LABORATORIO DE BIOQUIMICA 502504 GRUPO 1 sesin 20 de noviembre GUIA No 6.

1- Enzimas mitocondriales : citocromo oxidasa y succnico deshidrogenasa TENGA EN CUENTA QUE EL MISMO DA DE LA PRCTICA ESCRIBIR EL INFORME EN EL LABORATORIO: POR LO TANTO LEA TODA LA GUA,REALICE UN BUEN PREINFORME, CONSULTE EN TUTORA Y LLEVE TODA LA iNFORMACIN NECESARIA PARA PODER ELABORARLO ESE MISMO DA, SOLO DISCUTIENDO CON SU COMPAERO DE LABORATORIO. I. EL PROBLEMA. Identificar la actividad de algunas enzimas especficas presentes en clulas de diferentes tipos como la citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa, mediante el uso de aceptores electrnicos coloreados e identificar el efecto inhibitorio de algunas sustancias sobre este sistema enzimtico y sobre la fosforilacin oxidativa y el ciclo de Krebs. II. BSQUEDA DE INFORMACIN. ESCRITA EN MXIMO DOS PGINAS CON CITAS: 1.-Busque los nombres en ingles de cada una de las dos enzimas a usar en el laboratorio, luego con estos consulte en los enlaces del apartado correspondiente a enzimas de AVATA: reacciones que cataliza de inters para la prctica a realizar (dentro del ciclo de krebs o fosforilacin oxidativa) 2-Para las clulas a usar mencione brevemente( NO MS DE UN PRRAFO) si su metabolismo es ms anaerobio ( o fermentativo), anaerobio facultativo, o aerobio. 3-Fotocopie y pegue tablas con los valores de potencial redox para todos los componentes de la cadena respiratoria, as como del azul de metileno y la p-fenilendiamina, compuestos que se usarn para evidenciar la actividad de las enzimas citocromo oxidasa y succnico deshidrogenasa. 4- De acuerdo con la gua describa brevemente los cambios de color en el azul de metileno y la p-fenilendiamina cuando: a-La citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa se encuentran sin inhibidores. b- La citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa se encuentran con los inhibidores (cianuro o malonato). III. FUNDAMENTO TERICO. Cadena de transporte de electrones La cadena de transporte de electrones como parte de la fosforilacin oxidativa es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y est constituido por una serie de complejos enzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroprotenas. El complejo citocromo oxidasa o complejo IV es el componente final de la cadena respiratoria y est constituido por el citocromo a y a3 y dos iones Cu (II). Aproximadamente el 90% del consumo celular de oxgeno se debe a la accin de este

complejo. Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores electrnicos ms fuertes como el cianuro, azida y monxido de carbono, entre otros, los cuales inhiben irreversiblemente este complejo enzimtico y se interrumpe el transporte de electrones producindose una cianosis celular. La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidacin de sustancias como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de citocromos. Esta sustancia es muy reactiva as que se condensa y polimeriza fcilmente originando mezclas de pigmentos oscuros. El ciclo de Krebs y la succnico deshidrogenasa (SDH) La succnico deshidrogenasa o succinato deshidrogenasa o complejo II es una enzima que se encuentra asociada a la membrana interna de la mitocondria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidacin asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la cadena de transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma competitiva por la presencia de otros cidos dicarboxlicos como el malonato, malato, oxalacetato y oxalato, los cuales se unen al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulacin de succinato. El proceso se puede evidenciar in vitro mediante el uso de un aceptor electrnico artificial como el azul de metileno, que es coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida en que se reoxida la coenzima FAD. Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxgeno del aire, se reoxida tomando la coloracin azul y formando perxido de hidrgeno, por esta razn el sistema se asla mediante una capa de aceite mineral. IV. MATERIALES Y REACTIVOS. Material por grupo de laboratorio. - 10 tubos de ensayo - dos erlenemeyer de 150ml - un vaso de precipitados de 500ml - Cuatro pipetas de 5ml - Cinco pipetas de 2ml - Una gradilla - Un pipeteador Materiales y reactivos generales. (volmenes calculados para 10 grupos de laboratorio) - Arena lavada - Buffer fosfato 0,1M y pH 7.4 (300ml) - Solucin malonato de sodio 1% (100ml) - Solucin cianuro de potasio 0,05M (50ml) PELIGROSO - Solucin de p-fenilendiamina al 1% (100ml) - Solucin de succinato de sodio al 1% (100ml) - Solucin de azul de metileno 0,01% (100ml) - Aceite mineral (200ml) - Agua destilada -Hielo - Bao de mara termostatado a 37C - Extracto de msculo de conejo fresco y extracto de corazn de res fresco (GRUPO 1 SESIN 20 DE NOVIEMBRE)

V. PROCEDIMIENTO. 1. Extraccin y preparacin de las enzimas y coenzimas (lo realizar el auxiliar de laboratorio). Tomar una muestra de aproximadamente 5g de tejido libres de sangre y colocarlos en un

mortero con arena lavada, macere cuidadosamente hasta formar una masa suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer fosfatos hasta completar un volumen aproximado de 15ml. Transfiera la mezcla a un erlenmeyer de 150ml y mantngalo en un bao con hielo durante 15 minutos, mezclando ocasionalmente. Pase la muestra a tubos de centrfuga y centrifugue a 1500 rpm por 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro erlenmeyer de 150ml y mrquelo como extracto enzimtico y mantngalo en bao de hielo hasta su posterior uso. 2. Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa para las clulas animales: Prepare una serie de tubos debidamente marcados segn las indicaciones de la Tabla No 1, hasta adicionar el agua. Deje los tubos incubando a 37C durante 10 minutos y sin retirar los del bao agregue el extracto enzimtico y la p-fenilendiamina, agite bien, este momento corresponde al tiempo cero, observe durante 10 minutos y anote los resultados obtenidos en cada tubo: tiempo en minutos en que empieza a aparecer el complejo coloreado y color e intensidad de los colores finales. TABLA No 1. Tubos REACTIVO (ml) B 1 2 3 Buffer fosfato pH 1,0 1,0 1,0 1,0 7.4 Malonato de sodio 0,0 0,0 0,0 1,0 1% Cianuro de potasio 0,0 0.0 1.0 0.0 0,05M Agua destilada 2,0 1.0 0.0 0.0 Extracto enzimtico p-fenilendiamina 1% 1,0 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

3. Seguimiento de la reaccin catalizada por la succinico deshidrogenasa para las clulas animales: Prepare una serie de tubos debidamente marcados segn las indicaciones de la tabla No. 3. Antes de agregar el extracto enzimtico, deje los tubos incubando a 37C durante 10 minutos, y sin retirarlos del bao agregue el extracto enzimtico, inmediatamente agite bien y coloque el aceite mineral.Tome como tiempo cero el momento en que coloc el extracto enzimtico y anote los resultados obtenidos en cada tubo luego de 10 minutos: color e intensidad de color finales. TABLA No 3. Tubos Reactivo (ml) B 1 2 3 4 Buffer fosfato 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 pH 7.4 Succinato de 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0 sodio 1% Azul de 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 metileno Malonato de 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 sodio 1% Extracto 1,0 0,5 1,0 1,5 1,0 enzimtico Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

VI. PARA EL ANLISIS DE LA PRCTICA. -Fotos con tubos debidamente etiquetados. - Anlisis de las observaciones de la prctica con citas y usando toda la informacin de su preinforme BREVEMENTE: - Explique el propsito de agregar cada reactivo y la tempertaura de incubacin en cada caso. -Para cada tubo de ensayo y para cada muestra, con imgenes ilustrativas de la cadena respiratoria, indique hasta donde se llevo a cabo la Fosforilacin oxidativa y si el aceptor de electrones artificial coloreado quedo oxidado o reducido. -Explique el efecto de los inhibidores enzimticos presentes en algunos tubos de ensayo. - Explique el efecto de la concentracin de extracto enzimtico en el ensayo donde se a pertienente. -Compare y discuta qu tipo celular es ms aerobio o anaerobio y por lo tanto que rutas usa principalmente para la generacin de energa. VII. BIBLIOGRAFA. - NELSON, D. Lehninger principios de bioqumica. Quinta Edicin. Ediciones Omega, 2009. - BOHINSKI, R.C. Bioqumica. Quinta Edicin. Mxico: Pearson Educacin, 1998 - MATHEWS C., VAN HOLDE K., AHERN K G. Bioqumica. 3 ed. Madrid: Addison Wesley, 2002. - PLUMMER, D. Bioqumica prctica. Mxico: Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana, 1981