Bioinformtica - Bioinformatic

Alineamiento de secuencias y filogenia

Argenis Riofro1, Mara Cristina Vivianco2
1
2

Escuela de Ciencias de la Computacin afriofrio@utpl.edu.ec

Escuela de Bioqumico y Farmacia mavivanco@utpl.edu.ec

ABSTRACT

En las ltimas dcadas se ha incrementado el conocimiento en

reas como la Gentica y la Biologa Molecular gracias a avances
tecnolgicos logrados mediante una investigacin interdisciplinaria
que ha permitido establecer vnculos entre la medicina, la biologa,
la qumica y las ingenieras. El uso de la bioinformtica es necesaria para que el investigador logre transformar datos biolgicos en
informacin til, que permita el desarrollo de nuevas tecnologas,
por lo que en este artculo se presenta el proceso para el alineamiento mltiple de secuencias (AMS) de 52 especies seleccionadas del reino fungi, en su gran mayora del genero Calvatia, indicando el proceso y descripcin de la metodologa utilizada para
lograr el alineamiento de secuencias y finalmente construir la
filogenia molecular. Resaltando el software utilizado, estrategias,
metodologas y algoritmos.
PALABRAS CLAVE

Alineamiento Mltiple de Secuencias, ADN, Filogenia Molecular

INTRODUCCIN

Hoy en da es muy comn escuchar sobre el tema del proyecto del

Genoma Humano dentro del campo cientfico y esto ha llevado a
que existe una gran cantidad de informacin sobre la composicin
de los aminocidos, por lo tanto se debe recurrir al uso de herramientas bioinformticas que permitan procesar rpidamente esta
informacin, constituyndose de esta manera el centro de esta
ciencia.
En este contexto, el alineamiento de dos o ms secuencias de DNA
permite conocer su relacin evolutiva, es decir conocer si las dos
secuencias o ms de DNA tienen un ancestro comn, para llegar a
ello se presentan una gran variedad de mtodos y algoritmos que el
paso de los aos han sido determines para fortalecer este proyecto
del Genoma Humano.

El primer eslabn en este proceso es el alineamiento mltiple de

secuencias, que en principio se puede ver muy sencillo, es posible
determinar el alineamiento ptimo entre dos secuencias elaborando
todos los alineamientos posibles y calculando para cada uno de
ellos la suma de las puntuaciones de los residuos alineados. Sin
embargo, esto constituye un problema cuando existen gaps, en
este caso el nmero de alineamientos posibles entre las dos secuencias de DNA es muy grande y el clculo exhaustivo es muy
difcil de alcanzar usando los actuales recursos computacionales
[1].
Determinar el grado de semejanza entre dos secuencias de DNA
requiere elaborar el alineamiento y contar (directa o indirectamente) el nmero de posiciones equivalentes conservadas. Cuando la
relacin entre dos secuencias es lejana y exhiben una pobre conservacin global elaborar el alineamiento no es trivial, puesto que
es difcil (si no imposible) identificar los aminocidos equivalentes
en las dos secuencias, en particular porque residuos individuales e
incluso regiones enteras de la protena pueden haber desaparecido
(o haberse insertado) a lo largo de la evolucin en una de las dos
secuencias. Entonces, varios algoritmos progresivos son utilizados
e implementados en software, los cuales son simples, utilizan
pocos recursos computacionales, emplean poco tiempo y los resultados presentan un nivel de acierto muy aceptable. Sin embargo, la
desventaja es que los resultados generados son de ndole heurstico, es decir, los resultados son aproximados.
Teniendo en consideracin lo dicho anteriormente es importa
considera que antes de que cualquier secuencia pueda ser utilizada
para la reconstruccin filogentica, estas deben ser alineadas,
siendo la calidad de este procedimiento un factor que afecta la
calidad de la filogenia inferida, que es lo que se pretende logar con
al finalizar este artculo, por lo que se ha seleccionado a MAFFT
como software para realizar el alineamiento mltiple de secuencias, por su rapidez al realizar alineamientos de un gran nmero de
secuencias en tiempos relativamente cortos y por su variedad de
estrategias de alineamientos entre ellas las Transformaciones Rpidas de Fourier (FFT).
En otro aspecto se tiene la filogenia molecular, la cual hace referencia a las relaciones evolutivas entre los organismos (especies,
gneros, familias). El estudio de las relaciones entre las especies ha
formado implcitamente parte en los estudios de taxonoma clsica
desde el siglo XVI [2].

*To
*

whom correspondence should be addressed.

To whom correspondence should be addressed.

Universidad Tcnica Particular de Loja 2013

Bioinformatic

La obtencin de filogenias moleculares se basa en la seleccin,

amplificacin y secuenciacin de regiones de ADN nuclear, plastidial (en plantas) y mitocondrial (de uso frecuente en animales y
espordico en algunas familias de plantas). Dichas secuencias son
revisadas, alineadas en funcin de sus homologas y posteriormente analizadas bajo las asunciones de los distintos mtodos de
reconstruccin filogentica, de dichas secuencias bajo los distintos
mtodos de inferencia, que resumen se crear uno o ms rboles
de genes que representan las relaciones evolutivas de las muestras
analizadas, y que a partir de estos rboles, si el muestreo taxonmico y de regiones ha sido adecuado, se pueden realizar inferencias sobre las relaciones evolutivas de las especies.

La Calvatia es un gnero perteneciente a la familia Agaricaceae

donde las esporas se expulsan por un agujero o por la ruptura del
exoperidio en forma irregular, no estrellada. Tienen forma ms o
menos globosa, con un recubrimiento general exoperidio (capa
ms externa del peridio1) que contiene la gleba, donde maduran las
esporas hasta ser expulsadas [4].

Es importante considera que para la elaboracin de este artculo se

seleccion 52 secuencias de especies del gnero de Calvatia pertenecientes al reino Fungi,

En la siguiente Tabla 1., se listan todas las secuencias utilizadas

para cada especie y gnero.

Otro gnero a considerar es la Barcheria la cual son hongos perteneciente a la familia Agaricaceae. El gnero es monotpico y consiste en una nica especie Barcheria willisiana,a cual tambin es
considerada en este proceso.

CALVATIA, BARCHERIA Y LEUCOAGARICU

Antes de proceder al explicar la metodologa utilizada para realizar

el alineamiento de secuencias es conveniente detenernos a indicar
cuales son las especies seleccionadas para cada secuencia, ya que
se consider 3 gneros, los cuales son la Calvatia, Bacheria y
Leucoagicu, las cuales tiene el siguiente orden.

Reino: Fungi
Subreino: Dikarya
Divisin: Basidiomycota
Subdivisin: Agaricomycotia
Clase: Agaricomycetes
Orden: Agaricales
Family: Agaricaceae
Tabla1. Gneros y especies utilizadas en este artculo.

El primero de estos gneros es la Calvatia.

3
3.1

METODOLOGA
Alineamiento de Secuencias
3.1.1. Seleccin de secuencias

Figura 1. Calvatia cyathiformis,(Bosc) Morgan o Lycoperdon

cyathiforme, Bosc. pintado por Charles H. Peck's en 1895.
Fuente: http://www.amanitacesarea.com/calvatia.html

El primer paso para realizar un alineamiento mltiple es contar con

las secuencias necesarias para llevar a cabo el anlisis. En este caso
se utiliz 52 secuencias del reino fung de la familia Agaricaceae,
de las cuales 50 secuencias son pertenecientes al Genero Calvatia y
1 al Genero Barcheria y otra al Genero Leucoagaricus, distribuidos
de la siguiente manera, como se puede ver en las Tablas 2 a la 7.

Peridio: Capa externa en algunas fructificaciones, como algunos esporangios, esporforos, ascocarpos y algunos basidiocarpos

Alineamiento de secuencias y filogenia

Tabla 6: Distribucin de las otras 10 secuencias

Tabla 2. Distribucin de las 12 secuencias de la Calvatia Gigantea

Tabla 3. Distribucin de las 12 secuencias de la Calvatia Fragilis

Tabla 7: Distribucin del resto de secuencias de los gneros Barcheria y Leucoagaricus

3.1.1. Bsqueda y descarga de secuencias.

Tabla 4. Distribucin de las 7 secuencias de la Calvatia Cyathiformis var. Cyathiformis

Para realizar la bsqueda de secuencias se la realizo directamente sobre el GenBank2, el cual es parte de International
Nucleotide Sequence Database Collaboration, que est integrada por la base de datos de ADN de Japn (DNA DataBank of Japan (DDBJ)), El Laboratorio Europeo de Biologa Molecular (European Molecular Biology Laboratory
(EMBL)), y el GenBank en el National Center for Biotechnology Information (NCBI3).
Una vez que estamos en la pgina del GenBank como se
muestra en la Figura 2. Se procede a buscar los nucletidos
que se relaciones con la Calvatia que es genero de hongos
con el cual se va a trabajar, asi mismo hacemos con los otros
dos gneros como Barcheria y Leuciagaricus.

Tabla 5: Distribucin de las 2 secuencias de la Calvatia Chilensis

2
3

GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Bioinformatic

Figura 4: Aadir las secuencias seleccionadas al Clipboard

Figura 2: Pgina principal de GenBank

Luego de realizar la bsqueda obtenemos todas las coincidencias de las secuencias de nucletidos relacionadas con la
Calvatia, para lo cual se puede seleccionar todas o las secuencias que deseemos. A dems en la parte izquierda de los
resultados de bsquedas aparece una rbol que indica el top
del organismo relacionado con la bsqueda desde la cual se
puede ver los diferentes tipos de especies del Gnero Calvatia tal como se muestra en la Figura 3.

Figura 5: Descarga de Secuencias.

Existe otra forma de poder realizarlo y conociendo las el
identificador de cada secuencia, y el procedimiento sera el
mismo, solo que tendramos que copiar todo lo que se encuentra en la Figura 6 en el campo de bsqueda remplazando el nombre del gnero Calvatia como se lo busco en un
principio, luego el procedimiento sera el mismo.

Figura 3: Top Organisms en los resultados de bsqueda

Lo mismo se realizara para los otros dos gneros considerados en este trabajo.

EF190318,EF190317,EF190316,EF190315,EF190314,
EF190313,AF518603,HM237179,AJ617492,AJ237864
,AF026665,AJ486871,AJ486870,AJ486964,AJ486963,
AJ486962,AJ486961,AJ486960,AJ486959,AJ486958,
AJ486957,AJ617493,AJ237865,AJ486868,AJ486867,
AJ486866,AJ486864,AJ486873,AJ486872,AJ486865,
AJ486966,AJ486965,AB509867,GU939632,AJ486869,
EU833652,FJ772413,AJ237863,AF485064,EU833651,
EU833653,JQ734547,AY372216,AY372212,JF495038
,JF495037,JF495036,JF495035,JF495021,JF495020,JF
3.1.2. Seleccin de software para alineamiento
495019,AY372214
de secuencias.
Figura 6: Identificadores de secuencias

Luego que tenemos la bsqueda realizada y se ha seleccionado todas las secuencias se procedemos a realizar la descarga de la siguiente manera.
-

Aadimos al clipboard, todas las secuencias seleccionadas (Figura 4).

Seguido de ello elegimos el formato de descarga
para nuestro caso FASTA y procedemos a dar click
en Create File y guardamos (Figura 5).

Luego de descargar el archivo con todas las secuencias

procedemos a editarlo para recortar los nombres y quedarnos nicamente con la informacin que necesitamos, incluso
se en nuestro caso se tuvo que eliminar algunas secuencias
debido a que no eran acordes con el resto de secuencias ya
que existan exceso de gaps que dificultaban su interpretacin .

Alineamiento de secuencias y filogenia

Es importante resaltar que se trabajar sobre las secciones

ITS1, 5.8S y 18S casi en todas las secuencias seleccionadas
3.1.2. Alineamiento de secuencias utilizando
MAFFT

3.1.1. Seleccin del software de alineamiento

mltiple
Es muy importar resaltar que el alineamiento de secuencias
se hizo sobre cidos nucletidos y para seleccionar las herramientas se ha considerado varios parmetros tales como
los algoritmos que implementan y sus caractersticas
computacionales como:

Luego que tenemos el archivo con todas las secuencias de

cada especie seleccionada, lo vamos a copiar en la carpeta
que contiene el programa MAFFT, la cual se la copio en el
disco C5, C:\mafft-win como se muestra en la Figura 7,
nuestro archivo se llama Secuences02.fasta.

Precisin Biolgica
Tiempo de ejecucin
Uso de memoria

Entre los programas que tiene una buena precisin bilgica

estn
- MAFFT4
- Muscle
- Probcon
- T-Coffee
Existen otros que se caractersticas por su capacidad de
rapidez al momento se realizar el alineamiento entre estos se
destacan.
- MAFFT
- Muscle

Figura 7: Copia del archivo de las secuencias en la carpeta

mafft-win

Seguido de ellos procedemos a ejecutar el archivo mafft.bat

y seguimos las instrucciones como se va pidiendo, esto se
muestra en la Figura 8.
-

Y los que tiene un bajo consumo se memoria en el procesamiento esta:

- ClustalW

En base a esto criterios se selecciona a MAFFT, porque es

que tiene buena precisin biolgica y es considerablemente
rpido en ejecutar estas tareas, al igual a su funcionamiento
ya que inicialmente realiza un alineamiento por mtodos
progresivos y luego es refinado por mtodos iterativos. Para
los mtodos de alineamiento progresivo es utilizada una
aproximacin de las transformadas de Fourier (FT).
MAFTT es uno de los mtodos ms rpidos entre las herramientas de alineamiento mltiple actualmente disponibles y
ha sido utilizado en varios proyectos tales como Pfam (base
de datos de familia de protenas), Astral (Compendio de
bases de datos y herramientas para el anlisis de estructuras
proteicas) y Merops (Base de datos de peptidasas) [6].

La versin 5 de MAFFT gener una mayor exactitud que

otros mtodos de amplio uso, incluyendo la versin 2 de
Tcoffe y Clustal W en un test de prueba consistente en ms
de 50 secuencias.

Fijamos el archivo de entrada

Fijamos el archivo de salida
Fijamos el formato de salida. En nuestro caso seleccionares la opcin 2.
Se nos pide seleccionar la estrategia. Para este caso
utilizaremos FFT (Transformaciones Rpidas de
Fourier) - FFT-NS-2, Opcin 3
Aceptamos y comienza el proceso de alineamiento

Figura 8. Ejecucin del MAFFT para el alineamiento de secuencias

5

MAFFT: http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/

MAFFT en este artculo est siendo usado sobre el sistema operativo

Windows 7.

Bioinformatic

Finalmente se obtiene el resultado archivo con las secuencias alineadas.

3.1.3. Visualizacin del alineamiento
Para la visualizacin y edicin del archivo con contiene
nuestro alineamiento se lo puede hacer desde varios programas como PhyDe Figura 9.

3.1.4. Anlisis de alineamiento

Generalmente los programas de visualizacin y edicin nos
permitirn realizar el anlisis de estas secuencias alineadas
ya que una vez obtenidas las secuencias, es necesario agruparlas para construir la matriz de datos. Para ello se colocan
las secuencias superpuestas, de tal manera que cada fila
corresponde a una muestra y cada columna a un carcter.
Este es el proceso que se denomina alineamiento, y busca
enfrentar aquellas partes de las secuencias que son homlogas6, para as poder identificar mutaciones, inserciones,
deleciones, inversiones, etc. producidas entre las muestras
estudiadas.

Figura 9: Visualizacin del alineamiento de secuencias con

PhyDe

Aunque tambin existen otros programas que nos permiten

visualizar el alineamiento como MEGA 5, y tambin poder
tener algunas opciones para poder realizar el anlisis del
mismo.
Figura 11: Bsqueda de Homologa en el alineamiento
Por ejemplo en la Figura 11, podemos ver que de las 9 secuencias de Calvatia Gigantea, la secuencia 7 ha sufrido
una delecin desde la posicin 420 a la 425 en relacin a sus
semejantes.

Figura 9: Visualizacin del alineamiento de secuencias con

Mega 5

Pero la correcta elaboracin del alineamiento constituye un

paso fundamental para la obtencin de una buena filogenia,
dado que la topologa de los rboles filogenticos que se
obtengan al final del proceso est totalmente condicionada
por las asunciones de homologa reflejadas en la matriz de
identidad, esta se la puede ver en el Anexo 1.

En este anlisis tambin hemos credo considerar la relacin

de las posiciones bien conservadas y variantes de las secuencias de lo cual se tiene que:
-

Figura 10: Visualizacin con JalView

Tambin podemos observar en el anexo 2 la composicin de

cada especie respecto a los nucletidos, de manera general
6

351 posiciones bien conservadas de 1213

721 posiciones variables de 1213
157 posiciones tiene un solo nucletido en esa alineamiento

Homlogas: Que son idnticas o con el menor nmero de cambios posible

Alineamiento de secuencias y filogenia

T(U)

Citocina

Adenocina

Guanina

se puede observar que todas las especies tiene una composicin.

29,8%

21,2%

24,4%

24,6%

Tabla 2: Resumen de la composicin de nucletidos expresado en porcentaje

3.2

Filogenia Molecular

El primer paso para realizar la filogenia es iniciar con una

muestreo de campo, tras el que se desarrolla el trabajo de
laboratorio que consiste en extraccin de ADN, amplificacin de regiones de ADN y por ltimo secuenciacin de los
productos. Sin embargo, otros muchos trabajos de filogenia
molecular pueden iniciarse a partir de secuencias de ADN
que han obtenido otros autores, el cual es nuestro caso ya
que las extraimos directamente desde el GenBank [8].
En cualquiera de los dos casos, el planteamiento inicial debe
partir del establecimiento de la hiptesis de trabajo que
estar sustentada sobre una pregunta biolgica a la que
queramos dar respuesta, para este artculo queremos conocer
de qu manera se relacionan evolutivamente estas las especies consideradas dentro del reino de los Hongos, especialmente con el gnero de la Calvatia, Barcharia y Leucoagari-

Los primeros incluyen en el proceso de obtencin del rbol

el criterio de seleccin y no hacen bsquedas de rboles, por
lo que no realizan de manera explcita una optimizacin de
una funcin de seleccin con base en el criterio establecido.
Los segundos realizan bsquedas de rboles sobre los que se
optimiza una funcin segn el criterio bajo el que son evaluados mnimo nmero de cambios evolutivos en MP,
mxima verosimilitud7 en ML, mxima probabilidad a posteriori en BI, mnima suma de longitudes de rama (calculadas como ordinary least square) en ME, o mejor ajuste entre
los pares de distancias estimados y las distancias calculadas
a partir del rbol, MC.
Siguiendo estos criterios hemos seleccionado el Mtodo de
Mxima Verosimilitud (Maximum Likelihood), ejecutado
desde un programa informtico MEGA 5.
Pero es importante conocer que se realiza con este mtodo.
El mtodo de ML intenta estimar la cantidad de cambio real
de acuerdo con un modelo establecido. Este mtodo evala
la hiptesis (el rbol) mediante una funcin (verosimilitud)
que maximiza la probabilidad de obtener los datos matriz
de secuencias de ADN dado el rbol y el modelo evolutivo8.
De esta forma, conforme al criterio de ML el mejor rbol de
cuatro secuencias conectadas dos a dos es aquel que presen|ta el mayor valor de verosimilitud, independientemente
del nmero de transformaciones de estados de carcter que
necesite[8].

cus.

Seguido de ello debemos seleccionar un mtodo para la

reconstruccin filogentica pese a que existen muchos
mtodos y se los puede agrupar de la siguiente manera,
segn el procedimiento seguido:
(1) MTODOS PURAMENTE ALGORTMICOS
a. [UPGMA, Neibourgh-Joining (NJ)]
(2) MTODOS DE BSQUEDAS DE RBOLES
BASADOS
EN
CRITERIOS
DE
OPTIMIZACIN
a. Mxima Parsimonia (MP)
b. Mxima Verosimilitud (ML; Maximum
Likelihood),
c. Inferencia Bayesiana (BI; Bayesian Inference),
d. Mnima Evolucin (ME),
e. Mnimos Cuadrados (MC).

Figura 12: Software Mega 59 utilizado para realizar la reconstruccin filogentica

La verosimilitud es la credibilidad o congruencia de un elemento determinado

8
Los modelos evolutivos en filogenias moleculares describen el modo y la
probabilidad de que una secuencia de nucletidos cambie a otra secuencia
de nucletidos homloga a lo largo del tiempo. Es decir, estos modelos
describen para cada uno de los sitios de la matriz la probabilidad de que se
produzca el cambio de un nucletido a otro a lo largo de las ramas de un
rbol filogentico dado.
9
Mega 5: http://www.megasoftware.net/

Bioinformatic

Como se explic anteriormente el software utilizado para la

reconstruccin filogentica es MEGA 5, la cual es una herramienta integrada para llevar a cabo la alineacin de secuencias, inferir rboles filogenticos, bases de datos basadas en la minera web, las tasas de estimacin de la evolucin molecular, inferir secuencias ancestrales, y las pruebas
de hiptesis evolutivas. MEGA es utilizado por los bilogos
en un gran nmero de laboratorios para la reconstruccin de
la historia evolutiva de las especies y deducir la magnitud y
la naturaleza de las fuerzas selectivas que dan forma a la
evolucin de genes y especies [9].

Como se puede ver en la Figura 13. Se est seleccionado el

mtodo de Test Maximum Likelihood Tree, que es que nos
reconstruir la filogenia.
El siguiente paso ser configurar las preferencias de anlisis
de este mtodo, como se muestra en la Figura 14.

3.2.1. Procedimiento
En esta seccin se describir el procedimiento que se sigui
para realizar la reconstruccin filogentica, con nuestras
secuencias de ADN que se la alineo previamente en la seccin anterior.
Lo primero que tenemos que hacer es abrir el archivo donde
se tiene todas las secuencias alineadas (Alineamiento.fasta),
desde el programa MEGA (File
Open A File/Session)
Seguido de ellos nos har una pregunta en la que nos dice
que si queremos Analizar o Alinear el archivo, en nuestro
caso el archivo ya est alineado por lo que colocamos Analizar (Analyze).

Figura 14: Preferencias de anlisis para el Mtodo Maximum Likelihood

La siguiente pregunta es con que datos de entradas estamos

trabajando, en este artculo estamos trabajando con nucleotidos.

Hay que tener en cuenta que la seccin donde dice Phylogeny Test, por defecto viene None, por lo que hay que cambiar a Mtodo BootStrap y luego seleccionar el nmero de
replicaciones que se va a realizar, para este caso se seleccion 1000 replicaciones.

Luego de realizar este procedimiento el archivo est disponible para poder utilizar MEGA sin ningn otro inconveniente como se puede ver en la Figura 9.

Como modelo de sustitucin de nucletidos se ha seleccionado el Tamura-Nei model.

El siguiente paso es ubicarse en la barra de herramientas ir

hasta el botn Phylogeny y seleccionados

Finalmente se obtiene el rbol Filogentico como se ve en el

Anexo 3, y en el Anexo cuadro se indica el rbol filogenetico con el Bootstrap10.
Finalmente en el rbol filogentico que se muestra en el
Anexo 3, nos representa la lnea de descendencia evolutiva
de las diferencies especies, organismos o de los genes de un
ancestro comn. Esto apoya la teora de la evolucin propuesta por Charles Darwin.

10

Figura 13: Seleccin del Mtodo de Reconstruccin Filogenetica en Mega.

El rbol filogentico del anexo 4 fue creado con las mismas preferencias
del anlisis del primer rbol solo que el nmero de replicaciones cambio
por motivos de consumo computacional a 20 replicaciones, el cual fue
elaborado para motivos explicativos

Alineamiento de secuencias y filogenia

Durante la evolucin los linajes a menudo sufren divisiones,

los linajes que funcionan separados son cada vez diferentes
a medida que se alejan de su ancestro.

REFERENCIAS
[1] Lozano, M. A., & MEDINA, J. V. (2006). Diseo de un procesador para el alieamiento global de secuencias de DNA. In Iberchip Workshop, Costa Rica(pp. 1-5).

En este rbol podemos diferenciar tres grupos (tres nodos)

estos pertenecen al mismo clado, cada grupo comparte una
similitud gentica ms evidente, pero no se los considera de
diferente especie sino que cada grupo representa caractersticas distintas, puede ser en los pares de bases, en los nucletidos.

[2] Valcrcel, V. Manual para anlisis filogenticos molecular. Disponible on-line:

http://ocw.uam.es/cursos/valcarcelfilogenia/1_W_Text_1.pdf.
[3] Red Europea de Biologa Molecular (Embnet), Introduccin a la Bioinformtica
Disponible on-line:
http://bioinf.ibun.unal.edu.co/documentos/multAlignmentCBIB.pdf

Los nmeros que podemos encontrar en cada clado (conjunto de especies emparentadas con un antepasado comn, que
forman una nica "rama") representan la diferencia con los
dems clados, en este rbol filogentico podemos observar
26 clados.
Por ejemplo tenemos en la parte superior que un clado se
est diferenciando en un 92% de los dems y tiene ms
similitud entre su grupo y los que tienen un valor de 50 no
se los considera.

[4]

Gua

mictica.

Ficha

de

Especies

Disponible

on-line:

http://www.amanitacesarea.com/calvatia.html
[5] Poot, C. Alineamiento multiple de secuencias UNAM
[6] REACTIVOS. Alineamientos de secuencias de aminocidos. Disponible on-line:
http://www.reactivos.com/images/Capitulo_3_Alineamiento_Secuencias_Amino_cido
s_GQAC.pdf
[7] Draper, I. Manual para anlisis filogenticos moleculares. Disponible on-line:
http://ocw.uam.es/cursos/valcarcelfilogenia/1_W_Text_3.2.pdf

Los dominios de protenas se agrupan en familias basadas

en similitudes de secuencia (> 30% de identidad de residuo),
la estructura o la funcin.
Tambin tenemos dos grupos externos que son la Calvatia
gigantea y la Calvatia gigantea isolate.

[8] Aguado, M. Manual para anlisis filofenticos moleculares. Disponible on-lne:

http://ocw.uam.es/cursos/valcarcelfilogenia/1_W_Text_3.pdf
[9]

MEGA.

Software

para

anlisis

filogentico.

Disponible

on

line:

http://www.megasoftware.net/

gi|122719228|gb|EF190318.1|

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100.00

99.68

99.37

99.84

99.67

99.26

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43.92

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43.84

43.55

43.55

43.84

42.55

Universidad Tcnica Particular de Loja 2013

10

Anexo 2: Composicin de nucletidos por cada especie

gi|122719228|gb|EF190318.1| Calvatia gigantea isolate CG13

gi|122719227|gb|EF190317.1| Calvatia gigantea isolate CG11
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gi|122719224|gb|EF190314.1| Calvatia gigantea isolate CG2
gi|122719223|gb|EF190313.1| Calvatia gigantea isolate FrbSob
gi|22652915|gb|AF518603.1| Calvatia gigantea strain DSH 96-032
gi|299033681|gb|HM237179.1| Calvatia gigantea strain 9-7A 18S
gi|48596658|emb|AJ617492.1| Calvatia gigantea partial 18S
gi|6179393|emb|AJ237864.1| Calvatia gigantea 18S rRNA gene, partial, strain R19/90
gi|2586020|gb|AF026665.1|AF026665 Calvatia gigantea 12S ribosomal
gi|30524974|emb|AJ486871.1| Calvatia fragilis ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2, from USA:South Dakota
gi|30524973|emb|AJ486870.1| Calvatia fragilis ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2, from Mexico
gi|30524699|emb|AJ486964.1| Calvatia fragilis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
Ghana
gi|30524698|emb|AJ486963.1| Calvatia fragilis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
Mongolia
gi|30524697|emb|AJ486962.1| Calvatia fragilis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
Italy
gi|30524696|emb|AJ486961.1| Calvatia fragilis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
Spain
gi|30524695|emb|AJ486960.1| Calvatia fragilis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
Australia, Swan River
gi|30524694|emb|AJ486959.1| Calvatia fragilis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
Argentina
gi|30524693|emb|AJ486958.1| Calvatia fragilis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
Pakistan
gi|30524692|emb|AJ486957.1| Calvatia fragilis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
USA
gi|48596659|emb|AJ617493.1| Calvatia fragilis partial 18S rRNA gene, ITS1, 5.8S rRNA gene, ITS2, and
partial 28S rRNA gene, strain CFRO
gi|6179394|emb|AJ237865.1| Calvatia fragilis 18S rRNA gene, partial, strain CFRO
gi|30524971|emb|AJ486868.1| Calvatia cyathiformis var. cyathiformis ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2,
from USA:Philadelphia
gi|30524970|emb|AJ486867.1| Calvatia cyathiformis var. cyathiformis ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2,
from USA:South Carolina
gi|30524969|emb|AJ486866.1| Calvatia cyathiformis var. cyathiformis ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2,
from USA:Oklahoma
gi|30524967|emb|AJ486864.1| Calvatia cyathiformis var. cyathiformis ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2,
from France
gi|30524976|emb|AJ486873.1| Calvatia cyathiformis var. cyathiformis ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2,
from Paraguay
gi|30524975|emb|AJ486872.1| Calvatia cyathiformis var. cyathiformis ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2,
from Brazil
gi|30524968|emb|AJ486865.1| Calvatia cyathiformis var. cyathiformis ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2,
from Paraguay
gi|30524701|emb|AJ486966.1| Calvatia chilensis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
Argentina
gi|30524700|emb|AJ486965.1| Calvatia chilensis partial ITS1, 5.8S rRNA gene and partial ITS2, country
Chile
gi|298354255|dbj|AB509867.1| Calvatia craniiformis gene for 5.8S
gi|294818260|gb|GU939632.1| Calvatia candida strain PB101
gi|30524972|emb|AJ486869.1| Calvatia cyathiformis var. crucibulum ITS1, 5.8S rRNA gene and ITS2,
from Cuba
gi|212276600|gb|EU833652.1| Calvatia cf. leiospora AN014671 voucher AN014671 (ARIZ)
gi|225382603|gb|FJ772413.1| Calvatia fenzlii strain Jz01 18S
gi|6179392|emb|AJ237863.1| Calvatia complutensis 18S rRNA gene, partial, strain CCMD
gi|19569130|gb|AF485064.1| Calvatia rubro-flava 18S ribosomal RNA gene
gi|212276599|gb|EU833651.1| Calvatia bicolor voucher LMG756-58 (ARIZ)
gi|212276601|gb|EU833653.1| Calvatia pachydermica voucher AN014692 (ARIZ)
gi|389548685|gb|JQ734547.1| Calvatia holothurioides voucher LE 287408
gi|38425339|gb|AY372216.1| Barcheria willisiana specimen-voucher MEL2177563 25S
gi|38425335|gb|AY372212.1| Barcheria willisiana specimen-voucher BA1307 25S
gi|346328552|gb|JF495038.1| Barcheria willisiana voucher H7564
gi|346328551|gb|JF495037.1| Barcheria willisiana voucher H7518
gi|346328550|gb|JF495036.1| Barcheria willisiana voucher MEL2177563
gi|346328549|gb|JF495035.1| Barcheria willisiana voucher MEL269353
Anexo
3: rbol
gi|346328535|gb|JF495021.1| Barcheria willisiana voucher
MEL2177561
28Sfilogentico
gi|346328534|gb|JF495020.1| Barcheria willisiana voucher H7518 28S
gi|346328533|gb|JF495019.1| Barcheria willisiana voucher H7564 28S

Universidad Tcnica Particular de Loja 2013

T(U)
30,9
31,3
31,0
31,8
31,2
30,9
23,4
30,8
30,4
27,8
26,5
31,5
31,3

C%
21,8
21,6
21,9
21,7
21,6
22,1
20,1
20,6
21,4
22,6
14,6
21,4
21,5

A%
23,0
22,6
22,8
23,0
22,6
22,3
26,2
24,8
23,5
22,2
37,9
24,0
24,1

G%
24,2
24,5
24,4
23,6
24,6
24,7
30,2
23,8
24,7
27,3
20,9
23,1
23,1

Total
673,0
633,0
636,0
623,0
638,0
611,0
884,0
766,0
718,0
571,0
535,0
654,0
655,0

30,8

22,2

24,2

22,7

652,0

30,9

21,7

24,0

23,3

653,0

31,2

21,7

24,0

23,0

653,0

31,2

21,7

24,0

23,1

654,0

31,5

21,0

24,3

23,2

651,0

31,7

21,0

24,2

23,1

653,0

31,6

21,0

24,3

23,0

651,0

31,2

21,6

24,0

23,2

654,0

30,6
28,0

21,1
22,4

24,9
22,1

23,5
27,5

712,0
571,0

31,3

21,5

24,0

23,2

655,0

31,3

21,5

24,0

23,2

655,0

31,3

21,5

24,0

23,2

655,0

31,3

21,5

24,1

23,1

655,0

31,3

21,5

24,1

23,1

655,0

31,3

21,5

24,1

23,1

655,0

31,3

21,5

24,1

23,1

655,0

31,0

22,2

23,9

22,9

658,0

31,0
31,3
30,6

22,2
21,4
21,6

23,9
25,4
25,3

22,9
22,0
22,5

658,0
355,0
712,0

31,1
30,0
31,3
27,8
31,3
30,2
31,3
29,8
23,6
23,6
32,2
31,5
31,2
31,7
23,5
23,3
23,5

21,8
21,8
20,5
22,6
20,2
21,8
20,8
20,4
20,1
20,1
21,3
21,9
21,7
21,6
20,0
19,8
20,0

24,1
24,3
24,6
22,1
25,1
25,2
24,1
26,7
25,8
25,8
22,6
22,3
23,2
23,5
26,0
26,1
25,9

23,0
23,9
23,6
27,5
23,4
22,8
23,8
23,2
30,5
30,5
24,0
24,3
23,9
23,2
30,6
30,7
30,6

656,0
696,0
784,0
571,0
672,0
762,0
735,0
855,0
865,0
865,0
643,0
645,0
699,0
681,0
851,0
827,0
852,0

11

Bioinformatic

Anexo 3: rbol filogentico

12