml de una solucin de NiSO4 al 4 %. Se escogi una solucin de esta concentracin. 2. Se ajust el espectrofotmetro al 100 %T, usando agua destilada como blanco. Se coloc cada tubo en la posicin marcada y anotar la lectura de %T a 400 nm. 3. Se seleccionaron 10 tubos que den lecturas que no varen ms de 2 %T.

II.

FACTORES

QUE

AFECTAN

EL

DISEO

DE

UN

MTODO

ESPECTROFOTOMTRICO a) Estabilidad del color en funcin del tiempo Se prepararon dos tubos como se indica en la tabla 1 (ver manual p.p. 46), se taparon con plstico autoadherente, se mezclaron y leyeron en el

espectrofotmetro a 480 nm a los 0, 30, 60, 90 y 120 minutos de efectuada la reaccin, usando el tubo 1 como blanco para ajustar a 100 %T. b) Efecto de la concentracin del cromgeno. Se prepar una serie de tubos y se leyeron, uno por uno, al momento de agregar NH4SCN. Tabla 2 (ver manual, p.p 47) c) Efecto del pH sobre la reaccin entre Fe 3+ y SCN. Se prepar una serie de tubos de acuerdo a la tabla 3. (ver manual p.p 48) Al igual que en experimento anterior, el desarrollo de color se hizo tubo por tubo y se ley inmediatamente, usando como blanco el tubo 1.

1. Se preparar un blanco de reactivos con 0.2 ml de solucin saturada de tiocianato de amonio y 9.8 ml de agua destilada. Se ajust el espectrofotmetro a 100 % T. 2. En una vaso de precipitados de 100 ml, se adicionaron 12 ml de solucin de cloruro frrico 0.00025 M, 0.6 ml de solucin saturada de tiocianato de amonio, 0.43 ml de HCI concentrado (con pipeta) y 17 ml de agua destilada. 3. Se colocaron 5 ml de solucin colorida en cuatro tubos deferentes y se ley cualquiera de los tubos al espectrofotmetro, esta lectura se considera como la inicial. Se agregaron inmediatamente 10 mg de fluoruro de sodio, se agitaron y leyeron en el espectrofotmetro a 480 nm. Se repiti esta operacin con tartrato de sodio, oxalato de sodio y fosfato de potasio. e) Curva de calibracin Se preparar una serie de tubos de acuerdo a la tabla 4 (ver manual p.p 48). 1. Se agregaron todos los reactivos, excepto el NH4SCN

2. Se adicionaron el NH4SCN al tubo 1, se mezcl y ley a 480 nm en el espectrofotmetro previamente ajustado a cero de absorbencia (100 %T) 3. Se agreg NH4SCN al tubo No. 2, mezclar y leer inmediatamente. Se repiti con los dems tubos.

DATOS EXPERIMENTALES E INORME 1.- Resultados de la seleccin de tubos Completar la tabla 5. Tabla 5. seleccin de tubos comunes para usarlos como celdas Tubo No. %T400 (H2O) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tubo No. %T400 (NiSO4)

2. Curva de calibracin Complete la tabla 6. Tabla 6. curva de calibracin de Fe 3+ por el mtodo de NH4SCN

Tubo No.

Fe 3+ (g/ml)

A 480

A ajustada por regresin lineal

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Con los resultados anteriores construya la curva de calibracin (grfica 1) colocando en el eje de las abscisas la cantidad de in frrico y en el eje de las ordenadas las lecturas de absorbencia a 480 nm. a) Sigue esta reaccin la Ley de Bouger y Beer? Explique.__________________________________________________________ _____________________________________________________________ b) Comente a cerca de la sensibilidad del mtodo, el intervalo de concentracin y escala til del aparato. Seale estos datos en el grfico. ________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________ c) Una lnea recta calculada por regresin lineal, adems de utilizarse para tener la concentracin de analitos de inters, se puede usar en la determinacin del lmite de deteccin de un mtodo analtico, a partir de la ecuacin. Y= YB + 3SB Donde: (1)

Y= Seal instrumental o medida de absorbencia, en este caso, que produce la concentracin mnima detectable. YB = Medida de absorbencia del blanco que corresponde a la ordenada al origen, a, de la recta de regresin, as YB = a SB = es la desviacin estndar del blanco y puede hacerse igual a S y/x, que es la desviacin estndar de los residuos de y, por medio de la ecuacin (2)
2

Sy/x =

(y-1)2 (n-2)

Se ocupan los residuos de y, (y1 -i), donde los valores de i equivalen a los puntos sobre la recta de regresin lineal calculada, son los valores de y "ajustados" y se obtienen fcilmente a partir de la ecuacin de regresin lineal. Para obtener el LDD de un mtodo analtico se calcula el valor de y de la ecuacin (1), posteriormente, a partir de la ecuacin de la recta de regresin lineal del mtodo en estudio. Y= mx+b Se obtiene la concentracin mnima detectable. d) Mtodo de Ringbom para determinar el %Ep Complete la tabla 7. Con estos datos construya la grfica de Ringbom (grfica 2); Colocando en el eje de las abscisas el logaritmo de las respectivas concentraciones de in frrico y en el eje de las ordenadas, la absorbencia de cada tubo. Determine el intervalo de concentracin y la escala de A del aparato para error fotomtrico mnimo, y el porcentaje de error fotomtrico (% E p) para este mtodo. Tabla 7. Datos para aplicar el mtodo de Ringbom en la determinacin de Fe3+ por el mtodo del SCN Fe3+ Tubo No. 1 2 (g/ml) Log Fe
3+

Absorbencia A 480 %T 100 - % T

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

3. Efecto del tiempo en la estabilidad del color Complete la tabla 8 Tabla 8. Estabilidad del color respecto al tiempo Tiempo (min) 0 30 60 90 120 A 480

Construir una grfica (grfica 3) colocando el tiempo de reposo en el eje de las abscisas y las lecturas de absorbencia, en el eje de las ordenadas. Con base en los resultados obtenidos, conteste: a) Es estable el color? b) Cul es el tiempo ptimo para hacer las lecturas? Explique porqu. 4.- Efecto de la concentracin del cromgeno Complete la tabla 9

Tabla 9. Efecto de la concentracin de SCN en la determinacin de Fe3+ Tubo No. SCN (g/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Colocando los valores de la relacin SCN-/Fe
3+

Fe (g/ml)

SCN-/Fe3+ (g/ml)

A 480

en el eje de las abscisas y las

lecturas de absorbencia en el eje de las ordenadas, construya la grfica 4 De acuerdo a la grfica, Qu concentracin de tiocianato se recomienda? Explique porqu. _________________________________________________ 5. Efecto del pH en el desarrollo de color de la reaccin entre el Fe Complete la tabla 10 Tabla 10. Efecto del pH Tubo No. 1 2 3 4 5 6 pH A 480
3+

y el SCN-

Construya la grfica 5 con los valores de pH en el eje de las abscisas y las lecturas de absorbencia en el eje de las ordenadas.

a) De qu manera influye el pH en el sistema colorido? b) Cul es el pH recomendado para que se efecte la reaccin Fe3+ y el SCN? 6. Efecto de algunos aniones sobre la absorbencia absoluta Complete la tabla 11. Tabla 11. Efecto de algunos aniones en la reaccin Fe3+ y el SCNAnin Fluoruro Oxalato Tartrato Fosfato A 480 inicial A 480 final

a) Cul es el efecto de los diferentes aniones sobre la reaccin entre el in frrico y el tiocianato? b) A qu se debe ese efecto? 7. Parmetros ptimos para el mtodo del sulfocianuro de amonio para determinar fierro frrico. Con los resultados obtenidos en todos los experimentos, complete la tabla 12 Tabla 12. Condiciones ptimas para la determinacin de Fe3+ con NH4SCN Parmetro pH Tiempo Concentracin de SCNLmites de concentracin con % Ep mnimo Aniones que interfieren (en orden creciente) Lmite de deteccin del mtodo (LDD) Valor ptimo

DISCUSIN:____________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________ CONCLUSIONES: _______________________________________________

__________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________ REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Ayres. G. H. 1970. Anlisis Qumico Cuantitativo. 2a. Ed., Ed. Harta. S.A. Mxico, D.F.., pp. 459-514 2. Long, G.L. and J.D. Winefordner. 1983. Limit of Detection: A closer Look at the IUPAC Definition. Anal. Chem. 55: 712A 3. Kolthoff, I.M. and E.B. Sandel. 1952. Textbook of Cuantitative Inorganic Analysis. The McMillan Co., New York, pp. 613-627 4. Anlisis Instrumental. K. A. Rubinson, Prentice-Hall, 2000. 5. Anlisis Instrumental. D. A. Skoog y J. J. Leary. Mc.Graw-Hill., 1994. 6. Anlisis Instrumental. D. A. Skoog y D. M. West. Interamericana., 1984. 7. Mtodos Instrumentales de Anlisis. H. H. Willard, L. L. Merritt, J. A., Dean y F. A. Settle Grupo Editorial Iberoamrica, 1991

PRCTICA 8: ANLISIS ESPECTROFOTOMTRICO DE UN SISTEMA MLTIPLE INTRODUCCIN Partiendo de la ley de Bouger y Beer, se tiene que la absorbencia es proporcional al nmero de partculas efectivas que absorben la radiacin electromagntica a una longitud de onda especfica, esto implica que si en la solucin hay ms de una especie absorbente o cromforo y stas no reaccionan entre s, cada especie absorber como si las otras no estuvieran presentes, esto es, la absorbencia total, a una determinada longitud de onda ( l) para dos A y B, en la mezcla, es: AT(l) = A (Al) + AB(l) (1)

Esta ecuacin afirma que la absorbencia en un sistema mltiple es una propiedad aditiva y supone que no hay interaccin qumica entre los cromforos. La adicin de las absorbencias es importante en el anlisis de mezclas, por ejemplo, en la cuantificacin simultnea de dos o ms sustancias en la misma solucin. En este tipo de determinaciones, es requisito indispensable que las longitudes de onda mxima de los componentes no sean demasiado cercanas entre s. Las longitudes de onda de trabajo se seccionan a partir de los espectros de absorcin de cada uno de los componentes del sistema, y sern aquellas en las que un compuesto presente su mxima absorcin (max), y el otro no presente absorcin o sta sea mnima. De la ecuacin 1 podemos decir que la absorbencia total del sistema a l es: AT(l) = a m A (l ). bC mA + a mB (l) . bC mB. La absorbencia total a 2 es: AT(2) = a m A (1). bC MA + a mB (2). bC mB. (3) Las absortividades molares, am, de A y B a l y 2 se calcula a partir de curvas de calibracin de los cromforos A y B a las dos longitudes de onda. Para determinar CmA y CmB, se resuelven simultneamente las ecuaciones de 2 y 3. (2)

OBJETIVO Determinar constantes fotomtricas para aplicarlas en el clculo de la concentracin de los componentes de un sistema mltiple para comprobar la ley de aditividad.

MATERIALES Y APARATOS 1. Una gradilla 2. Veinte tubos de ensaye de 18 X 150 mm 3. Una pipeta de 1 ml (graduada en centsimas) 4. Dos pipetas de 5 ml (graduada en dcimas) 5. Una pipeta de 10 ml (graduada en dcimas) 6. Un vaso de precipitados de 100 ml 7. Espectrofotmetro para la regin visible 8. Cubetas para el espectrofotmetro PROCEDIMIENTO 1. DETERMINACIN DE LAS LONGITUDES DE ONDA DE TRABAJO (l y 2) Obtener los espectros de absorcin de las soluciones tipo de K 2Cr2O7 0.0016M y KMnO4 0.0004 M, leyendo entre 340-600 nm en intervalos de 10, contra un blanco de H2SO4 0.5 M. Seleccionar la longitud de onda de trabajo para cada solucin, considerando que la absorbencia sea mxima para un componente y mnima para el otro. 2. OBTENCIN DE LAS ABSORTIVIDADES MOLARES DE CADA COMPONENTE A LAS DOS LONGITUDES DE ONDA SELECCIONADAS (l y 2) Realizar curvas de calibracin de K2Cr2O7 y KMnO4 midiendo la absorbencia de seis diluciones (1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 y 1:7) en H2SO4 0.5 M de cada sustancia, a cada una de las longitudes de onda seleccionadas, utilizando como blanco H 2SO4 0.5 M 3. COMPROBACIN DE LA LEY DE ADITIVIDAD Medir la absorbencia de las mezclas que se indican en la tabla 1, contra un blanco que contenga 5.0 ml de agua destilada y 5.0 de H2SO4 0.5 M

Tabla 1. Preparacin de las mezclas para la comprobacin de la ley de aditividad Mezcla No. K2Cr2O7 0.0016 M KMnO4 0.0004 M (ml) 1 2 3 5.0 2.5 1.0 (ml) 1.0 2.5 5.0 H2SO4 0.5 M (ml) 0.2 0.2 0.2 H2O (ml) 3.8 4.8 3.8

4. DETERMINACIN DE LOS COMPONENTES DEL SISTEMA MLTIPLE.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME 1. Espectros de absorcin de las soluciones tipo de K2Cr2O7 0.0016 M y de KMnO4 0.0004 M Tabla 2. Valores de absorbencia para construir los espectros de absorcin de K2Cr2O7 y KMnO4 Longitud de onda (nm) 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 A K2Cr2O7 0.0391 0.455 0.435 0.338 0.24 0.147 0.077 0.044 0.041 0.048 A KMnO4 0.512 0.494 0.430 0.311 0.201 0.102 0.033 0.022 0.010 0.004

440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

0.054 0.049 0.039 0.028 0.015 0.004 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0.014 0.044 0.096 0.183 0.275 0.438 0.558 0.763 0.842 0.991 0.853 0.916 0.585 0.51 0.289 0.111 0.071

K2Cr2O7
0.6 0.5 0.4 Absorbancia 0.3 0.2 0.1 0 0 -0.1 100 200 300 400 500 600 700 Longitud de onda K2Cr2O7

Grfica 1.0 Espectro de absorcin de K2Cr2Oz

KMnO4
1.2 1 Absorbancia 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 200 400 600 Longitud de onda 800 KMnO4

Grfica 1.1 Espectro de absorcin del KmnO4

Espectro de absorcin de K2Cr2O7 y KMnO4

1.2 1 0.8 Absorbancia 0.6 0.4 0.2 0 300 -0.2 350 400 450 500 550 600 longitud de onda K2Cr2O7 KMnO4

Grfica 1.2 Espectro de absorcin de K2CrO7 Y KmnO4 en intervalos de longitudes de onda. Tabla 3. Valores de max para K2Cr2O7 y KMnO4 Compuesto K2Cr2O7 l KMnO4 2 max 370 530

b) Porqu se escogen estas longitudes de onda y no otras? Porque es en donde mostr la mxima absorcin en la muestra y por lo tanto grficamente se puede demostrar que cada compuesto se absorbi a su mxima longitud. 1. Curvas de calibracin, ajustadas por regresin lineal, de K2Cr2O7 y KMnO4

Curva de Calibracin A l y 2 K2Cr2O7 y KMnO4

0.6 0.5 0.4 absorbancia 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 concentracin 5 y = 0.068x + 0.1153 R = 0.9244 A l A 2 A l y = 0.0374x + 0.0307 R = 0.9696 y = 0.0223x + 0.0853 R = 0.9729 A 2 Linear (A l) Linear (A 2) Linear (A l)

Linear (A 2) y = 0.0077x - 0.0053 R = 0.8115 6 7

Grfica 2.0 Curva de calibracin de K2CrO7 y KmnO4 a sus dos longitudes mximas para obtener la regresin lineal y los datos de una curva. Tabla 4. Curvas de calibracin de K2Cr2O7 y KMnO4 a l y 2 Compuesto Dilucin Concentracin Molar (CM) 1:7 1:6 K2Cr2O7
(370)

A l

A 2

2.285x10-4 2.66x10-4 3.2x10-4 4x10-4 5.33x10-4 8x10-4 5.714x10-5 6.66x10-5 8x10-5 1x10
-4

0.1 0.13 0.16 0.18 0.20 0.21 0.06 0.1 0.15 0.20

0.16 0.29 0.34 0.36 0.410 0.560 0.01 0.01 0.01 0.02

1:5 1:4 1:3 1:2 1:7 1:6

KmnO4
(530)

1:5 1:4

1:3 1:2

1.33x10-4 2x10-4

0.22 0.024

0.03 0.05

Tabla 5. Valores de am para K2Cr2O7 y KmnO4 a l y 2 Absortividad K2Cr2O7 P=am a l 370 am a 2 530 0.0223 0.068 Sustancia KMnO4 0.0374 0.0077

3. Comprobacin de la Ley de la aditividad en un sistema mltiple. Tabla 6. Valores de CM y absorbencia en las mezclas de K2Cr2O7 y KMnO4 CM Mezcla No. 1 2 3 K2Cr2O7 8x10-4 4x10-4 1.6x10-4 CM KMnO4 4x10-5 1x10-4 2x10-4 A Observada l 370 0.06 0.12 0.23 2 530 0.17 0.30 0.53

Escriba todos sus clculos Tabla 7. Valores absorbencia observados y calculados de absorbencia de las mezclas de K2Cr2O7 y KMnO4 Mezcla No. l 1 2 3 Sustituyendo en A Calculada 2 l 0.06 0.12 0.23 A Observada 2 0.17 0.30 0.53

b) Para la verificacin adecuada del seguimiento de la ley de aditividad, calcule el valor de r y r2 a a l y 2, considerando como variable independiente las absorbencias calculadas y como variable dependiente, las absorbencias observadas. Explique si se cumple la ley de la aditividad.

DISCUSIN:____________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________________________________________ CONCLUSIONES: _______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________________________________________ REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Harley, J.H. and S.E. Wiberley. 1954. Instrumental Analysis. John Wiley, New York. 2. Willard, H.; L.L Merritt; J.A. Dean and F.A. Settle Jr. 1991. "Mtodos instrumentales de Anlisis". Grupo Editorial Iberoamrica., Mxico, D.F., 883 pp.

PRCTICA 10: TRATAMIENTO PRELIMINAR DE LA CAPACIDAD DE INTERCAMBIO DE UN INTERCAMBIADOR INICO

INTRODUCCIN Un intercambiador inico es un polielectrolito (polianin o policatin) insoluble. Est constituido por una matriz, un in fijo y un in mvil. Los intercambiadores pueden ser naturales, semisintticos y sintticos. Estos ltimos se utilizan en las separaciones cromatogrficas de molculas de bajo peso molcular, por ejemplo aminocidos. Las matrices de los intercambiadores sintticos ms comunes se preparan por la copolimerizacin de estireno y divinilbenceno (DVB) o poliacrilatos y divinilbenceno; este ltimo se incluye como agente para el entrecruzamiento,

obtenindose

redes

tridimensionales,

porosas,

las

que

se

les

une

covalentemente un grupo qumico ionizable. La sntesis de estas redes tridimensionales se controla de tal forma, que se obtienen intercambiadores qumica y fsicamente estables; as como de tamao, forma, porosidad y composicin qumica uniformes. Los intercambiadores fnicos tienen propiedades tales como: a) Grado de entrecruzamiento b) Tamao de partcula c) Selectividad d) Capacidad de intercambio Esta ltima es una propiedad muy importante definida como: "La cantidad de grupos cargados, expresada en miliequivalentes, que se intercambian por gramo de intercambiador seco". Una caracterstica importante de los intercambiadores fnicos, es que se pueden utilizar casi indefinidamente despus de ser sometidos a un proceso cclico de regeneracin, siempre y cuando las condiciones de intercambio y del proceso de regeneracin sean lo menos drsticas posible, pues cambios bruscos en la temperatura y el pH de trabajo afectan la estabilidad y duracin de los intercambiadores. OBJETIVO: Efectuar el tratamiento preliminar de un intercambiador inico para determinar la capacidad de intercambio inico del mismo. MATERIAL Y APARATOS 1. Un vaso de precipitados de 100 ml 2. Una pipeta de 10 ml (graduada en dcimas) 3. Un matraz Erlenmeyer de 250 ml 4. Una bureta de 25 ml (graduada en dcimas) 5. Una probeta de 50 ml 6. Un soporte universal 7. Una pinza para bureta 8. Un embudo de vidrio

9. Papel indicador de pH 10. Papel filtro 11. Balanza analtica 12. Un recipiente para pesar PROCEDIMIENTO A. TRATAMIENTO PRELIMINAR 1. Pesar 1 g de intercambiador Merck I y colocarlo en un vaso de precipitados de 100 ml. 2. Hacer tres lavados con agua destilada de 10 ml cada uno

NOTA: si la resina es nueva, antes de tratarla con NaOH 1 N, deben hacerse 2 lavados con una mezcla de alcohol-acetona en proporcin 1:3 3. Tratar dos veces con NaOH 1 N, empleando 10 ml de la solucin cada vez 4. Realizar quince lavados con proporciones de 10 ml de H2O destilada. 5. Medir el pH del agua destilada y del agua de lavado; si son iguales continuar con el tratamiento con HCI; de no ser as, seguir lavando hasta igualarlos. 6. Efectuar dos tratamientos con 10 ml de HCI 1 N, cada uno. 7. Hacer veinticinco lavados con H2O destilada, empleando 10 ml de sta en cada ocasin. 8. Tomar el pH del agua destilada y el del agua de la solucin de lavado, si son iguales continuar con el siguiente paso, en caso contrario, lavar con H 2O destilada hasta que sean iguales. 9. Filtrar el intercambiador a travs de papel Whatman 42, previamente pesado. No olvide anotar la masa del papel filtro. 10. Colocar el intercambiador filtrado en un recipiente adecuado y secar a 37 C en el cuarto estufa. 11. Pesar el intercambiador seco y obtener el porcentaje de intercambiador recuperado. B. DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD DE INTERCAMBIO 1. Pesar 0.5 g de intercambiador Merck I regenerado y colocarlo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.

2. Agregar 50 ml de NaCI 1 M y dos gotas de fenolftalena. 3. Titular con NaOH 0.1 N hasta el vire de la fenolftalena a un color rosa plido, que debe permanecer al menos por 30 s. 4. Calcular la capacidad de intercambio con la ecuacin: capacidad = XV = meq M donde: X = Normalidad exacta de la solucin NaOH V = Volumen de NaOH empleado en la titulacin M = Masa de resina utilizada DATOS EXPERIMENTALES E INFORME A. PORCENTAJE DE INTERCAMBIADOR RECUPERADO 1. Con los datos de la masa del intercambiador, antes y despus del tratamiento, obtenga el porcentaje de intercambiador recuperado. 2. Diga cul es la razn para determinar este porcentaje: g

_______________________________________________________________ __________ 3. Cul es el valor del pH despus de los lavados con H2O destilada?___ __________________________________________________________ 4. Qu importancia tiene determinar el pH despus de los ltimos lavados con H2O destilada?__________________________________________ __________________________________________________________ B. CAPACIDAD DE INTERCAMBIO 1. Obtenga el valor de la capacidad del intercambiador Merck I. Incluya clculos. 2. Cul es la importancia de determinar la capacidad de un

intercambiador?_______________________________________________ ________________________________________________________ DISCUSIN:____________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________

CONCLUSIONES: _______________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________ REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Braithwaite, A. And F. J. Smith. 1985. Chromatographic Methods. 41. Ed., Chapman and Hall New York, pp. 98-103 2. Barnard, J. A. and R. Chayen. 1970. Mtodos Modernos de Anlisis Qumico. Ed. Urmo, Bilbao, pp. 218-227

PRCTICA 11: SEPARACIN DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOCIDOS POR CROMATOGRAFIA POR INTERCAMBIO IONICO

INTRODUCCIN El intercambiador inico es un proceso en el que in electrolito problema es solucin se pone en contacto con los grupos inicos enlazados a un intercambiador de ines al que se une reversiblemente, desplazando al in mvil. La desorcin se puede dar por cambios en la fuerza inica o el pH del eluyente. El proceso de intercambio inico se puede esquematizar como sigue:
M ____ F-M+ A ____ F-M+ T _____F-M+ R _____F-M+ I _____F-M+ Z _____F-M+
B+

+ A- B+

M A T R I

____ F-B+ ____ F-B+ ____ F-B+ ____ F-B+ ____ F-B+

+ A- M+
F-

Z ____

Donde: F- es el in fijo, M+ es el in mvil y A - B+ es un compuesto, con agua, que se va a separar. El proceso de intercambio inico se aplica a la separacin de, prcticamente, cualquier molcula cargada, desde nucletidos y aminocidos hasta protenas de alto peso molecular. OBJETIVO: Emplear la tcnica de intercambio inico para la separacin de dos aminocidos y comprobar la separacin mediante una reaccin colorida y el perfil de elucin. MATERIAL Y APARATOS 1. Columna de vidrio (1 X 52 cm) 2. 2. Tubos de Hule 3. Varilla larga, de vidrio de 2 mm de dimetro 4. Un vaso de precipitados de 50 ml 5. Un vaso de precipitados de 100 ml 6. Una pipeta de 1 ml (graduada en centsimas)

7. Una pipeta de 10ml (graduada en dcimas) 8. Cuarenta tubos de ensaye de 13 X 100 mm 9. Cuarenta y dos tubos de ensaye de 18 X 150 mm 10. Una gradilla metlica 11. Una gradilla de plstico 12. Un soporte universal 13. Una pinza para bureta 14. Una pinza Hoffman 15. Espectrofotmetro para la regin visible 16. Celdas para espectrofotmetro 17. Potencimetro 18. Agitador magntico PROCEDIMIENTO 1. Empaquetamiento de la columna con el intercambiador Llenar la columna de vidrio con regulador de citratos 0.1 M, pH 5.25, hasta aproximadamente 3/4 partes de su capacidad, introducir un disco de lana de vidrio (previamente humedecida), hasta la base para formar un soporte. De acuerdo con las instrucciones del profesor, agregar en forma continua y con agitacin, el intercambiador amberlita IRC-50, previamente resuspendido en regulador de citratos 0.1 M, pH 5.25 hasta una altura de 35-40 cm. Al mismo tiempo que se agrega la resina a la columna, se abre la llave para desalojar regulador lentamente. Dejar sedimentar el intercambiador y ajustar la velocidad de elucin, entre 16 y 20 gotas por minuto. Lavar la columna con regulador de citratos 0.1 M, pH 5.25, hasta que sea transparente al salir de la columna. EVITAR QUE SE SEQUE LA COLUMNA DE INTERCAMBIADOR. 2. Aplicacin de la muestra Cuando la altura de la resina ya no vare, bajar el nivel del regulador hasta 3mm sobre la superficie del intercambiador y agregar 1.0 ml de la mezcla de aminocidos (prolina e histidina), lo ms cerca posible de la superficie, procurando no perturbar la superficie del intercambiador. Abrir la llave para introducir la muestra y comenzar a colectar la primera fraccin; cuando la mezcla est al ras de

la superficie de la resina, agregar 1.0 ml de regulador de citratos 0.1 M, pH 5.25, resbalando por las paredes. Bajar el nivel del regulador hasta la superficie de la resina y repetir la operacin dos veces ms. 3. Elucin de la muestra Llevar el regulador de pH 5.25, hasta una altura aproximada de 7 cm sobre la superficie de la resina, mantenindola constante durante el proceso de elucin. Eluir 12 fracciones de 3.0 ml cada una, con este regulador. Eluir otras 28 fracciones con regulador de citratos 0.1 M, pH 2.0. 4. Determinacin de prolina e histidina En tubos de ensaye de 18 X 150 mm, colocar 1.0 ml de cada una de las fracciones colectadas y agregar 1.0 ml de ninhidrina al 0.2 % a cada una. Preparar dos tubos que servirn como blanco de reactivos para el espectrofotmetro, colocando en uno de los 1.0 ml de regulador de pH 5.25 y en el otro, 1 ml de regulador de pH 2.0 y agregar 1.0 ml de ninhidrina al 0.2 %. Colocar todos los tubos en un bao mara a ebullicin durante 20min. Transcurrido este tiempo dejar enfriar, agregar 3.0 ml de agua destilada y leer en el espectrofotmetro las fracciones del primer aminocido a 400 nm y las restantes a 570 nm, ajustando a 100 % T con los blancos correspondientes. DATOS EXPERIMENTALES 1. Complete la siguiente tabla. Tabla 1. Separacin de prolina e histidina Volumen de elucin (ml) A400 A570

a) Con los datos obtenidos, construya el perfil de elucin colocando en el eje de las abscisas el volumen de elucin y en el de las ordenadas el valor de absorbencia correspondiente. b)Cul de los aminocidos eluy primero? Explique porqu._____________ _________________________________________________________________ _____________________________________________________________ c)Cul sera el efecto de reducir la velocidad de elucin?________________ __________________________________________________________________ ____________________________________________________________ DISCUSIN:____________________________________________________

__________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________________________________________ CONCLUSIONES: _______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________ _______________________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Cooper, Terrance C. 1984. "Instrumentos y Tcnicas de Bioqumica" Ed. Revert, Barcelona, Espaa, pp. 141-143. 2. Braithwaite, L. And F. J. Smith. 1985. "Chromatographic Methods". 48. Ed., Chapman and Hall New York, pp. 98-101 3. Moore, S., D. H. Spackman and W. H. Stein 1958. "Chromatography of Aminoacids on Sulfonated Poliestyrene Resins" Anal. Chem. 30: 1185.

PRCTICA 12: SEPARACIN DE GRUPOS USANDO CROMATOGRAFA POR EXCLUSIN

INTRODUCCIN Los modos de separacin que se explic anteriormente usa la qumica y / o caractersticas inicas del gel y de los analitos. En contraste, SEC es completamente diferente a otros modos de separacin, ya que usa las

Figure 1a Figure 1b caractersticas fsicas de los analitos. Como se ha explicado anteriormente, hay poros en la superficie del gel. La figura 1a ilustra la separacin SEC: Los componentes 3 son los ms pequeos en la mezcla de la muestra y entran profundamente en el poro. Mientras el mayor componente 1, no puede entrar en el poro. El componente de tamao mediano 2 entra en el poro con cierta profundidad. Los componentes que pueden entrar en los poros ms profundo, obviamente, pasan ms tiempo en la columna, con lo que la secuencia de elucin ms grande a la ms pequea es: 1> 2> 3. Como se ve, la SEC separa los componentes de acuerdo con su tamao. Si el dimetro de un componente es igual al tamao mximo de los poros, como 4 (Figura 1b), que no ser capaz de entrar en los poros, y por lo tanto no se retendr. Para cualquiera de los componentes ms grandes que 4, tales como 5 y 6, tampoco se retuvo. Esto significa que aunque son diferentes en tamaos, no van a ser separados. El peso molecular mnimo (MW) que no puede entrar en el poro (en este caso 4) se denomina lmite de exclusin. En otras palabras, los componentes ms grandes que el lmite de exclusin de la columna no se pueden separar por la columna. Es importante elegir una columna que es adecuado para el anlisis del compuesto objetivo. En Shodex ofrecemos columnas rellenas con una amplia gama de

tamaos de poros de geles. El lmite de exclusin para cada columna aparece en nuestro catlogo. Para la mejor separacin, se recomienda elegir una columna con lmite de exclusin pequeo, pero que cubre el peso molecular del analito. El peso molecular (PM) de un compuesto se calcula a partir de la adicin de la masa atmica de cada componente. Por ejemplo, metlica (CH 3OH) contiene cuatro de hidrgeno (masa atmica 1), uno de carbono (masa atmica 12), y uno de oxgeno (masa atmica 16). (Harris, 2001) As MW de metlica es de 14 + 121 + 161 = 32. Sin embargo, es importante sealar que el tamao molecular real no son siempre iguales cuando se comparan diferentes compuestos. Como muestra la figura 2, incluso cuando dos compuestos tienen el mismo PM, uno puede tener una estructura menos densa, mientras que otros tienen una estructura ms densa, por lo que tienen diferentes tamaos moleculares. Incluso para el mismo compuesto, se usa disolvente diferente para disolver la muestra, se puede cambiar la estructura molecular y en consecuencia, puede cambiar su tamao. El lmite de la exclusin en nuestro catlogo indica las normas y las condiciones utilizadas. Si la misma condicin y la muestra se va analizar, no habra ninguna preocupacin, pero si cualquiera de las condiciones o la muestra son diferentes, elFigura 2 lmite de exclusin enumerada puede ser utilizado como una referencia . (Harris, 2001)

OBJETIVO Determinar algunos parmetros que caracterizan al lecho cromatogrfico para efectuar la desalacin de la albmina, utilizando la tcnica de cromatografa por exclusin. PROCEDIMIENTO 1. Empaquetamiento del gel en la columna Se agreg regulador hasta 3/4 partes de la columna e introducir un disco de lana de vidrio y uno de tafeta (previamente humedecidos). Se dren el regulador, hasta dejar aproximadamente 5 cm. Resuspender 60 ml de Sephadex G-25 sedimentado en regulador, abrir parcialmente la llave de la columna y aadirlo lenta y continuamente. Dejar sedimentar para permitir que se empaque el gel, regular a la velocidad de elucin en 12-16 gotas por min. Agregar regulador hasta que no haya variacin en la altura del lecho cromatogrfico. Medir y anotar la altura del lecho cromatogrfico y el dimetro interno de la columna. (Figura 1). EL NIVEL DEL REGULADOR NUNCA DEBE ESTAR, POR DEBAJO DE LA SUPERFICIE DEL GEL Y SU ALTURA SIEMPRE DEBE SER LA MISMA. 2. Determinacin del volumen vaco (Vo) de la columna Drenar el regulador hasta que el menisco est sobre la superficie del Sephadex. Cerrar la llave y aadir cuidadosa y suavemente con una pipeta, 0.5 ml de Dextrana Azul 2000 directamente sobre la superficie del Sephadex. Abrir la llave lentamente para introducir la dextrana y comenzar a colectar la primera fraccin (3 ml). Hacer 3 lavados con 1 ml de regulador Tris- EDTA; elevar la columna del regulador y eluir con este a una velocidad de 12 a 16 gotas por min, colectar 14 fracciones de 3 ml cada una, hasta que toda la dextrana azul haya sido eluda. Leer en el espectrofotmetro todas las fracciones a 615 nm, ajustando a 100 %T con el tubo 1. El volumen vaco ser el volumen de elucin de aqulla fraccin que presente mayor absorbencia. 3. Separacin del sulfato de amonio de la protena. Lavar 25 tubos de 13 X 100 mm, numerarlos con marcador indeleble, agregar 3 ml de agua y marcar el nivel; tirar el agua, secar los tubos en un horno. Una vez secos y fros pesarlos en una balanza analtica, anotando el peso. Pasar a travs

de la columna 100 ml de regulador Tris-EDTA a una velocidad de elusin de 12 a 16 gotas/min, bajar el volumen del regulador hasta que est sobre la superficie del Sephadex y aadir 0.5 ml de la solucin de albmina al 1 % en (NH4)2SO4 1 M. Abrir la llave para introducir la mezcla y comenzar a colectar la primera fraccin, hacer 3 lavados de 1 ml cada uno con regulador Tris-EDTA. Llevar el regulador en la columna hasta una altura constante, eluir y colectar un total de 25 fracciones, de 3 ml cada una, en los tubos aforados, secos y pesados. RECUERDE QUE LA VELOCIDAD DEBE PERMANCER CONSTANTE DURANTE EL PROCESO DE ELUCIN. Determine la absorbencia de la albmina en cada fraccin a 280 nm, ajustando el espectrofotmetro a 100 %T con la primera fraccin colectada. Una vez efectuadas las lecturas de absorbencia, aadirle a cada fraccin 1.5 ml de BaCI 2 1 M, centrifugar los tubos donde aparezca precipitado de BaSO 4, eliminar el sobrenadante, secar el precipitado y pesarlos en la balanza analtica para obtener, por diferencia de pesos, la masa del sulfato de bario. DESPUS DE OBTENER EL PRECIPITADO DE BaSO4 SECO, SE RECOMIENDA USAR GUANTES PARA MANEJAR LOS TUBOS. 4. Lavado final de la columna Pasar a travs de la columna 100ml de regulador de Tris-EDTA 0.1 M, pH 7.5. Vaciar el gel a un recipiente para su regeneracin (Apndice l), cuidado de quitar la tafeta y la lana de vidrio. DATOS EXPERIMENTALES E INFORME 1. Determinacin del Volumen vaco (Vo) de la columna. Tabla 1. Determinacin del volumen vaco (Vo) de la columna Volumen de elucin (ml) A 615

a) Con los datos anteriores construya el perfil de elucin de la dextrana azul 2000 (grfica 1), colocando el volumen de elucin en las abscisas y la absorbencia a 615 nm en las ordenadas. b) Cul fue el volumen total de la columna (VT)?____________________ c) Cul fue el volumen vaco (Vo) de la columna?___________________ d) Determine el volumen que ocupa en la columna el lquido que se encuentra en el interior de la estructura del gel (Vi) y el volumen del gel solo (Vg).__________________ 3. Separacin del sulfato de amonio de la protena.

Tabla 2. Separacin del sulfato de amonio de la protena Volumen de elucin (ml) A 280 (NH4)2SO4 (mg)

a) Con los datos anteriores construya el perfil de elucin de la albmina y el sulfato de amonio (grfica 2), poniendo en el eje de las abscisas el volumen de elucin, hacer dos ejes de ordenadas: en el de la izquierda colocar la A280 de la albmina y en el derecho los mg de (NH4)2SO4. b) Qu sustancia eluy primero y cul despus? Explique porqu._________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ c) Qu es un gel? _______________________________________________ Qu caractersticas debe tener el que es cromatogrficamente til?________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ d) Mencione por lo menos tres aplicaciones, diferentes a la usada en la PRCTICA, que puede tener esta

tcnica.____________________________________________________________ ___________________________________ e) Escriba las estructuras qumicas del Sephadex y del Bio-Gel A. Indique dnde se da el entrecruzamiento, en cada caso. DISCUSIN:____________________________________________________

__________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________________________________________ CONCLUSIONES: _______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________ _______________________________________________________________ REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Anlisis Qumico Cuantitativo. D. C. Harris. Editorial Revert, 2001 Anlisis Qumico Cuantitativo. D. C. Harris. Grupo Editorial Iberoamrica, 1992. Quantitative Analysis. Day and Underword. Prentice-Hall (ingls) y Prentice Hall Hispanoamericana S.A. (castellano), 1989. Quantitative Analysis. Day and Underword. Prentice-Hall (ingls) y Prentice Hall Hispanoamericana S.A. (castellano), 1989 Barnard. J. A., R. Chayen. 1965. Modern Methods in Chemical Anlisis. Mc Graw Hill Publishing Co., New York, pp. 246-252 Sephadex in Gel Filtration 1963. Distribuido por Pharmacia ; Uppsala, Sweden Calcrcel, M.; A. Gmez H. 1998. "Tcnicas Analticas de Separacin". Ed. Revert, pp. 573-592